DNA RECOMBINANTE Generalidades del DNA DN A recombinante. recombinante. El término DNA recombinante hace referencia a la creación de nuevas combinaciones de segmentos o de moléc molécul ulas as de DNA DNA que que no se encue encuentr ntran an junt juntas as de maner manera a natu natura ral.l. Aunq Aunque ue el proc proces eso o genét genétic ico o de la recombinación produce DNA recombinante, este término se reserva a las moléculas de DNA producidas por la unión de segmentos que provienen de diferentes fuentes biológicas. La tecnologa del DNA recombinante utili!a técnicas que provienen de la bioqumica de los "cidos nucleicos unidas a metodologas genéricas desarrolladas originalmente para la investigación de bacterias # de virus. La utili!ación del DNA recombinante es una herramienta poderosa para el aislamiento de poblaciones puras de secuencias especficas de DNA a partir de una población de secuencias me!cladas. Los procedimientos b"sicos inclu#en una serie de pasos$ %. Los fragme fragmento ntoss de DNA se se generan generan utili!a utili!ando ndo unas unas en!imas en!imas denomi denominad nadas as endonucleasas de restricción , que reconocen # cortan las moléculas de DNA por secuencias nucleotdicas especficas. &. Los fragm fragment entos os produci producidos dos medi mediant ante e la digest digestión ión con con enzimas de restricción se unen a otras moléculas de DNA que sirven de vectores. Los vectores pueden replicarse autónomamente en una célula huésped # facilitan la manipulación de la molécula de d e DNA recombinante recién creada. '. La molé molécu cula la de DNA DNA recomb recombin inan ante te,, form formad ada a por un vect vector or que que llev lleva a un segm segmen ento to de DNA inser insertad tado, o, se trans transfifiere ere a una una célula huésped . Dentro de esta célula, la molécula de DNA recombinante se replica, produciendo docenas de copias idénticas conocidas como (clones). *. Al repl replic icar arse se las células huésped , las células descendientes heredan el DNA recombinante, cre"ndose una población de células idénticas, que llevan todas la secuencia clonada. +. Los segmentos segmentos de DNA clonados clonados pueden recuperar recuperarse se de las células células huésped, huésped, purificarse purificarse # anali!arse. anali!arse. . -otencialmen -otencialmente, te, el DNA clonad clonado o puede transcribirs transcribirse, e, su mNA puede puede traducirse, traducirse, # el producto producto génico puede puede aislarse # e/aminarse.
El desarrollo de las técnicas de DNA recombinante ofrece nuevas oportunidades para la investigación, #a que simpl simplifific ica a la obte obtenc nció ión n de grand grandes es canti cantidad dades es de DNA DNA que que codi codific fican an genes genes espe espec cfifico cos, s, # facil facilitita a las las investigaciones de la organi!ación, estructura # e/presión génicas. Esta metodologa también ha dado un impulso al desarrollo de la naciente industria biotecnológica, que est" suministrando un n0mero creciente de productos al mercado. El DNA recombinante produce grandes cantidades de copias de segmentos de DNA especficos, inclu#endo genes.
Enzimas de restricción. La piedra angular de la tecnologa del DNA recombinante es un tipo de en!imas denominadas endonucleasas de restricción . Estas en!imas, aisladas en bacterias, reciben este nombre debido a que limitan o previenen las infecciones vricas degradando el "cido nucleico invasor. Las en!imas de restricción reconocen una secuencia especfica de nucleótidos 1denominada sitio de restricción2 de una molécula de DNA de doble cadena, # cortan el DNA por esa secuencia. El premio Nobel de %345 se otorgó a 6erner Arber, 7amilton 8mith # Daniel Nathans por su investigación sobre las en!imas de restricción. 7asta la fecha, se han aislado # caracteri!ado casi &99 tipos de en!imas de restricción diferentes.
La en!ima en!ima de restri restricci cción ón Eco: reconoce # se une a la secuencia palindrómica ;AA ;AA<<=. <=. El cort corte e del del DNA DNA en este este siti sitio o prod produc uce e cola colass de cade cadena na senc sencill illa a complementarias. La colas de cadena sencilla resultantes pueden unirse con colas complem complement entari arias as de otros otros fragme fragmento ntoss de DNA DNA para para formar formar molécu moléculas las de DNA DNA recombinante.
Las en!imas de restricción se denominan seg0n el organismo en el que se descubrieron, utili!ando un sistema alfanumérico. La en!ima Eco: proviene de Escherichia coli > Hind::: se descubrió en Hemophilus influenzae . 7a# dos tipos de en!imas de restricción$ ?Las en!imas de
-ara formar moléculas de DNA recombinante, se corta DNA de distintas fuentes con Eco: # se me!cla para que se unan formando moléculas recombinantes. Después se utili!a la en!ima DNA ligasa para unirlos covalentemente en moléculas de DNA recombinante.
Algunas en!imas de restricción comunes, con sus sitios de reconocimiento # de corte, el patrón de corte # la fuente de origen.
Ctras en!imas de restricción de
Las moléculas de DNA recombinante pueden formarse a partir DNA cortado con en!imas que dejan e/tremos romos. En este método se utili!a la en!ima deso/inucleotidil transferasa terminal para crear colas complementarias mediante la adición de fragmentos de poliBdA # de poliBd<. Estas colas sirven para unir el DNA de diferentes fuentes # para crear moléculas de DNA recombinante, que son unidas covalentemente por tratamiento con la DNA ligasa.
Vectores Después de unirse a un vector o vehculo de clonación, un segmento de DNA puede llegar a entrar en una célula huésped # replicarse o clonarse. Los vectores son, esencialmente, moléculas de DNA transportadoras. -ara servir de vector, una molécula de DNA debe tener unas determinadas caractersticas$
'. Debe tener alg0n marcador de selección 1normalmente genes de resistencia a antibióticos o genes de en!imas que la célula huésped no tiene2 para poder distinguir las células huésped que transportan el vector de las que no lo contienen. *. El vector de la célula huésped debe ser f"cil de recuperar. Actualmente se utili!an tres tipos principales de vectores$ los pl"smidos, los bacteriófagos # los cósmidos.
?
Plásmidos.
Los pl"smidos son moléculas de DNA de doble cadena e/tracromosómicas de origen natural que tienen un origen de replicación 1oriG2 # que se replican autónomamente en las células bacterianas. -ara poder utili!arlos en ingeniera genética, se han modificado o diseFado muchos pl"smidos de manera que contengan un n0mero limitado de sitios de restricción # genes de resistencia a antibiótico s especficos. El vector pH'&& fue uno de los primeros pl"smidos diseFados que se utili!ó en DNA recombinante. Este pl"smido tiene un origen de replicación 1oriG2, dos genes de selección 1resistencia a los antibióticos ampicilina # tetraciclina2, # algunos sitios de restricción 0nicos.
Iapa de restricción del pl"smido pH'&&, que muestra las locali!aciones de los sitios de las en!imas de restricción que cortan el pl"smido por un solo sitio. Estos sitios pueden utili!arse para insertar los fragmentos de DNA a clonar.
Dentro del gen de resistencia a tetraciclina ha# sitios de restricción 0nicos para las en!imas Bam7:, Sph:, Sal :, Xma::: # Nru:, # dentro del gen de resistencia a ampicilina ha# sitios de restricción 0nicos para las en!imas Rru:, Pvu: # Pst :. 8i se introduce pH'&& en una célula bacteriana sin pl"smidos # sensible a antibióticos, la célula se convertir" en resistente a la tetraciclina # a la ampicilina. 8i se inserta un fragmento de DNA en los sitios de restricción Rru:, Pvu:, o Pst :, se inactivar" el gen de resistencia a ampicilina, pero el gen de resistencia a tetraciclina seguir" activo. 8i este pl"smido recombinante se transfiere a una célula bacteriana que no contenga pl"smidos, las células que contengan el pl"smido recombinante podr"n identificarse, #a que ser"n resistentes a tetraciclina # sensibles a ampicilina. =on el paso del tiempo se han desarrollado vectores plasmdicos m"s sofisticados, que ofrecen diversas caractersticas 0tiles. Jno de estos pl"smidos, que deriva de pH'&&, es el pJ=%5, que tiene las siguientes caractersticas$ %. El pl"smido tiene la mitad de tamaFo que pH'&&, lo que permite insertar fragmentos de DNA m"s largos. &. pJ=%5 se replica produciendo unas +99 copias por célula, lo que significa unas + ó %9 veces m"s que las que produce pH'&&. '.
El pl"smido pJ=%5 ofrece varias ventajas como vector de clonación. Debido a su pequeFo tamaFo, puede aceptar fragmentos de DNA relativamente grandes> se replica hasta un alto n0mero de copias, # tiene un gran n0mero de sitios de restricción en el sitio de clonación m0ltiple, locali!ado dentro del gen lacZ . Las bacterias que contienen pJ=%5 producen colonias de color a!ul si crecen en un medio que contenga MBgal. El DNA insertado en el sitio de clonación m0ltiple interrumpe el gen lacZ , resultando en colonias blancas, lo que permite la identificación directa de las colonias que tienen insertos de DNA clonados.
?
Bacterióa!os lambda "a!o #$ % &'(.
Lambda es un bacteriófago mu# utili!ado en e/perimentos de DNA recombinante. 8e han identificado # cartografiado todos los genes de lambda, # se conoce toda la secuencia nucleotdica de su genoma. El tercio central de su cromosoma es prescindible, # puede reempla!arse por DNA e/ógeno sin afectar la capacidad del fago para infectar células # formar calvas. 8e han desarrollado m"s de %99 vectores basados en el fago lambda, eliminando diversas porciones del grupo génico central. -ara clonar utili!ando el fago lambda, se corta el DNA del fago con una en!ima de restricción 1por ejemplo, Eco:2, lo que produce un bra!o i!quierdo, un bra!o derecho # una región central. 8e aslan los bra!os # se ligan 1utili!ando la DNA ligasa2 a un segmento de DNA obtenido tras cortar DNA genómico con la misma en!ima de restricción 1en este ejemplo, con Eco:2. Las moléculas recombinantes resultantes pueden introducirse en células huésped bacterianas por transfección. -rimero, se permeabili!an las células huésped mediante un tratamiento qumico, # se me!clan con las moléculas ligadas. Los vectores que contienen el inserto entran en las células huésped, donde dirigen la sntesis de fagos infectivos, llevando cada uno de ellos el inserto de DNA. =omo alternativa, se me!cla el DNA de lambda que contiene el inserto con los componentes proteicos del fago> de esta me!cla se forman partculas f"gicas infectivas. Los fagos pueden amplificarse haciéndolos crecer en placas sembradas con bacterias, donde se formar"n calvas, o bien infectando células en un medio lquido # recogiendo las células lisadas.
-asos en la clonación utili!ando el fago lambda como vector. 8e e/trae el DNA de una preparación de fago lambda # se elimina el grupo central de genes por tratamiento con una en!ima de restricción. El DNA a clonar se corta con la misma en!ima # se liga entre los bra!os del cromosoma de lambda. Luego se empaqueta el cromosoma recombinante dentro de las protenas del fago para formar un virus recombinante. Este virus puede infectar células bacterianas # replicar su cromosoma, incluido el inserto de DNA.
?
)os cósmidos % los *ectores transbordadores
Los cósmidos son vectores hbridos construidos utili!ando partes del cromosoma del fago lambda # de DNA plasmdico. Los cósmidos contienen la secuencia (cos) del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del DNA del fago dentro de su cubierta proteica, # secuencias plasmdicas de replicación # de genes de resistencia a antibióticos, que permiten identificar las células huésped que los contienen. El DNA de los cósmidos que contiene insertos de DNA se empaqueta en la c"pside proteica de lambda para formar partculas f"gicas infectivas. Jna ve! el cósmido entra en la célula huésped, se replica como un pl"smido. -uesto que la ma#ora del genoma de lambda se ha delecionado, los cósmidos pueden transportar insertos de DNA mucho m"s grandes que los que lambda puede llevar. Los cósmidos pueden transportar casi +9Kb de DNA insertado, mientras que los vectores f"gicos pueden acomodar insertos de DNA de unas %+Kb # los pl"smidos generalmente est"n limitados a insertos de +B%9Kb. El cósmido pOH8 contiene un origen de replicación bacteriano 1ori2, un solo sitio cos, un gen de resistencia a ampicilina 1amp , para seleccionar las colonias que han incorporado el cósmido2, # una región que contiene cuatro sitios de restricción para la clonación 1Bam7:, Eco:, Cla: # Hindlll2. -uesto que el vector es pequeFo 1+,*Kb de longitud2, puede aceptar segmentos de DNA e/ógeno de '' a *Kb de longitud. El sitio cos permite que el cósmido que contenga un inserto grande se empaquete con protenas de cubierta vrica de lambda como si fuesen cromosomas vricos. Las cubiertas vricas que contienen un cósmido pueden utili!arse para infectar células huésped adecuadas, # el vector, que transporta el inserto de DNA, se transferir" a la célula huésped. Jna ve! dentro, la secuencia (ori) permite que el cósmido se replique como un
E/isten otros vectores hbridos, construidos con orgenes de replicación provenientes de distintas fuentes 1por ejemplo, pl"smidos # virus animales como 8P*92, que pueden replicarse en m"s de un tipo de célula huésped. ;eneralmente, estos vectores transbordadores contienen marcadores genéticos que permiten su selección en los dos sistemas huésped, # pueden utili!arse para transportar insertos de DNA entre E.coli # otras células huésped, como levadura, # viceversa. A menudo, estos vectores se emplean para investigar la e/presión génica.
-asos en la clonación utili!ando cósmidos como vectores.
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+romosomas artiiciales bacterianos.
-ara cartografiar # anali!ar genomas eucarióticos complejos, se ha desarrollado un vector multiuso denominado cromosoma artificial bacteriano 1HA=2 basado en el factor de bacterias. El factor es un pl"smido que se replica independientemente # que est" implicado en la transferencia de información genética durante la conjugación bacteriana. -uesto que los factores pueden transportar fragmentos del cromosoma bacteriano de hasta %Ib, han sido diseFados para que funcionen como vectores de DNA eucariótico. Los vectores HA= tienen los genes de replicación # de n0mero de copias del factor , e incorporan un marcador de resistencia a un antibiótico # sitios de restricción para insertar el DNA e/ógeno que se desee donar. Adem"s, el sitio de donación est" flanqueado por regiones promotoras que pueden utili!arse para generar moléculas de NA # e/presar as el gen donado, o para utili!adas como sonda para paseo cromosómico, # para secuenciar el DNA del inserto clonado.
=romosoma artificial bacteriano 1HA=2. El sitio de clonación m0ltiple tiene diversos sitios de restricción 0nicos para la inserción de DNA e/ógeno. Las flechas marcadas como <4 # 8p son regiones promotoras que permiten la e/presión de los genes clonados entre estas regiones.
,ransormación del DNA. Jno de los mecanismos por el cual el DNA puede movili!arse entre las bacterias es la transformación, descubierta por red ;riffith en %3&5. La transformación consiste en la captación por parte de una célula receptora de una molécula o fragmento de DNA desnudo # la incorporación de esta molécula al cromosoma del receptor en una forma heredable. En la transformación natural, el DNA procede de una bacteria donadora. Es un proceso aleatorio,
contacto con una célula competente, es decir, una célula capa! de captar DNA # ser transformada, dicho fragmento puede unirse a la célula # ser transportado a su interior. La frecuencia de transformación de las células mu# competentes cuando se utili!a un e/ceso de DNA es de alrededor de %9 B' para la ma#ora de los géneros. Es decir, apro/imadamente una célula de cada mil toma e integra el gen. La competencia es un fenómeno mu# complejo # depende de diversas condiciones. Es preciso que las bacterias se encuentren en una determinada fase de crecimiento, por ejemplo, S.pneumoniae se vuelve competente durante la fase e/ponencial, cuando la población alcan!a las %9 4 ó %9 5 célulasQmL. =uando una población se vuelve competente, las bacterias del tipo de los neumococos segregan una pequeFa protena denominada (factor de competencia) que estimula la producción de 5 a 3 nuevas protenas necesarias para el proceso de transformación. La transformación natural sólo se ha descubierto hasta la fecha en ciertos géneros de bacterias grampositivas # gramnegativas$ Streptococcus, Bacillus, Thermoactinomyces , Neisseria, ora!ella, "cineto#acter , "zoto#acter # Pseu$omonas , aunque otros géneros también puede que sean capaces de e/perimentar transformación. La transferencia de genes mediante este proceso ocurre en medios terrestres # marinos, # puede constituir una importante ruta de intercambio genético en la naturale!a.
La transformación en Haemophilus influenzae , una bacteria gramnegativa, difiere de la de S.pneumoniae en diversos aspectos. Haemophilus no produce un factor de competencia para estimular el desarrollo de competencia, # sólo capta el DNA procedente de especies estrechamente relacionadas. El DNA bicatenario forma complejos con protenas # es captado por vesculas de membrana. La especificidad de la transformación de Haemophilus se debe a una secuencia especial de pares de bases 1+@BAA;<;=;;<=AB'@2 que se repite unas %.*99 veces en el DNA de H.influenzae . El DNA debe contener esta secuencia para que una célula competente se una a él. La transformación artificial se lleva a cabo en el laboratorio mediante diversas técnicas, entre ellas el tratamiento de las células con cloruro c"lcico, que aumenta la permeabilidad de sus membranas al DNA. Este enfoque tiene é/ito incluso con especies que no son competentes de forma natural, como E.coli . -ara aumentar la frecuencia de transformación se utili!an concentraciones relativamente m"s altas de DNA, superiores a las que est"n presentes en condiciones normales en la naturale!a. =uando se utili!an para la transformación fragmentos lineales de DNA, suele hacerse que E.coli pierda la actividad de una o m"s e/onucleasas con el fin de proteger los fragmentos transformantes. esulta m"s sencillo transformar bacterias con DNA de pl"smido, #a que los pl"smidos no se degradan con tanta facilidad como los fragmentos lineales # son capaces de replicarse dentro del huésped. Rste es un método habitual para introducir DNA recombinante en las células bacterianas. -uede introducirse DNA de cualquier fuente en las bacterias insert"ndolo en un pl"smido antes de la transformación.
,ransducción.
Los virus bacterianos o bacteriófagos participan en otra modalidad de transferencia génica bacteriana. Estos virus tienen estructuras relativamente sencillas en las que el material genético del virus est" incluido dentro de una cubierta e/terna, compuesta principalmente o e/clusivamente de protenas. La cubierta protege el genoma # lo transmite entre células huésped. Después de infectar la célula huésped, un bacteriófago a menudo toma el control # obliga al huésped a fabricar numerosas copias del virus. inalmente la bacteria huésped estalla o se lisa # libera los nuevos fagos. Este ciclo reproductor se denomina ciclo ltico porque conclu#e con la lisis del huésped. =onsta de cuatro fases$ ?En la primera, la partcula viral se fija a un sitio receptor especfico de la superficie bacteriana. ?En la segunda, el material genético del virus que con frecuencia es DNA bicatenario, penetra entonces en la célula.
8e distinguen dos tipos mu# diferentes de transducción$ ?
Generalizada . Ccurre durante el ciclo ltico de fagos virulentos # atemperados, # es capa! de transferir
?
Especializada. En ella la partcula transductora transporta sólo porciones especficas del genoma bacteriano.
cualquier parte del genoma bacteriano. Durante la fase de ensamblaje, cuando los cromosomas virales son empaquetados en el interior de c"psides proteicas pueden quedar encapsidados fragmentos del cromosoma bacteriano parcialmente degradado. -uesto que la c"pside sólo puede contener una cantidad limitada de DNA, el DNA del virus no se incorpora a la c"pside, # sólo queda incluido en ella el DNA bacteriano. La cantidad de DNA bacteriano transportada depende principalmente del tamaFo de la c"pside.
La transducción especiali!ada es posible a consecuencia de un error durante el ciclo vital lisogénico. =uando se induce a un fago a abandonar el cromosoma de la célula huésped, en ocasiones la escisión se reali!a de forma incorrecta. El genoma del fago resultante contiene porciones del cromosoma bacteriano 1apro/imadamente, entre el + # el %9 S del DNA bacteriano2 ad#acentes al sitio de integración. El genoma del fago originado en la transducción suele ser defectuoso # carece de alguna parte de su sitio de fijación. La partcula transductora in#ecta los genes virales a otra bacteria, aunque el fago defectuoso no es capa! de reproducirse sin a#uda. Los genes bacterianos pueden quedar incorporados de forma estable en las condiciones adecuadas. El ejemplo mejor estudiado de transducción especiali!ada es el fago lambda.
+onstrucción de bibliotecas de DNA -uesto que cada segmento de DNA clonado es relativamente pequeFo, deben construirse muchos clones diferentes para incluir todas las pequeFas porciones del genoma de un organismo. El conjunto clonado de todas las secuencias genómicas de un sólo individuo se denomina biblioteca . Las bibliotecas clonadas pueden provenir del genoma completo de un individuo, del DNA de un solo cromosoma, o del conjunto de genes transcripcionalmente activos en un 0nico tipo celular.
Bibliotecas !enómicas. Las bibliotecas genómicas 1o genotecas2 suelen construirse utili!ando vectores f"gicos, que pueden contener grandes fragmentos cromosómicos. -ara preparar una biblioteca en el fago lambda, se corta el DNA de lambda con una en!ima de restricción para eliminar el grupo génico central, tal # como se ha comentado anteriormente. El DNA genómico que se desea clonar se corta con la misma en!ima, # se purifican los fragmentos cortados de tamaFo óptimo para el empaquetamiento 1de %+ a %4Kb2 mediante una electroforesis en gel o por centrifugación. Estos fragmentos de DNA se ligan con los bra!os del cromo soma de lambda para formar la biblioteca. En una biblioteca genómica est"n representados todos los genes de un organismo. La biblioteca es un medio para recuperar cualquier gen del genoma del organismo, pudiéndose estudiar con detalle junto con sus secuencias reguladoras ad#acentes.
ln ( 1− p ) ln ( 1− f )
donde (N) es el n0mero de clones necesarios, (-) es la probabilidad de recuperar una secuencia determinada, # (f) representa la fracción del genoma presente en cada clon. 8upongamos que deseamos preparar una biblioteca del genoma humano utili!ando como vector al fago lambda. El genoma humano tiene ',9 T %9 Kb> si el tamaFo medio de los insertos clonados en el vector es de %4 Kb, # queremos tener una probabilidad del 33S 1- U 9,332 de que cualquier gen humano esté representado al menos en una copia, precisaremos una biblioteca de$ N =
ln 1−0,99
[
ln 1−
3
17 x 10
3,0 x 10
9
]
=8,1 x 105 clones
# si hubiésemos seleccionado a pH'&& como vector, con un tamaFo medio de insertos de + Kb, la biblioteca necesitara contener$ N =
ln ( 1−0,99 )
[
ln 1−
?
3
5 x 10
9
3,0 x 10
]
=2,8 x 106 clones
&uta!énesis diri!ida.
Los avances en las técnicas de sntesis de DNA han acelerado los progresos e/perimentados en el estudio de las funciones de las protenas # de la e/presión génica. Jna de las formas m"s efectiva de estudiar la relación entre la estructura # la función proteicas consiste en alterar una porción determinada de la protena # observar los cambios funcionales que se producen. 7asta hace unos aFos, esto se reali!aba mediante la modificación qumica de amino"cidos individuales o mediante inducción de mutaciones en el gen que codifica la protena objeto de estudio. 8in embargo, la modificación qumica de una protena no siempre es especfica, #a que pueden verse alterados varios amino"cidos # no sólo el que se desea alterar> por otro lado, hasta hace unos aFos no siempre era posible producir la mutación adecuada en la locali!ación del gen que se deseaba. Estas dificultades han sido superadas en los 0ltimos aFos gracias a la técnica de la mutagénesis dirigida> en ella se sinteti!a un oligonucleótido de unas &9 bases que contiene el cambio de secuencia deseado. -osteriormente se permite que dicho oligonucleótido alterado con la mutación objeto de estudio hibride con una copia monocatenaria del gen salvaje original completo> posteriormente se amplifica el complejo mediante -=, con lo que la polimerasa e/tiende el olignucleótido # copia el resto del gen diana para producir una nueva copia del gen con la mutación deseada. 8i unimos el gen a un fago de DNA monocatenario como es el caso del fago I%', puede introducirse el gen mutado en una bacteria huésped # clonarse, con lo que obtendremos grandes cantidades de una protena mutante para el estudio de su función.
Bibliotecas cromosómicas. Jna biblioteca construida a partir de una fracción genómica, como un cromosoma, puede ser mu# valiosa para seleccionar genes especficos # para e/aminar la organi!ación del cromosoma. -or ejemplo, se aisló por microdisección por l"ser un pequeFo segmento del cromosoma M de %rosophila correspondiente a una región de unas +9 bandas politénicas. 8e e/trajo el DNA de este fragmento cromosómico, se cortó con una endonucleasa de restricción, # se clonó en un vector lambda. Esta región del cromosoma contiene los genes &hite, zeste # Notch, as como el sitio original de un elemento transponible que puede transponer un segmento cromosómico a m"s de un centenar de otros loci. Aunque puede ser técnicamente difcil, este procedimiento produce una biblioteca que contiene sólo los genes que nos interesan # sus secuencias ad#acentes. Las bibliotecas provenientes de cromosomas individuales humanos se han preparado utili!ando la citometra de flujo. Los cromosomas de células mitóticas se tiFen con dos colorantes fluorescentes, uno que se une a los pares A V <, # otro a los pares ; V =. Los cromosomas teFidos pasan por un ra#o l"ser que estimula la fluorescencia, # un fotómetro clasifica # fracciona los cromosomas seg0n las diferencias de unión de los colorantes # de dispersión de la lu!. Jtili!ando esta técnica, diferentes laboratorios han preparado bibliotecas de cada uno de los cromosomas humanos. Esto ha facilitado enormemente el cartografiado # el an"lisis de cromosomas individuales como parte del -ro#ecto ;enoma 7umano. Jna modificación de la electroforesis conocida como electroforesis de campo puls"til se ha utili!ado para aislar cromosomas de levadura con el fin de construir bibliotecas cromosómicas de este organismo. El aislamiento # la construcción de bibliotecas del cromosoma ::: de levadura 1'%+ Kb2 fue el punto de partida para la formación de un consorcio de '+ laboratorios para determinar la secuencia nucleotdica de este cromosoma. Jno de los resultados inesperados de este pro#ecto fue el descubrimiento de que apro/imadamente la mitad de las secuencias codificantes de protenas de este cromosoma eran desconocidas. -ara muchos genéticos, fue difcil aceptar que los métodos convencionales de mutagénesis sistem"tica # de cartografiado de genes no fuesen tan eficientes como pensaban. 8in embargo, este descubrimiento se confirmó # se amplió en %33* con la publicación de la secuencia del cromosoma M: 1* Kb2, # en %33 con la secuenciación del resto del genoma de levadura. Estos resultados indican que las bibliotecas cromosómicas pueden utili!arse para acceder a los loci génicos a los que los métodos convencionales como la mutagénesis # el an"lisis genético no han podido acceder, o de los que no se dispone o no se conocen otras sondas como el mNA o los productos génicos. Adem"s, las bibliotecas cromosómicas proporcionan un medio para investigar la organi!ación molecular # la secuencia nucleotdica en una región definida del genoma.
Bibliotecas de cDNA. 8e puede construir una biblioteca que represente los genes que se est"n transcribiendo en una célula eucariótica en un momento dado, utili!ando el mNA aislado de esa célula. =asi todas las moléculas de mNA eucariótico tienen una cola de poliBA en su e/tremo '@. -rimero, se hibrida la población de moléculas de mNA que tienen colas de poliBA '@ con oligoBd< 1DNA corto de cadena sencilla formado sólo por deso/itimidina2. La secuencia de oligoBd< hibrida con la cola de poliBA, # sirve de cebador para la sntesis de una cadena complementaria de DNA utili!ando la en!ima retrotranscriptasa. Esta en!ima es una DNA polimerasa dependiente de NA que copia un molde de NA de cadena sencilla en un DNA de cadena sencilla. El resultado es un d0ple/ NA V DNA de doble cadena. La cadena de NA se elimina trat"ndola con la en!ima ribonucleasa 7. Entonces, la cadena sencilla de DNA se utili!a como molde para sinteti!ar la cadena complementaria de DNA, utili!ando la DNA polimerasa :. El e/tremo '@ de la cadena sencilla de DNA se dobla sobre s mismo formando una horquilla 1un la!o2, por lo que puede servir de cebador para sinteti!ar la segunda cadena. El resultado es un DNA d0ple/ con las cadenas unidas por un e/tremo. La horquilla puede abrirse utili!ando la en!ima nucleasa 8 % obteniéndose una molécula de DNA de doble cadena 1denominada DNA complementario o cDNA2, cu#a secuencia nudeotdica deriva de una molécula de NA.
8i se aFade un tro!o corto de DNA con sitios de restricción en cada uno de sus e/tremos, el cDNA puede clonarse. Este sitio de clonación puede cortarse con la en!ima de restricción adecuada, produciendo e/tremos cohesivos, lo que permite que el cDNA se inserte en el sitio de restricción de un vector plasmdico o f"gico. Jna biblioteca de cDNA es diferente a una biblioteca genómica #a que representa sólo un subconjunto de todos los genes del genoma, no contienen las secuencias promotoras ad#acentes al gen # tampoco contienen los intrones, #a que éstos han sido eliminados del preBmNA durante la maduración del mismo. Las bibliotecas de cDNA utili!an mNA como punto de partida, de manera que sólo representan a las secuencias que se est"n e/presando en un tipo celular, en un tejido, o en un estadio concreto del desarrollo embrionario. La decisión de construir una biblioteca genómica o de cDNA depende del problema planteado. 8i se est" interesado en un gen particular, podra ser m"s f"cil preparar una biblioteca de cDNA del tejido en el que se e/presa dicho gen. -or ejemplo, los glóbulos rojos producen grandes cantidades de hemoglobina, # la ma#ora del mNA de estas células es mNA de la Bglobina. Jna biblioteca de cDNA preparada utili!ando mNA aislado de glóbulos rojos permite aislar con facilidad un gen de la globina. 8i nos interesasen las secuencias reguladoras ad#acentes al gen de la globina, necesitaramos construir una biblioteca genómica, #a que estas secuencias reguladoras no se encuentran en el mNA de la globina, # por lo tanto no estaran representadas en la biblioteca de cDNA.
-roducción de cDNA a partir de mNA. -uesto que muchos mNA eucarióticos tienen una cola poliB adenilada de longitud variable, en su e/tremo '@, un oligonucleótido poliBd< corto puede hibridarse a ella. El poliBd< act0a de cebador de la en!ima retrotranscriptasa, que utili!a al mNA como molde para sinteti!ar una cadena de DNA complementaria. 8e forma una horquilla caracterstica al terminarse la sntesis de la cadena de DNA. 8e elimina el mNA por tratamiento alcalino del complejo, # se utili!a la DNA polimerasa para sinteti!ar la segunda cadena de DNA. La nucleasa 8% se utili!a para abrir la horquilla> el resultado es una molécula de cDNA de doble cadena que puede clonarse en un vector adecuado, o utili!arse como sonda para rastrear una biblioteca.
