AISLAMIENTO DEL ADN.
El ADN (acido desoxirribonucleico) es una macromolécula que forma parte de todas las células, contiene la información genética usada en el desarrollo y funcionamiento de los organismos; desde la química es un polímero de nucleótidos y cada nucleótido está formado por un azúcar, una base nitrogenada que puede ser Adenina, Timina, citosina o guanina y un grupo fosfato que actúa como enganche de cada nucleótido distinguiéndolo por su base nitrogenada. Los ácidos nucleicos presentan unas propiedades físico-químicas como en disolución, reactividad, hidrólisis química de ácidos nucleicos, hidrólisis acida, hidrólisis alcalina y absorción en el ultravioleta. El ADN en los organismos eucariotas esta dentro del núcleo celular y en los organismos procariotas esta en el citoplasma; gracias al conocimiento de la estructura del ADN se ha logrado analizar problemas concretos.
PALABRAS CLAVES: ADN, POLIMERO, DESOXIRRIBOSA, ADENINA, GUANINA, TIMINA, CITOSINA, ARN, FOSFODIESTERES INTRODUCCION El ADN se encuentra en el núcleo de las células eucarióticas donde aparece unido a proteínas formando la cromatina. Es la molécula portadora de la información genética, donde se encuentra la clave de los caracteres hereditarios que se traspasan de la célula madre a las células hijas y en definitiva de padres a hijos. Cada persona tiene su propia información genética, heredada del padre y de la madre. Y por tanto, el ADN de cada persona es único y constituye sus señas moleculares de identidad. Sin embargo, la estructura de la molécula del ADN es igual en todos los seres vivos y consta de una doble cadena de nucleótidos de A (Adenina), T (Timina), C (Citosina) y G (Guanina) enrollados en hélice. La estructura del ADN, llamada la doble hélice, fue descubierta por Watson y Crick en 1953 y abrió el camino de la Genética Molecular El modelo de ADN consta de dos bandas o cadenas de ADN entrelazadas que se enrollan sobre sí mismas en direcciones opuestas.
Esta doble cadena mantiene su estructura gracias a puentes de hidrogeno, formando una estructura tridimensional, en forma similar a una escalera en espiral. Cada cadena es una larga secuencia de nucleótidos; cada nucleótido posee un grupo fosfato, un azúcar de cinco carbonos (desoxirribosa) y una de cuatro bases nitrogenadas distintas. Cada peldaño de la escalera en espiral se forma de un par de bases de nucleótidos, una base de cada cadena. Una de las características fundamentales del ADN es que segmentos muy cortos del mismo contienen genes, los cuales especifican el orden en que cada aminoácido se une para construir una proteína. A su vez, las proteinas rigen el desarrollo de los rasgos de un individuo. El modelo de la doble cadena explica la forma en que el ADN puede transmitir la información genética. Si las cadenas opuestas son complementarias y aunque existen restricciones respecto al apareamiento de las bases nitrogenadas, el número de combinaciones en cada cadena es casi limitado, y las diversas secuencias codifican diferente información. Como las moléculas de ADN en una célula pueden tener millones 1
de nucleótidos, la secuencia de bases en una cadena puede almacenar inmensas cantidades de información. Con base en la información anterior, en la práctica se busco la extracción del ADN de los guisantes de una forma sencilla utilizando los materiales llevados al laboratorio y preparando las muestras, teniendo como objetivo romper la cadena de ADN y como resultado observar los hilos en las muestras preparadas.
ASPECTOS METODOLOGICOS El ADN (Acido desoxirribonucleico) es la molécula que guarda los secretos de los genes y se encuentra en el núcleo de cada célula. Una sola molécula de ADN es muy pequeña para verla a simple vista. Pero si tienes muchas moléculas de ADN juntas, ellas se pegan unas a otras y se forman filamentos blancos. Para poder extraer el ADN de las células de lentejas, primerio se hizo la realización del tampón salino (se toma un vaso precipitado de 250ml, se hace una mezcla de 200 ml de agua destilada, 2 gramos de sal común y 5 gramos de bicarbonato de sodio.); previamente este es llevado al la nevera por un periodo de tiempo de aproximadamente de 15 a 20 minutos. Posteriormente en el vaso de la licuadora, se tritura las lentejas en 4 secciones de 15 segundos, esto permite romper y liberar las moléculas del ADN, a esta mezclar se le agrega la preparación tampón salino y se deja accionar en la licuadora por un minuto. En un vaso precipitado de 250ml, se tomo la mezcla y se filtro utilizando la coladera (al filtrar separamos el ADN de la pared celular, algunas proteínas y restos de las lentejas), al filtrado obtenido, se le añadió 30ml de detergente liquido con la pipeta de 10ml (Si a través del filtro aún pasan células, cloroplastos o membranas que no fueron trituradas por la licuadora, las rompemos
con el jabón.), se mezcla con la varilla de vidrio evitando ocasionar emulsión (espuma), dejando reposar por 15 o 20 minutos. En una gradilla se toman 4 tubos de ensayo se le aplica 5ml a cada tubo de la muestra elaborada, se le agrego 5ml de alcohol isopropilico enfriado a 0ºc (El ablanda carne rompe algunas proteínas y hace que el ADN se haga menos compacto.) se dejo deslizar el alcohol por la cara interna del recipiente, teniendo este inclinado. Se deja actuar el alcohol isopropilico durante 20 minutos. Durante este tiempo se formaron 3 fases, la primera que es la parte inferior del tubo y corresponde al caldo molecular, la segunda fase en la fase superior y corresponde al alcohol isopropilico y en la tercera fase la unión del caldo molecular y el alcohol donde se formo una fibrillas de color blancuzco que son las fibrillas de ADN.
RESULTADOS Y ANALISIS Para obtener los resultados del aislamiento del ADN, procedimos a preparar el tampón salino con 200 ml de agua destilada, 2 gramos de sal y 5 gramos de bicarbonato de sodio, formamos la mezcla y dejamos enfriar en la nevera durante 20 minutos. Luego en la licuadora, depositamos los guisantes en este caso decidimos utilizar lentejas, con un poco de agua y accionamos 4 veces las cuchillas durante 15 segundos cada una, lista la preparación agregamos la mezcla realizada en la licuadora con el tampón frio y la volvemos a colocar en la licuadora. En un vaso aparte tomamos la mezcla que resulto y la filtramos con el colador, al filtrado añadimos 30 ml de detergente, en este caso fue jabón líquido de manos antibacterial con ayuda de la pipeta, lo
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mezclamos y dejamos reposar durante 20 minutos.
Luego de dejar reposar la muestra, las depositamos en los 4 tubos de ensayo en cada uno 5 ml de la muestra. Luego agregamos 5 ml de alcohol isopropilico a 0°C a cada c ada uno de los tubos de ensayo, haciendo que se resbale por las paredes del tubo, esto lo dejamos durante 20 minutos.
Se observan tres capas, la parte de abajo es la mezcla de las lentejas con el detergente, la segunda fase es el alcohol isopropilico isopropilico y la tercera fase es la reacción de la mezcla con el alcohol isopropilico donde se forman las fibras del ADN
Examinamos las muestras en los tubos y observamos que se formaron tres capas, en la parte superior donde se encuentra la tercera capa se logran ver las fibras de ADN en la forma de unos hilos blancos.
El ADN se precipita en el alcohol fuera de la solución, donde puede ser visto. Además de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la solución acuosa. Introducimos la varilla atravesando la capa de alcohol, es decir hasta la segunda capa, las fibras de ADN quedan adheridas, como si fuera hilos de algodón. Eso nos confirma que para el aislamiento del ADN se requiere unas etapas básicas: primero tiene que romperse la pared celular y la membrana plasmática 3
para poder acceder al núcleo de la célula, esto se realiza gracias al procedimiento en la licuadora. Luego debe romperse también la membrana nuclear para dejar libre el ADN. El detergente emulsiona los lípidos de las membranas celulares y las rompen, por esto se necesita un detergente fuerte. Luego para aislar el ADN se agrega alcohol para que precipite en el. El ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el agua. Y nos permite ver las fibras de ADN en la capa superior.
DISCUSION En este laboratorio queríamos distinguir el aislamiento del ADN ya que se debe a varios procesos y etapas de enfriamiento, en la primera parte procedimos a preparar el tampón salino con los 250 ml de agua destilada, 2 gramos de sal y 5 gramos de bicarbonato de sodio, formamos la mezcla y dejamos enfriar en la nevera durante 20 minutos, pudimos observar que la mezcla se encontraba refrigerada y procedimos a la segunda parte de la cual procedimos a licuar pero tenemos en cuenta que utilizamos lentejas las que disolvimos dándole cuatro veces a la hojilla de la licuadora, observamos una masa espesa de gránulos de lentejas pasamos a colarlo y agregarle el detergente, luego se dejo reposar y agregamos el alcohol y observamos las tres capas que se formaron, al reposar vimos como precipito las fibras del ADN en la capa superior.
REFERENCIAS
Orué, A., Martínez, C., Mendoza, A. 2008. Identificación de una secuencia de ADN genómico de especifica del Leishmania subgénero Leishmania , Caracas, Revista de la Sociedad
Venezolana 28:6-13
de
Microbiología;
Fernández, N., Ramírez, A., Ortega Y. Modelación Dinámica de Una Comunidad de Macro invertebrados Bentónicos Frente a Un Gradiente Temporal de Contaminación Orgánica. Propuesta Metodológica, Colombia. Bustamante C., Principios Básicos de Biología, Fascículo 2: Moléculas de Importancia Biológica, Estructura y Función de La Célula Eucariota.
ANEXO ¿Cuál es la función de utilizar tampón salino en el procedimiento? La extracción del ADN, requiere una serie de etapas básicas. En primer lugar tienen que romper la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula. Rompiéndose la membrana nuclear se deja libre el ADN. La solución de sal (tampón salino), ayudada por la licuadora es capaz de romper la pared celular y las membrana plasmáticas y nuclear.
¿Qué finalidad tiene el exponer las células a un detergente fuerte? Es posible romper la membrana celular e incubar las nucleasas intracelulares intracelul ares al mismo tiempo. Por ejemplo, el detergente permite que se solubilicen las membranas celulares y sales caotropicas fuertes que inactiven las enzimas intracelulares. intracelulares. Posteriormente tras la lisis celular y la inactivación de las nucleasas, los restos de células se eliminan fácilmente por filtración o precipitación.
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¿Qué acción tiene el alcohol isopropilico isopropili co sobre la molécula de ADN? El alcohol se utiliza para precipitar el ADN, que es soluble en agua pero, cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y se precipita en la interface entre el alcohol y el agua.
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