Absorcion y Transporte de Nutrientes

Máster de Nutrición Vegetal en Cultivos Hortícolas Intensivos

Módulo II: Absorción Absorción y transporte transporte de nutrientes

MÓDULO 2: ABSORCIÓN Y TRANSPORTE DE NUTRIENTES MINERALES Mª Ángeles Ferrer Ayala Dpto. Ciencia y Tecnología Tecnología Agraria. Área Área Fisiología Vegetal Vegetal ETSIA. Universidad Universidad Politécnica de Cartagena [email protected] Índice del módulo segundo: segundo:

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Introducción.................................. Introducción......................................................... .............................................. .............................................. ........................... 1 Las raíces como como superficies absorbentes absorbentes ........................................... ............................................................ ................. 2 las membranas biológicas ............................................. .................................................................... ...................................... ............... 8 Transporte pasivo y activo...................... activo ............................................. .............................................. .................................... ............. 10 Transporte de solutos a través de la membrana .............................................. ................................................ 16 Proteínas transportadoras transportadoras de membrana....................................... membrana.......................................................... ................... 27 Transporte de iones en la raíz ............................................... ...................................................................... ............................ ..... 48 Absorción foliar de nutrientes................................................. nutrientes......................................................................... ............................ 56 Resumen........................................................... Resumen.................................... .............................................. .............................................. ........................... .... 57 APÉNDICES ............................. .................................................... .............................................. .............................................. .......................... ... 58 Bibliografía ................................................ ....................................................................... ............................................... ................................. ......... 68

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INTRODUCCIÓN

1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.-

A excepción del carbono, las plantas terrestres t errestres toman los componentes esenciales de sus tejidos del suelo. Los elementos elementos minerales entran en la biosfera biosfera sobre todo a través del sistema radicular y, en este sentido, las plantas actúan como verdaderos “mineros” de la corteza terrestre. La absorción mineral de las plantas es un proceso muy efectivo. Ésto se debe a la capacidad de éstas para absorber iones inorgánicos que se encuentran a bajas concentraciones y al gran área superficial de las raíces. Después de su absorción, los elementos minerales son son almacenados, metabolizados metabolizados o transportados transportados vía xilema al resto de la planta. Otros organismos, como bacterias y hongos también participan, junto con las raíces, en la adquisición de nutrientes. Una característica que comparten todas las células vivas es su capacidad para mantener en su interior iones y moléculas notablemente fuera de equilibrio. En gran medida, esta propiedad se debe a las características estructurales y funcionales de la membrana plasmática 1. El plasmalema es algo más que una doble capa lipídica compuesta por distintos fosfolípidos y esteroles: contiene distintos tipos de proteínas, algunas de ellas con una marcada actividad enzimática, a través de las cuales existe un continuo tráfico de iones que permite a las células incorporar y acumular nutrientes, 1

En las células vegetales la membrana plasmática recibe el nombre de plasmalema

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excluir iones o sustancias tóxicas, o intervenir en distintas respuestas a estímulos hormonales o medioambientales. No todos los iones se transportan a través del plasmalema de la misma forma o a través del mismo tipo de proteína. Algunos son transportados y acumulados en condiciones cercanas al equilibrio, otros se transportan y se acumulan muy por encima o muy por debajo de su potencial electroquímico. En este módulo, hablaremos de las propiedades de las raíces que les permiten absorber los nutrientes minerales minerales de manera manera eficaz. A continuación, describiremos describiremos las propiedades de las membranas, los tipos de proteínas transportadoras presentes en el plasmalema y tonoplasto y, finalmente analizaremos varios aspectos de la absorción foliar de nutrientes.

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LAS RAÍCES COMO SUPERFICIES ABSORBENTES

El sistema radical tiene que cumplir normalmente una doble misión: la fijación de la planta al suelo y la absorción de agua agua y sustancias minerales nutritivas. Aunque la capacidad de captar nutrientes viene determinada genéticamente, ésta viene limitada fundamentalmente por la disponibilidad de nutrientes en el suelo. No obstante, el potencial de las plantas para obtener agua y nutrientes depende también de su capacidad para desarrollar el sistema radicular, de forma que la raíz en desarrollo “busque” agua y nutrientes allá donde estén. El contenido de raíces en el suelo alcanza valores sorprendentes; así p. ej., en 1 2 m de suelo de un prado de Lolium perenne, a una profundidad de 70 cm, la masa radicular es de 35 kg, la longitud total de la raíz de 55.5 km y la superficie radicular de 50 m2. Hay que tener en cuenta además, además, que la raíz crece continuamente y su proliferación depende de la disponibilidad de agua y minerales (sobre todo N y P; ver Fig. 2.1.A) en el microentorno que rodea a la raíz, la l a rizosfera. Si existe abundante agua y nutrientes minerales, la planta desarrolla un sistema radicular pequeño (la raíz representa en estas condiciones el 20-50% de la biomasa total de la planta). Si escasea el agua y falta N, el sistema radical que se desarrolla puede representar el 90 % de la biomasa vegetal (Bloom et al., 1993). Para estudiar las raíces en crecimiento bajo el suelo se emplean técnicas especiales (ver Apéndice A: Rizotrones). La forma cilíndrica y filamentosa de las raíces tiene una importancia determinantes para la absorción de agua y solutos del suelo. Un cilindro posee una mayor resistencia por unidad de área transversal que otras formas. Esta configuración junto con la cofía (también denominada caliptra) ayuda a las raíces en crecimiento a desplazar a un lado las partículas del suelo sin que la raíz se rompa. La forma filamentosa de las raíces les posibilita explorar un volumen de suelo mucho mayor por unidad de volumen radical que si fuesen esféricas o discoidales. Para que la absorción de agua y nutrientes sea máxima las raíces incrementan su superficie de absorción por mediación de los pelos absorbentes también denominados radicales. Un pelo radical es una célula epidérmica modificada que posee una prolongación filamentosa que puede llegar a alcanzar unos 1.5 mm de longitud (ver Fig. 2.3). Los pelos radiculares son poco longevos (3-9 días) y la zona donde se ubican los pelos radicales mide sólo 1-2 cm de longitud. A pesar pesar de ello se ha calculado que una planta desarrollada de centeno presenta más de diez millones de pelos radicales, cuya longitud total alanza los 10.000 km y cuya superficie total corresponde a un cuadrado de 20 m de lado. l ado. Esto equivale a unas 50 veces la superficie de todo el sistema caulinar, incluidas las hojas. 2



2.1.- LOS SISTEMAS RADICULARES RADICULA RES DIFIEREN EN FORMA PERO ESTÁN BA SADOS EN ESTRUCTURAS COMUNES

La forma de los sistemas radicales, al igual que el sistema caulinar, difiere mucho entre las distintas especies vegetales y depende del hábitat de éstas. En las monocotiledóneas, monocotiledóneas, el desarrollo de la raíz comienza con la emergencia de tres a seis raíces primarias. A continuación, aparecen las raíces adventicias, denominadas nodales. Más tarde, las raíces primarias y nodales se alargan y se ramifican extensivamente formando un complejo sistema radicular fasciculado (Fig. 2.1.B y C). En el sistema radicular fasciculado, todas las raíces tienen el mismo diámetro (excepto cuando las condiciones ambientales o las interacciones con patógenos modifican la estructura radicular), por lo que es difícil distinguir la raíz primaria. Por el contrario, en dicotiledóneas, el sistema radicular consta de una raíz principal que puede crecer en grosor como resultado de la actividad del cambium secundario. De esta raíz principal se desarrollan raíces laterales que dan lugar a un sistema radicular ramificado (raíz axonomorfa, ver Fig. 2.2). B . Su el o s ec o

A

Co n t r o l

Fo s f at o

am o n i o

C. Su el o i r r i g ad o

Ni t r at o

p o t as i o

Figura 2.1. A) Proliferación de raíces de cebada en zonas limitadas de arena fertilizada con fosfato, nitrato, amonio y potasio. Las porciones delimitadas por barras de los sistemas radiculares se cultivaron durante 21 días en compartimentos de arena separados con cera, a través de la cual las raíces pueden crecer pero la solución de nutrientes no fluye. Las Las distintas zonas se se fertilizaron con una solución solución de nutrientes que contenía niveles altos (H) o bajos (L) del nutriente indicado. El control recibió niveles altos de los elementos en las tres zonas . Malcolm Drew llevó a cabo estos experimentos en 1975. Este investigador mostró que las raíces crecen preferentemente en regiones que contienen mayores niveles de nutrientes. De esta forma, se optimizan los recursos ya que, para la planta desarrollar desarrollar tanto en zonas de suelo suelo ricas como pobres en nutrientes un sistema radicular uniforme supondría un “gasto de recursos” innecesario. B y C) Sistema radicular fasciculado en trigo (monocotiledónea). (A) Sistema radicular de una planta de trigo adulta (3 meses de edad) crecida en suelo seco. (B) Sistema radicular de una planta de trigo crecida en suelo irrigado. En el sistema radicular fasciculado, el eje de la raíz primaria no es distinguible. Obsérvese que la morfología de la raíz se ve afectada por la cantidad de agua presente en el suelo. Tomado de Taiz y Zeiger (1998).

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Módulo II: Absorción y transporte de nutrientes

El desarrollo del sistema radicular tanto de monocotiledóneas como de dicotiledóneas depende de la actividad del meristemo apical radicular. En la Figura 2.3 se muestra un esquema general de la región apical de una raíz. En la zona meristemática, las células se dividen tanto en dirección basal, para formar células que se diferenciarán en tejidos funcionales de la raíz como en dirección apical, para formar la caliptra. La caliptra protege a las delicadas células meristemáticas durante el movimiento de la raíz por el suelo. Además, segrega una substancia gelatinosa denominada mucigel, que rodea normalmente al ápice radicular. La función precisa del mucigel se desconoce aunque, se ha sugerido que podría estar implicada en 1) lubricar la región que va a penetrar la raíz, 2) proteger el ápice de la desecación, 3) promover la transferencia de nutrientes hacia la raíz, y 4) favorecer la interacción entre la raíz y los microorganismos del suelo. La caliptra es primordial en la percepción de la gravedad, que es la señal que dirige el crecimiento de la raíz, proceso denominado respuesta gravitrópica.

Figura 2.2. Sistema radicular de dos dicotiledóneas: remolacha azucarera (A) y alfalfa (B). El sistema radicular de la remolacha azucarera representado corresponde al de una planta de 5 meses, y el sistema radicular de la alfalfa es el típico de una planta de 2 años. En los dos sistemas, se observa una raíz principal y, en el caso de la remolacha, se observa que la porción superior de la raíz principal está engrosada ya que actúa como tejido de almacenamiento. Ambas plantas han recibido un suministro adecuado de agua. 4



Tomado de Taiz y Zeiger, (1998). La división celular en el “verdadero” ápice de la raíz es relativamente lenta y, por ello, esta región se conoce como centro quiescente. Después de unas pocas divisiones celulares lentas, las células de la raíz que se encuentran a unos 0.1 mm del ápice empiezan a dividirse a mayor velocidad. La división celular disminuye otra vez a unos 0.4 mm del ápice, y las células se expanden por igual en todas las direcciones. La zona de elongación empieza a unos 0.7-1.5 mm del ápice. En esta zona, las células se elongan rápidamente y sufren una serie final de divisiones para producir un anillo central de células que se denomina endodermis. Las paredes celulares de esta capa de células endodérmicas se van a engrosar y, la deposición de suberina en las paredes celulares radiales forma la denominada banda de Caspari , una estructura hidrofóbica que impide el movimiento apoplástico del agua o de solutos hacia el interior de la raíz. La endodermis divide a la raíz en dos regiones: el córtex hacia el exterior y la estela hacia el interior. La estela contiene los elementos vaculares de la raíz: el floema, el cual transporta metabolitos del tallo a la raíz, y el xilema, que transporta agua y solutos hacia el tallo. periciclo Primordio radicular lateral

Células corticales epidermis emergencia de una raíz lateral

Pelo radicular

Zona de maduración Vaso maduro Células endodérmicas di ferenciadas Diferenciación de los primeros vasos del xi lema Máxima velocidad de elongación celular Zona de elongación

Diferenciación de los primeros vasos del f loema Cese de la división celular en la mayoría de los tejidos

Meristemo apical División celular máxima Centro quiescente Cofia o caliptra

Figura 2.3. Sección longitudinal de la región apical de una raíz. Las células meristemáticas se localizan cerca del extremo de la raíz. Estas células generan la cofía o caliptra y los tejidos superiores de la raíz. En la zona de elongación, las células diferenciadas producen xilema, floema y córtex. Los pelos radiculares, formados en las células epidérmicas, aparecen en la zona de maduración. Tomado de Taiz y Zeiger, 1998. 5



El floema se desarrolla antes que el xilema [ver Fig. 2.3, diferenciación de los vasos del floema (rojo) y xilema (azul)], lo que corrobora que la función de éste es crítica cerca del ápice radicular. De hecho, son necesarias grandes cantidades de carbohidratos para poder mantener las divisiones y las elongaciones celulares en las zonas de crecimiento apical. Los carbohidratos permiten un rápido crecimiento de las células proporcionando energía y los esqueletos carbonados necesarios para la síntesis de compuestos orgánicos. Los carbohidratos de 6 átomos de carbono (hexosas) funcionan además como compuestos osmóticamente activos en los tejidos de la raíz. En el ápice de la raíz, donde el floema no se ha desarrollado, el movimiento de los carbohidratos depende de la difusión por el simplasto y, este proceso es relativamente lento (Bret-Harte y Silk, 1994). Se piensa que la baja velocidad de división celular en el centro quiescente puede deberse a un aporte insuficiente de carbohidratos en esta región. Los pelos radiculares, con su gran superficie para la absorción de agua y solutos, aparecen en la zona de maduración, y es aquí donde el xilema desarrolla la capacidad de transportar grandes cantidades de agua y solutos hacia el tallo.

2.2.- DIFERENTES ZONAS DE LA RAÍZ ABSORBEN DIFERENTES IONES MINERALES

Además del tamaño y ramificación de las raíces, conviene determinar la zona de entrada de los iones al sistema radicular. Algunos investigadores sostienen que los nutrientes se absorben sólo en las regiones apicales de las raíces principales y laterales (Bar-Yosef et al., 1972), mientras que otros afirman que los nutrientes se absorben a lo largo de toda la superficie radicular (Nye y Tinker, 1977; Greenwood, 1982). En los últimos años se han llevado a cabo diversos estudios experimentales que apoyan ambas hipótesis dependiendo del ion y de la especie analizados. Así, por ejemplo La absorción radicular del calcio en cebada parece estar restringida solamente a la región apical. • El hierro puede incorporarse bien por la región apical como en cebada (Clarkson y Sanderson 1978), o bien a lo largo de toda la superficie, como ocurre en maíz (Karhirad et al., 1973). • El potasio, nitrato, amonio y fosfato pueden ser absorbidos libremente en cualquier zona de la superficie de la raíz (Clarkson y Sanderson, 1978), pero en maíz es en la zona de elongación donde se observan las mayores velocidades para la acumulación del potasio (Sharp et al., 1990) y para la absorción del nitrato (Colmer y Bloom, 1998). • En maíz y en arroz, el ápice radicular absorbe más rápidamente el amonio que en la zona de elongación (Colmer y Bloom, 1998). • En varias especies, los pelos radiculares son los más activos para la absorción del fosfato (Fohse et al., 1991). •

Las elevadas velocidades en la absorción de nutrientes en las zonas apicales de la raíz se deben a la fuerte demanda de nutrientes en esos tejidos y a la relativamente elevada disponibilidad de nutrientes en el suelo que rodea a estas zonas. Por ejemplo, la elongación celular depende de la acumulación de solutos, como el potasio y el nitrato, 6



para incrementar la presión osmótica dentro de la célula. El amonio es la fuente de nitrógeno “preferida” para mantener la división celular en el meristemo debido a que los tejidos meristemáticos sus reservas de carbohidratos son a menudo limitadas y la asimilación de amonio consume menos energía que la de nitrato. El ápice de la raíz y los pelos radiculares crecen en suelo no explorado y, en esta zona, la concentración de nutrientes es relativamente elevada. En el suelo, los nutrientes pueden moverse hacia la superficie de la raíz bien por flujo masivo o por difusión. En el flujo masivo, los nutrientes son transportados por el movimiento del agua del suelo hacia la raíz. La cantidad de nutrientes que llega a la raíz por el flujo masivo depende de la velocidad del flujo del agua del suelo a la planta, la cual depende de la velocidad de transpiración, y de la cantidad de nutrientes presentes en la solución del suelo. Cuando la velocidad del flujo del agua y la concentración de nutrientes en el suelo son elevadas, el flujo masivo juega un papel importante en el proceso de absorción de nutrientes. En la difusión, los nutrientes minerales se mueven de una región de alta concentración de nutrientes a otra región en la que la concentración es menor. La concentración de nutrientes en la superficie de la raíz es muy baja, lo que genera un gradiente de concentración entre la solución del suelo y la raíz. La difusión de nutrientes, a favor del gradiente de concentración, y el flujo masivo pueden incrementar la disponibilidad de nutrientes en la superficie de la raíz. Cuando la absorción de nutrientes por las raíces es elevada y la concentración de los nutrientes en el suelo baja, el flujo masivo proporciona sólo una pequeña fracción del total de los nutrientes minerales necesarios para el correcto crecimiento y desarrollo de las plantas (Mengel y Kirkby, 1987). Bajo estas condiciones, va a ser la velocidad de difusión la que limita el movimiento de los nutrientes hacia la superficie de la raíz. Cuando la difusión es demasiado lenta (para mantener cerca de la raíz una zona de alta concentración de nutrientes) se forma una zona de reducción de nutrientes (del inglés, nutrient depletion zone). Como se observa en la Figura 2.4, la reducción de los nutrientes disminuye conforme nos acercamos a la superficie de la raíz. Conviene tener en cuenta que la toma de un nutriente va a depender tanto de la afinidad de los transportadores que facilitan su incorporación a la planta, como de la concentración de dicho nutriente en la superficie próxima a la raíz.

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Figura 2.4. Formación de una zona de reducción de nutrientes en la región adyacente a la raíz. Esta zona de reducción se forma cuando la velocidad de incorporación de un nutriente supera la velocidad con la que éste es reemplazado en la solución del suelo. Esta reducción provoca una disminución localizada de la concentración del nutriente en el área adyacente a la superficie radicular. Tomado de Taiz y Zeiger, 1998. La formación de esta zona de reducción de nutrientes revela un aspecto muy importante sobre la nutrición mineral. Debido a que las raíces agotan los minerales de la rizosfera, su efectividad en la obtención de los minerales del suelo viene determinada no sólo por la velocidad de extracción de los minerales de la solución del suelo sino de su continuo crecimiento. Sin crecimiento, las raíces rápidamente agotarían los minerales del suelo adyacente a su superficie radicular. Una adquisición óptima de nutrientes depende tanto de la capacidad para incorporar los nutrientes minerales del suelo como de la capacidad del sistema radicular para crecer en suelo no explorado.

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LAS MEMBRANAS BIOLÓGICAS

Las células vegetales están separadas del medio que las rodea por una membrana plasmática, que en las células vegetales recibe el nombre de plasmalema. El plasmalema separa un medio interno, de composición relativamente constante de un medio externo con una composición extremadamente variable. Además, la membrana debe facilitar y promover el continuo tráfico de iones y moléculas a su través, como el que tiene lugar cuando la célula ingiere nutrientes esenciales, o cuando excreta los productos residuales. Como es el único contacto con el medio externo, la membrana debe también actuar como transmisor de las condiciones físicas del entorno, de la presencia de un patógeno, y también de las señales procedentes de células vecinas. Para llevar a cabo estas tareas, la membrana plasmática debe disponer de un control continuo de la velocidad de movimiento de cada uno los distintos solutos (que son muchos) que la atraviesan. Esto mismo es válido para las membranas internas que delimitan los diferentes compartimentos celulares presentes en el interior de la célula eucariota. A continuación, vamos a describir brevemente la naturaleza de las membranas biológicas. 3.1.- NATURALEZA DE LA MEMBRANA

Como hemos comentado en el apartado anterior, la célula está rodeada por una membrana que delimita su extensión y mantiene las diferencias esenciales entre el contenido de la célula y su entorno y permite la existencia de determinados compartimentos en su interior. Todas las membranas biológicas tienen una estructura básica común: una doble capa (bicapa) bien de fosfolípidos o, en el caso de los cloroplastos de glicosilglicéridos, en la cual se encuentran embebidas proteínas. La composición de los lípidos y de las proteínas varía en las diferentes membranas, lo cual confiere a cada tipo de membranas unas características funcionales únicas. Los fosfolípidos son una clase de lípidos formados por dos cadenas de ácidos grasos esterificados a dos de los grupos hidroxilo del glicerol. El tercer grupo hidroxilo está ligado covalentemente a un grupo fosfato. Unido a este grupo fosfato, se encuentra una

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componente variable, denominada cabeza polar, que puede ser un residuo de serina, colina, etanolamina, o inositol. Los fosfolípidos son moléculas anfipáticas es decir, tienen un extremo hidrofílico, la cabeza polar, y un extremo hidrofóbico, las dos colas hidrocarbonadas. Las cadenas de ácidos grasos de los fosfolípidos y de los glicosilglicéridos pueden tener diferente longitud (normalmente contienen de 14 a 24 carbonos). Normalmente, una de las colas presenta uno o más dobles enlaces cis (es decir, está insaturada). La presencia de un doble enlace cis genera una suave curvatura en la cadena que impide que las moléculas de lípido puedan empaquetarse una contra otra y, por lo tanto, afectan a la fluidez de la misma (aumenta la fluidez). La fluidez de la membrana juega un papel crucial en la función de ésta. La fluidez también depende de la temperatura. Las plantas como organismos poiquilotérmicos (organismos que no pueden regular la temperatura de su cuerpo) mantienen la fluidez de sus membranas en condiciones de bajas temperaturas aumentando el porcentaje de ácidos grasos insaturados, como el ácido oleico (un doble enlace, 18:1), ácido linoleico (dos dobles enlaces, 18:2) y α-linolénico (tres dobles enlaces, 18:3). Este proceso está catalizado por enzimas denominadas desaturasas. Los esteroides, como el sitosterol, estigmasterol, colesterol, etc., y los glicolípidos aunque, menos abundantes, también son componentes de las membranas vegetales.

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Figura 2.5. (A) La membrana plasmática, del retículo y otras endomembranas de las células vegetales están constituidas por una bicapa de fosfolípidos en la que se encuentran embebidas proteínas. (B) Micrografía electrónica en la que se observa la membrana plasmática de células meristemáticas de la raíz de Lepidium sativum. Al microscopio electrónico el plasmalema aparece como dos densas líneas separadas por un espacio claro de un grosor total de 8 nm. (C) Estructura química de un fosfolípido típico, la fosfatidilcolina. Tomado de Taiz y Zeiger (1998). Las proteínas asociadas a la bicapa lipídica son de dos tipos, integrales y periféricas, también denominadas intrínsecas y extrínsecas, respectivamente. Las proteínas integrales se encuentran embebidas en la bicapa lipídica. La mayoría de estas proteínas atraviesan la bicapa lipídica de forma que parte de la proteína interactúa con el exterior de la célula, otra parte con la región hidrofóbica de la membrana y una tercera parte con el interior de la célula, el citosol. Las proteínas que forman canales iónicos son siempre proteínas integrales de membrana. Las proteínas periféricas se unen a la superficie de la membrana mediante enlaces no covalentes, tales como puentes de hidrógeno y enlaces iónicos. Las proteínas periféricas desempeñan diversas funciones en la membrana. Por ejemplo, algunas están involucradas en las interacciones entre el plasmalema y los componentes del citoesqueleto, como los microtúbulos y los microfilamentos de actina. Las membranas presentan asimetría, esto es, existen diferencias entres sus dos mitades, externa e interna. Esta asimetría no sólo se refiere a las proteínas, sino también a los lípidos, lo que refleja las diferentes funciones de las dos caras de la membrana celular. Además, la mayoría de las proteínas que quedan al descubierto sobre la superficie celular y algunas de las moléculas lipídicas de la monocapa externa tienen cadenas de oligosacáridos unidos covalentemente. Esta cubierta de azúcares, denominada glicocáliz, ayuda a proteger la superficie celular del daño mecánico y químico, y algunas de estas cadenas son reconocidas por proteínas ( lectinas) que intervienen en procesos específicos de adhesión célula-célula.

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TRANSPORTE PASIVO Y ACTIVO

Las substancias para desplazarse necesitan energía, decimos que una substancia difunde, es decir, se mueve de forma pasiva si lo hace a favor de la fuerza física que actúa sobre ella y, de forma activa cuando lo hace en contra de dicha fuerza, para lo cual se requiere energía metabólica. De acuerdo con la ley de Fick la velocidad de transporte o la densidad de flujo ( J s), esto es, la cantidad de soluto, s, que pasa a través de una unidad de área por unidad de tiempo es igual al gradiente de concentración multiplicado por una constante de proporcionalidad llamada coeficiente de difusión de la substancia s, Ds: J s= - Ds (δcs/δx)

donde el flujo difusivo J s viene expresado en mol m -2 s-1, la concentración, c s, en mol m 3 , la distancia, x, en m y el coeficiente de difusión en m 2s-1. El coeficiente de difusión es característico de cada substancia (ver Tabla 2.1; las moléculas grandes tienen un 10



coeficiente de difusión bajo), depende del medio (por ejemplo, la difusión en el aire es más rápida que en medio líquido) y no es una constante ya que varía con la concentración y con la temperatura. El gradiente de concentración ( δcs/δx) es aproximadamente Δcs/Δx es decir, la diferencia de concentración de la substancia s ( Δcs) entre dos puntos separados por la distancia Δx. El signo negativo indica que la difusión se realiza desde la zona de alta concentración hacia la zona de menor concentración. Si expresamos la diferencia de concentraciones como Δcs (que es la fuerza impulsora de la difusión) y, la distancia (x) la combinamos con el coeficiente de difusión en un término denominado resistencia (r), entonces la ecuación anterior puede expresarse como: J s= Δcs/r

Así, de esta forma se puede visualizar fácilmente que el flujo difusivo es proporcional a la magnitud de la fuerza impulsora Δcs e inversamente proporcional a la resistencia, r. Las unidades de la resistencia son unidades de tiempo por unidad de distancia (s m -1). Esta ecuación es análoga a la ley de Ohm, la cual establece que el flujo de una corriente eléctrica en un conductor es proporcional a la fuerza impulsora, el voltaje, e inversamente proporcional a la resistencia opuesta por el conductor. Ambos son ejemplos de una ley general que puede enunciarse como: El movimiento (flujo) de una substancia es igual a la fuerza impulsora dividida por la resistencia. En lugar de la resistencia podemos encontrar en la bibliografía la permeabilidad (Ps). La permeabilidad es el recíproco de la resistencia ( Ps= 1/r) y sus unidades son unidades de distancia por unidad de tiempo, m s -1: J s= Ps Δcs

Tabla 2.1. Coeficientes de difusión en soluciones acuosas y en aire Pequeños solutos en aguaa Substancia

D j (m2 s-1)

Alanina Citrato Glucosa Glicina Sacarosa Ca2+ (con Cl-) K + (con Cl-) Na+ (con Cl-) CO2

0.92 x 10-9 0.66 x 10-9 0.67 x 10 -9 1.10 x 10-9 0.52 x 10 -9 1.2 x 10-9 1.9 x 10-9 1.5 x 10-9 1.7 x 10-9

Proteínas globulares en aguaa Masa (kDa) 15 1000

molecular D j (m2 s-1) 1 x 1010 1 x 10 11

Gases en aireb Gas CO2 H2O O2

D j (m2 s-1) 1.51 x 105 2.42 x 105 1.95 x 105

Datos tomados de Nobel (1999) a Valores calculados para soluciones diluidas a 25ºC. b Valores calculados a 20ºC y una presión de 1 atmósfera

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A partir de la ley de Fick se obtiene una expresión que nos permite calcular el tiempo necesario para que una proporción de moléculas difundan a una cierta distancia a partir de su posición de origen. Por ejemplo, el tiempo para que difunda la mitad de una población inicial de moléculas ( t c = ½) a una distancia concreta viene dado por la siguiente ecuación: 2

t c= ½ = (distancia) K Ds

donde K es una constante que depende de la forma del sistema (para facilitar los cálculos posteriores utilizaremos un valor de K = 1) y Ds es el coeficiente de difusión. Esta ecuación muestra que el tiempo requerido para que una substancia difunda una cierta distancia aumenta en relación con el cuadrado de la distancia. Para determinar el significado de esta expresión vamos a considerar dos ejemplos numéricos. Primero, ¿cuánto tiempo tarda una pequeña substancia en difundir la distancia equivalente al eje mayor de una célula eucariota típica? El coeficiente de difusión de un soluto pequeño, como la glucosa, es aproximadamente 10 -9 m2 s-1, y el tamaño de una célula unos 50 µm. Así, tendríamos: t c= ½ = (50 x 10 -6 m)2 = 2.5 s

10-9 m2 s-1

Este cálculo muestra que una pequeña molécula difunde rápidamente distancias de dimensiones celulares. Pero, ¿qué ocurre con la difusión a mayores distancias? Podemos calcular el tiempo necesario para que esa misma molécula se mueva una distancia de 1 m (que es por ejemplo, la longitud de una hoja de maíz), y obtendríamos: t c= ½ = (1 m)2 = 109s ≈ 32 años 10-9 m2 s-1 un valor que excede en varios órdenes de magnitud la vida media de una planta de maíz, que es solo de unos pocos meses. Estos ejemplos numéricos ponen de manifiesto que el proceso de difusión puede ser efectivo dentro de las dimensiones celulares pero, es demasiado lento para el transporte de sustancias a largas distancias. Conviene tener en cuenta que el movimiento de moléculas por difusión es siempre espontáneo, a favor de un gradiente de concentración o de un gradiente electroquímico hasta que se alcance el equilibrio. El movimiento de moléculas a favor de gradiente se denomina transporte pasivo. En el equilibrio, no se produce movimiento neto de solutos, a menos que se le aplique una fuerza. El movimiento de substancias en contra de su gradiente electroquímico se denomina transporte activo. El transporte activo no es espontáneo y requiere energía metabólica y una forma de llevarlo a cabo es acoplándolo a la hidrólisis del ATP. Para calcular la fuerza que determina el movimiento pasivo de una substancia o la energía necesaria para mover una substancia en contra de gradiente es necesario medir el gradiente de energía que, a menudo, es función de la diferencia de concentración. En el transporte en sistemas biológicos puede intervenir además otras fuerzas como la presión hidrostática, los campos eléctricos y la gravedad, aunque esta última rara vez contribuye al transporte.

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La suma de estos componentes se denomina potencial químico y cuantifica la capacidad de trabajo que un soluto posee. El potencial químico se define como la suma de los potenciales de concentración, eléctrico e hidrostático , y el potencial químico en condiciones estándar: μ j

=

Potencial químico para un soluto dado, j

μ j*

+

RT ln Cj +

Potencial Concentración químico de (actividad) j bajo condiciones estándar

zj FE +

Vj P

Componente potencial eléctrico

Componente presión hidrostática

Donde: j es el potencial químico del soluto j en julios por mol (J mol –1), j* es el potencial químico en condiciones estándar (C=1 y E= 0; es un factor de corrección que eliminaremos en las futuras ecuaciones y puede por tanto ignorarse), R es la constante universal de los gases (8.314 J mol –1 K –1), T es la temperatura absoluta en grados kelvins, Cj es la concentración (sería más apropiado utilizar en la ecuación la actividad del soluto; en soluciones muy diluidas la actividad es aproximadamente igual a la concentración (mol vol -1) de j, zj FE , la componente eléctrica que se aplica sólo a iones en disolución; z es la carga electrostática del ion (+1 para cationes monovalentes, -1 para aniones monovalentes, +2 para cationes divalentes, etc.), F es la constante de Faraday (96.5 J mol –1 mV –1) y E es el potencial eléctrico del sistema, y el último término, Vj P, expresa la contribución del volumen molar parcial de j (Vj) y la presión (P) al potencial químico de j. (El volumen parcial molal de j es el cambio en volumen por mol de substancia j añadida al sistema, para una adición infinitesimal). Este término contribuye en menor medida al potencial químico que los términos relacionados con la concentración y con la componente eléctrica, excepto en el movimiento del agua por ósmosis. El potencial químico del agua (es decir, el potencial hídrico) depende de la concentración de solutos disueltos y de la presión hidrostática del sistema.

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Membrana Semipermeable Potencial químico en el compartimento A

μ j A

Potencial químico en el compartimento B μ j B

Descripción Transporte pasivo (difusión) ocurre espontáneamente a favor del gradiente de potencial químico μ jA > μ jB

En el equilibrio no hay movimiento neto μ j A

μ j B

μ jA = μ jB

Transporte activo tiene lugar en contra del gradiente químico μ j A

μ j B

μ jA < μ jB ΔG para el movimiento de j de μ jB - μ jA. Para que el conjunto

A a B es igual al tenga un ΔG negativo, la reacción debe estar acoplada con un proceso que disminuya su energía libre y que sea más negativo que – ( μ jB - μ jA )

Figura 2.6. Relación entre el potencial químico, μ, y el transporte de moléculas a través de una barrera semipermeable. El movimiento neto del soluto j entre los compartimentos A y B depende de la magnitud relativa del potencial químico de j en cada compartimento, representado aquí por la altura de las barras. El movimiento a favor del gradiente de potencial químico ocurre espontáneamente; el movimiento en contra de dicho gradiente requiere energía y se denomina transporte activo. El escribir la ecuación en términos de potencial químico, μ j, permite considerar la contribución de una substancia individual (en nuestro caso j) a la energía libre del sistema. El término μ puede describirse como la energía libre parcial molal de un soluto j: representa el aumento en energía libre por mol de j añadido, para una adición infinitesimal en condiciones constantes, y Δμ j es la contribución de un soluto j al total del cambio de la energía libre ( ΔG) al sistema. La importancia del concepto de potencial químico es que incluye la suma todas las fuerzas que pueden actuar sobre una molécula para dirigir el transporte neto. En general, la difusión (transporte pasivo) siempre provoca el desplazamiento de substancias desde zonas de mayor potencial químico a

14



zonas de menor potencial. El movimiento en contra del gradiente químico es indicativo de un transporte activo (Fig. 2.6). Si tomamos como ejemplo la difusión a través de la membrana de un soluto no cargado como la sacarosa, el potencial químico de la sacarosa en un sistema presenta sólo una componente: la debida a la concentración. Así, el potencial químico de la sacarosa por ejemplo dentro de la célula (compartimento “i”) se puede expresar: μsi

Potencial químico de la sacarosa dentro de la célula

=

μs*

+

Potencial químico de la sacarosa en condiciones estándar

i

RT ln C s

Concentración (actividad)

El potencial químico de la sacarosa fuera de la célula (compartimento “e”) sería: μse

= μs* + RT ln C se

La fuerza que determina el movimiento de la sacarosa entre los dos compartimentos viene dada por el gradiente de potencial químico, Δ μs

= μsi - μse = (μs* + RT ln C si ) - (μs* + RT ln C se) = RT (ln Csi- ln Cse) = RT ln Csi/Cse

Si la diferencia en el potencial químico es negativa, indica que el proceso puede ocurrir espontáneamente (la membrana presenta una permeabilidad finita al soluto). La fuerza impulsora para la difusión del soluto está relacionada con la magnitud del gradiente de concentración. Es frecuente encontrar la ecuación escrita con logaritmos decimales para facilitar los cálculos. Así, para determinar el gradiente de potencial químico necesario para transportar 1 mol de sacarosa de un compartimento en que se encuentra a una concentración de 10 -1 M a otro de concentración diez veces menor, a 25ºC, sería: Δ μs

Δ μs

= RT ln Csi/Cse = RT x 2.303 log 10 Csi/Cse

= 8.314 (J mol –1 K –1) x 298 (K) x 2.303 log 10 (0.01/0.1)= - 5.706 kJ mol –1

Pero, si la molécula que queremos transportar posee carga eléctrica, hay que tener en cuenta, además, la componente del potencial eléctrico. Tomemos a modo de ejemplo una sal, el cloruro potásico y supongamos que tanto K + y Cl - son permeables. Como estos iones difunden independientemente, cada uno tiene su propio potencial químico. Así para la difusión del potasio tendremos que: ΔμK+

= μK+i - μK+e 15



= RT ln (C K+i /C K+e) + z K+ F (Ei- Ee) y como la carga electrostática del K + es +1, z=+1 tendremos, ΔμK+

= RT ln (C K+i /C K+e) + F (Ei- Ee)

La magnitud y el signo de esa expresión determinan la fuerza motora de la difusión del K + a través de la membrana y su sentio. Una expresión similar se puede obtener para el anión Cl- pero, en este caso recordemos que z Cl- = -1. Esta ecuación pone de manifiesto que los iones, como el potasio, difunde tanto en respuesta a su gradiente de concentración (C K+i /C K+e) como a la diferencia de potencial eléctrico entre los dos compartimentos (E i- Ee). Esto implica que los iones pueden ser conducidos pasivamente en contra se su gradiente de concentración si se aplica el voltaje adecuado (campo eléctrico) entre los dos compartimentos. Debido a la importancia del campo eléctrico en el transporte en el transporte biológico, μ con frecuencia se denomina potencial electroquímico y Δμ es la diferencia de potencial electroquímico entre dos compartimentos.

5.-

TRANSPORTE DE IONES A TRAVÉS DE LA MEMBRANA

En el movimiento de K + Cl- entre dos compartimentos hay que tener en cuanta que están separados por una membrana biológica, que añade un factor al movimiento de iones. La membrana puede permitir o restringir el movimiento de una substancia a su través. Esta propiedad se conoce como permeabilidad de la membrana. La permeabilidad, como analizaremos, depende de la composición de la membrana y de la naturaleza química del soluto. En un sentido amplio, la permeabilidad se puede expresar en términos de coeficiente de difusión del soluto en la membrana. Sin embargo, la permeabilidad depende de otros factores adicionales, como la capacidad de un soluto para penetrar en la membrana, que son difíciles de medir. A pesar de la complejidad teórica, la permeabilidad puede ser medida determinado la velocidad a la que un soluto atraviesa una membrana bajo unas condiciones específicas (las unidades de la permeabilidad son unidades de distancia por unidad de tiempo por ejemplo, m s -1). Generalmente la membrana retrasará la difusión y reducirá la velocidad a la que se alcanza el equilibrio. La permeabilidad o resistencia de la membrana por sí misma, sin embargo, no puede alterar las condiciones finales de equilibrio. El equilibrio se produce cuando Δ μ j =0. Como hemos dicho, el valor de la permeabilidad (Ps) puede determinarse empíricamente siempre que el flujo de una substancia pueda medirse y las concentraciones interna y externa sean conocidas. El principal problema en la estimación de la permeabilidad es la obtención de los valores de concentración en las proximidades de la membrana, ya que, sólo es posible medirlos en la solución de cualquiera de los dos lados de la misma. Cerca de la membrana, habrá una capa límite en la cual la concentración varía con la distancia a la membrana (Fig. 2.7), de modo que las concentraciones en las proximidades de la membrana son inciertas. Esta capa límite no puede eliminarse mediante una agitación de la solución sobre todo cuando se trabaja con células vegetales, ya que la capa estará localizada dentro de la pared celular, donde la agitación no es posible. 16



A continuación describiremos los factores que influyen en la distribución de iones a través de la membrana. Estos parámetros pueden utilizarse para predecir la relación entre el gradiente eléctrico y el gradiente de concentración de un ion.

Figura 2.7. Capas límite. La presencia de capas no agitadas cerca de las membranas impide determinar la concentración de los solutos en la superficie de la membrana, la concentración real de solutos es inferior a la medida, por tanto, los verdaderos gradientes a través de la membrana no pueden calcularse. En las células vegetales, las capas no agitadas son particularmente importantes, ya que su espesor aumenta debido a la presencia de la pared celular. Tomado de Flowers y Yeo, 1997. 5.1.- EL POTENCIAL DE DIFUSIÓN SE DESARROLL A CUANDO IONES DE DISTINTA CARGA SE MUEVEN A TRAVÉS DE LA MEMBRANA A DIFERENTE VELOCIDAD

Cuando las sales difunden a través de una membrana, pueden generar un potencial eléctrico de membrana (voltaje). Consideremos que las dos disoluciones de KCl están separadas por una membrana como ocurre en la Figura 2.8. Los iones K + y Clatravesarán la membrana de forma independiente (por separado), difundiendo a favor de sus respectivos gradientes de potencial electroquímico. Y, a menos que la membrana sea muy porosa, las permeabilidades de los dos iones serán diferentes. Como consecuencia de estas permeabilidades diferentes, el K + y el Cl- difundirán inicialmente a través de la membrana en proporciones diferentes (de hecho, las membranas biológicas son más permeables al K + que al Cl-). El resultado será una ligera separación de cargas, que generarán un potencial electroquímico a través de la membrana (ver Fig. 2.8). Así, pues el K + difundirá desde la célula (compartimento A fig. 2.8) más rápidamente que el Cl-, provocando la aparición de un potencial eléctrico negativo con respecto al medio. El potencial de membrana que aparece como resultado de la difusión se denomina potencial de difusión.

17



Condiciones iniciales [KCl]A>[KCl]B

El potencial de difusión persiste hasta que se alcance equilibrio

Condiciones de equilibrio: [KCl]A = [KCl]B En el equilibrio, el potencial de difusión es igual a cero

Figura 2.8. Desarrollo del potencial de difusión y separación de cargas entre dos compartimentos separados por una membrana que presenta mayor permeabilidad para los cationes. Si la concentración de cloruro potásico es mayor en el compartimento A ([KCl]A > [KCl]B), los iones potasio y cloro difundirán a mayor velocidad hacia el compartimento B y, se establecerá un potencial de difusión. Como las membranas son más permeables al potasio que al cloro, los iones potasio difundirán más rápidamente que los iones de cloro y tendrá lugar una separación de cargas (+ y -). Tomado de Taiz y Zeiger, 1998. Un principio importante que debemos tener presente cuando estudiamos el movimiento de iones a través de la membrana es el principio de la neutralidad eléctrica. Las soluciones siempre contienen el mismo número de aniones que de cationes. La existencia de un potencial de membrana implica que hay una distribución desigual de cargas a través de la membrana; no obstante el número real de iones desequilibrados es despreciable en términos químicos. Por ejemplo, un potencial de membrana de –100

18



mV (milivoltios), como el que se encuentra en membranas de muchas células vegetales, es debido a la presencia de un único anión extra en el exterior de la célula por cada 100.000 en el interior de la célula, es decir, una diferencia de concentración de sólo el 0,001%. Como se observa en la Figura 2.8, todos estos aniones extra se encuentran inmediatamente adyacentes a la superficie de la membrana; no hay ningún desequilibrio de cargas en toda la masa celular. En nuestro ejemplo de difusión del KCl, la neutralidad eléctrica se mantiene porque, como el K + se mueve más rápidamente que el Cl- a través de la membrana, el potencial de difusión resultante retarda el movimiento del K + y acelera el del Cl -. Finalmente, ambos iones difunden en la misma proporción, pero el potencial de difusión se mantiene y puede medirse. Cuando el sistema se aproxime al equilibrio, el gradiente de concentración desaparece y el potencial de difusión también. 5.2.- LA ECUACIÓN DE NERNST RELACIONA EL POTENCIAL DE MEMBRANA Y LA DISTRIBUCIÓN DE UN ION EN EL EQUILIBRIO

Como la membrana es permeable tanto a los iones K + como a los iones Cl -, en el ejemplo anterior no se alcanzará el equilibrio para ningún ion hasta que los gradientes de concentraciones se reduzcan a cero. Sin embargo, si la membrana fuera permeable sólo a los iones K + , la difusión de los iones K + transportaría cargas a través de la membrana hasta que el potencial de membrana equilibrara el gradiente de concentración. Dado que para producirse un cambio en el potencial se requieren muy pocos iones, este equilibrio se alcanza casi instantáneamente. El transporte estaría entonces en equilibrio, incluso aunque el gradiente de concentraciones no hubiera cambiado. Cuando la distribución de cualquier soluto a través de la membrana alcanza el equilibrio, el flujo pasivo, J (por ejemplo, la cantidad de soluto que atraviesa una unidad de área de membrana por unidad de tiempo), es el mismo en ambas direcciones, desde el exterior al interior y desde el interior al exterior: J e→i = J i→e

Los flujos están relacionados con Δμ; así en el equilibrio también serán iguales los potenciales electroquímicos del interior y el exterior de la célula: μ ji = μ je

y para cualquier ion (simbolizado por el subíndice j): μ j* + RT ln C je + z j FE e = μ j* + RT ln C ji + z j FE i

Agrupando los términos, se obtiene que la diferencia en el potencial eléctrico entre los dos compartimentos en el equilibrio es: Ei- Ee = RT (ln C je/ C ji) 19



z jF Esta diferencia en el potencial eléctrico se conoce como potencial de Nernst (ΔEn) para un ion: ΔEn = Ei – Ee

y ΔEn = RT (ln C je/ C ji) z jF

o ΔEn = 2.3 RT (log C je/ C ji) z jF

Esta relación, conocida como ecuación de Nernst, pone de manifiesto que en el equilibrio la diferencia de concentraciones de un ion entre dos compartimentos está equilibrada por la diferencia de voltaje entre los dos compartimentos. La ecuación de Nernst puede simplificarse a 25ºC y para un catión monovalente de la siguiente forma: RT /zF vale 25.7 mV y, multiplicado por 2.303 nos da 59 mV, luego tendríamos: ΔEn = 59 (log C je/ C ji)

donde ΔEn viene expresado en mV. Hay que destacar que una diferencia en las concentraciones de 10 veces para un catión monovalente corresponde a un potencial de Nersnt de -59 mV (C e/ Ci = 1/10, log 10 –1= -1). Es decir, que un potencial de membrana de -59 mV mantendría un gradiente de concentración de diez veces de un ion que fuera transportado por difusión pasiva (es decir, que mediante un transporte pasivo la concentración de un ion monovalente en el interior de la célula es 10 veces superior a la concentración de ese mismo ion en el exterior; C ji = 10 x C je). De la misma forma, esta ecuación permite, a partir de una simetría en la concentración, calcular el potencial con el cual el ion estará en equilibrio. Todas las células muestran un potencial de membrana que es debido a la distribución asimétrica de los iones entre el interior y el exterior de la célula. Conviene recordar que el interior de la célula es negativo con respecto al exterior. El citosol contiene un gran número de cargas fijas, que no difunden, como los grupos amino ( NH4+) y carboxilo (-COO-) de macromoléculas como proteínas, ácidos nucleicos, etc. Además, las células bombean de forma activa diversos cationes como H +, Ca2+ y Na + al apoplasto. Todo esto hace que en el citosol predominen las cargas negativas y que en las paredes celulares se acumulen cationes.

20



El potencial de membrana de puede determinar insertando un microelectrodo en la célula y midiendo la diferencia de voltaje entre el interior de la célula y una solución estándar externa (Fig. 2.9).

Figura 2.9. Diagrama de un par de microelectrodos usados para determinar el potencial de membrana. Uno de los microelectrodos se inserta en la célula (normalmente en la vacuola o en el citoplasma) a estudiar, y el otro se mantienen en una solución estándar de electrolito que sirve de referencia. El microelectrodo se conecta a un voltímetro, que registra la diferencia de potencial eléctrico entre el compartimento celular y la solución de referencia. Los potenciales de membrana de las células vegetales están comprendidos entre – 60 y – 240 mV. Tomado de Taiz y Zeiger, 1998. 5.3.- LA ECUACIÓN DE NERNST PUEDE USARSE PARA DISTINGUIR ENTRE TRANSPORTE ACTIVO Y PASIVO

La ecuación de Nernst puede utilizarse en todo momento para calcular si un ion dado se encuentra en equilibrio y, se utiliza para determinar si un ion ha sido transportado, o excretado, mediante transporte activo o pasivo. Para ello, se determina experimentalmente las concentraciones interna y externa del ion en cuestión y con estos valores se calcula el potencial de Nernst para ese ion. A continuación, se compara ese valor con el potencial de membrana medido experimentalmente. La desigualdad entre las dos magnitudes demuestra la presencia de procesos de absorción activa de iones, veamos a continuación un ejemplo. En la Tabla 2.2 se muestra una comparación de los valores de concentración teórica, obtenidos mediante la ecuación de Nernst, y los valores reales, determinados experimentalmente, realizada en raíces de guisante por Higinbotham et al. (1967). Todos los iones se encuentran en el interior de las células a mayor concentración que en el medio externo. Se aprecia además que sólo en el caso del K + la concentración teórica y la experimental son similares, lo cual indica que este ion está en equilibrio pasivo. Por el contrario, las concentraciones de los demás cationes es inferior a la de equilibrio, 21



por lo que debe existir algún mecanismo que secrete estos iones al exterior, impidiendo de este modo que alcancen la concentración de equilibrio. Los aniones presentaron unas concentraciones internas mayores que las teóricas, indicando que su toma se debe a un transporte activo (en el equilibrio se obtiene que Δμ > 0, luego ha tenido que aplicarse energía para acumular el ion en la célula). Estos equilibrios pueden calcularse a partir de la expresión del potencial electroquímico de los iones. El trabajo necesario para incorporar un mol de un ion a la célula es igual a la diferencia del potencial electroquímico de ese ion entre el interior y el exterior de la misma: Δμ j = µ ji -µ je = (μ j* + RT ln C ji + z j FE i )- (μ j* + RT ln C je + z j FE e)

agrupando los términos eléctricos y los de concentración, resulta Δμ j =[z j F ( E i – E e)] – [ RT ln (C je/ C ji)]

Mediante la ecuación de Nernst podemos expresar un cociente de concentraciones como un potencial eléctrico es decir, RT ln (C je/ C ji) = E N zF y tendríamos que: Δμ j = [z j F ( E i – E e)] – (E N z jF )

el término ( E i – E e) corresponde al potencial de membrana E m y, finalmente Δμ j /F = z j

(Em – E N)

es el gradiente de potencial electroquímico para un ion “ j”, expresado en mV y, se obtiene multiplicando la carga del ion “ j” por la diferencia entre el potencial de membrana y el potencial de Nernst para ese ion. Si Δμ j/F es positivo, el ion está sometido a una fuerza física que tiende a sacarlo del interior de la célula y cuando tiene valor negativo, el ion se ve empujado a entrar al interior de la célula. Los resultados descritos en la Tabla 2.2 pueden considerarse representativos del comportamiento de buen número de especies: los aniones se acumulan activamente, mientras que los cationes entran de forma pasiva e incluso existen mecanismos para su secreción. Sin embargo, el comportamiento no es uniforme, algunas plantas son capaces de acumular K + activamente, otras presentan una acumulación activa de Na +, etc. Δμ j /F,

22



Tabla 2.2. Comparación de las concentraciones iónicas determinadas experimentalmente con las del equilibrio pasivo en tejidos de raíces de guisante. El potencial de membrana calculado fue de -110 mV. Tomado de Higinbotham et al. (1967). Concentración Concentración interna (mM) Dirección Ion en el medio fuerzas a b externo (mM) Teóricos Experimentales pasivasc K +

1

74

75

Na+

1

74

8

interior

Mg2+

0.25

1,340

3

interior

Ca2+

1

5,360

2

interior

NO3-

2

0.0272

28

exterior

Cl-

1

0.0136

7

exterior

H2PO4-

1

0.0136

21

exterior

SO42-

0.25

0.00005

19

exterior

equilibrio

a

Calculada para cada ion a partir del potencial de membrana y su concentración en el medio externo, aplicando la ecuación de Nernst. Como T = 298ºK, RT/F= 58,9 y la expresión queda por tanto: Ci= Ce x exp [- (n)(-110)/(58,9)]. Así, para el ion Mg 2+, Ce= 0.25 y n= + 2; Ci= 0.25 x exp [-(+2)(-110)/(58,9)]= 1 340 b Las raíces se equilibraron frente a un medio de la concentración indicada en la columna 2, a una temperatura de 25 ºC hasta que su concentración no varió con el tiempo. c Aquellos iones que se encuentran en la raíz a mayor concentración que la predicha por la ecuación de Nernst, son impulsados hacia el exterior por las diferencias de potencial electroquímico; su acumulación se ha producido contra estas diferencias de potencial utilizando energía metabólica (acumulación activa). Por el contrario, la mayor parte de los cationes están a menor concentración de la predicha por el equilibrio pasivo, por lo que un mecanismo de secreción es necesario para impedir su acumulación pasiva. Solamente el potasio se encuentra en equilibrio pasivo. El ejemplo presentado en la Tabla 2.2 es una simplificación. Las células vegetales presentan gran cantidad de compartimentos internos cada uno de ellos con una composición iónica diferente, siendo el citosol y la vacuola los compartimentos celulares más importantes. En una célula vegetal madura, la vacuola ocupa el 90 % o más del volumen celular, por lo que el citosol queda restringido a una delgada capa entre el tonoplasto (la membrana de la vacuola) y el plasmalema. Debido al volumen relativamente pequeño del citosol de la mayoría de las células de las angiospermas es difícil efectuar mediciones de este tipo. Por ello, los primeros estudios que se efectuaron para determinar las relaciones iónicas en plantas se llevaron a cabo en algas como

23



Nitella o Chara,

cuyas células internodales poseen varios centímetros de longitud, casi un milímetro de diámetro y un volumen de citosol apreciable. En la Figura 2.10 se representan a modo de resumen las conclusiones de estos estudios y los llevados a cabo con plantas superiores.

Figura 2.10. Las concentraciones iónicas en el citosol y en la vacuola están controladas por procesos de transporte pasivo (fechas discontinuas) y activo (flechas continuas). En la mayoría de las células vegetales la vacuola ocupa más del 90 % del volumen celular y contiene la mayor parte de los solutos celulares. El control de la concentración de iones en el citosol es importante para la regulación de las enzimas metabólicas. La pared celular que rodea al plasmalema no representa una barrera de permeabilidad y por tanto no afecta al transporte de solutos. Tomado de Taiz y Zeiger, 1998. En general, en las células vegetales el K + se acumula dentro del citosol y de la vacuola de forma pasiva excepto, cuando la concentración extracelular de éste es muy baja y, en este caso su absorción se realiza de forma activa. El Na + y el Ca2+ se eliminan activamente del citosol hacia el espacio extracelular y hacia la vacuola, y lo mismo ocurre con el exceso de protones. Esta eliminación de H + permite mantener el pH del citosol constante y próximo a la neutralidad (pH ≈ 7.2), mientras que el pH de la vacuola y del apoplasto son generalmente más ácidos (pH ≈ 5-6). Todos los aniones se acumulan activamente en el citosol. 5.4.- LA ECUACIÓN DE GOLDMAN RELACIONA EL POTENCIAL DE DIFUSIÓN Y EL GRADIENTE DE IONES

Hay muchos iones que atraviesan las membranas de las células vegetales de forma simultánea. Por ello, el potencial de Nernst de una sola especie iónica rara vez puede describir el potencial de difusión real de la membrana. La contribución de todos los iones al potencial de difusión de la membrana viene dado por la ecuación de Goldman: 24



Esta ecuación nos proporciona un valor bastante aproximado del valor real del potencial de difusión de una membrana. En dicha ecuación se asume que la difusión de los iones es independiente y a favor del gradiente de potencial químico y que para determinar el valor del potencial de difusión de la membrana basta con conocer las concentraciones ( C ) y las permeabilidades ( P) de los tres iones más relevantes de la célula es decir el K +, Na+ y Cl-, a ambos lados de la membrana. Los valores así calculados son muy similares a los valores experimentales ya que estos tres iones son los que presentan una mayores concentraciones y coeficientes de permeabilidad en las células vegetales y por tanto, dominan la ecuación. La relación entre la ecuación de Goldman y la ecuación de Nernst puede verse fácilmente si se considera una membrana que sólo es permeable a un ion por ejemplo el K +, luego el coeficiente de permeabilidad para el Na + y para Cl- son nulos. En estas condiciones, la ecuación de Goldman se reduce a la ecuación de Nernst para el K +. 5.5.- EL TRANSPORTE DE PROTONES ES EL PRINCIPAL DETERMINANTE DEL POTENCIAL DE MEMBRANA

Cuando se conocen las permeabilidades y los gradientes de los iones, es posible calcular el potencial de difusión de la membrana mediante la ecuación de Goldman. Sin embargo, en plantas y en hongos, los valores experimentales del potencial de membrana son mucho más negativos que los obtenidos a partir de la ecuación de Goldman. Por ejemplo, el potencial de membrana medido en células del tallo y de raíces de plántulas está comprendido entre –130 a –110 mV, mientras que el calculado (a partir de la ecuación de Goldman) oscila entre –80 a –50 mV. Estos resultados ponen de manifiesto que el potencial de difusión no es el único componente que contribuye al potencial de membrana y, por tanto, debe existir otro mecanismo. Pues bien, este exceso de voltaje se debe a la acción de una bomba electrogénica, es decir una enzima que bombea de forma activa (utiliza energía metabólica, ATP) protones al exterior (es decir saca protones del interior de la célula y los vierte al exterior) y que se denomina ATP foforilasa de protones o H +-ATPasa del plasmalema. Siempre que un ion entra o sale fuera de la célula sin ser equilibrado con el movimiento de un contraión de carga opuesta, se crea un voltaje a través de la membrana. Cualquier mecanismo de transporte activo que provoque el movimiento de una carga eléctrica neta, modificará el valor de potencial de membrana respecto al predicho por la ecuación de Goldman. Este tipo de transporte se denomina bomba electrogénica, y es común en las células de todos los organismos. La energía metabólica necesaria para llevar a cabo este tipo de transporte casi siempre es proporcionada por la hidrólisis del ATP. En las plantas se ha demostrado la dependencia del potencial de membrana del ATP observando el efecto del cianuro (CN -) en el potencial de membrana (Fig. 2.11). El cianuro inhibe la síntesis de ATP y, en estas condiciones el potencial de membrana se encuentra cercano al potencial de 25



difusión de Goldman, el cual corresponde al movimiento pasivo de K +, Na+ y Cl-. Por consiguiente, el potencial de membrana de las células vegetales tienen dos componentes: el potencial de difusión y otra componente debida al transporte electrogénico de iones. En presencia de cianuro, se inhibe este transporte, y el pH del medio externo aumenta mientras que, el pH citosólico se acidifica. Esto pone de manifiesto que el transporte activo de protones al exterior de la célula es electrogénico.

Figura 2.11. El potencial de membrana de células de guisante se colapsa cuando se añade cianuro (CN-) al medio. El cianuro bloquea la producción de ATP en las células. El colapso del potencial de membrana tras la adición de cianuro indica que el ATP es necesario para el mantenimiento del potencial . Si se elimina el cianuro del medio, la producción de ATP se reestablece y se restaura el potencial de membrana. Tomado de Taiz y Zeiger, 1998.

Como analizamos anteriormente, un cambio en el potencial de la membrana causado por una bomba electrogénica cambiará las fuerzas de difusión de todos los iones a través de la membrana. Por ejemplo, el transporte de H+ al exterior de la célula puede generar la fuerza motora necesaria para la difusión pasiva de K+ al interior de la ce´lula. El H+ es transportado electrogénicamente a través de la membrana plasmática no sólo en plantas, sino también en bacterias, algas, hongos y algunas células animales como las epiteliales del riñón. La síntesis de ATP en mitocondrias y cloroplastos también depende de una H+ATPasa. En estos orgánulos, esta proteína de transporte se denomina ATP sintasa debido a que forma ATP en lugar de hidrolizarlo. A continuación vamos a describir la estructura y función de las proteínas de membrana implicadas en el transporte activo y pasivo en las células vegetales.

26


6.-


PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS DE MEMBRANA

Como hemos visto en el apartado 3.1 la membrana celular es una barrera que separa dos medios acuosos de distinta composición, el extracelular y el intracelular, lo que les permite regular el tráfico de sustancias y por ende la composición iónica del interior de la célula. Hemos comentado que los iones son moléculas hidrofílicas inmiscibles en los lípidos de la membrana y que para atravesarla requieren de mecanismos específicos de transporte. Normalmente, en los estudios de permeabilidad se utilizan membranas artificiales constituidas por un solo tipo de fosfolípidos (bicapas lipídicas que carecen de proteínas). Debido a la naturaleza hidrofóbica del interior de la membrana, las membranas sintéticas puras son altamente impermeables a los iones. En la Figura 2.12 se muestran los valores de permeabilidad de las bicapas artificiales para varias substancias. Las moléculas no polares como el O 2 (32 daltons) atraviesan la membrana rápidamente, incluso pequeñas moléculas polares (agua, 18 daltons; CO 2, 44 daltons; glicerol, 92 daltons) también difunden rápidamente aunque, su permeabilidad es ligeramente menor. Entre las moléculas polares el agua presenta una elevada permeabilidad, probablemente debido a las fuertes interacciones con los extremos polares de los lípidos y por su pequeño tamaño. En general, cuando una molécula aumenta en tamaño y polaridad su permeabilidad disminuye. Por el contrario, las bicapas lipídicas son altamente impermeables a los iones por muy pequeños que éstos sean. Cuando se comparan los valores de permeabilidad de las bicapas artificiales con los de las membranas biológicas se pueden encontrar importantes similitudes y diferencias (Fig. 2.12). Las moléculas no polares y muchas pequeñas substancias polares, presentan unos valores de permeabilidad similares en ambos tipos de membrana. Por otro lado, para iones y moléculas polares grandes (glucosa, 180 daltons) las membranas biológicas son mucho más permeables que las artificiales. Esto se debe a la presencia de proteínas transportadoras que facilitan la entrada de iones y de otras moléculas polares. Las moléculas que presentan valores de permeabilidad similares en ambos tipos de membranas difunden directamente a través de la fase lipídica de la membrana. Sin embargo, la mayoría de las substancias importantes en la nutrición y en el metabolismo celular no pueden atravesar la bicapa lipídica directamente por lo que deben ser transportadas mediante proteínas de membrana. Estas proteínas transportadoras se clasifican en tres grupos: canales, transportadores ( carriers ) y bombas. Las proteínas transportadoras presentan especificidad en el transporte de solutos, de ahí su gran diversidad. Aunque generalmente, una proteína transportadora transporta específicamente un tipo de solutos también pude transportar otras substancias relacionadas. Por ejemplo, en plantas el transportador de K + de la membrana plasmática puede también transportar otros cationes monovalentes Rb + y Na+ aunque, es el K + el ion que se transporta preferentemente. Además, el transportador de K + no es efectivo en el transporte de aniones como el Cl - o de solutos no cargados como la sacarosa. De la misma forma, una proteína involucrada en el transporte de aminoácidos neutros puede transportar glicina, alanina o valina pero no ácido aspártico, que posee carga negativa, o lisina, el cual posee carga positiva.

27



Figura 2.12. Coeficientes de permeabilidad, P, en centímetros por segundo, para el paso de diversas moléculas a través de membranas sintéticas y biológicas. Los valores de P para las moléculas no polares y algunas substancias no cargadas como el agua, son similares en ambos sistemas pero, para la mayoría de las moléculas polares los valores de P son mucho mayores en las membranas biológicas, lo que pone de manifiesto del papel de las proteínas transportadoras. Tomado de Taiz y Zeiger, 1998. En primer lugar, vamos a describir el papel de los canales iónicos y de los transportadores en el transporte de solutos a través de las membranas. Distinguiremos, a continuación, entre el transporte primario y el transporte activo secundario. Terminaremos examinado la estructura y dominios funcionales de varios transportadores presentes en el plasmalema y el tonoplasto. 6.1.- LOS CANALES IÓNICOS Y LOS TRANSPORTADORES FACILITAN EL TRANSPORTE DE SOLUTOS A TRAVÉS DE LA S MEMBRANAS

Existen dos tipos de proteínas transportadoras que facilitan la entrada de solutos a través de la membrana: los canales iónicos y los transportadores (carriers) (Fig.2.13).

6.1.1.- Canales iónicos Los canales iónicos, en general son proteínas transmembrana que funcionan como poros selectivos en la membrana. El transporte a través de un canal es siempre pasivo, sin embargo, los canales iónicos no son simples poros acuosos conductores, sino que desarrollan tres funciones fundamentales: a) Permiten el flujo de iones a su través a una velocidad muy superior a la de cualquier sistema biológico (10 8 iones s-1 frente a 103 iones s-1 que mueve un transportador o una ATPasa-H +) b) Son capaces de discriminar qué iones pasan a su través, es decir presentan selectividad iónica. La especificidad del transporte viene dada por el tamaño del poro y la densidad de la superficie cargada en su interior. La región del canal que determina la especificidad se denomina filtro selectivo (ver Fig. 2.14). El 28



transporte a través de los canales puede o no implicar una unión transitoria del soluto con la proteína canal c) En respuesta a un estímulo, las proteínas del canal son capaces de adoptar diversos estados conformacionales. En general, existe un estado conductor (estado abierto, que permite el paso de iones a su través cuando las puertas están abiertas; ver Fig. 2.14) y dos no conductores (estados inactivo y de reposo). A nivel del potencial de reposo celular, la probabilidad de apertura de algunos canales es mínima, es decir, que sólo un reducido número de canales puede abrirse al azar, pero sí pueden abrirse en respuesta a un estímulo adecuado. La despolarización celular (es decir, los cambios en el potencial de membrana) aumenta la probabilidad de apertura de los canales, pero si la despolarización se mantiene, la probabilidad de apertura disminuye como consecuencia del proceso de inactivación iniciado simultáneamente por el de activación; así el canal pasa al estado inactivo-cerrado desde el cual no puede volver a abrirse. Para que el canal vuelve a abrirse es necesario que el canal inactivado pase al estado de reposo, proceso al que denominamos reactivación del canal. Por tanto, la magnitud de la corriente que cruza la membrana depende de la densidad de canales, de la conductancia del canal abierto y de cuánto tiempo el canal permanece en dicho estado.

Figura 2.13. Los tres tipos de proteínas transportadoras: canales, transportadores (carriers) y bombas. Los canales y los transportadores pueden mediar el transporte pasivo de solutos a través de las membranas (por simple difusión o difusión facilitada), a favor del gradiente de potencial electroquímico. Las proteínas canal actúan como poros en la membrana, y su especificidad viene determinada principalmente, por las propiedades biofísicas del canal. Los transportadores se unen a la molécula que transportan en un lado de la membrana y la liberan en la cara opuesta. El transporte activo primario se lleva a cabo mediante bombas que transforman la energía metabólica (ATP) en energía útil para el transporte de solutos en contra de su gradiente de potencial electroquímico. Atendiendo a sus propiedades cinéticas (activación-inactivación), al estímulo que determina el cambio conformacional se pueden clasificar los canales iónicos en a) activados por cambios en el voltaje (canales voltaje-dependientes), b) activados tras la interacción de un antagonista con su receptor específico localizado en la superficie de la membrana celular (canales receptor-dependientes), c) activados por mediadores intracelulares (calcio, ATP, nucleótidos cíclicos, proteín quinasas). Sin embargo, esta 29



división es muchas veces artificial, ya que la despolarización de la membrana puede inducir la liberación de moléculas señal y activar canales activados por receptores/mediadores, mientras que muchos ligandos endógenos pueden también modificar el potencial de membrana celular y activar canales voltaje-dependientes.

Figura 2.14. Modelo de un canal regulado por voltaje (canal de K +) de una célula vegetal. El canal está compuesto por un tetrámero de la subunidad principal ( α) que contiene un filtro selectivo y una puerta regulada por voltaje. La secuencia de esta puerta consiste en una serie de aminoácidos básicos que proporcionan carga positiva y que, en respuesta al potencial de membrana producen la apertura o cierre del canal. Las subunidades reguladoras β también pueden estar presentes. Tomado de Taiz y Zeiger, 1998. Así mismo y mediante la técnica de patch clamp (ver Apéndice B) se han podido distinguir dos tipos de “puertas” en los canales, en función del tiempo que permanecen abiertas en respuesta a un estímulo prolongado. Así, se han caracterizado los canales que se activan rápidamente (denominados tipo R, rapidly activated ) y los que se activan lentamente (tipo S, slowly activated ). La diferencia entre ambos canales, como su propio nombre indica es que los canales tipo R se abren y se cierran rápidamente en respuesta a un estímulo [por ejemplo un cambio en el voltaje (los cambios en el voltaje, es decir los cambios en el potencial de membrana, son los principales estímulos que promueven la apertura de los canales)] mientras que los canales tipo S permanecen abiertos mientras dure el estímulo. Ambos tipos de canales también se han identificado en el tonoplasto y, se denominan como canales vacuolares rápidos (FV, fast vacuolar channels) o canales vacuolares lentos (SV, slow vacuolar channels). De lo anteriormente expuesto se puede deducir que en las células vegetales existen importantes tipos de canales que facilitan el transporte de ciertos iones, como los canales de K + y Cl- (la actividad de estos canales es de gran importancia para la regulación de importantes procesos fisiológicos como el mantenimiento de la turgencia celular, el control de la apertura y el cierre de los estomas, la regulación de la elongación celular, entre otros) pero también permiten el transporte de pequeñas 30



moléculas como el agua. Los canales que facilitan el transporte de moléculas de agua se denominan acuaporinas2. El descubrimiento de las acuaporinas fue bastante sorprendente para la comunidad científica ya que, hasta entonces se pensaba que la bicapa lipídica era suficientemente permeable al agua y que, simplemente cambiando la composición de lípidos se controlaba el flujo de agua. Hoy en día, desde el aislamiento de la primera acuaporina en 1991 en eritrocitos humanos, estas proteínas se han identificado en todos los seres vivos. No cabe duda que su identificación en células vegetales ha revolucionado la visión de las relaciones hídricas de las plantas. Así, la existencia de las acuaporinas proporciona a la planta a) una ruta de baja resistencia al flujo de agua en condiciones de elevada transpiración, b) facilita el paso del agua por la endodermis radicular y c) permite controlar el flujo del agua en la planta. Dicho control se llevaría a cabo regulando la actividad y la expresión de los genes que codifican para acuaporinas y, de esta forma, la célula es capaz de modificar la permeabilidad al agua de sus membranas según se requiera.

6.1.2.- Transportadores o carriers En el transporte mediado por un transportador o carrier la substancia a transportar se une a una región específica de la proteína. La unión provoca un cambio conformacional reversible que, de forma alternada expone en primer lugar la zona de unión al soluto en una cara de la membrana y luego en la otra. El transporte finaliza cuando la substancia se disocia del lugar de unión del transportador (ver Fig. 2.15).

Figura 2.15. Los dos modelos de difusión facilitada. Los solutos pueden transportarse a favor de su gradiente electroquímico mediante canales iónicos (a) y proteínas transportadoras (b). Los canales iónicos permiten la comunicación directa del interior y el exterior de la célula y facilitan el paso de un elevado número de iones en cada apertura. Esta apertura puede estar regulada por un ligando o por el valor del potencial de membrana. Los transportadores o carriers se unen selectivamente a los iones en una de las superficies y sufren cambios conformacionales que permiten al ion atravesar la membrana. Tomado de Campbell & Reece (2002).

2

La Real Academia Sueca de las Ciencias concedió el premio Nobel de Química 2003 a los profesores Meter Agre por el descubrimiento de las acuaporinas, y Roderick Mackinnon por el estudio de la estructura de los canales iónicos

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Debido al cambio conformacional necesario para llevar a cabo este tipo de transporte, la velocidad del transporte es de varios órdenes de magnitud más lenta que la llevada a cabo a través de un canal. Normalmente, los transportadores pueden transportar entre 100 a 1000 iones o moléculas por segundo, esto es 10 6 veces más lento que el transporte mediando por un canal. La unión y la liberación de las moléculas de las proteínas transportadoras son similares a la unión y liberación de las moléculas de una enzima en una reacción. De hecho, como veremos más tarde, se utiliza la cinética enzimática para caracterizar el transporte mediado por transportadores. El transporte mediado por transportadores, a diferencia del transporte mediado a través de un canal iónico, puede ser pasivo o activo, y puede transportar una mayor variedad de substancias. El transporte pasivo mediado por proteínas, canales o carriers, se denomina difusión facilitada, y es semejante a la difusión (la que se realiza a través de la bicapa) es decir, se transporta una substancia a favor de su gradiente electroquímico, sin gasto de energía metabólica.

6.2.- EL TRANSPORTE PRIMARIO ESTÁ MEDIADO POR BOMB AS Y ESTÁ ACOPLADO A UNA FUENTE DE ENERGÍA METAB ÓLICA

Hasta ahora hemos visto el transporte pasivo de solutos es decir, aquel que tiene lugar a favor de un gradiente de potencial electroquímico, como por ejemplo el proceso de acumulación de cationes en la célula. Por el contrario, la acumulación de aniones y la secreción de cationes, procesos que tienen lugar en contra del potencial electroquímico de los iones, precisan de un aporte de energía. La energía metabólica se transforma en energía útil para el transporte de iones en las membranas a través de la actividad de las bombas primarias (ver Fig. 2.16). Estas bombas son proteínas de membrana que mueven iones (masa y carga) en contra de su gradiente de potencial electroquímico, utilizando energía metabólica y generando gradientes tanto de concentración como eléctricos. El transporte de iones que tiene lugar a través de las bombas primarias se denomina transporte primario. Las bombas iónicas se han caracterizado como electrogénicas o electroneutras. En general, el transporte electrogénico hace referencia al transporte de un ion en el cual se produce un movimiento neto de carga a través de la membrana. Por el contrario, un transporte electroneutro, como su propio nombre indica, no implica un movimiento neto de carga. La bomba primaria de las células animales es la bomba ATPasa de Na +-K +. Ésta es una bomba electrogénica ya que impulsa la salida de tres iones Na + y la entrada de dos iones K + consumiendo ATP. Por el contrario, la bomba ATPasa H +-K + de la mucosa gástrica es electroneutra: por cada H + que bombea al exterior toma un K +. Las células vegetales no tienen bombas de Na +-K +. La bomba primaria del plasmalema es una bomba de protones que los saca del citosol y los excreta hacia el apoplasto. Esta bomba se encuentra en la membrana plasmática de las células vegetales, de hongos y de bacterias, en el tonoplasto y en varios sistemas de endomembranas tanto de células animales como vegetales. La ATPasa de H + de la membrana crea un gradiente de potencial electoquímico de H+ en la membrana plasmática mientras que la ATPasa de H + vacuolar (V-ATPasa) y 32



la pirofosfatasa de H + (H+-PPasa; utiliza la energía contenida en la molécula de pirofosfato para excretar protones) bombean electrogénicamente protones dentro del lumen de la vacuola y de las cisternas del aparato de Golgi. Son muchos los estudios que sugieren que, en células vegetales sólo el H + y el Ca2+ se transportan mediante bombas primarias. Por tanto, son necesarios otros mecanismos que permitan el transporte activo del resto de solutos imprescindibles para el desarrollo vegetal. Un modo de transportar estos compuestos sería mediante cotransporte es decir, acoplar la energía liberada por el transporte de un soluto que se mueve a favor de su potencial electroquímico con la incorporación de otro ion que se desplaza en contra de su potencial. Este mecanismo, por el que el transporte de una sustancia proporciona la energía necesaria para la acumulación de otra en contra de su potencial electroquímico, se denomina transporte secundario activo, para diferenciarlo de aquellas situaciones en que el transporte está acoplado directamente a una reacción metabólica, como la hidrólisis del ATP.

Figura 2.16. La bomba primaria que energetiza al plasmalema es una ATPasa de protones. Esta enzima hidroliza ATP para bombear H + al exterior de la célula. Como se observa, no existe un flujo asociado de otro ion que compense el déficit de carga positiva del citoplasma. Esto hace que el potencial de membrana de las células vegetales sea muy negativo, entre -160 y -250 mV. Tomado de Campbell & Reece (2002).

6.2.1.- La bomba primaria que energetiza al plasmalema es una ATPasa de protones Cuando los protones son expulsados del citosol por las ATPasas de H + electrogénicas se crea un potencial de membrana y un gradiente de pH a expensas de la hidrólisis del ATP. La energía acumulada asociada a H + puede expresarse por tanto, como el gradiente de potencial electroquímico para el H +, o fuerza protón motriz o Δ p, que consta de dos componentes: una asociada a la asimetría de concentración de H + y como diferencia de potencial eléctrico (ver Apéndice C: Teoría Quimiosmótica):

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ΔμH+/F= Em – E NH+

En células vegetales, el componente eléctrico es mucho más importante que la asimetría de concentración por dos razones. En primer lugar, en el funcionamiento de la ATPasas de H+ no existe un flujo asociado de otro ion que compense, ni siquiera parcialmente como en células animales con la bomba Na +-K +, el déficit de carga positiva del citosol. En segundo lugar, la asimetría de protones que genera la bomba se disipa parcialmente debido a la capacidad amortiguadora del medio externo, por un lado, y a los mecanismos de homeostasis del pH del citoplasma, por otro. En la literatura bioquímica, las ATPasas de H + del plasmalema se denominan de tipo P porque forman una unión covalente con el fosfato (Pi), proveniente del ATP, durante cada ciclo de bombeo de H + al exterior. Debido a la particular unión con el Pi durante la catálisis, las ATPasas de H + del plasmalema son sensibles a la presencia de ortovanadato (HVO42-), un análogo del fosfato (HPO 42-), que compite con el fosfato del ATP por la unión al sitio activo de la enzima (ver Tabla 2.4). En vesículas aisladas del plasmalema, la presencia de concentraciones de ortovanadato del orden de micromolar inhibe la actividad de la bomba, si bien la inhibición in vivo es mucho más pequeña debido, probablemente, a la escasa permeabilidad de las membranas a este ion. Por esta razón, cuando se pretende una inhibición de la bomba se usan inhibidores de la respiración (i.e., cianuro o azida) que cortan el suministro de ATP. Es importante destacar que la actividad de ATPasas de H + del plasmalema y, en consecuencia, el E m de las células vegetales, sean fotosintéticas o no, se mantiene en oscuridad; por tanto, el ATP que usan proviene mayoritariamente del metabolismo respiratorio. Las ATPasas de H + están codificadas por una familia multigénica, constituida por al menos 10 miembros y, cada gen codifica una isoforma diferente de la enzima. La Figura 2.17 muestra el modelo funcional propuesto para una ATPasas de H + de levaduras, enzima que es muy similar a la presente en el plasmalema de las células vegetales. La proteína consta de 10 dominios transmembrana y varios dominios hidrofílicos presentes tanto en la cara citoplásmica como en la apoplástica. Algunos de los dominios transmembrana forman un poro que permite el transporte de H +. El dominio catalítico se encuentra en la cara citosólica de la membrana. En dicho dominio se encuentra el residuo aspártico que se fosforila durante el ciclo catalítico y al que puede unirse el ortovanadato. La actividad de las ATPasas-H + del plasmalema se regula por la concentración de sustrato (ATP), pH, temperatura (como cualquier otra enzima) y por señales específicas, como luz, fitohormonas, y por el ataque por patógenos (Palmgren, 2001). La regulación de la actividad de la ATPasas-H + mediada por señales específicas está controlada por un dominio especializado autoinhibidor presente en el extremo Cterminal de la proteína. Este dominio autoinhibidor permite regular la actividad de la misma y si se elimina, por ej. mediante una proteasa, la enzima se activa de forma irreversible. El efecto autoinhibidor del dominio C-terminal puede también regularse mediante la acción de proteín quinasas y fosfatasas, estas enzimas añaden (las quinasas) o eliminan residuos fosfato a residuos serina o treonina del dominio autoinhibidor. Por ej., uno de los mecanismo de respuesta a patógenos en tomate es la activación de

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fosfatasas que eliminan residuos fosfato del dominio autoinhibidor de las ATPasas-H + del plasmalema. De esta forma, activan estas enzimas que forman parte de la cascada de respuestas que activan los mecanismos de defensa de las plantas.

Tabla 2.4. Características de las tres clases de enzimas que bombean protones. Propiedad Tipo F (tipo F0F1) Localización celular Procariotas Eucariotas

ATPasas Tipo P (tipo E1E2)

Membrana Plasmática

Membrana Plasmática

Mitocondria Cloroplasto

Membrana Plasmática, RE

Velocidad (ion/segundo) H+

Iones Transportados

Pirofosfatasa Tipo V (tipo Tp) Endomembranas

¿Membrana Plasmática? Tonoplasto

60 (variable)

60 (variable)

38 a 82

H+, Na+, K +, Ca2+

H+

H+

Inhibidores

Azida

Ortovanadato

Bafilomicina A1 Nitrato

1,1-Difosfato

Intermediario Covalente

Ninguno

Aspartil fosfato

Ninguno

Ninguno

Estequiometría H+ : ATP Función Nº subunidades diferentes Periféricas Intrínsecas

2a 3

Síntesis de ATP

5 (F1) 3-8 (F0)

Nº genes ( Arabidopsis) Masa molecular

500 kDa

1

2a3

1H+ : 1 PPi

Hidrólisis de ATP

Hidrólisis de ATP

Hidrólisis de PPi

0 1

≥ 2 (plantas) ≥ 1 (plantas)

1

>10

4 (16 kD, subunidad c) 1 (subunidad C)

1

100 kDa

750 kDa (complejo) 8 a 10 subunidades diferentes

81 kDa

Nota: Los nombres antiguos aparecen entre paréntesis. Adaptado de Azcón-Bieto y Talón, 1993 y Sze et al., 1999.

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Además de las ATPasas de H +, las plantas poseen en el plasmalema un segundo tipo de bomba primaria que también pertenece a las ATPasas de tipo P: una Ca2+-H+ ATPasa. Esta enzima excreta Ca 2+ del citosol al tiempo que incorpora H + en un proceso dependiente de ATP. Esta bomba es también de tipo P ya que el bombeo de Ca 2+ requiere la formación de un intermediario fosfatado durante la catálisis. La contribución de esta bomba a la acumulación de energía en el plasmalema es muy pequeña ya que, además de ser menos electrogénica que la ATPasas de H +, es mucho menos activa que ésta. Su función es evacuar el Ca 2+ del citoplasma, para mantener su concentración en torno a 0.1 µM es este compartimento celular. Conviene recordar que el calcio es un ion muy importante y su concentración debe regularse de forma muy estricta. La pared celular y el espacio apoplástico son ricos en calcio pero la concentración del Ca 2+ en el citosol se mantiene a niveles muy bajos a pesar del fuerte gradiente electroquímico para la difusión del Ca 2+ hacia el interior de la célula. Pequeñas fluctuaciones en la concentración de Ca 2+ citosólico alteran drásticamente la actividad de muchas enzimas (muchas enzimas se inhiben a concentraciones de calcio superiores a 1 µ M). La regulación de los niveles de calcio intracelulares se llevan a cabo controlando la apertura de los canales iónicos de Ca 2+ que permiten su difusión a la vacuola y al retículo endoplásmico; que son los principales reservorios de este ion en el protoplasma y modulando la actividad de las bombas Ca 2+-H+ ATPasa, que conducen el Ca2+ del citosol al espacio apoplástico. Membrana plasmática

Dominios transmembrana

Espacio extracelular

Dominio regulador

Citoplasma

Figura 2.17. Representación bidimensional de la bomba ATPasa H + del plasmalema. Esta enzima posee diez dominios transmembrana (representados en color verde) y un dominio autoinhibidor en el extremo C-terminal. Tomado de Taiz & Zeiger, 2002. 36



6.2.2.- Las bombas primarias del tonoplasto: la ATPasa de protones y la pirofosfatasa Aunque se sabe desde hace mucho tiempo que la vacuola es el compartimento celular donde las células vegetales almacenan agua y solutos, hace relativamente poco tiempo que se conocen los mecanismos responsables, asociados al tonoplasto, de esta función. La fuerza que impulsa la acumulación de agua y que permite la generación de la turgencia en las células es osmótica 3. A su vez, el origen del potencial osmótico es la acumulación de iones, principalmente el K +, en la vacuola. El tonoplasto, que es la membrana que delimita la vacuola, regula el tráfico de iones y de otros metabolitos entre el citosol y la vacuola, como el plasmalema regula la entrada y salida de solutos de la célula. Sin embargo, el transporte del tonoplasto ha permanecido relativamente inaccesible hasta que no se han desarrollado los métodos adecuados para la obtención de vacuolas intactas y vesículas de tonoplasto. La energía que se emplea en el tonoplasto para mover iones está asociada a la actividad de bombas primarias. En el tonoplasto existen dos tipos de bombas primarias y ambas bombean protones hacia el interior de la vacuola. Por esta razón, el lumen vacuolar es típicamente ácido y positivo. Medidas directas con microelectrodos indican que el pH vacuolar se encuentra alrededor de 5, aunque el pH de las vacuolas de algunas especies es muy bajo, y pueden tener un pH de 1. Este fenómeno se conoce como hiperacidificación (ver Tabla 2.5). La hiperacidificación vacuolar es la responsable del sabor agrio de ciertos frutos (limón) y vegetales (ruibarbo). Estudios bioquímicos recientes realizados en frutos de limón sugieren que el bajo pH de las vacuolas de estos frutos se debe al efecto combinado de dos factores: (1) la baja permeabilidad del tonoplasto a los protones, que permite la generación de un gradiente de pH acentuado; (2) la presencia de bombas primarias especializadas, concretamente V-ATPasa-H +, capaces de bombear protones al interior de la vacuola de forma muy efectiva. Otro factor importante que contribuye al sabor agrio de estos frutos y vegetales es la acumulación de ácidos orgánicos como el cítrico, málico, y oxálico, los cuales contribuyen a mantener un pH bajo en la vacuola ya que estos compuestos actúan como tampones.

3

Este proceso es de gran relevancia ya que la elongación de las células vegetales depende de la entrada de agua a las vacuolas, por tanto, el potencial osmótico de éstas debe mantenerse en unos valores adecuados para permitir la entrada de agua desde el citoplasma. El valor del potencial osmótico ( ψs) para la soluciones diluidas ideales es ψs= -RT Ci, donde Ci es la concentración de solutos del sistema. El valor del potencial osmótico es idéntico al de presión osmótica ( π), pero poseen signo opuesto es decir: ψs= -π. En otras palabras, la presión osmótica es siempre positiva y el potencial osmótico siempre posee valores negativos.

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La actividad de las bombas electrogénicas de protones presentes en el tonoplasto hace que el potencial de membrana que soporta el tonoplasto sea mucho menor que el soportado por el plasmalema y éste oscila, según la especie considerada, entre 5-20 mV (dentro de la vacuola positivo). Otro aspecto a tener en cuenta es el mantenimiento de la electroneutralidad. Para ello, debido a la entrada masiva de H +, se transportan hacia el lumen vacuolar aniones como el Cl - o el malato2- procedentes del citosol a través de canales iónicos. La existencia de este transporte de aniones permite no sólo mantener la electroneutralidad sino que, además, se genere un gradiente de potencial electroquímico de protones muy marcado (téngase en cuenta el valor de pH en la vacuola, pH 5, y en el citoplasma, pH entre 7.0-7.5). La componente eléctrica de la fuerza ion motriz, generada por estas bombas, impulsa la entrada de aniones a la vacuola y, el gradiente de pH (es decir, la asimetría en la concentración de H +) se va a aprovechar para incorporar cationes y azúcares dentro de la vacuola, en contra de su gradiente electroquímico, mediante un sistema de transporte activo secundario. Este tipo de transporte se estudiará en detalle en el siguiente apartado.

Tabla 2.5. pH vacuolar de varias especies hiperacidificantes

Tejido

Especie

pH

Frutos

Lima (Citrus aurantifolia) Limón (Citrus limonia) Cereza (Prunus cerasus) Pomelo (Citrus paradisi)

1.7 2.5 2.5 3.0

Hojas

Oxalis deppei Begonia semperflorens Begonia lucerna Oxalis sp. Rumex sp. Opuntia phaeacantha*

1.3 1.5 0.9-1.4 1.9-2.6 2.6 1.4 (6:45 a.m.) 5.5 (4:00 p.m.)

* El pH vacuolar de Opuntia fluctúa a lo largo del día. Esta planta, como muchas suculentas, presenta un tipo especial de fotosíntesis denominada metabolismo ácido de las crasulaceas (CAM), que provoca un descenso del pH vacuolar durante la noche.

6.2.2.1.-

La ATPasa de protones vacuolar

La identificación de los dos tipos de bombas presentes en el tonoplasto ha sido posible gracias al desarrollo de técnicas que permiten el aislamiento de vacuolas purificadas. Gracias a estos trabajos se descubrió la presencia en el tonoplasto de un nuevo tipo de bomba ATPasa-H +, que como hemos comentado transporta protones hacia el interior de la vacuola. La ATPasa de protones vacuolar (V-ATPasa) difiere de la ATPasa de protones del plasmalema (P-ATPasa) en su estructura, mecanismo de reacción y tipo de inhibidores (ver Tabla 2.4). La ATPasa de protones vacuolar se 38



denomina de tipo V y se parece mucho más a otras bombas de protones - las bombas FATPasas- presentes en mitocondrias y cloroplastos 4. Mientras que las ATPasa-H + de tipo P, presentes en el plasmalema, están constituidas por un solo péptido de 100 kDa, las ATPasa-H+ de tipo V son complejos enzimáticos de gran tamaño, aproximadamente de 750 kDa, compuestos por al menos 10 subunidades diferentes. Al igual que las FATPasas, las subunidades de las V-ATPasas se organizan en un complejo catalítico periférico, de apariencia lobulada muy característica, V 1, y un complejo canal integrado en la membrana, Vo que facilita el transporte de protones (ver Fig. 2.18). Por la similitud existente entre las F-ATPasas y las V-ATPasas se ha asumido que operan como pequeños motores giratorios. Además, las V-ATPasas durante su acción no se forma un intermediario fosforilado, y por tanto, no son sensibles a ortovanadato, un inhibidor de las PATPasas. Sin embargo, las V-ATPasas se inhiben específicamente con el antibiótico bafilomicina y por nitrato, compuestos que no afectan a las P-ATPasas (ver Tabla 2.4).

Figura 2.18. Modelo del motor rotatorio de una V-ATPasa. Como se aprecia en la figura este complejo está constituido por varios polipéptidos. El complejo catalítico V 1 se puede disociar fácilmente del tonoplasto. Los distintos componentes estructurales de este complejo catalítico se nombran con letras mayúsculas (A-H). El complejo V 0, forma un poro que permite el transporte de H + hacia el interior del lumen vacuolar. Los 4

Es recomendable visitar la página web del profesor W. Junge. En ella se ilustra entre otros aspectos la rotación del complejo ATP sintasa del cloroplasto en la sección titulada “From light to ATP”. http://www.biologie.uni-osnabrueck.de/Biophysik/Junge/overheads.html

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distintos polipéptidos que forman el complejo V 0 se designan con letras minúsculas. Se ha propuesto que la hidrólisis del ATP se cataliza en cada una de las subunidades A del complejo catalítico V1. Éstas actúan de forma secuencial y permiten la rotación del eje D y de las 6 subunidades c. Tomado de la página web del Dr. Forgac (Tufts University) http://www.tufts.edu/sackler/physiology/faculty/forgac/

6.2.2.2.-

La pirofosfatasa de H +

En el tonoplasto, se encuentra otro tipo de bomba primaria de protones, la pirofosfatasa de H + (H+-PPasa), que participa junto con la V-ATPasa en la generación del gradiente de protones a través del tonoplasto. Esta enzima consta de un único péptido que tiene un peso molecular de unos 80 kDa. La H +-PPasa utiliza la energía resultante de la hidrólisis del pirofosfato inorgánico (PP i) para bombar protones al interior de la vacuola. Conviene destacar que las plantas, al ser organismos sésiles, tienen un metabolismo más versátil que el de los animales. Así, las células vegetales pueden usar la energía de la hidrólisis del pirofosfato en algunas reacciones glicolíticas al igual que en el transporte de protones en el tonoplasto. La H+-PPasa y otras enzimas que utilizan PP i son inducidas en algunas plantas cuando los niveles de oxígeno son bajos (hipoxia) o por frío ( chilling). En estas situaciones, los niveles de ATP son muy reducidos por lo que se cree que estas enzimas representan un sistema de reserva para mantener las actividades celulares esenciales en situaciones de estrés. Aunque la energía libre liberada por la hidrólisis del PP i es menor que la liberada tras la hidrólisis del ATP, esta falta es compensada por el hecho de que la H +PPasa vacuolar sólo transporta un protón por cada molécula de PP i hidrolizada, mientras que la V-ATPasa parece transportar dos protones por molécula de ATP hidrolizada. Así, la energía disponible por ion de H + transportado es aproximadamente la misma, y cada enzima puede, de esta forma, generar el mismo gradiente de potencial electroquímico de H+. 6.2.2.3. Los transportadores ABC Otra familia de transportadores activos presentes en el tonoplasto y que obtienen su energía de la hidrólisis del ATP son los transportadores denominados transportadores ABC (del inglés, ATP-binding cassette) (ver Fig. 2.22). Estos transportadores utilizan la energía procedente de la hidrólisis del ATP para transportar moléculas orgánicas, de tamaño molecular elevado, a través de la membrana, independientemente del gradiente de H + o del potencial electroquímico. Como las H +ATPasas de tipo P, los transportadores ABC forman un intermediario fosforilado durante la catálisis, y por tanto se inhiben con ortovanadato.

6.3.- EL TRANSPORTE SECUNDARIO ACTIVO UTILIZA LA ENERGÍA AL MACENADA EN LA FUERZA ION MOTRIZ

La fuerza protón motriz generada por el transporte electrogénico de H + por las bombas primarias se puede utilizar para llevar a cabo el transporte de otras substancias en contra de su gradiente de potencial electroquímico. En la Figura 2.19 se muestra 40



cómo podría operar este tipo de transporte. El transportador es una proteína transmembrana con un lugar de unión para los protones accesible desde el exterior de la membrana. La unión con el protón hace accesible otro lugar de unión. Este lugar se une al ion o molécula que se va a transportar activamente. Cuando las dos moléculas están ligadas al transportador, éste sufre un cambio conformacional quedando los lugares de unión expuestos en el otro extremo de la membrana. El ciclo se completa con la difusión del protón y de la otra molécula ligada de sus lugares de unión, provocando que el transportador vuelva a su conformación original.

Figura 2.19. Modelo hipotético del transporte secundario activo. La energía conductora del proceso puede acumularse como fuerza protón motriz (representado por un triángulo en la derecha de A) y puede emplearse para incorporar un substrato (S) en contra de su gradiente de concentración (triángulo de la izquierda). (A) En la conformación inicial, los lugares de unión a la proteína están expuestos hacia la cara externa y pueden captar un protón. (B) Esta unión provoca un cambio conformacional que permite la unión a la proteína del substrato, S. (C) La unión con S da lugar a otro cambio conformacional de forma que quedan expuestos los lugares de unión y sus substratos en el interior de la célula. (D) La liberación del protón y de S en el interior de la célula restaura la 41



conformación original del transportador y permite que éste inicie un nuevo ciclo. Tomado de Taiz y Zeiger, 1998. El ejemplo representado en la Figura 2.19 se denomina transporte unidireccional o simporte (symport ) porque las dos substancias se mueven en la misma dirección a través de la membrana. En el transporte de intercambio o antiporte (antiport ) la entrada de protones a la célula “cuesta abajo” favorece la salida de un soluto en contra de su gradiente electroquímico (“cuesta arriba”) (ver Fig.2.20). En ambos tipos de transporte secundario, el ion o el soluto que se transporta junto con los protones lo hace en contra de su gradiente electroquímico, por lo que es un transporte activo. Sin embargo, la energía conductora de este transporte proviene de la fuerza ion motriz, y no de la hidrólisis del ATP. En el transporte secundario la entrada de protones disipa la fuerza ion motriz generada por las bombas primarias y despolariza la membrana. A diferencia del transporte primario, que genera una diferencia de potencial eléctrico y es, por tanto, electrogénico, el transporte secundario disipa la diferencia de potencial acumulada en la membrana y es electroforético. Teniendo esto en cuenta podemos afirmar que una célula depende de un sistema de transporte activo primario acoplado a la hidrólisis del ATP para establecer un gradiente de potencial electroquímico de un ion, por ejemplo, en el caso de las células vegetales de H +. Y, utilizando este gradiente, otros muchos iones o compuestos orgánicos pueden transportarse junto con uno o dos protones en contra de su gradiente. Así, los H + circulan a través de la membrana, hacia el exterior mediante las bombas primarias y regresan a la célula mediante los transportadores activos secundarios.

Figura 2.20. Dos ejemplos de transporte activo secundario acoplados a un gradiente de protones. (A) Simporte, la energía disipada por la entrada de los protones a la célula es acoplada a la incorporación de una molécula a la célula, por ejemplo un azúcar. (B) Antiporte, la energía disipada por el regreso de los protones a la célula es acoplada con la salida de una molécula de la célula, por ejemplo el ion sodio. En ambos casos, el substrato en cuestión se mueve en contra de su potencial electroquímico. Tanto substratos neutros como cargados puede ser transportados por este proceso. Tomado de Taiz y Zeiger (1998). 42



En las plantas y en los hongos, los azúcares y los aminoácidos se toman mediante transportadores de tipo simporte. Por consiguiente, cuando se añade glucosa a células vegetales sumergidas en un medio salino simple, se observa simultáneamente una reducción en el potencial de membrana, un aumento del pH externo y la toma de glucosa (Fig.2.21). La disminución del potencial de membrana se debe a la carga positiva (H+) que entra en la célula junto con la glucosa. Esta despolarización de la membrana es transitoria, sin embargo, debido a la reducción del voltaje de la membrana, la bomba de protones trabaja más deprisa para restablecer el voltaje inicial y el gradiente de pH mientras se produce la toma de glucosa. Se piensa que la mayoría de los gradientes iónicos a ambos lados de la membrana en las células vegetales superiores se generan y se mantienen por el gradiente de potencial electroquímico de H +. Y este gradiente de H + se genera por la acción de las bombas de protones electrogénicas. Se cree que el Na + se transporta fuera de la célula mediante un transportador tipo antiporte Na +-H+ y que el Cl -, NO3-, H2PO4-, sacarosa, aminoácidos y otras substancias entran en la célula mediante transportadores tipo simporte específicos. El potasio cuando se encuentra a muy bajas concentraciones en el exterior se incorpora a la célula mediante un transportador tipo simporte activo, pero a altas concentraciones el K + puede entrar por difusión mediante canales específicos de K +. Sin embargo, hay que tener en cuenta que incluso el transporte a través de un canal está mediado por una ATPasa de H +, ya que la difusión del K + viene dada por el potencial de membrana, el cual se mantiene en valores más negativos que los del potencial de equilibrio para el K + por la acción de la bomba electrogénica. En la Figura 2.22 se representan varios procesos de transporte localizados en el plasmalema y en el tonoplasto.

Figura 2.21. Efecto de la incorporación de glucosa sobre el potencial de membrana y el pH externo de la planta acuática Lemma gibba. La incorporación de glucosa a la célula se lleva a cabo mediante cotransporte con protones (ver figura de la izquierda). En la 43



figura de la derecha se observa que antes de la adición de glucosa el pH del medio externo es de 5.7 y el potencial de membrana de -250 mV. Cuando se añade 50 mM de glucosa al medio, se observa un aumento del pH, lo que indica que los protones “desaparecen” del medio externo, y al mismo tiempo se observa que el potencial de membrana disminuye, debido a la entrada de H + a la célula. Estas observaciones son las esperadas durante el cotransporte de glucosa y protones. Con el tiempo, un aumento en la actividad de la bomba restablece los valores de pH y de potencial de membrana iniciales. Tomado de Taiz y Zeiger (1998) y Campbell & Reece (2002).

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Figura 2.22. Esquema general con el que se pretende dar una visión general de los distintos canales iónicos y carriers presentes en el tonoplasto y plasmalema de las células vegetales. Tomado de Taiz y Zeiger (2002)

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6.4.- ANÁLISIS CINÉTICOS PERMITEN ELUCIDAR LOS MECANISMOS DE TRANSPORTE

Hasta ahora hemos descrito el transporte celular en términos energéticos. Sin embargo, el transporte celular puede estudiarse mediante el empleo de la cinética enzimática ya que, como hemos visto, el transporte mediado por proteínas transportadoras o carriers implica una unión y una disociación de los solutos al “ sitio activo” de las proteínas. Una ventaja de las aproximaciones cinéticas es que abre nuevas perspectivas a la hora de analizar la regulación del transporte. Así, en la difusión la velocidad de incorporación de una molécula es directamente proporcional a la concentración externa de la molécula transportada. Por el contrario, en el transporte mediado por un carriers el transporte se satura, es decir tiende a una velocidad máxima ( V max) que no puede excederse y que es independiente de la concentración del soluto. V max hace referencia a que el lugar de unión del transportador está siempre ocupado, ligado al soluto (ver Fig. 2.23A) y es la concentración del transportador, y no la concentración del soluto, la que se convierte en el factor limitante del proceso. La constante K m, que equivale a la concentración de soluto que determina una velocidad de incorporación igual a la mitad de la velocidad máxima de transporte, refleja las propiedades de un lugar de unión dado. Es decir, la velocidad de transporte, v, se ajusta a una curva de Michaelis-Menten: v= V max S/ (K m +S)

donde S sería la concentración del ion, o soluto, en el medio externo. En general conviene tener en cuenta que el transporte de un ion puede ser tanto activo como pasivo cuando se analiza un amplio rango de concentraciones para un soluto dado. En la Figura 2.23B se muestra la incorporación de sacarosa por los protoplastos de soja en función de la concentración externa de sacarosa. La incorporación aumenta bruscamente con la concentración y comienza a saturarse a una concentración de 10 mM. A concentraciones superiores a ésta, la toma de glucosa sigue una cinética lineal y no saturable. La inhibición de la síntesis de ATP bloquea el transporte saturable pero no afecta al lineal. Estos resultados parecen indicar que la toma de glucosa a bajas concentraciones se realiza mediante un transportador activo (transportador tipo simporte sacarosa-H +) y a concentraciones mayores, la sacarosa penetra en la célula a favor de su gradiente de concentración y, por tanto, su incorporación no se ve afectada por la presencia de inhibidores de la síntesis del ATP y, parece ser que el transporte no saturable se podría llevar a cabo mediante un transportador de baja afinidad. Algunos estudios cinéticos del transporte de iones a través de la raíz muestran varias componentes saturables para un mismo soluto (ver Fig. 2.24). Estos resultados se han interpretado asumiendo la presencia de diferentes transportadores para un mismo soluto en el mismo tejido, cada uno de ellos con un valor de K m diferente para el soluto transportado (Epstein, 1972). En el caso del K +, recientemente, se ha caracterizado el canal de la entrada de K + y se han secuenciado y clonado los genes de los canales moduladores de la entrada de K + (inward-rectifying K + channels) y de los transportadores de tipo simporte. El sistema de transporte de alta afinidad responsable de la toma de K + a bajas concentraciones parece estar mediado por un transportador secundario activo tipo simporte que incorporaría K + junto con H+ y que también 46



permite la entrada Na+ en lugar de H +. Recientemente, se ha aislado un gen en trigo denominado HKT1, que codifica un transportador de alta afinidad por el K + y que incorpora K + en cotransporte con Na +. La importancia fisiológica de este sistema de transporte que utiliza el gradiente de potencial electroquímico favorable a la entrada de Na+ para impulsar la incorporación de determinados nutrientes esenciales está aún por determinar. Por otra parte, análisis cinéticos detallados del sistema de transporte de baja afinidad (toma de K + a altas concentraciones de K +) revela que la velocidad de incorporación de K + no es saturable, como inicialmente se pensaba, luego, el transporte de baja afinidad del K + se explicaría de forma más adecuada si se considera que la toma de K + se realiza a través de un canal iónico.

Carriers

d a d i c o l e V

Difusión

Concentración externa del soluto a transportar

a s o r a c a s ) e h d x n s a ó l i c l u a é r o c p 6 r 0 o 1 c x n l i e o d m n d ( a d i c o l e V

Observada

Predicha por la cinética de Michaelis-Menten

Concentración sacarosa (mM)

Figura 2.23. El transporte mediado por un transportador muestra cinéticas de saturación, debido a la unión del soluto a transportar con el carriers. Sin embargo, la difusión a través de un canal iónico es directamente proporcional a la concentración del soluto transportado (izquierda). El tipo de transporte de un soluto puede cambiar en función de la concentración de éste en el medio (derecha). Por ejemplo, a bajas concentraciones (1 a 10 mM), la velocidad de incorporación de la sacarosa por las células de soja muestra una cinética saturable, típica de un transportador o carriers. A concentraciones de sacarosa superiores, si el transporte de sacarosa se llevara a cabo con este transportador la velocidad máxima sería de 57 mol por 10 6 células por hora pero, lo que se observa es una velocidad de incorporación mayor y que ésta aumenta de forma lineal durante un amplio rango de concentraciones (50 mM), lo que sugiere la existencia de otro tipo de transportador de sacarosa, probablemente un transportador de baja afinidad por el substrato. Tomado de Taiz y Zeiger (2002).

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Figura 2.24. El transporte de potasio en las raíces de cebada muestra dos fases diferenciadas. Este tipo de cinética de incorporación se denomina cinética bifásica y sugiere la existencia de dos mecanismos para el transporte de potasio. El primero, sería un sistema de transporte de alta afinidad, activo, de tipo simporte y con un valor de K m para el potasio entre 0.02 a 0.03 mM y, el segundo, sería un sistema de baja afinidad (que puede o no mostrar cinéticas de saturación) debido a la difusión del potasio a través de un canal. Tomado de Taiz y Zeiger, 1998. Se han observado cinéticas de absorción parecidas a las mostradas en la Fig. 2.24 para otros cationes y aniones. Así por ej., cuando la raíz dispone de gran cantidad de sulfato, el sistema de absorción es de baja afinidad y constitutivo (se expresa siempre y por tanto, continuamente disponible). Si el contenido de sulfato en el medio desciende hasta valores inferiores al umbral crítico (que causan deficiencia), entonces se induce la formación de un segundo transportador de sulfato de elevada afinidad capaz de “trabajar” de forma efectiva aun a concentraciones de sulfato micromolares.

7.-

TRANSPORTE DE IONES EN LA RAÍZ

Los nutrientes minerales absorbidos por la raíz son transportados a la parte aérea arrastrados por la corriente transpiratoria a través del xilema. No sólo la toma inicial de nutrientes es un proceso muy regulado y altamente específico, también lo es el movimiento posterior de los iones minerales desde la superficie de la raíz al córtex y, a continuación, al xilema. El transporte iónico a través de los distintos tejidos que constituyen la raíz obedece las mismas leyes biofísicas que gobiernan el transporte celular. Sin embargo, la anatomía de las raíces impone ciertas restricciones especiales al movimiento de los iones. A continuación, vamos a discutir las rutas y los mecanismos

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involucrados en el movimiento radial de los iones desde la superficie de la raíz a los vasos conductores del xilema. 7.1.- LOS SOLUTOS SE MUEVEN TANTO POR EL APOPLASTO COMO POR EL SIMPLASTO

Hasta ahora, en nuestra discusión del transporte celular de iones no hemos incluido a la pared celular. Cuando hablamos del transporte de pequeñas moléculas, la pared celular podemos considerarla como un entramado de polisacáridos y proteínas abierto a través del cual los nutrientes minerales pueden difundir fácilmente (ver Apéndice D: La pared celular). Compartimentos: célula Pared celular citosol vacuola

plasmodesmos

Simplasto: espacio constituido por el citoplasma de las distintas células que presenta continuidad a través de los plasmodesmos Ruta Transmembrana. Los solutos y el agua se mueven atravesando de forma reiterada el plasmalema y las paredes celulares. También pueden penetrar al interior de la vacuola.

Tonoplasto

Plasmalema

Compartimentos: tejidos Simplasto

Apo plas to

Rutas de transporte lateral

Apo pl asto : espacio extraprotoplasmático constituido por las paredes celulares y los espacios aéreos y que puede presentar continuidad en el seno de un tejido

apoplasto simplasto

Ruta Simplásti ca: las sustancias que entran al citoplasma, una vez que han atravesado el plasmalema, pueden desplazarse célula a célula vía plasmodesmos. La compleja estructura de los plasmodesmos probablemente regula esta vía de transporte. (Recordad que por esta vía se desplazan ciertas proteínas, ARNm y otras moléculas grandes como los virus)

Ruta Apoplástica. El agua y los solutos disueltos en ésta difunden a través de las paredes celulares y de los espacios aéreos

Figura 2.25. Principales compartimentos presentes en las células vegetales y rutas de transporte. A) La pared celular, el citosol y las vacuolas son los principales compartimentos presentes en la mayoría de células vegetales. El tráfico de sustancias entre estos compartimentos está regulado por proteínas transportadoras específicas (canales y carriers) presentes en el plasmalema y en el tonoplasto. B) A nivel tisular existen dos compartimentos: el apoplasto y el simplasto. Esto va a proporcionar a los tejidos u órganos de las plantas tres rutas para el movimiento radial de solutos, transmembrana, simplástica y apoplástica. Conviene tener en cuenta que un soluto puede “pasar” de una ruta de transporte a otra. Debido a que todas las células vegetales están rodeadas por la pared celular, los iones pueden desplazarse a lo largo de un tejido a través de las paredes celulares sin entrar en 49



el interior de célula (ver figura 2.25). Este espacio continuo constituido por todas las paredes celulares se denomina espacio libre o apoplasto.5 Podemos determinar el volumen del apoplasto de un tejido simplemente comparando la toma de agua marcada con 3H y de manitol marcado con 14C. El manitol es un azúcar-alcohol no permeable que se equilibra en el espacio libre pero que no puede entrar a la célula. El agua, por el contrario, permea libremente tanto en la célula como en la pared celular. Las medidas de este tipo normalmente muestran que entre el 5 y el 20 % del volumen de un tejido vegetal está ocupado por las paredes celulares.

Lámina media plasmalema

Partículas proteicas adheridas a la membrana externa del RE

Pared celular tonoplasto

Retículo endoplásmico (RE)

Citoplasma

vacuola plasmodesmos Partículas p roteicas presentes en la Desmotúbulo cara interna del RE que forman el denominado “ central rod” y por tanto, los plasmodesmos carecen de lumen

Partículas proteicas adheridas a la membr ana externa del RE

Partículas proteicas “ incrustadas” en la membrana plasmática que rodea al plasmodesmo

“ Central rod” Plasmalema

Partículas proteicas “ incrustadas” en la membrana plasmática “Manga” citoplásmica

Microcanales

Sección transversal de un plasmodesmo

Figura 2.26. Diagrama ilustrativo de cómo los plasmodesmos conectan el citoplasma de células adyacentes. Los plasmodesmos son conexiones citoplasmáticas que atraviesan la pared celular entre células contiguas. Al hallarse unidos entre sí los protoplastos de las células vivas por medio de plasmodesmos, constituyen un simplasto único. El movimiento de sustancias a través de los plasmodesmos se denomina transporte simplástico. Dicho transporte puede controlarse, regulando el tamaño de los microcanales y permitir la entrada de moléculas de mayor tamaño. Tomado de Taiz y Zeiger, 2002 y Buchanan et al., 2000. La membrana plasmática de las células vegetales, junto con dominios específicos del retículo endoplásmico, forman una estructura denominada plasmodesmos. Los plasmodesmos son puentes citoplásmicos (rodeados por membrana) que atraviesan las paredes celulares y que permiten la comunicación entre células adyacentes. Como resultado de estas uniones, el citoplasma no aparece como un en espacio individualizado 5

Apoplasto. El apoplasto puede definirse como el espacio externo a la membrana plasmática donde se encuentra la pared celular y que puede presentar continuidad en el seno de un tejido

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e independiente de las células contiguas, si no que se origina un compartimento continuo, interconectado vía plasmodesmos, que recibe el nombre de simplasto (Fig. 2.25). En consecuencia no sólo las paredes celulares forman un espacio continuo en el seno de un tejido. En células animales por el contrario, cada célula posee su propia membrana y la comunicación célula a célula se lleva a cabo mediante puentes proteicos denominados unión en hendidura o gap que permiten el paso directo de pequeñas moléculas entre células. Los plasmodesmos son poros cilíndricos de 20-60 nm de diámetro. Si se observa un plasmodesmo en sección transversal con el microscopio electrónico de transmisión (MET), se advierte que están constituidos por una doble membrana: la externa corresponde a la membrana plasmática y, la interna corresponde al desmotúbulo, que es un túbulo del retículo endoplasmático. Entre ambas membranas hay un espacio citoplásmico denominado manga citoplasmática. Los componentes de la cara interna de la biomembrana que forma el desmotúbulo se fusionan entre sí, de manera que el desmotúbulo no tiene lumen (Fig. 2.26). El transporte entre célula y célula está limitado a la "manga citoplasmática" que rodea al desmotúbulo. Estudios con microscopía electrónica de alta resolución han demostrado que hay proteínas globulares de enlace ("linking proteins") incrustadas en la membrana plasmática que rodea al plasmodesmo, y en la cara externa del desmotúbulo. Estas proteínas dividen la manga citoplasmática en microcanales que determinan el tamaño máximo de las moléculas que pueden desplazarse por difusión al mismo tiempo que establecen el tráfico selectivo de macromoléculas, que parece ocurrir por un proceso análogo al transporte de moléculas entre el núcleo y citoplasma. Así, mediante inyección de colorantes y estudios de resistencia eléctrica de las células que contienen gran número de plasmodesmos, se ha demostrado que el agua, los iones y los pequeños solutos pueden moverse célula a célula libremente a través de los plasmodesmos.

7.2.- LOS IONES SE MUEVEN POR LA S RAÍCES TANTO POR EL SIMPLA STO COMO POR EL A POPLASTO

Si nos fijamos en la Figura 2.27, en la cual se representan los rasgos más distintivos de la estructura primaria de una raíz, se puede apreciar que el apoplasto forma una sistema continuo desde la superficie de la raíz hasta el córtex pero, en el límite entre el el córtex y el cilindro vascular (la estela) se encuentra una capa de células especializadas: la endodermis. Las paredes radiales y tangenciales de la endodermis están impregnadas con lignina y suberina y estos depósitos hidrofóbicos se conocen como banda de Caspari . La existencia de la banda de Caspari en las células de la endodermis supone, dada su hidrofobicidad, una barrera infranqueable en el camino hacia el xilema: tanto el agua como los nutrientes deben obligatoriamente atravesar el plasmalema de las células que componen la endodermis. La permeabilidad, selectividad y afinidad de los canales y transportadores localizados en el plasmalema de las células de la endodermis determinan, en última instancia, qué solutos y a qué velocidad se incorporan o se liberan. Teniendo en cuenta todo lo anterior, un ion puede desplazarse en dirección radial en la raíz siguiendo la ruta apoplástica , transmembrana o simplástica . Pero, 51



independientemente de la ruta seguida, los iones deben entrar al simplasto antes de entrar a la estela debido a la presencia de la banda de Caspari. Una vez que el ion ha entrado a la estela a través de las conexiones simplásticas de la endodermis, difunde de célula a célula hasta llegar al xilema. Finalmente, el ion vuelve a entrar al apoplasto y difunde hacia las traqueidas o los elementos conductores del xilema.

Banda Endodermis de Caspari

Rutas simplástica y transmembrana

periciclo

xilema

floema

córtex

epidermis

Ruta apoplástica

Figura 2.27. Movimiento radial de iones a través de la raíz. El movimiento radial del agua y los nutrientes a través de la raíz puede seguir tres rutas: transmembrana, simplástica y apoplástica. La existencia de la banda de Caspari interrumpe el transporte vía apoplasto y los solutos deben atravesar el plasmalema de la endodermis. Esto desempeña una función decisiva, la de barrera selectiva, pues las fases lipídicas de las membranas biológicas son barreras efectivas contra la difusión no selectiva de iones hacia el cilindro central de la raíz. (Recordad que las barreras de semipermeabilidad celular no están en la pared celular, sino en las membranas y que, las cualidades transportadoras de una biomembrana se determinan a partir de las proteínas transportadoras que contiene). Tomado de Taiz y Zeiger (2002). La presencia de la banda de Caspari es de gran importancia ya que a) impide que el ion pueda regresar mediante difusión hacia el exterior, es decir hacia el suelo, por la ruta apoplástica y, b) permite que la planta pueda mantener una concentración iónica más elevada en el xilema que en la solución del suelo que rodea a la raíz. Es decir, la raíz como un todo, por la diferencia de concentración osmótica entre el cilindro central y el cortical y la existencia de una barrera semipermeable de paso obligatorio en el 52



transporte radial (endodermis), actúa físicamente como un osmómetro y puede generar así una presión hidrostática o presión radicular 6que puede facilitar la toma de nutrientes, en condiciones de baja transpiración, y reducir la cavitación. 7.3.- LAS CÉLULAS PARENQUIMÁTICAS PARTICIPAN EN LA CARGA DEL XILEMA

Una vez que los iones se encuentran en el simplasto deben pasar, desde la estela a los elementos conductores del xilema para que puedan ser transportados hacia la parte aérea de la planta. Como los elementos conductores del xilema son células muertas, los iones deben salir del simplasto al apoplasto y, atravesar la membrana plasmática por segunda vez. El proceso por el cual los iones salen del simplasto y entran en las células conductoras del xilema se denomina carga del xilema. La carga del xilema es un proceso que no se conoce todavía con exactitud a pesar de haber sido objeto de numerosos estudios. ¿Cómo pueden llegar los iones al xilema? Pues, como hemos visto a lo largo de este módulo los iones pueden “entrar” al xilema mediante difusión que, como sabemos es un proceso pasivo. Aunque en este proceso de carga del xilema pasiva podría haber alguna etapa (sólo una) en la que pudiera haber un requerimiento de energía metabólica. Esta etapa en la que se podría ser necesaria una fuente de energía metabólica sería el paso de los iones a través de la membrana bien en las células epidérmicas, o del córtex o de las células endodérmicas. Según este modelo de difusión pasiva, los iones se transportaría pasivamente hacia la estela vía simplasto a favor de su gradiente electroquímico, y podrían salir de las células vivas de la estela (posiblemente debido al poco oxígeno disponible en el interior de la raíz; recordad que es necesario el ATP para mantener la actividad de las bombas primarias y que un 6

Otra de las consecuencias de la presencia de la endodermis en la raíz es la existencia de la presión radicular, que se genera en el xilema de la raíz y empuja el agua verticalmente hacia arriba. Cuando la transpiración es muy reducida o nula, como ocurre durante la noche, las células de la raíz pueden aún secretar iones dentro del xilema. Dado que los tejidos vasculares en la raíz están rodeados por la endodermis, los iones no tienden a salir del xilema. De esta manera, el aumento de concentración dentro del xilema causa una disminución del potencial hídrico del mismo, y el agua se desplaza hacia dentro del xilema por ósmosis, desde las células circundantes. Se crea así una presión positiva llamada presión de raíz (presión radicular), que fuerza al agua y a los iones disueltos a subir por el xilema hacia arriba. Las gotas de agua similares al rocío que aparecen a primeras horas de la mañana, en plantas de pequeño porte ponen de manifiesto la existencia de la presión radicular. Estas gotas no son rocío sino que proceden del interior de la hoja, este fenómeno lo conocemos con el nombre de gutación (del latín “gutta”, gota). La presión radicular es menos efectiva durante el día, cuando el movimiento de agua a través de la planta es más rápido, debido a la transpiración. Esta presión no es suficiente para llevar el agua hasta la parte más alta de un árbol de gran porte, más aún, algunas plantas como las confieras no desarrollan presión de raíz. Por lo que su presencia no está generalizada y su intensidad, variable según las especies, suele ser baja.

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cambio en la actividad de éstas provoca un cambio en el potencial de membrana que puede afectar a la actividad de los canales iónicos) a las células conductoras del xilema. Entre los trabajos que apoyan esta hipótesis de difusión pasiva se encuentran los llevados a cabo por Bowling y colaboradores. Estos investigadores determinaron el potencial electroquímico de varios iones en diferentes tejidos radiculares de maíz usando microelectrodos selectivos (ver Fig. 2.28). Observaron que algunos iones como K +, Cl-, Na+, SO42-, y NO3- se toman de forma activa en las células epidérmicas y corticales. Esto provoca un aumento de su potencial electroquímico, lo que facilitaría su transporte pasivo vía simplasto a favor del gradiente de potencial desde estos tejidos hasta el xilema. De hecho, se observa una caída en el potencial electroquímico de los iones estudiados en el punto de liberación al xilema (ver Fig.2.28).

alto Cloro (Cl -) o c i m í u q o r t c e l e l a i c n e t o P

Potasio (K+)

bajo

Solución exterior

Epidermis

Córtex

Endodermis

Parénquima xilemático

Elementos del xilema

Banda de Caspari

Tejidos radiculares

Figura 2.28. Diagrama ilustrativo de los perfiles del potencial electroquímico del potasio y el cloro en raíces de maíz. Para determinar el potencial electroquímico, las raíces se sumergen en una disolución 1mM de KCl y 0.1 mM de CaCl 2. El electrodo de referencia se coloca en la solución que baña la raíz y el electrodo de medida (específico para ion) se introduce en los diferentes tejidos radiculares. En el eje horizontal se muestran los diferentes tejidos que se encuentran en una sección transversal de la raíz. El incremento substancial de potencial electroquímico para el K + y el Cl- entre la solución externa y la epidermis indica que los iones son incorporados en la raíz mediante un mecanismo de transporte activo. Por el contrario, el potencial disminuye en el xilema, lo que indica que los iones son transportados al xilema mediante difusión a favor del gradiente de potencial electroquímico. Tomado de Taiz y Zeiger, 1998.

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Sin embargo, existen en la literatura otros estudios que indican que la etapa final de la carga del xilema se lleva a cabo mediante un proceso activo en la estela (Lüttge y Higinbotham, 1979). Con un tipo de “dispositivo” como el que aparece en la Figura 2.29, es posible realizar medidas simultáneas de la toma de iones dentro del citoplasma de las células epidérmicas o corticales y de la carga del xilema. Mediante tratamientos con inhibidores y hormonas vegetales, se ha visto que la toma de iones en el córtex y los procesos de carga del xilema operan de forma independiente. Así por ejemplo, los tratamientos con inhibidores de la síntesis proteica, por ej., con cicloheximida, o con una citoquinina, benziladenina, inhiben el proceso de carga del xilema pero no afectan a la toma de iones en el córtex. Estos resultados sugieren que la salida de iones de las células de la estela se regula de forma independiente a la toma de éstos por las células corticales. Estudios bioquímicos recientes sugieren que las células parenquimáticas del xilema desempeñan un papel crucial en el proceso de carga del xilema. La membrana plasmática de las células parenquimáticas del xilema contiene bombas primarias de protones, acuaporinas, y una gran variedad de canales iónicos tanto de entrada como de salida de iones. En cebada, se han identificado dos tipos de canales para la salida de cationes en las células parenquimáticas del xilema: canales específicos para la salida de K + y canales no selectivos para la salida de cationes. La actividad de estos canales está regulada tanto por el potencial de membrana como por la concentración de calcio citosólico (De Boer y Wegner, 1997). Este descubrimiento sugiere que el flujo de iones de las células parenquimáticas del xilema a los elementos conductores, no es un simple proceso de difusión pasiva, sino que se encuentra bajo un estricto control metabólico.

Figura 2.29. Medida de la toma de iones por la raíz y de la carga del xilema. Podemos medir la relación entre ambos procesos simplemente colocando un segmento de raíz entre dos compartimentos y añadiendo un ion radiactivo en uno de ellos (el compartimento A en este caso). La velocidad de desaparición del elemento en el compartimento A proporciona una medida de la toma de ese ion, y la velocidad de aparición en el compartimento B proporciona una medida de la carga del xilema. Tomado de Taiz y Zeiger, 1998.

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8.-


ABSORCIÓN FOLIAR DE NUTRIENTES

La raíz es la principal vía para la absorción de nutrientes pero, éstos también pueden ser absorbidos por las hojas. En los últimos años, sobre todo debido a las altas exigencias tecnológicas de los cultivos, lo que implica un manejo óptimo y un estricto control de la variable nutricional, está adquiriendo gran relevancia la técnica denominada fertilización foliar. La nutrición foliar puede reducir el periodo de retardo (lag) entre la aplicación y la toma del nutriente por la planta, que puede ser importante durante la etapa de rápido crecimiento. Puede también evitar el problema de toma limitada de nutrientes en el suelo, muy particularmente para los micronutrientes. Por ejemplo, la aplicación foliar de nutrientes minerales como el hierro, manganeso, cobre es más efectiva y económica que la aplicación a través del suelo, ya que éstos son adsorbidos por las partículas del suelo y por tanto, están menos disponibles.

Cutícula Capa cuticular Capa de pectina Pared celular primaria

Pared celular secundaria

Plasmalema Citoplasma

ectodesmos

Figura 2.30. Estructura de la pared externa de una célula epidémica mostrando la ordenación de los ectodesmos (en rojo) y la influencia de los agentes surfactantes en la adhesión de las gotas de solución a la superficie. En la superficie de las paredes de las células epidérmicas se deposita una capa especial compuesta por sustancias lipídicas denominada cutícula. Es frecuente que en la superficie cuticular aparezcan excrecencias céreas ( C). A, retención de una gota con surfactante (trazo verde); B, retención de una gota sin surfactante (trazo amarillo). Tomado de Guardiola y García (1990).

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La toma de nutrientes por las hojas es más efectiva cuando la solución nutritiva permanece en la hoja como una delgada película. Para conseguir esta capa fina se suele añadir a las soluciones nutritivas surfactantes químicos, como el detergente Tween 80, que reducen la tensión superficial. El movimiento de los nutrientes a la planta se cree que se realiza mediante difusión a través de la cutícula y penetración al apoplasto del mesófilo de donde, del mismo modo que los nutrientes transportados por el xilema, son incorporados a las células o retransportado a otras partes de la planta. También los nutrientes pueden incorporase a través de los ectodesmos, canales hidrofílicos de naturaleza extracitoplásmica que facilitan el intercambio entre el espacio interior de la hoja y el exterior (Figura 2.30). Aunque la toma a través de los estomas podría ser una vía de entrada de nutrientes se cree que la arquitectura del poro estomático impide la penetración de líquidos (Fig.2.30).

9.-

RESUMEN

Las plantas intercambian solutos con el medio que las rodea y entre los diferentes tejidos y órganos que forman el cuerpo de la misma. Tanto el transporte a nivel celular como el transporte a largas distancias está controlado por las membranas celulares. Las fuerzas conductoras que permiten el transporte biológico, entre las que se incluye el gradiente de concentración, el gradiente de potencial eléctrico y la presión hidrostática, se integran en una expresión conocida como potencial electroquímico. El transporte de solutos a favor del gradiente químico (i.e., difusión) se conoce como transporte pasivo. El movimiento de solutos en contra del gradiente de potencial electroquímico se conoce como transporte activo y requiere energía metabólica. La extensión con la cual las membranas permiten o restringen el movimiento de una substancia se denomina permeabilidad . La composición de la membrana y las propiedades químicas de los solutos son los principales determinantes de la permeabilidad de la membrana. Cuando los cationes y los aniones atraviesan la membrana a diferentes velocidades, se genera un potencial eléctrico denominado potencial de difusión. Para cada ion, la relación entre la diferencia de voltaje a través de la membrana y la distribución de un ion en el equilibrio se describe mediante la ecuación de Nernst . La ecuación de Nernst muestra que la diferencia de concentración de un ion entre dos compartimentos está equilibrada con la diferencia de voltaje existente entre dichos compartimentos. Esta diferencia de voltaje, o potencial de membrana, se ha visto en todas las células vivas y, se genera por una distribución asimétrica de los iones dentro y fuera de las mismas. Todos los potenciales de difusión a través de la membrana se recogen en la ecuación de Goldman . Las bombas electrogénicas, las cuales llevan a cabo el transporte activo y transportan una carga neta, cambian el potencial de membrana del valor creado mediante difusión. Las membranas contienen proteínas especializadas, canales iónicos, transportadores o carriers y bombas primarias, que facilitan el transporte de solutos. Los canales iónicos son proteínas transportadoras que atraviesan la membrana formando poros por los cuales los solutos difunden a favor de su gradiente de potencial electroquímico. Los transportadores se unen al soluto en un lado de la membrana y lo liberan en el otro lado. La especificidad del transporte viene determinada por las propiedades de los canales y de los transportadores. 57



En las plantas, una familia de bombas de protones, H+-ATPasas proporcionan la fuerza conductora primaria para el transporte de sustancias a través del plasmalema. Otras dos bombas electrogénicas de protones actúan con este fin en el tonoplasto. Las células vegetales tienen además ATPasas que bombean Ca 2+ y que participan en la regulación de la concentración del calcio intracelular y transportadores ABC ( ATPbinding cassette) que usan la energía del ATP para transportar grandes moléculas a la vacuola. El gradiente de potencial electroquímico generado por las bombas electrogénicas de protones es utilizado para transportar otras substancias en un proceso denominado transporte secundario . Estudios genéticos revelan la multitud de genes, y sus correspondientes proteínas transportadoras, que dan cuenta de la versatilidad del transporte en las plantas. Estudios electrofisiológicos llevados a cabo con la técnica del patch clamp permiten estudiar un único canal, y por consiguiente, determinar la permeabilidad y la actividad actividad (gating) de un canal individual. Los solutos se mueven entre las células bien por los espacios extraprotoplásmicos (apoplasto) o por el citoplasma (vía simplasto). Los citoplasmas de células vecinas están conectados por puentes citoplásmicos denominados plasmodesmos, que facilitan el transporte por el simplasto. Cuando un ion entra en la raíz, puede entrar al citoplasma de una célula epidérmica o puede difundir por el apoplasto hasta el córtex donde es incorporado al simplasto (debido a la presencia de la banda de Caspari en la endodermis) y, desde ese punto, transportado hasta el parénquima xilemático del mismo modo que que los iones de la ruta simplástica.

10.- APÉNDICES 10.1.- APÉNDICE A : RIZOTRONES

Para estudiar las raíces en el suelo se requiere de un mecanismo que nos permita observarlas directamente. Ya en 1873, el botánico alemán Julius Sachs estudió el sistema radicular usando un recipiente que tenía una cara de cristal. En la actualidad, existen grandes laboratorios que disponen de cámaras subterráneas para la observación del sistema radicular. Estas cámaras se denominan rizotrones (del Griego rhizos, que significa “raíz” y tron, que significa “instrumento para el estudio”) y permiten analizar el crecimiento radicular mientras la parte aérea de la planta se encuentra expuesta a las condiciones naturales. En un rizotrón, las raíces crecen en una cámara con paredes de vidrio. Las cuadrículas en el cristal indican la profundidad del suelo. Los detalles de la morfología (tipo de raíz y distribución) bajo condiciones naturales pueden observarse con unos microscopios especiales, montados cerca de las paredes de cristal de la cámara. Además, puede medirse la cinética del crecimiento radicular simplemente tomando fotografías a diferentes intervalos de tiempo. Los fisiólogos vegetales utilizan esta información (velocidad de crecimiento) y la relacionan con los cambios en la composición de nutrientes y con los niveles de agua disponible en el suelo para calcular la actividad de la raíces a lo largo del perfil del suelo.

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Debido al elevado elevado coste que conlleva construir y mantener un rizotrón, éstos se han substituido por minirizotrones o periscopios de raíces. Los minirizotrones son tubos transparentes de plástico que se introducen en el suelo con un cierto ángulo de inclinación y cerca de la planta que quiere examinarse. Un dispositivo óptico como un espejo inclinado con una lente de aumento o una pequeña videocámara se introduce en el tubo para observar las raíces (ver figura). Este dispositivo proporciona información sobre la densidad de raíces en el suelo, el crecimiento y fenología de la misma. 10.2.10.2.- APÉNDICE APÉNDICE B : TÉCNICA TÉCNICA DEL PATCH CLA MP

El uso de la técnica denominada patch clamp en el estudio de las membranas vegetales ha permitido obtener información muy útil de las propiedades de las membranas que difícilmente se podría haber obtenido con otras técnicas. Los estudios electrofisiológicos convencionales con electrodos intracelulares son válidos para la determinación, a nivel macroscópico, del potencial de membrana y otras propiedades eléctricas de las células vegetales. Hubo que esperar a los años setenta para que el examen aislado aislado de los canales de iones se convirtiera en realidad. La técnica del pinzamiento de membrana ( patch clamp), por cuyo descubrimiento recibieron en Nobel de Fisiología en 1991 los profesores profesores Neher y Sakmann, permitió acceder a esos detalles Esta técnica consiste consiste en adherir adherir (que no insertar) un electrodo de punta roma a la superficie de la membrana y se puede registrar la corriente que entra en la pipeta a través de la zona de la membrana unida a la célula o separada de ésta (Figuras 1 y 2). La pipeta se llena con una solución de electrolito y, junto con la membrana, se coloca en una solución que contiene un segundo electrodo. Posteriormente se mide el flujo de corriente que se produce al aplicar una serie de voltajes entre los electrodos. Obviamente, para aplicar esta técnica a células vegetales es necesario disgregar las células del tejido y eliminar la pared celular mediante un tratamiento enzimático. Se 59



obtiene de este modo una célula vegetal sin pared celular que se denomina protoplasto. La adhesión del extremo de la micropipeta (con un diámetro de 1µm) con el protoplasto se denomina sellado y debe tener una resistencia elevada, normalmente se sitúa alrededor de 10 9 ohmios (GΩ), que permite reducir el ruido de fondo (debido a la ruptura) lo suficiente para obtener una alta resolución de la corriente asociada al flujo iónico de un solo canal.

Figura 1. Micrografía de una micropipeta empleada en la técnica del patch clamp unida a la superficie de un protoplasto de una célula de la aleurona de cebada. Tomado de Taiz y Zeiger, 1998. Cuando se consigue un sellado firme se puede seguir succionando y quitar la porción de membrana delimitada por la apertura de la micropipeta de forma que, el interior de la célula se encuentra encuentra en contacto con con la solución de la micropipeta micropipeta (así se pueden introducir diferentes soluciones dentro de la célula a través de la micropipeta). En esta configuración denominada en “célula total” (ver Fig. 2), la corriente eléctrica medida refleja la suma total total del flujo iónico, tanto activo como como pasivo, a través de la membrana de la célula entera es decir, se puede registrar el comportamiento eléctrico de la célula de forma similar a como se haría con un microelectrodo pero, podemos alterar la composición química de la célula permitiendo que diferentes compuestos difundan desde la pipeta al citoplasma. Si en vez de succionar tiramos del electrodo se consigue una pequeña porción de membrana, un parche, separada de la célula. Debido a que estas zonas de la membrana contienen muy pocos canales, esta configuración ( membrane patch configuration, ver Fig. 2) permite estudiar los cambios bruscos de corriente provocados durante la apertura y el cierre de unos pocos canales e incluso esta técnica es lo suficientemente sensible para detectar los cambios cambios en la conformación conformación de un solo solo canal (Figura 3). Como los protoplastos son esféricos es fácil determinar su volumen y la l a ausencia de conexiones eléctricas con otras células facilita los cálculos de flujos iónicos por unidad de área de membrana. Otra ventaja del método del patch clamp es la capacidad para distinguir entre un suceso suceso eléctrico de la membrana plasmática plasmática y del tonoplasto tonoplasto y la posibilidad de controlar la composición tanto del citosol como la de la solución de referencia.

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Figura 2. Esquema de la configuración de la pipeta y del protoplasto en un experimento de path clamp. La pipeta debe quedar firmemente adherida al exterior de la célula (sellado) tras lo cual, succionando o tirando, se puede acceder al interior de la célula (whole-cell configuration) o retirar una pequeña porción del plasmalema ( membrane patch configuration). En el primer caso se registra la actividad de los sistemas de transporte de toda la célula y, en el segundo, la actividad de los que se encuentran incluidos en el pequeño trozo que se retira. Tomado de Taiz y Zeiger, 1998. Los experimentos de patch clamp revelan que los canales están abriéndose y cerrándose continuamente a una velocidad altísima (Fig. 3). A esta propiedad de abrirse y cerrarse se denomina gating y la probabilidad de apertura refleja la actividad del canal. El flujo de iones que pasa a través de los canales es, pues, un proceso discontinuo. La cantidad de iones que fluyen a través de un canal cuando está abierto, está determinada por su conductancia y por la magnitud de la fuerza ion motriz (AzcónBieto y Talón, 2000). Cuando el número de canales abiertos aumenta en respuesta al potencial de membrana, los canales se denominan canales regulados por voltaje (voltage-gated-channels). La representación gráfica de la intensidad de corriente que atraviesa los canales en función del voltaje que se aplica da lugar a las denominadas curvas I-V (intensidad/voltaje), cuya pendiente es una medida de la conductancia del canal (Figura 3). Asumiendo que el flujo de iones a través de la bicapa lipídica de las membranas es nulo, la permeabilidad de una membrana para un determinado ion es un valor integrado del número de canales, su conductancia y su actividad ( gating) (Azcón-Bieto y Talón, 2000). Los canales más abundantes en el plasmalema y en el tonoplasto son los canales de K +. Actualmente, se conoce que la entrada y la salida de K + están reguladas por dos tipos de canales (Maathuis et al., 1997). Los canales que modulan la salida de K + (outwardrectifying channels) se abren sólo cuando el potencial de membrana favorece la salida mediante difusión de K + y, los canales moduladores de la entrada de K + (inwardrectifying channels) se abren sólo cuando el potencial de membrana favorece la entrada mediante difusión del K +. Como cada tipo de canal tiene sus propios mecanismos de 61



regulación, la célula puede controlar la velocidad de la difusión, tanto la de entrada como la de salida, de forma independiente. Además, la actividad de los canales es sensible a una serie de estímulos ambientales y fisiológicos como luz, hormonas, toxinas, etc. Por ejemplo, un aumento de la concentración de calcio citosólico en el citoplasma de las células oclusivas, en respuesta a la oscuridad o al ácido abscísico, induce el cierre de canales de entrada de K + y la apertura de canales de salida de K + y de canales aniónicos, lo que determina la pérdida de turgencia de las células oclusivas y, en consecuencia, el cierre del estoma (Azcón-Bieto y Talón, 2000).

Figura 3. Registro continuo de la intensidad de corriente asociada al flujo de K + a través de segmento de plasmalema durante un experimento de pinzamiento de membrana ( patch-clamp). La intensidad de corriente que atraviesa los canales es proporcional a la diferencia de potencial eléctrico aplicado a ambos lados de la membrana. En este caso, se trata de un canal reversible. La representación gráfica de la intensidad de corriente que atraviesa los canales, en función del voltaje aplicado, da lugar a las curvas I-V, cuya pendiente es un estimador de la conductancia del canal. Tomado de Azcón-Bieto y Talón ( 2000).

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10.3.- APÉNDICE C: TEORÍA QUIMIOSMÓTICA

El término “quimiosmosis” fue introducido por el premio Nobel británico Peter Mitchell para explicar el acoplamiento entre el gradiente de potencial electroquímico de los protones a través de una membrana selectivamente permeable y la realización de trabajo celular. En las plantas, el gradiente de protones desempeña un papel crucial 1) en el transporte a través de las membranas (sobre todo del plasmalema y del tonoplasto) y 2) en la síntesis de ATP mediante fosforilación oxidativa y fotofosforilación (procesos que tiene lugar en las membranas internas de las mitocondrias y del cloroplasto). El paso de protones a favor de su gradiente eléctrico y químico puede emplearse para llevar a cabo un trabajo celular debido a que el cambio en la energía libre es negativo. Este proceso puede representarse mediante la siguiente ecuación: ΔG= ΔμH+ = F Δ E + 2.3 RT log ([H+]i/[H+]e)

donde ΔμH+ es el gradiente de potencial electroquímico de protones, F es la constante de Faraday, Δ E es el potencial de membrana, R es la constante de los gases, T es la temperatura absoluta, y los superíndices “i” y “e” hacen referencia al interior y al exterior de la célula respectivamente, o de cualquier otro compartimento. Mitchell introdujo el término “fuerza ion motriz”( Δ p) para indicar la diferencia de potencial electroquímico entre los protones dentro y fuera de la célula. Es conveniente expresar Δ p en unidades de potencial electroquímico, para ello hay que dividir ambos términos por la constante de Faraday: Δ p= ΔμH+ = Δ E + 2.3 RT log ([H+]i/[H+]e) F F

Como pH=-log [H+], el término log([H+]i/[H+]e) se puede simplificar a –(pH i-pHe). Si Δ pH se define como pHi-pHe, la expresión general para la fuerza protón motriz quedaría como: Δ p= ΔμH+ = ΔE - 2.3 RT log Δ pH F F

A 25°C, 2.3 RT /F = 59 mV, y si sustituimos este valor, la expresión resultante para la fuerza ion motriz sería: Δ p= Δ E – 59 Δ pH

donde Δ p se expresa en milivoltios. Consideremos el siguiente ejemplo, una célula bañada por una solución de 1 mM KCl y 1 mM de sacarosa, un potencial de membrana de –120 mV y como resultado del bombeo de protones por una H +-ATPasa la diferencia de pH entre el interior y el 63



exterior de la célula de dos unidades de pH. Así, si empleamos la ecuación anterior obtendríamos: Δ p =-120 mV-59(2) mV= - 238 mV

¿Cuánto potasio puede entrar en la célula usando este Δ p? Debido a que el potasio tiene carga positiva y el potencial de la membrana dentro de la célula es negativo, el potasio puede entrar a través de los canales iónicos por la componente eléctrica de Δ p, que equivale a -120 mV. Usando la ecuación de Nernst podemos calcular que en el equilibrio con una concentración externa de 1 mM de K + y un Δ E = -120 mV, la concentración de K + en el interior de la célula será de 100 mM. Esto es, la componente eléctrica de la fuera protón motriz, Δ p, se ha usado para generar una asimetría de concentración de 1/100 para el potasio a ambos lados de la membrana. La fuerza protón motriz puede usarse también para la incorporación de sacarosa (un compuesto que no tiene carga) en contra de su gradiente de concentración. El transporte de sacarosa en plantas se lleva a cabo mediante un transporte con protones de tipo simporte. Como la sacarosa se cotransporta junto con los protones, intervendrán en su transporte las dos componentes del potencial electroquímico (es decir, la componente eléctrica y el gradiente de pH; -238 mV en nuestro ejemplo). Δµ s utilizando las fórmulas descritas en la página 14 de este módulo es: Δ μs

= μsi - μse = 2.3 RT log (Csi/Cse)

En el equilibrio, ΔμH+ = F Δ p= 2.3 RT log (Csi/Cse) log Csi/Cse = (F Δ p)/( 2.3 RT) Así, podemos calcular que para una concentración externa de sacarosa de 1 mM (10 -3 M), un Δ p de –238 mV se equilibrará con una concentración interna de sacarosa de 10 M. Hay que tener en cuenta que este gradiente de concentración tan elevado no se puede conseguir en los sistemas biológicos ya que las células cuentan con mecanismos que regulan la concentración de solutos y alcanzados ciertos niveles, se bloquean los transportadores, lo que impide su transporte.

10.4.- APÉNDICE D. LA PARED CELULAR Y EL POTENCIAL DE DONNAN

La pared celular es una estructura altamente organizada compuesta por una red tridimensional de microfibrillas de celulosa que se encuentran embebidas en una matriz constituida por polisacáridos (hemicelulosas y pectinas), proteínas y fenoles en una solución ligeramente ácida. La pared celular confiere fuerza mecánica a la célula vegetal e impide la entrada de organismos potencialmente patógenos. Este entramado de redes poliméricas que constituyen la pared celular actúa a modo de filtro, restringiendo 64



la difusión de las moléculas en función de su tamaño. El diámetro de los poros de las paredes celulares oscila entre 3.5-5 nm. Es obvio que el tamaño de los poros no restringe la difusión de moléculas cuya masas molecular sean inferiores a 15 kDa. Pero la pared posee algunas características que van a “limitar” la difusión de pequeñas moléculas. Por ejemplo, el camino entre las microfibrillas es muy tortuoso y la difusión va a ser mucho más lenta que los procesos de difusión libre. Además, la pared celular posee gran cantidad de cargas negativas residuales debidas a la presencia de grupos carboxílicos disociados (i.e., los ácidos galacturónicos de las pectinas y glucurónicos de los xilanos), que convierten a la pared celular en un intercambiador de iones (un sistema Donnan), con importantes consecuencias para la concentración de iones concretos en las cercanías de la membrana plasmática: los cationes se acumulan en la pared celular y los aniones son excluidos (Grignon y Sentenac, 1991).

Figura 1. Estructura del principal componente de las pectinas, el ácido D- αgalacturónico. Los grupos carboxilo libres de los restos galacturosil pueden estar disociados y dar lugar a la formación de puentes de calcio. El apoplasto haciendo referencia a la solución acuosa que se encuentra en él, se denomina “espacio libre aparente” (inglés apparent free space, AFS). La absorción en el AFS, al no ser un proceso metabólico, no resulta influida de modo considerable por las bajas temperaturas ni por los inhibidores del metabolismo, o sea que las sustancias en el AFS pueden ser fácilmente arrastradas de nuevo al exterior. El AFS se subdivide en dos partes para las partículas cargadas: en el espacio libre acuoso (inglés, water free space, WFS) los iones difunden en la solución que se encuentra en el apoplasto; en el espacio libre de Donnan ( Donnan free space, DFS) se fijan por acción de las cargas del apoplasto: AFS= WFS+DFS (ver figura 2). Estas cargas netas no pueden difundir a través de la pared, se encuentran fijas en la misma, por lo que se genera un potencial conocido como potencial de Donnan . Este potencial también aparece en el plasmalema y en todas aquellas fases capaces de mantener cargas no difundibles. El potencial de Donnan se define como el potencial de difusión que ocurre cuando un contraión no puede difundir a través de la membrana, bien porque es impermeable o bien porque se encuentre fijo. Los aniones fijados o con difusión dificultada (por ej., grupos carboxilo disociados) atraen a los cationes libremente móviles de los alrededores. Si este proceso continúa hasta la neutralización de las cargas fijadas, se alcanza la neutralidad eléctrica, pero queda un gradiente 65



químico para los cationes, desde el ámbito más próximo (compartimento 1) al más remoto (compartimento 2) respecto a los aniones fijados; es decir que el sistema no está en equilibrio. Así pues, difunden cationes de 1 a 2, hasta que las fuerzas motrices (gradiente de potencial por un lado, gradiente de concentración por otro) se equilibran. El equilibrio resultante se llama equilibrio de Donan. Se caracteriza porque la fase de Donan que contiene los iones fijados no difundibles presenta una concentración total de iones superior a la fase externa y porque se mantiene un gradiente de potencial (potencial de Donan) cuya dirección viene dada por la carga del ion no difundible; en el caso que esté fijado un anión, la fase de Donan en equilibrio con el entorno está siempre cargada negativamente. Veamos lo expuesto con un ejemplo numérico. Imaginemos dos compartimentos separados por una fase de Donnan, en un compartimento, por ejemplo en el interior, hay cargas negativas no difundibles, por ejemplo P -, mientras que en el compartimento exterior, e, existen iones difundibles como el K + y el Cl-. Inicialmente, debemos suponer que existe equilibrio de cargas es decir, se cumple que: [K +]e = [Cl-]e [K +]i = [P-]i En esta situación, el Cl - difundirá desde el exterior, e, hacia el interior, i, y los iones K + le acompañarán por el efecto de cargas. Si llamamos C e a la concentración inicial de K +e, que es igual a la de Cl -e, y C i a la concentración inicial de K +i y x a la cantidad de K + = Cl- que difunde del compartimento e al i, en el equilibrio, los productos de los iones difundibles debe ser igual [K +]e [Cl-]e = [K +]i [Cl-]i o bien (C e - x) (C e - x) = (C i + x) x Si consideramos que C e = 10 y C i= 5, tendremos (10 –x) (10 –x) = (5 + x) x 100 – 20x + x 2= x2 + 5x x=4 En el equilibrio tendremos que la concentración del K + será C e= 6 y C i= 9; es decir, los iones potasio han penetrado en contra de gradiente de concentración, mientras que para el Cl- su C e= 6 y C i= 4, por lo que los iones cloruro han penetrado a favor de gradiente.

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A 2

1

B

Apoplasto

Plasmalema

Espacio libre de Donnan (DFS) Espacio libre acuoso

Espacio libre aparente

Espacio libre de Donnan (DFS)

Figura 2. Distribución de Donnan. A. Establecimiento de un potencial de Donnan. Para los cationes (+), los compartimentos 1 y 2 son permeables; en cambio los aniones (rojo) son impermeables y se encuentran exclusivamente en el compartimento 1. Los cationes difunden siguiendo su gradiente de concentración desde 1 hacia 2 hasta que el potencial eléctrico que se forma compensa al gradiente de concentración, momento en que se deja de percibir un flujo neto de cationes. El potencial que se forma en una membrana selectivamente permeable se llama potencial de Donnan. B. Representación esquemática del espacio libre aparente formado por el espacio libre de Donnan y el espacio libre acuoso en los apoplastos de las células vegetales. El gráfico ilustra que en los apoplastos, los iones disueltos en agua pueden permanecer en el espacio de acceso libre a la difusión (WFS) pero además también junto a las estructuras superficiales del plasmalema y junto a los polímeros cargados de la pared celular respectivamente (DFS), estableciéndose así distribuciones de donan. Ambos compartimentos forman el espacio aparentemente permeable a los iones del apoplasto (AFS). Tomado de Sitte et al. (2004).

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11.- BIBLIOGRAFÍA

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Absorcion y Transporte de Nutrientes

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