I.
JUDUL PERCOBAAN
: Penentuan Kada adar Glukosa Dara arah
II.
HARI / TANGGAL TANGGAL PERCOBAAN PERCOBAAN
: Kamis, 4 Oktober Oktober 2012
III.
SELE SELESA SAII PERC PERCOB OBAA AAN N
: Kami Kamis, s, 4 Okto Oktobe berr 2012 2012
IV.
TUJUAN
:Menentukan kadar glukosa daam darah
V.
DASAR TEORI Glukosa Glukosa merupakan merupakan suatu gula monosakarid monosakarida, a, dimana dimana glukosa glukosa adalah salah satu karbohidrat terpenting yang digunakan sebagai sumber tenaga bagi hewan dan tumbuhan. Glukosa merupakan salah satu hasil utama fotosintesis dan awal awal bagi bagi respira respirasi. si. Bentuk Bentuk alami alami (D-glu (D-glukos kosa) a) disebu disebutt juga juga dengan dengan dekstrosa. dekstrosa. Glukosa adalah suatu aldoheksosa aldoheksosa dan sering disebut dekstrosa karena mempunyai sifat dapat memutar cahaya terpolarisasi kearah kanan. Gula terdapat dalam dua enantiomer (isomer cermin), cermin), D-glukosa D-glukosa dan L-gl L-gluk ukos osa, a, tapi tapi pada pada orga organi nism sme, e, yang ang dite ditemu muka kan n hany hanyaa
isom isomer er D-
isomer.Suatu karbohidrat berbentuk D atau L berkaitan dengan konformasi isomerik pada karbon 5. Jika berada di kanan proyeksi Fischer , maka bentuk cincinnya adalah enantiomer D, kalau ke kiri, maka menjadi enantiomer L. Sangat mudah diingat, merujuk pada D untuk "dextro”, yang merupakan akar bahasa Latin untuk "right" (kanan), sedangkan L untuk "levo" yang merupakan akar kata "left" (kiri). Struktur cincinnya sendiri dapat terbentuk melalui dua cara yang berbeda, yang menghasilkan glukosa-α (alfa) dan β (beta). Secara struktur, glukosa-α dan -β berbeda pada gugus hidroksil yang terikat pada karbon pertama pada cincinnya.Bentuk α memiliki gugus hidroksil "di bawah" hidrogenny hidrogennyaa (sebagaimana (sebagaimana molekul ini biasa digambarkan digambarkan,, seperti terlihat pada gambar di atas), sedangkan s edangkan bentuk β gugus hidroksilnya berada "di atas" hidrogenny hidrogennya. a. Dua bentuk bentuk ini terbentuk terbentuk bergantian sepanjang waktu dalam laruta larutan n air, hingga hingga mencap mencapai ai nisbah nisbah stabil stabil α:β 36:64, 36:64, dalam dalam proses proses yang yang disebut mutarotasi yang dapat dipercepat.
Perubahan proyeksi Fischer ke proyeksi Haworth α-D-Glukopiranosa
Glukosa darah akan mereduksi Cu 2+ dalam suasana basa, yang hasil reduksinya akan bereaksi dengan arseno molibdat menghasilkan warna biru. glukosa dapat mereduksi Cu 2+ karena glukosa merupakan gula pereduksi yang dapat mereduksi senyawa-senyawa penerima electron. Pada penambahan Ba(OH)2
sampel
darah
sedikit
menggumpal.
Ba(OH)2
ini
berfungsi
memberikan suasana basa dan juga mengendapkan ion-ion besi dalam darah. Salah satu ion besi yang diendapkan adalah ion besi pada haemoglobin , ion besi ini diubah menjadi molekul Fe(OH) 2 berupa endapan merah. Pada ZnSO 4 maka endapan merah dari sampel semakin banyak dan terakoagulasi menjadi pucat. Penambahan ZnSO4 ini berfungsi untuk mengendapkan dan juga mendenaturasi protein secara sempurna. Karena berat jenis yang lebih besar dari berat jenis glukosa yang akan dianalisis, maka pemisahan selanjutnya dilakukan dengan sentrifuge untuk mengendapkan protein. Pengendapan ini bertujuan untuk memisahkan protein dari glukosa karena akan mengganggu pengukuran. Penentuan kadar selanjutnya akan dilakukan dengan cara spektrofotometri. Untuk mengukur arbsorbansinya maka ditambahkan Cu alkalis dan juga arsenomolibdat. Penambahan Cu alkalis dalam suasana basa akan mereduksi
senyawa
Cu2+ menjadi
Cu yang
beereaksi
dengan
arsenomolbdat menghailkan warna hiru. Arbsorbansi sebanding dengan konsentrasi glukosa ang akan diukur. Larutan
ini diukur pada panjang
gelombang maksimum aitu 660 nm. Dengaan menggunakan hokum LambertBeer : A=kxcxl Dimana A = absorbansi (serapan cahaya) k = koefisisen ekstinksi molar larutan c = konsentrasi sampel l = tabel kuvet berdasarkan hokum lambert-beer, serapan cahaa berbanding lurus dengan konsentrasi. Dalam analisis absorbansi metode yang digunakan adalah UV-vis dimana lat ini biasanya digunakan untuk analisis kimia kuantitativ dan terkadang juga kualitativ. Prinsip kerja spektofotometer UV-vis, didasarkan pada fenomena penyerapan sinar oleh spesi kimia tertentu di daerah ultra lembayung (ultraviolet) dan sinar tampak (visible). VI.
ALAT DAN BAHAN a. Alat •
Spektronik 20
•
Sentrifuge
•
Tabung reaksi
•
Penangas air
•
Gelas ukur
•
Gelas piala
b. Bahan •
Larutan Cu alkalis
•
Larutan Ba(OH)2 0.3 N
•
Larutan ZnSO4.7H20 5%
•
Larutan standar glukosa 1 mg/ mL
•
Pereaksi arsenomolibdat
VII. CARA KERJA 1. Deproteinase 0.1 ml darah yang “oxalated” -dimasukkan ke dalam tabuing sentrifuge yg telah berisi 1.90 ml aquades -dicampur dengn baik -ditambah 1.5 ml Ba(OH)2 0.3M -diaduk baik2 hingga merata -ditambah lagi ZnSO4.7H2O 5% dicampur dengan baik -didiamkan selama 5 menit -disentrifuge selama 30 menit -dilakukan dekantasi
Filtrat (filtrate darah bebas
Residu
protein) -dilakukan uji biuret Hasil uji Biuret
2. Penentuan kadar glukosa 1.0 ml filtrate darah bebas protein -dimasukkan ke dalam tabung reaksi -ditambah pereaksi Cu alkalis Dimasukkan ke dalam air mendidih selama 20 menit -dimasukkan dalam air dingin -ditamabah 1.0 ml pereaksi arsenmolibdat -diaduk sampai rata -dibaca absorbansi dengan alat spektronik 20 pada panjang gelombang 660 nm
Hasil absorbansi
3. Larutan blanko
1.0 ml aquades -dimasukkan dlm tabung reaksi -ditambah 1.0 ml pereaksi Cu alkalis -dimasukkan kedalam air mendidih selama 20 menitin -dimasukkan kedalam air dingin -ditambah 1.0 ml pereaksi arsenomolibdat (diaduk sampai rata) -dibaca absorbansinya dgn alat spektronik 20 dgn panjang gelombang 660 nm. Hasil absorbans i
VIII. HASIL PENGAMATAN N 1
Prosedur Deproteinase Filtrat Darah Dimasukkan 0,1 mL darah ke tabung yang sentrifuge yang oxalated berisi 1,90 mL aquades
Hasil Pengamatan darah = • Sampel Cairan berwarna merah dan kental = • Aquades Larutan jernih tidak berwarna Ba(OH)2 = Larutan jernih Dicampur tidak berwarna dengan baik ZnSO4.7H2O = Larutan jernih Ditambah 1,5 mL tidak berwarna Ba(OH)2 0,3M Aquades = • + larutan berwarna Diaduk hingga merah rata + Ba(OH)2 = Larutan berwarna Ditambah coklat ZnSO4.7H2O 5% + ZnSO .7H O = 4 2 Larutan berwarna Dicampur hijau kecoklatan dengan baik •
•
•
•
Didiamkan 5 menit ±Disentrifuge 5 mL filtrat 10 menit Dibagi Didekantasi 1 mL untuk uji biuret
Sisa Diencerka n ± 10 mL Sampel kurva standart
Dugaan / Reaksi Filtrat darah yang dihasilkan adalah filtrat yang bebas protein.
Kesimpulan Filtrat darah telah bebas protein dan dibuktikan engan uji biuret yang ditandai warna larutan tidak berwarna.
2.
Penentuan Kadar Glukosa Dimasukkan ke 1 mL filtrat tabung reaksi darah bebas Ditambah pereaksi protein Cu alkalis Dimasukkan ke dalam air mendidih 20 menit Dimasukkan dalam air dingin
Filtrat darah Larutan yang bebas protein = dihasilkan adalah Larutan jernih berwarna hijau tidak berwarna alkalis = • Cu larutan berwarna biru muda (++) Cu alkalis = •+ Larutan berwarna biru muda (+) • + arsenomolibdat = Larutan berwarna biru jernih •
Absorbansi bebas
darah protein
0.595 Y=-0.05x + 0.310 0.595 = -0.05x + 0.310 0.595 – 0.310 = -0.05x 0.285 = -0.05x x = -5.7 mg/ml
Ditambah 1 mL pereaksi asenomolibdat Diaduk sampai rata
3.
Dibaca absorbansi Hasil dengan alat Absorbansi spektronik 20 Pembuatan padakurva λ = 660 standart nm 1 mL filtrat Dimasukkan ke darah tabung reaksi bebas protein Ditambah pereaksi Cu alkalis Dimasukkan ke dalam air mendidih 20 menit Dimasukkan dalam air dingin Ditambah 1 mL pereaksi asenomolibdat
Setelah pemanasan -0.1
larutan berwarna semakin besar nilai
semakin
besar
biru jernih
nilai
absorbansinya. :
larutan berwarna mg/ml
:
larutan berwarna merah bata + -0.4
mg/ml
:
larutan berwarna biru jernih -0.5
mg/ml
:
larutan berwarna biru jernih
absorbansinya y= -0.05x +n0.310 Dengan R 2= 0.013
merah bata ++ -0.3
konsentrasi
besar maka
mg/ml
:
besar Semakin konsentrasi
-0.2
mg/ml
Smakin
Diaduk sampai rata Dibaca absorbansi dengan alat spektronik 20 pada λ = 660 Hasil nm Absorbansi Diberlakukan juga untuk glukosa 0,2;0,3;0,4;0,5 mg/mL
Dimasukkan ke Larutan Blangko tabung reaksi
4.
1Ditambah mL aquades pereaksi Cu alkalis Dimasukkan ke dalam air mendidih 20 menit Dimasukkan dalam air dingin Ditambah 1 mL pereaksi asenomolibdat Diaduk sampai rata
Aquades alkalis
+Cu :
biru
pemanasan
:
jernih Setelah berwarna
biru
muda jernih Dimasukkan dalam air
dingin
berwarna
: biru
jenih Ditambah
1.5
pereaksi arsenomolibdat : berwarna biru
Dibaca absorbansi Hasil alat dengan Absorbansi spektronik 20 pada λ = 660 nm
IX.
ANALISIS DAN PEMBAHASAN 1. Deprotenasi filtrate darah
Pada percobaan ini bertujuan untuk memperoleh filtrat darah yang bebas protein dari sampel yang berupa “darah oxalated”. Hal pertama yang dilakukan adalah darah yang oxalated 0,1 mL (±2 tetes) dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge yang telah berisi 1.9 mL aquades. Penambahan aquades pada percobaan ini bertujuan untuk mengencerkan sampel darah yang digunakan sehingga albumin yang terkandung dalam darah akan larut oleh aquades. Albumin adalah protein yang dapat larut dalam air serta dapat terkoagulasi oleh panas dan biasanya terdapat dalam serum darah. Kemudian ditambahkan 1,5 mL Ba(OH)2 0,3 N (larutan tidak berwarna), setelah ditambahkan larutan tetap tidak berwarna terdapat endapan berwarna coklat. Larutan Ba(OH)2 disini berfungsi untuk mengendapkan albumin yang terlarut dalam air. Lalu ditambahkan 1,5 mL ZnSO4 5% (larutan tak
berwarna), larutan menjadi berwarna hijau kecoklatan dan terdapat endapan didasar tabung sentrifuse dan larutan didiamkan selama 5 menit. Pada penambahan ZnSO4 5% berfungsi sebagai katalisator yaitu mempercepat terjadinya reaksi, pada percobaan ini untuk mempercepat ternbentuknya albumin dari Ba(OH)2. Selain itu tujuan didiamkannya larutan agar terjadi endapan albumin secara sempurna. Selanjutnya larutan disentrifuge selama 10 menit agar terbentuk endapan albumin secara sempurna, dan dihasilkan larutan jernih dan pada larutan tetap terdapat endapan berwarna hijau kecoklatan. Larutan sample tidak dapat menunjukkan bahwa filtrate bebas protein dengan begitu saja. Kemudian dilakukan dekantasi pada larutan tersebut sehingga diperoleh filtrat darah bebas protein tak berwarna yang kemudian diuji dengan menambahkan 2 tetes biuret (biru jernih), dan hasilnya tetap tidak terjadi perubahan warna, hal ini menunjukkan bahwa filtrate tersebut benar – benar bebas protein. 2. Penentuan Kadar Glukosa Darah
Pada percobaan kedua ini bertujuan untuk menentukan kadar glukosa darah yang terdapat pada filtrate sampel yang sudah bebas protein dari percobaan pertama diatas. Pada penentuan kadar glukosa darah yang dilakukan adalah mengambil 1 mL filtrate (setelah diencerkan terlebih dahulu) dimasukkan dalam tabung reaksi, ditambah 1.0 mL pereaksi Cu alkalis (berwarna biru jernih) larutan menjadi berwarna biru jernih. Penambahan Cu alkalis disini berfungsi sebagai pereduksi glukosa dalam sampel. Kemudian tabung reaksi tersebut dimasukkan kedalam gelas kimia yang berisi air mendidih selama 20 menit, hal ini bertujuan untuk menambah laju reaksi dari Cu alkalis menghasilkan warna yang tetap yaitu biru jernih , setelah didinginkan tidak terjadi perubahan warna. Setelah itu ditambah 1 mL pereaksi arsenomolibdat (kuning jernih) larutan tetap berwarna biru jernih, karena larutan mengandung asam laktat dan ion Cu2+. Hal ini sesuai dengan prinsip uji Tauber yang akan memberikan hasil positif (larutan biru) pada larutan yang mengandung monosakarida (glukosa). Ion kupri (Cu 2+) akan direduksi oleh gula menjadi kupro (Cu+) dan mengendap sebagai Cu 2O (kuprooksida). Penambahan pereaksi arsenomolibdat tersebut bertujuan agar Cu2O dapat larut kembali dan warna larutan berubah menjadi biru tersebut karena
adanya
oksidasi arsenomolibdat.
Selanjutnya
larutan
diukur
absorbansinya dengan spektronik 20. Uji glukosa darah pada praktikum ini menggunakan metode spektofotometri. Spektrometer absorbsi adalah sebuah instrumen untuk mengukur absorbsi/penyerapan cahaya dengan energi (panjang gelombang) tertentu oleh suatu atom/molekul. Dalam praktikum ini pengukuran dilakukan pada panjang gelombang pada panjang gelombang 660 nm, hasil pengukuran menunjukkan bahwa absorbansi glukosa yang diperoleh dari filtrat adalah 0.595. 3. Pembuatan Kurva Standar
Pada percobaan ini bertujuan untuk membuat kurva standar. Untuk membuat kurva standar tahap pertama yang harus dilakukan yaitu membuat larutan standart. Larutan standart dibuat dengan cara larutan glukosa 0,05 mg/mL. untuk larutan standart 0,1 mg/mL dibutuhkan 5 mL larutan glukosa 0,2 mg/mL yang diencerkan dengan aquades sampai volume 25 mL. Selanjutnya untuk membuat larutan glukosa 0,3 mg/mL; 4 mg/mL; 5 mg/mL; 0,002 mg/mL digunakan rumus pengenceran: M1 x V1 = M2 x V2 Setelah pengenceran, masing-masing larutan standar yang telah dibuat dipipet 1 mL dan diletakkan pada masing – masing lima tabung reaksi yang berbeda. Kemudian ditambahkan 1 mL Cu alkalis pada masing-masing tabung dan dihasilkan larutan yang berwarna biru jernih. Penambahan Cu Alkalis mengakibatkan ion kupri (Cu 2+) akan direduksi oleh glukosa menjadi kupro (Cu+) dan mengendap sebagai Cu 2O (kuprooksida). Setelah ditambahkan Cu Alkalis, tabung reaksi dipanaskan kedalam gelas kimia yang berisi air mendidih selama 20 menit. Pemanasan ini bertujuan untuk menambah laju reaksi oleh Cu alkalis, kemudian didinginkan. Setelah itu ditambahkan 1 mL pereaksi arsenomolibdat sehingga larutan berwarna biru jernih. Lalu larutan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 660 nm, Absorbansi yang didapat adalah sebagai berikut: Glukosa 0,1 = 0.220 (biru) ; Glukosa 0,2 = 0.394 (merah bata ++); Glukosa 0,3 = 0.329 (merah bata +) ;Glukosa 0,4 = 0.288 (biru); Glukosa 0,5 = 0.248 (biru). Berdasarkan absorbansi yang didapat pada masing-masing larutan standart, dapat diperoleh nilai konsentrasi dan absorbansi yang dibuat kurva kalibrasi,
konsentrasi
absorbansi
0.1
0.22
0.2
0.394
0.3
0.329
0.4
0.288
0.5
0.248
Sehingga diperoleh kurva kalibrasi sebagai berikut :
Pada perubahan warna larutan dari 5 tabung reaksi berbeda, pada tabung 1, 4 dan 5 tidak terjadi perubahan warna saat dipanaskan dalam gelas kimia yang berisi air mendidih selama 20 menit. Seharusnya terjadi perubahan warna menjadi merah bata. Warna merah bata ini menandakan bahwa Cu2+ telah diendapkan dalam bentuk Cu2O. Karena glukosa merupakan senyawa karbohidrat yang memiliki gugus hemiasetal, bila didalam air akan berada dalam kesetimbangan dengan bentuk aldehida atau atau keto. Pada percobaan yang telah kami lakukan endapan merah bata tidak terbentuk. Hal ini disebabkan oleh beberapa factor, diantaranya yaitu oleh karena sampel filtrate darah yang tidak diencerkan terlebih dahulu sebelumnya, dan juga selain itu dalam pengenceran pada setiap tabung reaksi untuk percobaan ini terjadi kesalahan juga yaitu kesalahan pada teknik dalam pengenceran dan kesalahan terse but menyebabkan nilai absorbansinya pada saat dibaca oleh UV-Vis tidak sesuai dengan teori dari
Lambert Beer yaitu bahwa semakin besar konsentrasi suatu zat maka nilai absorbansinya juga besar. Sehingga diperoleh persamaan regresinya adalah y = -0.05x + 0.310 dengan R 2 = 0.013, dari kelinieritasan sangat jauh dari seharusnya yaitu mendekati 1. 4. Pembuatan larutan blanko Larutan blanko dibuat sebagai larutan standar dimana dari larutan blanko ini dapat diperoleh nilai absorbansi yang sebenarnya tanpa ada partikel – partikel lain didalam larutan tersebut. Pertama – tama dipipet 1 mL aquades dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 1 mL larutan Cu alkalis (biru jernih) dan larutan menjadi berwarna biru keruh. Kemudian larutan dimasukkan ke dalam air mendidih selama 20 menit, dimana semua perlakuan sama dengan percobaan sebelumnya dan fungsi atau tujuan dari perlakuanpun masih sama, lalu larutan didinginkan. Selanjutnya ditambahkan 1 mL pereaksi arsenomolibdat yang berwarna kuning jernih. Kemudian larutan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 660 nm, dan hasil absorbansi yang didapat dari larutan blanko sebesar 0.169. Konsentrasi sampel : -5.682 diperoleh nilai negatif hal ini disebabkan karena kesalahan dalam pembuatan larutan, alat yang digunakan bukan alat kuantitatif sehingga konsentrasinya berpengaruh X.
DISKUSI Pada percobaan ketiga yaitu pada pembuatan kurva standar terjadi
kesalahan, sehingga hasil yang kami dapatkan tidak sesuai dengan teori. Pada tabung 1, 4 dan 5 tidak terjadi perubahan warna pada saat pemanasan seharusnya terjadi perubahan warna yaitu dari larutan biru jernih dan berubah menjadi warna merah bata hal ini disebabkan karena kesalahan teknik dalam pengenceran, yaitu pada waktu mengambil sample atau mengukur sample yang akan diuji seharusnya menggunakan alat-alat yang untuk kualitatif misalnya saja untuk mengambil larutan yaitu menggunakan pipet ukur bukan dengan gelas ukur. Selain itu kemungkinan salah dalam pengambilan sampel yaitu mungkin karena kecerobohan kami menggunakan sample yang mungkin mirip akan tetapi memiliki perbedaan seperti konsentrasinya misalnya. XI.
KESIMPULAN
Berdasarkan percobaan yang kami lakukan dapat disimpulkan bahwa : 1. Filtrat darah yang digunakan dalam sampel telah bebas dari protein yang ditandai oleh pengujian biuret menghasilkan warna larutan yang tidak berwarna. 2. Kadar sampel filtrat darah bebas protein dihasilkan sebesar -5.7 mg/ml dengan nilai absorbasi sampel tersebut adalah 0.595. 3. Dengan pembuatan kurva larutan standar menghasilkan persamaan regresi : y = -0.05x + 0.310 4. Larutan blanko dihasilkan nilai absorbansi sebasar 0.169.
XII.
JAWABAN PERTANYAAN 1. Tentukan kadar glukosa darah dalam mg glukosa / 100 ml darah. Jawab: Dari persamaan regresi yang didapatkan : y = 0.0852x + 0.006 dengan y dimisalkan nilai absorbansi sampel = 0.595 sehingga, y
= -0.05x + 0.310
0.595 = -0.05x + 0.310 0.595 – 0.310 = -0.05x 0.285 = -0.05x x
= -5.7 mg/ml
2. Apa fungsi proses pendidihan pada percobaan diatas ? Jelaskan. Jawab: Proses pendidihan berfungsi untuk mempercepat laju reaksi oleh Cu-Alkalis
3. Jelaskan peranan hormon insulin dalam proses pengaturan kadar glukosa darah. Jawab: Hormon insulin berperan penting dalam terjadinya proses perpindahan glukosa dari darah ke dalam sel tubuh . Di dalam sel tubuh glukosa kemudian dimetabolismekan, sehingga menghasilkan kalori (energi). Menurunnya efektivitas hormon insulin mengakibatkan menurunnya pula kadar glukosa yang masuk ke dalam sel. Akibatnya, sel tubuh kekurangan glukosa dan berusaha mendapatkan kalori dari pemecahan lemak. Pemecahan lemak akan menghasilkan keton yang dapat mengakibatkan terjadinya ketoasidosis.
XIII.
DAFTAR PUSTAKA
Anonim (http://www.id.wikipedia.org/wiki/Gula-Pereduksi) , diakses pada tanggal 2 oktober 2012, jam 21:50 Huda, Nurul. 2001. Pemeriksaan Kinerja Spektofotometer UV-vis GBC 911A Menggunakan
Pewarna
Tartrazine
Cl
19140
(online
:
http://www.digilib.batan.go.id/ejournal/artikel/sigma-epsilon/vol 2021 februari-maret 01/Nurul Huda.pdf Laila Rusda, Qori. 2010. Dalam Penentuan Kadar Glukosa Darah. (online
:
www.scribd.com/doc/41273300/Dalam-Penentuan-Kadar-GlukosaDarah), diakses pada tanggal 02-10-2012, jam 21:44 Lehninger, Albert L.1982.Dasar-dasar Biokimia (jilid 1). Jakarta : Penerbit Erlangga. Tim Dosen Biokimia. 2012. Petunjuk Praktikum Biokimia. Surabaa : Unesa Press.
