AISLAMIENTO DE DNA DE ORIGEN VEGETAL Y SU CARACTERIZACIÓN CARACTERIZAC IÓN ESPECTROFOTÓMETR ESPE CTROFOTÓMETRICA ICA E HIDROLISIS DE RNA Y DNA E IDENTIFICACIÓN DE BASES PÚRICAS Y PIRIMÍDICAS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Purón Hernández Eduardo y Sánchez Sandoval Saed / Grupo: 3FV1 / Sección 2
INTRODUCCION Los ácidos nucleicos se encuentran en todos los seres vivos y aún en los virus, desempeñando las funciones de almacenamiento y transmisión de la información genética. Los ácidos nucleicos al igual que las proteínas son biopolímeros de alto peso molecular constituidos por nucleótidos, los cuales se encuentran unidos entre sí por enlaces covalentes denominados enlaces fosfodiéster. Un nucleótido está formado por una base heterocíclica nitrogenada derivada de la purina o de la pirimidina, de un azúcar y un grupo fosfato. Dependiendo del tipo de nucleótido existen 2 clases de ácidos nucleicos: el ácido desoxirribonucleico (DNA) y el ácido ribonucleico (RNA).
El DNA está formado por desoxirribonucleotidos cuya base nitrogenada puede ser adenina, guanina, citosina o timina; el azúcar 2-desoxi-Dribosa y el grupo fosfato. El RNA está formado por ribonucleotidos cuya base nitrogenada puede ser adenina, guanina, citosina o uracilo; el azúcar D-ribosa y el grupo fosfato.
Observar gráfica anexa al reporte de absorbancia vs longitud de onda. Con ayuda del nomograma se obtuvieron las concentraciones de DNA y proteínas, a 260 y 280 280 nm respectivamente: 2 = .
í í 28 = .
1.35
0.66
Identificación de bases púricas y pirimídicas por cromatografía en capa fina
Guanina
RNA hidrolizado DNA hidrolizado
Citosina Uracilo de RNA Adenina Timina de DNA Uracilo Timina
Las funciones del DNA consisten en almacenar la información genética completa, necesaria para especificar la estructura de todas las proteínas y en cada una de las clases de RNA del organismo, en programar, tanto en el tiempo como en el espacio, la biosíntesis ordenada de los componentes de las células y de los tejidos, en determinar la actividad de un organismo a lo largo de su ciclo vital y finalmente, en definir la individualidad de un organismo dado.
OBJETIVOS
Aislar, purificar y caracterizar DNA de espinaca. Separar las bases nitrogenadas del DNA y el RNA por cromatografía en capa fina a partir de hidrolizados de los mismos, identificándolas por la propiedad que tienen de absorber luz ultravioleta.
RESULTADOS
Cromatografía en capa fina de DNA, RNA y bases nitrogenadas.
Tabla 1 MUESTRA
Rf
DNA hidrolizado RNA hidrolizado Guanina Adenina Citosina Timina Uracilo
0.76 0.68 0.40 0.46 0.32 0.78 0.70
Caracterización espectrofotométrica del DNA 1
DISCUSIONES Para la obtención de DNA de origen vegetal, se utilizaron hojas de espinaca, las cuales se colocaron en un mortero y se procedió a triturar, de esta forma se está rompiendo la pared celular de estas células vegetales y a su vez separarlas. Al finalizar se adiciono 5 mL solución de EDTA-Tris-NaCl y se siguió triturando, en esta solución el EDTA protege al DNA al no permitir que lo ataquen las nucleasas (enzimas que atacan ácidos nucleicos) que tienen como cofactor al Mg +2, ya que el EDTA forma un complejo con el cofactor y por lo tanto no permite que las nucleasas realicen su función, el Tris es una sal que da amortiguamiento de pH para dar estabilidad al DNA. Posteriormente se 0.3 mL de amilasa, la cual se encarga de romper el almidón en moléculas más pequeñas, se mezcló y se incubo durante 10 minutos a temperatura ambiente, de inmediato se agregaron 10 mL de una solución saturada de NaCl, la cual favorece la ruptura de la célula, ya que con esta se ejerce una presión osmótica muy alta y por lo tanto las membranas se rompen, por lo tanto se libera almidón, lípidos proteínas, etc. También se adiciona 5 mL de SDS al 10%, el cual rompen las membranas también y se libera el DNA, una vez adicionas estas soluciones se filtró el homogeneizado a través de una tela sintética en un embudo, colocando el filtrado en un tubo Falcon. Más tarde se adiciono 15 mL de la mezcla cloroformo: alcohol isoamílico, en donde los lípidos son afines al cloroformo y se van con él, mientras que el alcohol isoamílico desnaturaliza a las proteínas, por lo tanto estas precipitan.
Una vez obtenida la gráfica de absorbancia vs longitud de onda, se observa a la longitud de onda de 260 nm una campana en la gráfica, la cual corresponde al DNA, mientras que a la longitud de onda de 280 nm se observa otra campana pero más pequeña que la de 260 nm, esta corresponde a las proteínas. Lo anterior significa que se tiene más DNA que proteínas, lo cual se puede comprobar cuando obtenemos las concentraciones de estos con ayuda de nomograma, en el cual se tienen que la concentración de DNA es de 0.054 mg/mL, mientras que en las proteínas se tiene una concentración de 0.05 mg/mL.
Identificación de bases púricas y pirimídicas por cromatografía en capa fina
Para la cromatografía se utilizó DNA y RNA hidrolizados de los cuales se colocaron 5 aplicaciones sobre el cromatograma, y también se colocaron 2 aplicaciones de las bases nitrogenadas. Se desarrolló la placa de cromatografía, utilizando como fase móvil una mezcla de butanol: ácido acético: agua. Una vez desarrollado el cromatograma se revelo por exposición a la luz ultravioleta en un cuarto oscuro. Se puede observar en el cromatograma, dos manchas muy amontonas, las cuales corresponden al DNA y RNA (de derecha a izquierda) y estas al estar hidrolizados se tiene una impureza y por lo tanto no se distingue la separación de manchas, estas largas manchas tienen a su lado izquierdo las manchas de guanina, adenina y citosina (de derecha a izquierda), lo cual significa que tanto DNA como RNA contienen estas 3 bases nitrogenadas.
Posteriormente se procedió a centrifugar la mezcla a 4000 rpm durante 10 minutos, una vez finalizado esto, se recuperó el sobrenadante (ahí se encuentra el DNA) con una pipeta Pasteur, evitando tocar la interfase donde se encuentran las proteínas. Se vertió el sobrenadante a un frasco que contenga 30 mL de alcohol 96° frío.
Caracterización espectrofotométrica del DNA
Se recuperó el DNA con una varilla de vidrio y se vertió en un tubo que contenga 3 mL aproximadamente de agua, para posteriormente leer en el espectrofotómetro en un intervalo de longitud de onda de 200 a 300 nm. Las bases nitrogenadas son cíclicas y aromáticas, debido a la presencia de dobles ligaduras conjugadas, por lo tanto pueden absorber en el espectro ultravioleta.
Las 3 bases nitro enadas ue contienen el DNA
el RNA.
Por último, lo que sí se puede distinguir en las primeras manchas de DNA hidrolizado y de RNA hidrolizado, es una mancha en la parte superior para ambas, al camparlas con las manchas de timina y uracilo (de derecha de izquierda), tenemos que la mancha de DNA se encuentra a la misma distancia que la mancha de 2
timina, y la mancha de RNA se encuentra a la misma distancia que la mancha de uracilo, con esto podemos decir que el DNA y RNA tienen las mismas bases nitrogenadas (adenina, guanina y citosina) a excepción de una última, que en el DNA corresponde a timina y en el RNA corresponde a uracilo.
Las bases nitrogenadas timina y uracilo, encuentran en DNA y RNA respectivamente.
que
se
CONCLUSIONES
El DNA se encuentra en una mayor concentración en las células vegetal que las proteínas. Las bases nitrogenadas al ser aromáticas y tener dobles enlaces conjugadas pueden absorber la luz ultravioleta. El DNA y el RNA contienen adenina, guanina y citosina, lo único que lo diferencia es la timina presente en DNA y el uracilo presente en RNA.
BIBLIOGRAFÍA 1.
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E. Conn Eric, “Bioquímica fundamental”, Universidad de California, Editorial Limusa, 2001, México D.F. Voet Donald, “Fundamentos de Bioquímica”, Editorial Médica Panamericana, 2ª Edición, 2007, Madrid, España.
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