REPRODUCCIÓN IN VITRO DEL ERIZO DE MAR El erizo de mar Tetrapygus niger es muy utilizado en estudios reproductivos ya que es fácil obtener sus gametos y realizar fecundaciones, además las etapas de desarrollo pueden ser identificadas claramente. A través de esta actividad los alumnos pueden realizar una fecundación in vitro del erizo de mar y observar las diferentes fases del desarrollo hasta llegar a la “larva pluteus”.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS Se espera que los alumnos y alumnas: conozcan una de las técnicas utilizadas para la obtención de gametos en el erizo de mar. Realicen el proceso de fecundación en esta especie marina, aplicando técnicas de fecundación in vitro. Sean capaces de identificar tanto los gametos como los diferentes estados del desarrollo embrionario en esta especie. Comprendan cómo afecta la intervención humana a la reproducción del erizo y la asocien a los efectos que se producen en la reproducción de otros organismo marinos. •
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SUGERENCIAS METODOLÓGICAS Para esta actividad se requieren erizos (los negros son más fáciles de conseguir), esta especie vive en la parte más baja del intermareal rocoso. Puedes organizar una salida a terreno para su colecta, siguiendo las indicaciones explicadas en otras guías para el trabajo con marea baja, la otra opción es encargar 15 erizos negros en una caleta de pescadores o en el terminal pesquero. (Los erizos deben ser de tamaños superiores a los 6 cm de diámetro) El KCl se prepara siguiendo los siguientes pasos: 1.- Depositar 37.3 gramos de KCl en un matraz de aforo. 2.- Agregar agua destilada hasta completar un litro. 3.- Mezclar. (para preparar 100 ml. de solución se requieren 3.73 gr. de KCl) Otro aspecto importante a considerar es que el agua de mar debe estar lo mas limpia posible, sería ideal
un proceso de filtración, filtración, sin embargo embargo lo que se puede realizar es mantener el agua durante un par de días en un recipiente sin moverla para decantar toda la materia en suspención, luego trasladarla a otro recipiente con mucho cuidado. Es aconsejable también realizar una esterilización del agua, este proceso puede ser sencillo, podrías mantener a "Baño María" un recipiente con el agua de mar, durante 45 minutos a temperatura de 100ºC. De esta manera se evita la contaminación del agua durante el desarrollo embrionario. Es importante la disposición de los microscopios en tu establecimiento, debido a que es una experiencia básicamente de observación es ideal que los alumnos y alumnas tengan suficiente tiempo para observar cada muestra. Los grupos ojalá sean de dos personas, en caso contrario puede dividir al curso y realizar la experiencia en días diferentes. Por último la actividad implica que los alumnos deben observar el desarrollo del erizo durante varios días y a diferentes intervalos de tiempo, por tanto es bueno asegurarse que observen las muestras en los tiempos correspondientes. CONTENIDOS: Los estudios en erizos de mar proporcionan información sobre la fecundación y el desarrollo embrionario, siendo un modelo de desarrollo del embrión. El tamaño de los gametos en erizo es muy similar al de los gametos humanos. ¿Qué es la fecundación? Es la unión de dos gametos distintos espermatozoide (masculino) y ovocito (femenino) respectivamente, seguida de la unión de los pronúcleos de ambos gametos.
UN MAR DE COSAS POR EXPLORAR - PROYECTO EXPLORA ED5/00/015
REPRODUCCIÓN IN VITRO DEL ERIZO DE MAR Gónadas en el erizo de mar Los Echinoideos (erizos de mar), son todos diocos, es decir tienen sexos separados. Por lo general, existen cinco gónadas dispuestas en el lado interno del caparazón. De cada una parte un conducto denominado gonoducto que se abre por un orificio llamado gonoporo localizado en la zona aboral (parte superior del erizo). Obtención de gametos Existen diversas técnicas a través de las cuales se pueden obtener los gametos en un organismo vivo. Consisten básicamente en estímulos que se aplican al animal en todo el cuerpo o en sectores localizados con el fin de alterar sus gónadas e inducir la liberación de los gametos. Existen tres métodos empleados: Estímulo Químico, Estímulo Físico y Estímulo Eléctrico. El estímulo químico consiste en la aplicación de un compuesto químico o reactivo en el individuo, el cual actúa directamente sobre las gónadas induciendo la salida de los gametos. El estímulo físico de basa en la aplicación de un agente físico sobre el individuo como "shocks" térmicos, salinos o estimulación por masajes, como en el caso de los peces. El estímulo eléctrico consiste en aplicar pequeños golpes de electricidad de bajo voltaje, lo que cambia la polaridad de las membranas de las gónadas, permitiendo con ello la salida de los gametos. Esta técnica es usada generalmente en camarones.
plasmática del ovocito con la membrana interna del acrosoma. Luego se forma una capa de fecundación , la que evita la poliespermía. Posteriormente el espermatozoide penetra hacia el interior del ovocito para terminar en la fusión de ambos pronúcleos. Desarrollo embrionario Luego de la fecundación, la fusión de ambos gametos forman una única célula denominada zigoto , con el cual se recupera el número inicial de cromosomas del individuo. Con esto se gatilla el inicio de la segmentación, proceso por el cual, a partir de una célula única, se suceden una serie de divisiones mitóticas hasta llegar al estado de blástula. La segmentación se inicia con la división del núcleo, quedando la célula huevo dividida en dos células hijas denominadas blastómeros , cada una de la cuales se divide para en total 4 células y de esta manera el aumento de blastómeros crece en forma geométrica. En esta etapa los blastómeros permanecen unidos dando al cigoto el aspecto de una mora (Estado de Mórula ). ESTADOS DE DESARROLLO EN EL ERIZO DE MAR
HUEVO FECUNDADO 90-110 min
DOS BLASTOMEROS 2,5 h
Fecundación en organismos marinos El proceso de la fecundación comienza con la interacción del espermatozoide con el ovocito maduro. La primera interacción consiste en el contacto del espermatozoide con la cubierta más externa del ovocito, esto desencadena una serie de reacciones, entre ellas la reacción del espermatozoide, lo que permite finalmente la incorporación y dispersión del material genético al interior del ovocito. En los erizos la primera interacción de los gametos ocurre en la cubierta de gelatina externa del ovocito. Esta cubierta posee receptores especie-específicos, que interactúan con los receptores de la membrana celular de los espermatozoides, gateando la reacción del acrosoma . Con esto se desencadena una serie de eventos que llevan a la fusión de la membrana
G10-2
4 BLASTOMEROS
32 BLASTOMEROS
GASTRULA 48 h
8 BLASTOMEROS
64 BLASTOMEROS
PLUTEUS 3 dias
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16 BLASTOMEROS
BLASTULA 24 h
PLUTEUS 5 dias
REPRODUCCIÓN IN VITRO DEL ERIZO DE MAR Tras cada división los blastómeros son más pequeños. La Blástula, el último estado de segmentación, en el cual podemos encontrar 64 blastómeros formando una capa externa de células compactas entre sí (blastodermo ) y con una gran cavidad interna (blastocele ) convirtiendo al embrión en una especie de esfera hueca. La siguiente fase es la Gastrulación , en la cual el blastodermo da origen a las capas germinales, el estado resultante se llama gástrula . Posteriormente la gástrula pasa a formar la larva, en este caso denominada “larva pluteus”. Esta posee boca, ano y tubo digestivo, su forma es cónica y caracterizada por la presencia de 4 brazos o espinas. En la Figura anexo al final de esta guía se puede apreciar el desarrollo embrionario del erizo y los tiempos en que se produce cada estado. DESARROLLO DE LAS ACTIVIDADES Actividad 1: El erizo de mar y su morfología. El objetivo de esta actividad es que el alumno logre diferenciar las partes de un erizo. Materiales: sólo se necesita papel, lápiz, una bandeja y un erizo por grupo. Sugerencia: se debe instar a observar detalladamente ambos extremos, “oral y aboral”, debido a que posteriormente la inyección del KCl se realizará por el lado oral y la evacuación de los gametos por el lado aboral. Quizás algunos alumnos o alumnas puedan presentar cierto temores, es importante recalcar que el erizo es un animal inofensivo, sus espinas no poseen ningún tipo de veneno y además es un organismo herbívoro por lo que su alimentación es a base de algas.
en sí mismo no es peligroso, siendo el ingrediente principal en formulaciones substitutas de la sal, la inyección en una vena o una arteria puede causar un desequilibrio eléctrico en el corazón o en el cerebro dando por resultado la muerte. Se debe inyectar en la cavidad del cuerpo del erizo y no en la boca. Luego se sacude suavemente el erizo para mezclar la solución de KCl dentro de él. En esta etapa como no sabemos el sexo del erizo se debe esperar la salida de los gametos, depositando los animales en la bandeja, una vez comenzada la salida de gametos, de acuerdo a la coloración se separan, y se depositan en un vaso o cápsula de Petri con la parte aboral hacia abajo. Cabe mencionar que la coloración de los gametos es roja para las hembras y blanco para los machos. Actividad 3: Observando los gametos. El objetivo de esta actividad es que los alumnos logren observar y diferenciar los gametos masculinos y femeninos del erizo. Materiales: se requiere de lápiz, papel, dos cubreobjetos, dos portaobjetos, una cápsula de Petri y dos pipetas Pasteur. Sugerencia: se debe poner énfasis en la dilución de los espermatozoides, ya que es tan alta la concentración que al no realizar una dilución sería imposible su observación. En la siguiente figura se puede ver un esquema con la forma de los espermatozoides. 5 micrones
ERIZO DE MAR
Acrosoma
Núcleo
Mitocondra
Flagelo
Actividad 2: Obtención de gametos. El objetivo de esta actividad es que los alumnos y alumnas conozcan la técnica mediante la cual se obtienen los gametos en el erizo de mar. Materiales: Cada grupo necesita una bandeja, una cápsula de Petri, un vaso precipitado, solución de KCl 0,5M y un erizo. Sugerencias: Al comenzar esta actividad puedes comentarle que existen otras técnicas utilizadas por científicos, tal como se menciona más arriba. Es importante recalcar que la aplicación del KCl debe realizarse con mucho cuidado, aunque este reactivo
HUMANO
Actividad 4: La fecundación. El objetivo de esta actividad es observar el proceso de la fecundación.
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G10-3
REPRODUCCIÓN IN VITRO DEL ERIZO DE MAR Materiales: por grupo se requiere: dos vasos precipitados de 200 ml., 500 ml. de agua de mar, 2 pipetas Pasteur, un portaobjetos y un cubreobjetos. Sugerencia: es importante destacar que por ser un proceso de fecundación externa, las especies presentan algunos mecanismos para reconocer los gametos de la misma especie, en este caso los ovocitos, poseen una capa de gelatina que reconoce e interactúa sólo con los espermatozoides de erizos negros. Sin embargo, puedes comentar algunos casos de fecundación interespecies, como el de asnos y yeguas, dando origen a las mulas. Sin embargo estas especies son híbridos incapaces de reproducirse. Una vez realizada la experiencia, los alumnos podrían apreciar la denominada corona de espermios , esto es, varios espermatozoides rodeando al ovocito. Actividad 5: Desarrollo embrionario. El objetivo de esta actividad es observar los diferentes estados de desarrollo de un erizo de mar, desde la primera división hasta la fase de “Larva Pluteus”. Materiales: por grupo se requiere: un vaso precipitado de 200 ml. un portaobjetos, un cubreobjetos y una pipeta Pasteur. En esta etapa, se requiere la observación en diferentes lapsos de tiempos, incluso, puedes realizar fecundaciones algunas horas antes del laboratorio, para que los alumnos logren apreciar las primeras divisiones, lo que da pie para comentar la importancia de la mitosis y meiosis en estos procesos.
detergentes u otros agentes contaminantes, para relacionarlos con el efecto del hombre y la contaminación en la reproducción de organismos marinos. En este caso sería interesante observar el desarrollo embrionario completo, en algunos casos, las larvas presentarían cierto nivel de deformaciones, comparadas con las obtenidas en el proceso de fecundación in vitro realizada en la actividad 4y 5. Con las observaciones se puede solicitar la realización de maquetas (plasticina) o esquemas con los diferentes estados de desarrollo observados. FUENTES DE INFORMACIÓN Direcciones Internet
Información erizos http://icarito.tercera.cl/especiales/mes_del_mar/rec ursos/mariscos/erizos.htm http://marenostrum.org/vidamarina/animalia/invert ebrados/equinodermos/equinodermos.htm Información completa sobre las reproducción en erizo de mar, imágenes, gráficos, animaciones 3D, materiales, métodos, etc. http://www.stanford.edu/group/Urchin/contents.html
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD Se espera que los estudiantes observen todas las fases del desarrollo, para lo cual se podría solicitar un informe con los diferentes estados, también es importante recoger sus opiniones en cuanto al trabajo desarrollado, realizando preguntas sobre la actividad. Se puede también realizar una discusión grupal, en la que se toquen diferentes aspectos relacionados con la fecundación, como, la reproducción entre especies diferentes, inseminaciones artificiales, etc. CONTINUACIÓN DE LA ACTIVIDAD Se sugiere algunos trabajos al final de la guía del estudiante, como la observación de la movilidad de los espermios en medios con diferentes niveles de acidez o en presencia de
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