Lesiones y Reparación del ADN
Lesión (alteración química en el ADN)
=/
Mutación (Modificación en la secuencia del ADN)
Mutación: Cambio en la secuencia nucleotídica de una región corta de un genoma. Se producen por errores de la replicación del ADN o por acción de mutágenos (agentes químicos y radiación). Deficiencia en la reparación del ADN. Tipos de mutaciones: Puntuales (transiciones y transv t ransversiones). ersiones). Inserciones Deleciones Efectos de las mutaciones: Letales o no letales. Organismos unicelulares o multicelulares. Reparación de las mutaciones: Prereplica Prereplicativa tiva o posreplicativ posreplicativa. a.
Categoría de mutaciones Espontánea vs inducida
Somática vs germinal
Tipos de mutaciones Cambios a nivel de un nucleótido (puntuales) en el ADN:
Sustitución de bases
Inserciones y deleciones Inserción:
Deleción:
+ A-T
- G-C
TGGTCGTAT
TGGTC AGTAT
ACCAGCATA
ACCAG TCATA ACCAGT
TGGTCG TGGTC GTAT
TGGTCTAT
ACCAGC ACCAG CATA
ACCAGATA
Tipos de mutaciones
Alteraciones Alter aciones químicas producidas en las bases nitrogenadas
Agentes alquilantes: metilmetano sulfonato (mutágeno químico), añade grupos alquilo a las bases nucleotídicas. El efecto depende de la posición en la que es modificado el nucleótido.
Las radiaciones ionizantes Producen diversos efectos que dependen del tipo de radiación y de su intensidad. Pueden actuar de forma indirecta al estimular la formación de moléculas reactivas, como peróxidos en las células. Acción de los radicales libres sobre el DNA DNA
GC
TA
Desaminación del ADN: la eliminación del grupo amino ocurre espontáneamente a baja frecuencia, que puede ser aumentada por agentes químicos químicos (ácido nitroso: desamina A, C, G, T no tiene tiene grupo amino). Bisulfito de sodio: desamina C. La pérdida también puede ser espontanea dependiente de temperatura y pH.
CG UA TA
A Grupos amino C exocíclicos G
Transición C Transición T 100 a 500 eventos por célula en un día
Mutaciones causadas por mutágenos químicos Análogos de bases. Son bases púricas y pirimidínicas que presentan similitud a las bases convencionales y se incorporan erróneamente como sustratos durante la síntesis de ADN.
5-bromouracilo : análogo análogo a la timina, pero se aparea con Guanina además además de Adenina cuando existe en la forma enol (hacia donde está est á favorecido el equilibrio entre sus tautómeros).
Efecto mutágeno del 5-bromouracilo
Es un análogo de Timina; se aparea con Adenina, pero su tautómero lo hace con Guanina. Resultado: transición T-A CG durante la replicación.
Efecto mutágeno de la 2-aminopurina:es un análogo de Adenina; se aparea con Timina, pero su tautómero lo hace con Citosina. Resultado: transición T-C durante la replicación.
Pérdida de bases La despurinización (pérdida espontánea de purinas) del DNA puede verse favorecida por acción de la temperatura. El calor estimula la degradación inducida por agua del enlace b- N -glucosídico, -glucosídico, que une la base al componente hidrocarbonado del nucleótido. Esto sucede más a menudo con las purinas que con las pirimidinas, creando un sitio AP (apurínico/apirimidínico) o sitios sin bases. Una célula de mamífero pierde entre 2.000 2.000 a 10.000 purinas purinas cada cada 20 h a 37ºC. En general los sitios apurínicos son reparados, pero si permanecen se producen mutaciones durante la replicación.
Ruptura del enlace glicocídico entre la base y la desoxirribosa. Se pierde G o A.
Agentes intercalantes: Por lo general se asocian con mutaciones de inserción. Son moléculas planas que se intercalan en el ADN, aumentando la distancia entre los pares de bases adyacentes.
Radiación UV: Induce dimerización de bases pirimidínicas adyacentes, sobre todo si ambas son Timinas, originando un dímero de ciclobutilo. También se forman dímeros 5´ 5 ´CT3 CT3´´; 5´TC3 TC3´´; y 5´CC3 CC3´´ en orden de frecuencia decreciente). Los dímeros de purina son mucho menos comunes. Por lo general se producen deleciones cuando se copia la cadena modificada.
Cuando los daños no son reparados, se pueden gener generar ar cambios en las secuencia de las bases duran durante te la replicación, produciendo una mutación.
REPARACIÓN •Corrección directa del DNA dañado. •Eliminación de la región dañada del DNA y relleno con DNA recién sintetizado.
Sistemas de Reparación del ADN Reparación directa DNA fotoliasa: revierte los dimeros de timina - fotorreactivación Transferasas Transfera sas de grupos alquilo: eliminan los grupos alquilo generados por mutágenos (metanosulfonato de etilo, nitrosoguanidina) Escisión de la región dañada • Escisión de la región dañada seguida de reemplazamiento preciso -Escisión de base -Escisión de nucleótidos
•
Reparación de errores de replicación - Desapareamientos (“ mismatch repair ”) (“mismatch ”) - Translesión (“ (“by-pass by-pass”) ”)
•
Reparación de roturas de doble cadena - Unión de extremos no-homólogos
Reparación directa
Reparación directa
Reparación por escisión Etapas principales • Reconocer la lesión • Eliminar la lesión escindiendo parte de una de las hebras • Nueva síntesis para llenar el hueco • Sellar la mella para restablecer la continuidad del DNA
Reparación por escisión de base
Reparación por escisión de nucleótido
• Una glucosilasa elimina la base, deja la cadena intacta
• Un corte doble elimina la lesión, se elimina un oligonucleótido
• La AP endonucleasa corta la cadena, la AP AP liasa elimina el azúcar
(12-13 nucleótidos en E. Coli , 27-29 en humanos)
• La DNA polimerasa rellena el hueco
• La DNA polimerasa rellena el hueco
• La DNA ligasa sella la mella
• La DNA ligasa sella la mella
Reparación por escisión de base
El sistema de reparación G
Despurinación de G
por escisión de base también repara los daños en el DNA producidos por despurinación de bases, a partir de AP endonucleasa
Reparación por escisión de nucleótido
Este sistema de reparación actúa sobre una gran variedad de lesiones • Dímeros de pirimidina • Modificaciones químicas con carcinógenos: benzopireno, aflatoxina y con agentes quimioteráp quimioterápicos icos como cisplatino • Bases desapareadas y pequeños lazos del DNA
Es el sistema de reparación más genérico y flexible
Este sistema, en E. Coli consta de 4 componentes
Función
Componente
Escaneo DNA
UvrA
Nucleasa: ESCINUCLEASA
UvrB, UvrC
Helicasa
UvrD
Sistema de replicación
DNApol I/DNApol II; ligasa
Reparación por escisión de nucleótido
Fig 9-16 .- Biología Molecular del Gen 5ª ed., Watson y col.
Proteína de reconocimiento del daño
Alteración en la estructura del ADN producida por un dímero de Timina
Reparación por escisión de nucleótido
Comparación entre E. Coli y en humanos Función
E. Coli
Humanos
Escaneo DNA
UvrA
XPA, XPA, XPC; RP RPA A
Nucleasa: ESCINUCLEASA
UvrB, UvrC
XPF, XPF, XPG
Helicasa
UvrD
XPB, XPD
Sistema de replicación
DNApol I/DNApol II;
DNApol d / e; ligasa
ligasa
Reparación por escisión de nucleótido en humanos Gen humano
Función de la proteína
XPA XPA
Proteína Proteín a de reconocimiento reconoci miento del daño (interacción con DNA lesionado)
XPB
DNA helicasa, subunidad de TFIIH
XPC
Reconocimiento inicial de la lesión. Interacción con TFIIH
XPD
DNA helicasa, subunidad de TFIIH
XPF
Actividad nucleasa (5’lesión)
XPG
Actividad nucleasa (3’ lesión) lesión)
ERCC1
Unión a XPF y a proteína proteí na RP RPA A
RPA RP A
Unión al complejo XPF-ERCC1 XPF-ERCC 1 (reconocimiento de lesión junto a XPA)
Reparación por escisión de nucleótido en humanos Reparación global de genoma • El heterodímero XPC – hHR23B localiza lesiones que distorsionan a la doble hélice.
Reparación por escisión de nucleótido en humanos Este sistema de reparación también repara lesiones durante la transcripción. En este caso (Reparación acoplada a la transcripción), es la RNA polimerasa (No XPC – hHR23B ) quien identifica el daño en el ADN. Se detiene la transcripción
Un tercer sistema de reparación reconoce a las bases no complementarias y pequeños lazos de ADN que se incorporan in corporan durante la replicación que no fueron eliminadas por la DNA polimerasa
Reparación de errores de replicación Reparación de bases desapareadas (“ (“mismatch mismatch repair ”) ”)
Los eucariotas tienen un sistema de reparación similar. El reconocimiento de la cadena recientemente sintetizada se realiza por la presencia de roturas en ambos extremos de los fragmentos de Okazaki, mientras que la hebra conductora se puede identificar por su extremo 3´en crecimiento. Cáncer colorectal hereditario no poliposo (HNPCC) o síndrome sínd rome de Lynch
Consecuencia de un defecto en los mecanismos de reparación de los apareamientos incorrectos Mutaciones en los genes hMSH2y hMLH1 Equivalentes humanos de los genes MutS y MutL de E. coli
Los pequeños lazos de ADN que se incorporan durante la replicación se pueden producir cuando…
Sistemass de reparación inducibles Sistema Se activan cuando hay un daño extenso al DNA. En bacterias es el sistema SOS. Se activa con daño extenso ej. UV La tasa de mutación es más alta después de la reparación por este sistema que si no existiera. Mutantes sin sistema SOS presentan menor tasa de mutación.
Reparación por síntesis de translesión “trans lesion synthesis” (TLS) ¿Qué ocurre si la DNA pol de replicación encuentra una lesión, dímero de T o un sitio AP, que no ha sido reparada? Actúa un mecanismo mecanismo de seguridad seguridad que permite que la la maquinaria de replicación se salte “by “ by – –pass pass”” estos sitios de lesión
Síntesis de transle translesión sión Este sistema es muy propenso a cometer errores, pero evita que un cromosoma se replique de manera incompleta
Reparación Repar ación por síntesis de translesión (TLS) Polimerasas de translesión: Familia Y de DNA polimerasas
E. Coli
• Sintetizan DNA a través del sitio de la lesión • Son dependientes de molde • Incorporan nucleótidos de una manera independiente de apareamiento de bases, por eso cometen errores con frecuencia
Fig 9-18 .- Biología Molecular del Gen 5ª ed., Watson y col.
Reparación de roturas de doble cadena Las roturas de doble cadena son potencialmente potencialmente letales Causas de rotura de doble hebra • Radiaciones ionizantes (rayos g, rayos X) • Especies de oxígeno reactivas • Quimioterápicos (bleomicina)
Se pueden reparar por un mecanismo conocido como reparación recombinatoria Se conocen dos vías principales de reparación recombinatoria:
Recombinación con secuencias homólogas de un cromosoma intacto (Este mecanismo actúa tras la replicación, cuando las cromátidas hermanas aún permanecen unidas). (NHEJ)(alta tasa Reparación mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ)(alta de error)
Reparación Re paración mediante Unión de Extremos No Homólogos (propenso a error) •
Los extremos rotos son alineados y recortados, luego son ligados.
•
Varias proteínas participan en NHEJ:
•
Ku-heterodímero de Ku70 y Ku80
•
DNA ligasa IV
•
Xrcc4
•
Ku se une a los extremos del AND de doble cadena.
•
El “recorte” de nucleótidos se lleva a cabo por el complejo Mre11, dependiente de ATP.
•
Los baches son rellenados por DNA polimerasas y sellados por DNA ligasa IV y Xrcc4.
Reparación Repar ación mediante recombinación con secuencias homólogas Las roturas de cadena simple pueden repararse utilizando la cadena de ADN intacta, utilizandola como dadora de información de secuencia. Las roturas de doble cadena, pueden repararse utilizando la información faltante de otro DNA de doble cadena, que puede provenir de: • cromátidas hermanas, durante la fase S tardía o en G2 del ciclo celular • El cromosoma parental homólogo en organismos diploides • Elementos de secuencias repetidas Using the sister as a template for repair (late S-phase)
Intramolecular information informatio n donor
Intermolecular information donor Homologous chromosome or ectopic sequence repeat
Reparación de Rotura de ADN Reparación de doble cadena mediante Recombinación Homóloga 1.
Los extremos son recortados para generar ADN de cadena simple. Los extremos 3’ invaden a la secuencia homóloga y forman pares de Uniones de Holliday Hol liday..
2.
Sín ínttes esiis de de AD ADN N y li lig gac ació ión n
3.
Resolución de ambas estructuras de Holliday.
Inmunofluorescencia verde (anticuerpos anti histona H2AX fosforilada; inmunofluorescencia roja (anticuerpos anti subunidad catalítica de ADN-PK). La imagen de la derecha muestra la superposición de las otras dos imágenes, apareciendo en amarillo los puntos en los que coincide una señal verde con una roja. Tras la irradiación (que genera muchas roturas bicatenarias en el ADN) de fibroblastos, se crean unos focos de reparación donde se concentran concentran las maquinarias encargadas encargadas de llevar a cabo dicha reparación. Aunque en esta imagen se muestran moléculas que intervienen en la reparación no homóloga de extremos libres, la utilización de anticuerpos frente a componentes del sistema de reparación por recombinación homóloga (RAD51, NBS, etc) da lugar a imágenes similares.
Reparación de roturas de doble cadena mediante recombinación homóloga