FACULTAD FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES EXACTAS Y DE LA EDUCACIÓN DEPARTAMENTO DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA BIOLOG ÍA
Prácticas de Laboratorio de Biología Molecular
Guía No. 2
UNIVERSIDAD DEL CAUCA
EXTRACCIÓN DE ADN BACTERIANO
INTRODUCCIÓN Cuando los científcos comprendieron la estructura de la molécula de ADN y como como la inor inormac mación ión que lleva lleva se traduc traduce e en uncio unciones nes y carac caracter teríst ística icas, s, come comenz nzar aron on a dise diseña ñarr técn técnic icas as de labo labora rato tori rio o para para aisl aislar arlo lo,, anal analiz izar arlo lo,, modifcarlo y asta transerirlo de un or!anismo a otro" Actua Actualme lmente nte e#ist e#isten en numero numerosos sos proto protoco colos los para para e#tra e#traer er ADN ADN a partir partir de muestra muestras s de diere dierentes ntes or!an or!anism ismos os vivos, vivos, ya sean sean ve!eta ve!etales les,, animal animales es o microor!anismos, microor!anismos, siendo el ob$etivo ob$etivo principal obtener una preparación preparación de ADN de buena calidad y en !ran cantidad" %a calidad se refere a la posibilidad de alma almace cena narr el ADN ADN por por tiem tiempo po inde indefn fnid ido, o, mant manten enie iend ndo o su estr estruc uctur tura a y propiedades y es la calidad del ADN el actor responsable de la reproducibilidad en e#pe e#peri rime ment ntos os post posteri erior ores es"" %a cant cantid idad ad es un conc concep epto to rela relati tivo vo que que depende, del n&mero y estado de las células propias propias del te$ido a estudiar" estudiar" 'or lo tanto, como re!la !eneral, un buen método de e#tracción debe mantener la inte!ridad ísica y bioquímica del ADN e incrementar sus ran!os de pureza y concentración ()ambroo* et al" +-." %os %os proto protocol colos os de e#trac e#tracció ción n de ADN ADN emplea emplean n método métodos s ísico ísicos, s, químic químicos os y mec/ mec/ni nico cos s que que invo involu lucr cran an b/si b/sica came ment nte e tres tres paso pasos0 s0 -" %isi %isis s celu celula larr +" 1liminación de proteínas 2" 'recipitación y limpieza del ADN" 1s muy impo import rtan ante te tene tenerr en cuen cuenta ta que que el trab traba$ a$o o de biol biolo! o!ía ía mole molecu cula larr requiere de una serie de precauciones para no contaminar las muestras con /cidos /cidos nuclei nucleico cos s e#tra e#traños ños"" 1s necesa necesario rio limpia limpiarr las /reas /reas de traba$ traba$o o con con solventes como el /cido clorídrico (-3., sosa (Na45, "6 N. y7o etanol (83." 9ambién 9ambién ay que utilizar !uantes para protección personal y para evitar cont contam amin inar ar las las mues muestra tras, s, así así como como traba traba$a $arr con con mate materi rial ales es y solu soluci cion ones es estériles" )e recomienda traba$ar en una campana de :u$o laminar y si es posible, someter el material a radiación ultravioleta de 6 a - minutos para de!radar cualquier /cido nucleico presente"
OBJETIVO
Comprender los procedimientos necesarios para e#traer ADN de buena calidad y cantidad"
MATERIALES
;ue!o de micropipetas (+<+u%, de +<+u% y de -<-ul . =año de >aría A!itador ?ecipiente para ielo Centriu!a para tubos de -,6 ml, que alcance -@ rpm Con!elador (<+C. 9ubos 9ubos ependorB de -,6ml -,6ml uantes de l/te# 9oallas 9oallas de papel papel
Cantidad 6 -
REACTIVOS 9ris<5C% 9ris<5C% -> p5, 1D9A ,6> p5, )D) - 3 NaCl 6> Acetato de sodio 2> p5 6,+ 1tanol !rado biolo!ía molecular =uBer 91 ?Nasa 'roteinasa E
Cantidad - m% 6 m% 6 m% 6 m% - m% 6 m% 6 m%
PROCEDIMIENTO -" 4bte 4btene nerr un culti cultivo vo de bacte bacteri rias as Escherichia coli de - oras de incubación en caldo nutritivo" +" 1n un micro microtub tubo o a!re!a a!re!arr -"6 ml del del cultiv cultivo o bacter bacterian iano o con ayuda ayuda de una una micropipeta" 2" Centri Centriu! u!ar ar a -+ -+ rpm rpm por por 2 minutos minutos @" 1liminar 1liminar el sobrenadant sobrenadante e perectamente perectamente escurrie escurriendo ndo las muestras muestras en papel secante" 6" ?esuspen ?esuspender der en + Fl de buBer buBer de lisis lisis (@ m> de 9ris<5C 9ris<5Cll p5 8,, + m> de acetato de sodio, -m> de 1D9A y - 3 de )D)." G" 'ipet 'ipetear ear vi!o vi!oro rosam sament ente" e" 8" 4pcional0 4pcional0 para inacti inactivar var proteína proteínas s adiciona adicionarr 63 v7v v7v de H y mezclar"
J" Centriu!a Centriu!arr a -+ -+ rpm por por - min a @ C" C" -"9ranserir -"9ranserir el sobrenadante a un nuevo tubo y adicionar un volumen i!ual de cloroormo" --"Knvertir manualmente 6 veces, asta que se orme una solución lecosa" -+"Centriu!ar a -+ rpm durante 2 min" -2"?epetir la e#tracción con cloroormo cloroormo -@"?ecuperar el sobrenadante (apro#" +6 Fl., sin tocar el botón y transerir a un tubo nuevo" -6"Adicionar 2 Fl de etanol absoluto río (a <+ C." -G"Kncubar a <+L C durante 2 min" -8"Centriu!ar a -+ rpm durante 2 min" -"1liminar perectamente el sobrenadante" -J"%imp -J"%impiar iar el botón botón con con 2 Fl de etanol etanol al 83 a!itando a!itando breveme brevemente nte en vórte#" +"Centriu!ar a -+ rpm por 2 min" +-"1liminar perectamente el sobrenadante" ++")ecar perectamente el botón a G6 C por 6 min" +2"?esuspender en 6 a -Fl de a!ua pura, desionizada y estéril ó buBer 91 (9ris - m> I 1D9A - m>." 1l ADN que a sido e#traído de un te$ido debe ser cuantifcado y su calidad verifcada" 1l método m/s empleado para la determinación simult/nea de estas características es la electrooresis en !el de a!arosa" %a cuantifcación también se puede realizar empleando un espectrootómetro, espectrootómetro, el cual detecta la radiación emitida por las bases nitro!enadas presentes en el ADN lue!o de ser e#citadas con luz de +G nm" De i!ual manera se puede emplear un :uorómetro, el cual cuantifca la emisión de ener!ía de los compuestos químicos (:uorocromos. que se intercalan dentro del ADN"
BIBLIOGRAFÍA ?oca oca<) <)al alav avar arri riet eta a '" (+ (++. +."" 9eorí eoría a y pr/c pr/cti tica ca para para la e#tr e#trac acci ción ón y purifcación del ADN de palma de aceite" 'almas Mol" Mol" +2(2.0 J<-8" )ambroo*, ;" and D" ?ussell" +-" >olecular Clonin!0 A %aboratory >anual, 2rd edition" Cold )prin! 5arbor 5ar bor %aboratory %aborat ory 'ress" Cold )prin! 5arbor, 5arb or, NO"
