Aislamiento y Purificación de Hesperidina a Partir de Cáscaras de Naranja y Mandarina

UNIVERSIDAD UNIVERSIDAD PEDAGÓGICA Y TECNOLÓGICA DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS ESCUELA DE QUIMICA QUMICA

AISL AMIENTO Y PURIFICACIÓN DE HESPERIDINA A PARTIR PA RTIR DE CÁSCARAS CÁSCA RAS DE NARANJA Y MANDARINA MANDARINA Ál varez, var ez, Brand Br and on ,a Guamán, Patricia, a Sandoval, Andreaa Laboratorio de Química Medicinal, Rotonda Norte, Centro de Laboratorios. Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, Avenida Central del norte 39-115, Tunja, Boyacá, Colombia. a

Resumen: En el presente trabajo se realizo la extracción de hesperidina a partir de cáscaras de naranja mediante la técnica de extracción por reflujo y cáscaras de mandarina mediante la técnica Soxhlet usando como disolvente metanol. Las distintas técnicas de extracción utilizadas presentaron diferencias significativas en cuanto a la cantidad de hesperidina extraída con un rendimiento de extracción de 0,865 % para la cáscara de naranja y 0,143% para la cáscara de mandarina. La caracterización física se realizó mediante cromatografía en capa fina (TLC), espectroscopía UV-Vis y resonancia magnética nuclear protónica (RMN- 1H) y la caracterizaci c aracterización ón química se realizó a través de la prueba de Shinoda y prueba para fenoles. Se observó que la hesperidina obtenida a partir de las cortezas de naranja presentó un mayor rendimiento de extracción, grado de pureza adecuado y resultados positivos para las pruebas de caracterización química frente a la hesperidina obtenida a partir de la corteza de mandarina. Abs Ab s trac tr act: t: In this work, the extraction of hesperidin from orange peels was carried out using the technique of reflux extraction and tangerine peels using the Soxhlet technique using methanol as solvent. The different extraction techniques used showed significant differences in terms of the amount of hesperidin extracted with an extraction yield of 0.865% for orange peel and 0.143% for tangerine peel. The physical characterization was carried out by thin layer chromatography (TLC), UV-Vis spectroscopy and proton nuclear magnetic resonance (1H-NMR) and the chemical characterization was carried out through the Shinoda test and phenol test. It was observed that the hesperidin obtained from the orange rinds had a higher extraction yield, adequate degree of purity and positive results for the chemical characterization tests against the hesperidin obtained from the mandarin bark. 1. INTRODUCCIÓN actividades biológicas: antioxidante, 2 antimicrobiana,3 antiinflamatoria, 4 En general, los flavonoides pertenecen al inmunomoduladora, 5 antiviral, 6 grupo de los compuestos fenólicos, un antiproliferativa, 7 antimutagénica, 8 grupo de metabolitos numerosos que anticarcinogénica,9 acciones abarcan aproximadamente 8.000 vasodilatadoras, y prevención de sustancias, divididas en 22 grupos con enfermedades coronarias y desórdenes una estructura común, determinada por neurodegenerativos, 10 un anillo aromático unido al menos a un sustituyente hidroxilo (grupo fenol) y En los cítricos, los flavonoides más frecuentemente se encuentran como abundantes son aquellos pertenecientes derivados de ésteres, éteres y a los grupos de las flavonas, flavanonas, glicósidos.1 Los compuestos fenólicos chalconas y dihidrochalconas. Estos han mostrado una amplia variedad de compuestos tienen una distribución

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restringida, lo cual hace que sean descritos como flavonoides minoritarios a pesar de estar presentes en concentraciones significativas en 11 algunos alimentos de alto consumo.

mandarina efectuando una comparación en el rendimiento de extracción contrastando las técnicas empleadas y la corteza del fruto empleado con posterior caracterización físico-química del producto obtenido mediante pruebas químicas y análisis UV-Vis, TLC y RMN1H.

El flavonoide hesperidina fue aislado por primera vez por Leberton, en 1828, de la parte interna de la cáscara de la naranja12. Posteriores investigaciones han estudiado la extracción de este metabolito a partir de la cascara de mandarina13, limon14 y toronja 15 principalmente.

2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Extracción de hesperidina

Se tomó las cortezas de naranjas y mandarinas dejándose secar a temperatura ambiente por un periodo de una semana. Posteriormente se procedió a cortar en pequeños trozos las cortezas de naranja y mandarina reportándose un peso inicial de 30,168 g y 30,760 g respectivamente. Cada corteza por separado se empaquetó dentro de un dedal de papel filtro y se introdujo en un extractor Soxhlet con 150 mL de éter de petróleo (40-60°) dejándose hasta observar desaparición del color por parte del disolvente (el éter de petróleo se recuperó por medio de un proceso de rotaevaporación).

Figura 1. Estructura de la hesperidina 13.

La hesperidina está formada por una aglicona, hesperetina y un disacárido unido, rutinosa (figura 1). La hesperidina se presenta cono una sustancia solida que es fácilmente soluble en piridina y soluciones alcalinas, generando una solución amarillenta clara; presenta ligera solubilidad en metanol, ácido acético glacial caliente y nula solubilidad en acetona, benceno y cloroformo. En soluciones acuosas disuelve una parte por cada 5000 de agua. En estado puro se produce como agujas y tiene un color entre blanco y amarillo pálido, insípida e inodora; presenta una formula molecular C18H34O15 con un peso molecular de 610,57 g/mol y un punto de fusión entre 258 y 260°C. 13,16 En este trabajo se realizó la extracción de hesperidina a partir de cascaras de naranja y

Las cortezas residuales se dejaron secar a temperatura ambiente con subsiguiente extracción con 150 mL de metanol para cada una de las cortezas: para la cascara de mandarina se procedió a realizar en un sistema Soxhlet y para la cáscara de naranja se realizó bajo un sistema de reflujo, dejando cada uno de los sistemas actuando por un tiempo aproximado de dos horas. Cada uno de los extractos metanólicos obtenidos del paso anterior se concentraron hasta obtener una 2


consistencia de jarabe mediante rotaevaporación, procediendo a recuperar el disolvente utilizado (metanol). Los jarabes obtenidos se disolvieron en 50 mL de una solución de ácido acético al 6% hasta formación lenta de un precipitado amarillo-blancuzco; se filtró la solución y se recuperó el precipitado que se llevó a secado a temperatura ambiente. Una vez seco, se procedió a su purificación mediante lavado en acetona caliente y se registró los pesos finales del extracto aislado. 2.2.

preparación de la muestra se disolvió 10 mg de alopurinol en una mezcla cloroformo/metanol 1:1, se aplicó por separado en cada placa dejando correr la muestra hasta que recorrió aproximadamente las tres cuartas partes de la longitud de la placa. Se retiro la placa, se marcó el frente del solvente y se revelo en una cámara adaptada con yodo. Espectroscopia UV-Vis

Se realizó la toma del espectro UV-Vis mediante un barrido espectral a un rango de 190-1100 nm mediante un espectrofotómetro UV-Vis (Mapada UV1800PC).

Caracterización química

En la identificación de flavonoides se efectuó la prueba de Shinoda: se tomó 4 mg del extracto y se disolvió en 1 mL de etanol al 95%; se adicionó una pequeña lámina de magnesio y unas gotas de ácido clorhídrico concentrado.

Espectroscopia de resonancia magnética nuclear pr otónica

Por último, se realizó la toma del espectro RMN-1H mediante un equipo Bruker AscendTM – 400, que opera a 400 MHz para RMN-1H. Se utilizó dimetilsulfóxido deuterado como disolvente, usando las señales

En la identificación de taninos se tomó 3,5 mg del extracto con disolución en 1 mL de etanol al 95%; luego se adicionó unas gotas de solución de cloruro férrico al 5%. 2.3.

residuales del mismo como referencia (δ:

2,52 ppm en RMN- 1H).

Caracterización física

3. DISCUSIÓN Y RESULTADOS

Cromatografía en capa delgada

Se realizó pruebas de solubilidad empleando mezclas de diclorometano/metanol y cloroformo/metanol en diferentes proporciones. En base a los ensayos realizados anteriormente, se procedió a realizar cromatografía de capa delgada en placas de silica gel, utilizando como fase móvil diclorometano/metanol y cloroformo/metanol en proporciones 3:1 y 1:1 respectivamente. Para la

Las extracciones realizadas por los dos métodos tuvieron diferencias significativas en el rendimiento de extracción debido a las técnicas empleadas para cada caso, así como el tipo de corteza usada. La extracción realizada a partir de la naranja con extracción por reflujo tuvo el mayor rendimiento de extracción (0,865%) en comparación con la extracción realizada a partir de la mandarina con extracción 3


Soxhlet (0,143%). Esto puede indicar que probablemente la naranja posea un mayor contenido de hesperidina en comparación con la mandarina o que la técnica por Soxhlet no es la apropiada para el aislamiento de este tipo de compuestos.

La prueba con tricloruro de hierro es aplicable a la identificación de taninos, los cuales son polímeros de los polifenoles con 1 a 2% de hidróxidos fenólicos libres, los cuales precipitan en presencia de cloruro férrico, provocando una ruptura de enlace y la unión del grupo fenóxido al hierro formando un complejo de coloración oscura. 13 (figura 3).

De acuerdo con lo reportado por Dominguez17, la cantidad de hesperidina encontrada en naranjas y mandarinas es de 35-80 mg/Kg y 2,43-3,99 mg/Kg respectivamente, valores superiores a los resultados obtenidos en este estudio. Cabe decir que el valor reportado es para todo el fruto como tal y no solo para la corteza, por lo cual estos datos sólo pueden ser comparativos de forma parcial.

Figura 3. Reacción de fenol con cloruro férrico.

Las pruebas se solubilidad aplicadas al extracto mostró el mejor resultado para una mezcla CHCl3/CH3OH 1:1. Los R f obtenidos para cada placa cromatográfica fueron 0,73 y 0,875 en fases móviles de CH2Cl2/CH3OH 3:1 y CHCl3/CH3OH 1:1, que concuerda con lo reportado por Tarazona 13. La diferencia en los Rf se debe a la variación en los solventes empleados y sus diversas proporciones de aplicación, indicando que un Rf ideal está entre 0,65 y 0,7.

Las pruebas químicas realizadas al extracto aislado dieron prueba positiva, indicando que el extracto contiene dentro de su estructura taninos y flavonoides. La prueba de Shinoda es positiva cuando el compuesto presenta un flavonoide (flavonas, flavonoles y flavanonas) con núcleo benzopirona que reacciona en presencia de magnesio y ácido clorhídrico concentrado en disolución alcohólica, generando un complejo rojizo en la solución 13 (figura 2):

El espectro UV-Vis (figura 4) arrojó un máximo de absorción a 295 nm y un hombro de absorción a 335 nm; Tarazona 13 reportó para este compuesto un máximo de absorción a 289 nm con una inflexión de baja intensidad a 330 nm siendo picos muy próximos a los mostrados por el extracto obtenido que da un indicio correspondiente a la presencia de hesperidina.

Figura 2. Esquema general de la reacción de Shinoda 13.

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debido a su enlace con el oxígeno que es muy electronegativo. CONCLUSIONES

Se logró aislar un extracto a partir de las cáscaras de mandarina y naranja con un buen grado de pureza indicado por las pruebas realizadas en su caracterización fisicoquímica. Se observó variaciones en el rendimiento de extracción debido a las distintas técnicas de extracción empleadas, así como el uso de dos diferentes fuentes de hesperidina reportándose un mayor contenido de este flavonoide en la naranja con un valor de 0,865%. Las pruebas químicas aplicadas arrojaron resultados positivos para la presencia de taninos y flavonoides dentro de la estructura del extracto aislado. En las técnicas UV-Vis y RMN-1H los resultados fueron concordantes con lo reportado por la literatura 13, que junto con las pruebas químicas confirman que el compuesto aislado corresponde al flavonoide hesperidina. Se recomienda en futuros estudios asociados con la hesperidina tomar un mayor número de muestras para tener resultados significativos hablando en términos estadísticos, consultar técnicas alternativas de extracción menos agresivas tales como microondas y ultrasonido que minimizan el riesgo de pérdida de muestra debido a que este tipo de compuestos son sensibles al calor y a la exposición directa de luz. Con respecto a la caracterización del extracto es sugerible el uso de técnicas como IR, espectrometría de masa y difractometria de rayos X que permitan identificar de

Figura 4. Espectro UV-Vis realizado al extracto.

El espectro RMN-1H permite reconocer características estructurales importantes del compuesto a identificar. En los anexos se muestra el espectro protónico obtenido para el extracto aislado. Se observa la presencia de un doblete a un δ 1,070-1084 ppm correspondiente a los protones de grupo metil en la posición 2ʹʹʹ

que se encuentran altamente protegido por lo cual están en campo alto. En la región comprendida entre 2,747 y 3,766 ppm se encuentran los protones asociados a la molécula de rutinosa ya que se encuentran en ambientes químicos similares. En la región comprendida entre 4,498 y 4,976 ppm se asocian los grupos -OH en la molécula de rutinosa. Entre 5,191 y 5,477 ppm se relaciona con los protones cercanos a los enlaces O-glucosidicos. A partir de 6,117 y 6,931 ppm se relaciona con los protones de los anillos aromáticos presente en la flavonona y por último a 9,137 ppm se relaciona la grupo -OH de la posición 3 ʹ del 3 anillo de la flavonona al estar muy desprotegido ese protón 5


una manera conjunta junto con las pruebas aplicadas el extracto obtenido mediante este trabajo.

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