RECONOCIMIENTO DE PROTEINAS Autores: NatalyYisel Meza Ortega – Manuela Coral Ruiz – Anny Bravo. RESUMEN
Al presentar el laboratorio seguimos el procedimiento paso a paso para llegar a los resultados obtenidos en el siguiente informe. La persona que dono la saliva hace un procedimiento de limpieza bucal para después tener en su boca 20 ml aproximadamente de agua destilada, por un tiempo de 2 minutos hasta que exista una cantidad considerable de amilasa salival para realizar la prueba, después este es depositado en un beaker. Tomamos 3 tubos de ensayo los cuales marcamos con los siguientes números: 0-40-100 y procedimos a agregar a cada uno 1 ml de almidón. A dos de ellos los sometimos a baño maría y después colocamos en ellos 0.5 ml de amilasa salival después se agita cada uno de ellos. Tomamos la placa colorimétrica y a esta le añadimos 3 gotas de lugol en tres cavidades diferentes y colocamos en cada uno de las cavidades 5 gotas de la sustancia de cada uno de los tubos utilizados anteriormente. A continuación rotulamos tres tubos mas con los números 3-7-10, al tubo tres le agregamos 1 ml de almidón y 2 ml de amortiguador de pH 3, al tubo 7se le agrego 1 ml de almidón y 2 ml de amortiguados pH 7 y al tubo 10 1 ml de almidón y 2 ml de amortiguador de pH 10. Después estos tubos los dejamos en baño maría durante un tiempo de 5 minutos, después agregamos a cada uno de los tubos 0.5 ml de amilasa salival posteriormente tomamos el tubo 3 y agregamos 5 gotas de esta solución en la placa de porcelana que contiene dos gotas de lugol y así sucesivamente repetimos este mismo procedimiento con los tubos restantes. Procedimos con la rotulación de tres tubos de ensayo los cuales marcamos con los nombres de amilasa, pepsina y ureasa. A cada uno de ellos agregamos 1 ml de almidón y 2 ml de amortiguador de pH. Depositamos los tubos en el agua a la temperatura requerida y después de 5 minutos al tubo que se marco como amilasa agregamos 0.5 ml de amilasa salival, al tubo marcado como pepsina, 0.54 ml de pepsina y al tubo marcado como ureasa 0.5 ml de ureasa y después procedimos a ensayar con lugol, como lo hicimos con las sustancias de los anteriores tubos. Finalmente rotulamos 3 tubos de ensayo como amilasa, mercurio y plomo, y a cada uno agregamos 1 ml de almidón, 2 ml de amortiguador de pH al tubo rotulado como mercurio le agregamos 1 ml de HgCl (cloruro de mercurio) y al tubo rotulado como pb agregamos 1 ml de nitrato de plomo, depositamos los tubos en el agua a temperatura optima. Esperamos 5 minutos y agregamos a cada tubo 0.5 ml de y se evalúan los resultados como se hizo anteriormente.
Palabras clave: enzimas, amilasa, actividad enzimática, factores enzimáticos.
INTRODUCCION
SALIVA La saliva (también conocida como baba) es un fluido orgánico complejo producido por las glándulas salivales en la cavidad bucal, y directamente involucrada en la primera fase de la digestión. La saliva puede ser vehículo de contagio de enfermedades en humanos, como el herpes labial o la mononucleosis.
CARACTERISTICAS Y FUNCION La saliva es un líquido transparente y de viscosidad variable, lo cual se atribuye al ácido siálico. Es inodora como el agua. La composición y pH de la saliva varían en función de los estímulos (como el olor o la visión de la comida). El pH salival normal oscila entre 6,5 y 7.3 La composición de la saliva es similar a la del plasma y se caracteriza por los siguientes componentes:
PRODUCCION Se estima que la boca está humedecida por la producción de entre 1 y 1.5 litros de saliva al día, durante la vida de una persona se generan unos 34.000 litros. Esta cantidad de saliva es variable ya que va disminuyendo conforme avanzan los años y debido a diferentes tratamientos.1
La producción de saliva está relacionada con el ciclo circadiano, de tal manera que por la noche se segrega una mínima cantidad de saliva. La saliva es segregada por las glándulas salivares mayores parótida y submaxila r (80%90%)) en condiciones estimuladas, mientras que las glándulas sublinguales producen solo el 5% del total. Las glándulas menores son responsables basicamente de la secreción en reposo y contribuyen al 5% al 10% del total de saliva secretada.2 La disminución patológica de saliva recibe el nombre de hiposalivación o hiposialia, mientras que la sensación de sequedad bucal se denomina xerostomía, y la producción excesiva, sialorrea. La medición de la producción de la saliva se llama sialometría.
Agua: Representa un 45 99,5 %. Permite que los alimentos se disuelvan y se pueda percibir su sabor a través del sentido del gusto. Iones cloruro: Activan la amilasa salival o ptialina. Bicarbonato y fosfato: Neutralizan el pH de los alimentos ácidos y de la corrosión bacteriana. Moco:: El contenido de mucina, glicoproteina fundamental de la saliva, produce la viscosidad necesaria para funciones lubricantes y de formación del bolo alimenticio que facilita la deglución a lo largo del tubo digestivo, sin dañarlo. 6 Lisozima: Es una sustancia antimicrobiana que destruye las bacterias contenidas en los alimentos, protegiendo en parte losdientes de la caries y de las infecciones. Enzimas: Como la ptialina, que es una amilasa que hidroliza el almidón parcialmente en la boca, comenzando la digestión de loshidratos de carbono. La lipasa lingual inicia también la digestión de grasas.6 Estaterina: Con un extremo amino terminal muy ácido, que inhibe la precipitación de fosfato cálcico al unirse a los cristales de hidroxiapatita. Además, también tiene función antibacteriana y antifúngica.
Otras sustancias: La saliva contiene también inmunoglobulinas específic as, transferrina y lactoferrina. En el 2006 investigadores franceses del Instituto pasteur identificaron una sustancia en la saliva humana que llamaron Opiorfina, similar a la encontrada enb ratas y vacas, que es hasta seis veces más potente que la morfina para calmar el dolor. 7 2 Calcio:: La saliva está saturada de Ca++, con lo que se evita que los dientes lo pierdan y ayuda a digerir el alimento.
LA AMILASA denominada también sacarasa o ptialina, es un enzima hidrolasa que tiene la función de catalizar la reacción de hidrólisis de los enlaces 1-4 del componente α-Amilosa al digerir el glucógeno y el almidón para formar azúcares simples, se produce principalmente en las glándulas salivares (sobre todo en las glándulas parótidas) y en el páncreas. Tiene actividad enzimática a un pH de 7. Cuando una de estas glándulas se inflama, como en lapancreatitis, aumenta la producción de amilasa y aparece elevado su nivel en sangre(amilasemia). Fue la primera enzima en ser identificada y aislada por Anselme Payen en1833, quien la bautizó en un principio con el nombre de "diastasa". El trabajo de una enzima puede verse afectado por diversos factores, desde
el pH, la temperatura, iones metálicos, y la concentración del sustrato. En el laboratorio se estudiaron todos estos diversos factores comprobando que una enzima se comporta de una manera extraordinaria frente a los procesos de hidrólisis del almidón. La a-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradación del almidón, que es un polisacárido de reserva vegetal. El almidón está formado por dos tipos de moléculas: la amilosa y la amilopectina ambos polisacáridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces a- C1-C4, mientras que la amilopectina tiene, además de estos últimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La aamilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacaridos) como productos.
MATERIALES Y METODOS
RESULTADOS
Materiales y reactivos:
1
2 Beaker de 100 mL Gradilla con 12 tubos de ensayo Cinta de enmascarar Hielo Termómetro Pipeta de 2 mL Agitador de vidrio Placa colorimétrica Gotero Mechero y placa 150 mL de suspensión de almidón 50 mL de reactivo de lugol 50 mL de solución amortiguadora de pH 3 100 mL de solución amortiguadora pH 7 50 mL de solución amortiguadora pH 10 10 mL de pepsina al 0,1% 10 mL de ureasa al 0,1% 10 mL de cloruro de Mercurio al 1% 10 mL de nitrato de plomo al 1%
Métodos: Preparación de amilasa salival Influencia de la temperatura sobre la actividad de la amilasa salival Influencia del pH en la actividad enzimática Especificad de la enzima Efecto de los iones metálicos pesados sobre la acción de la amilasa
INFLUENCIADE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL Ro Tipo de Color Tº tu baño resultante lo (10 min) I d e a l 0 Baño de Azul Hielo oscuro 40 Baño Amarillo maría Tº ocre X entre (35 y 40 ºC) 100 Baño Azul maría a oscuro ebullición 2 INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL R Amortig Color o uador resultante pH t de u pH op l ti o mo 3 3 Azul oscuro 7 7 Amarillo X ocre 1 10 Café 0 oscuro
3 ESPECIFICIDAD DE LA ENZIMA rotulo Color Rx resultante (positiva) amilasa Amarillo X ocre Pepsina negro negro ureasa 4
Especificidad de la enzima Ureasa
Pepsina
EFECTO DE LOS IONES METALICOS PESADOS SOBRE LA ACCIÓN AMILASA rotul Reactivo Color R o adicional resulta x nte Amil _________ amarillo X asa Hg 1 mL de Azul HgCl oscuro Pb 1 mL de negro nitrato de plomo (Pb(NO3)2)
EVICENCIA DE LOS RESULTADOS - Influencia de pH en la actividad enzimática 3
-
-
7
10
Efecto de los iones metálicos pesados sobre la acción de la amilasa. Hg
Pb
Amilasa
Amilasa
ANALISIS DE RESULTADOS
LOS
“La α-amilasa es una enzima
proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradación del almidón, que es un polisacárido de reserva vegetal. El almidón está formado por dos tipos de moléculas: la amilosa y la amilopectina, ambos polisacáridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces α - C1-C4, mientras que la amilopectina tiene, además de estos últimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La α-amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando extrinas lineales y ramificadas (oligosacáridos) como productos. Para medir la actividad enzimática de la α -amilasa, se utilizará un test colorimétrico que detecta el almidón. Para ello se contará con una solución de lugol, ya que el
almidón en presencia de esta solución adquiere una coloración azulada característica. Esto tiene una explicación física: “el lugol se coloca en el interior de la hélice que forma la amilosa (en las regiones hidrofóbicas), formando un complejo de color azul. Cuando la αamilasa actúa, degrada la amilosa, se desintegra la hélice y por tanto en presencia de lugol ya no dará una coloración azul, sino un color amarillo ocre.” 1. En este laboratorio mediremos la desaparición de sustrato (evidenciada por el test colorimétrico) para determinar la actividad de la enzima. Además, analizaremos cómo afectan las distintas condiciones en que actúa la enzima. En la primera parte del laboratorio se estudió la influencia de la temperatura sobre la actividad de la amilasa salival en el cual se rotulo 3 tubos de ensayo como 0, 40 y 100 que corresponden a la temperatura a la que se sometió 1 mL de almidón al 0.5%, que después de 10 minutos se adiciono 0.5 mL de amilasa salival, como se puede observar el factor que afecta la actividad es la temperatura, “la velocidad
de muchas reacciones enzimáticas se duplica aproximadamente por cada 10ºC que aumenta la temperatura. Como la función enzimática depende de la estructura terciaria (o cuaternaria) la actividad de la enzima puede llegar a desaparecer si se producen
cambios notables de temperatura. La mayoría de las enzimas se inactivan a Tª comprendidas entre 50 y 60ºC”2. Por lo tanto en nuestro caso la temperatura óptima es de 40 ºC. Enseguida se estudio la influencia del pH en la actividad enzimática con almidón añadiendo 2 mL de amortiguador de pH 3, 7,10. La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. “El pH alto o bajo se puede producir la desnaturalización de la enzima y en consecuencia su inactivación” 3. “El pH También afecta la forma y por lo tanto la tasa de reacción, cada enzima tiene un pH óptimo. Éste está entre pH 6 - 8 para la mayoría de las enzimas ”4, como en este caso que es de 7 donde se desarrolla la intensidad máxima de la actividad de la enzima y en el prueba se obtuvo un color amarillo ocre que confirma que es optimo. En la prueba de especificidad enzimática se rotulo tres tubos como amilasa, pepsina y ureasa y a cada uno se le agrego 1 mL de almidón, después de someter a un baño de temperatura optima (40°C)y esperar 5 minutos se agregó 0,5 mL de la enzima correspondiente a cada tubo al que se les realizo la prueba colorimétrica donde la amilasa salió positivo con color amarillo
y la pepsina y la ureasa negativo con color negro. Las enzimas son muy específicas, discriminando fácilmente entre sustratos con estructuras muy similares como en el caso de la pepsina y la ureasa donde la coloración indica que no hay actividad enzimática porque la pepsina es una enzima que interviene en la digestión de proteínas, por lo tanto no actúa cuando el sustrato es almidón el cual es un polisacárido de reserva típico de las plantas; en cuanto a la ureasa es una enzima que degrada la urea en amoniaco y no daría el caso con el almidón. αY se comprueba que la amilasa (α (1-4)-glucan-4glucanohidrolasa) actúa sobre la α-amilosa en donde hidroliza al azar los enlaces α (1-4) formando una mescla de de glucosa y maltosa libresdándonos una coloración amarilla en la placa colorimétrica. Y en el efecto de los metales pesados sobre la amilasa salival Los iones metálicos inhiben la actividad enzimática esto se debe a que cambian la naturaleza del centro activo impidiendo la formación del complejo enzima sustrato. Además los metales, pueden participar como catalizadoras para reacciones no deseadas como por ejemplo facilitar reacciones de oxido reducción del ion metálico.
CONCLUSIONES
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La mejor actividad enzimática que se obtuvo es a una temperatura de 40ºC, debido a que se encuentra establecida en la literatura como optima. Por esta razón se concluye que la enzima estuvo en su máxima actividad y funcionamiento. Con el desarrollo experimental de la presente practica nos pudimos percatar de que la variación de una enzima en su metabolismo depende directamente de los factores de factores fisicoquímicos. Se puede mencionar que hay sustancias encargadas de inhibir las reacciones de sustrato con enzima, como los metales pesados, un ejemplo de ello son la plata y el mercurio. Con esta investigación se puede concluir que la acción de la amilasa salival es bastante buena y, sobre todo, rápida en ayuda de una temperatura similar a la temperatura corporal, ya que sin ella la actividad enzimática se desfavorece y la proteína se puede desnaturalizar o perder su actividad.
RECOMENDACIONES
No pipetear los reactivos con la boca ya que estos pueden ser tóxicos y causar daño en el organismo. Mantener los reactivos en la cámara de aire ya que estos
expulsan unos gases que pueden ser perjudiciales para la salud. Lavar muy bien la boca antes y no haber comido ningún alimento si se es voluntario para donar la saliva. Hacer buches con agua de grifo para eliminar cualquier residuo de comida que pueda quedar localizado en la boca y de esta manera obtener mejores resultados. Lavar muy bien la placa colorimétrica antes de usarla para que los resultados sean exactos y no aparezcan falsos positiva.
CIBERGRAFIA
1. Actividad enzimática de la amilasa, tomado el 26 de octubre a las 3:31 pm de, http://www.monografias.com/tra bajos-pdf900/actividadenzimatica-amilasa/actividadenzimatica-amilasa.pdf 2. FACTORES QUE REGULAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA tomado el 26 de octubre a las 4:10 pm de,http://www.slideshare.net/cipr esdecartagena/factores-queregulan-la-actividad-enzimtica5852800
3. libro botanica online, enzimas, tomado el 26 de octubre a las 4:12 pm de, http://www.forest.ula.ve/~rubenh g/enzimas/index.html 4. Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Efecto del pH en la actividad enzimática tomado el 26 de octubre a las 4:23 pm de,
http://docencia.izt.uam.mx/sgpe/ files/users/uami/sho/Tema_5b_ pH.pdf
