Aspectos generales de la tecnología del de l ADN recombinante
A mediados mediados de la década de de 1970, inició el desarrollo desarrollo de nuevas nuevas formas formas de estudio del ADN que condujeron a métodos de investigación radicalmente novedosos, como la tecnología del ADN recombinante, en la cual los investigadores empalman ADN de diferentes organismos en el laboratorio. Un objetivo de esta tecnología es permitir a los científicos obtener mucha s copias de un segmento específico de ADN para fines de estudio. Ya que continuamente están surgiendo nuevos métodos para analizar el ADN, aquí no se intentará explorarlos en detalle. En lugar de ello, se analizan algunos de los métodos importantes que han aportado un fundamento para las tecnologías comúnmente utilizadas por los genetistas moleculares. En principio se considera cómo los estudios de secuencias de ADN han ayudado a los científi cos a entender la organización de los genes y la relación entre los genes y sus productos. En efecto, la mayor parte de nuestro conocimiento actual de la estructura y control de la expresión de los genes eucariotas, y de sus funciones durante el desarrollo de un organismo, proviene de la aplicación de esos métodos. La secuenciación de ADN también ha revolucionado sistemáticamente ayudando a aclarar las relaciones evolutivas. Este capítulo también explora algunas de las aplicaciones prácticas de las tecnologías del ADN. Una de las áreas de estudio, de rápido avance, es la modifi cación molecular, que altera el ADN de un organismo para producir nuevos genes con nuevos rasgos. La modifi cación molecular, también llamada ingeniería genética, puede tomar múltiples vías, que van desde la investigación básica a la producción de cepas de bacterias para fabricar productos proteínicos de diversa utilidad, hasta el desarrollo de plantas y animales que expresan genes ajenos. El desarrollo de la clonación de ADN, de la modifi cación molecular, y de técnicas relacionadas ha transformado el punto de vista de las personas acerca de la biotecnología, que es el uso comercial o industrial de células u organismos. Actualmente, Actualmente, la biotecnologí biotecnología a incluye numerosas numerosas aplicaciones aplicaciones en tan tan diversas diversas áreas como medicina, alimentos y agricultura, y en ciencias forenses.
CLONACIÓN DEL ADN
La tecnología del ADN recombinante no se desarrolló rápidamente. Tiene sus raíces en la década en 1940 en estudios genéticos de bacterias y bacteriófagos (“devoradores de bacterias”) o virus que las infectan. El biólogo molecular Paul Berg fue el primer investigador que elaboró una molécula de ADN recombinante; en 1980, compartió el Premio Nobel en Química por sus contribuciones a la tecnología del ADN recombinante. Después de décadas de investigación básica y la acumulación de extenso conocimiento, esta tecnología se ha hecho alcanzable y es disponible entre muchos científi cos que ahora emplean esos métodos. En la tecnología del ADN recombinante, los científi cos utilizan enzimas de restricción (endonucleasas) de las bacterias para cortar moléculas de ADN sólo en lugares específi cos. Las enzimas de restricción permiten dividir la molécula de ADN en segmentos manejables. Luego, cada fragmento se puede incorporar a una molécula vectorial apropiada, un portador capaz de llevar el fragmento de ADN al interior de la célula. Los bacteriófagos y las moléculas de ADN llamadas plásmidos son dos ejemplos de vectores. La molécula de ADN bacteriano es una doble cadena generalmente circular y cerrada; mientras que la mayoría de los plásmidos son moléculas sueltas de ADN, mucho más pequeñas, que pueden estar presentes y replicarse dentro de una célula bacteriana, como la E. coli. Los investigadores introducen plásmidos en células bacterianas mediante un método llamado transformación, mediante el cual las células permiten el ingreso de ADN ajeno Para que la transformación sea efi ciente, los científi cos alteran la química de las células mediante la electroporación o electropermeabilización, que consiste en aplicar un shock eléctrico, para que la membrana plasmática sea permeable a los plásmidos. Cuando el plásmido entra a la célula, puede integrarse al genoma, replicarse y transmitirse a las células hijas durante la división celular. Cuando un plásmido recombinante, que tiene empalmado un ADN ajeno, se replica de esta manera, se elaboran muchas copias idénticas del ADN ajeno; en otras palabras, el ADN ajeno se clona. Los transposones son otros vectores efi cientes para transferir genes en ratones y en otros organismos modelo utilizados en la investigación. Recuerde, del capítulo 13, que un transposón es un elemento genético móvil que puede cortarse a sí mismo de un lugar del genoma de una célula e insertarse en un lugar o posición diferente.
Las enzimas de restricción son “tijeras moleculares”
El descubrimiento de las enzimas de restricción constituyó un importante avance en el desarrollo de la tecnología del ADN recombinante. En la actualidad, un gran número de distintos tipos de enzimas de restricción, cada uno con sus propias características, están fácilmente disponibles a los investigadores. Por ejemplo, una enzima de restricción conocida como HindIII es capaz de buscar un segmento de ADN llamado sitio de restricción del tipo 5¿ – AAGCTT –3¿, y cuando lo encuentra, lo corta. Un sitio de restricción es una secuencia de ADN que contiene el sitio que será eliminado o cortado por una enzima de restricción específi ca. La secuencia 5¿-GAATT C – 3¿ es cortada por otra enzima de restricción, conocida como EcoRI. En general, los nombres de las enzimas de restricción son derivados de los nombres de las bacterias en que originalmente fueron aisladas. Así, HindIII y EcoRI son derivados de Hemophilus infl uenzae y E. coli, respectivamente. ¿Por qué las bacterias producen estas enzimas? Durante la infección, un bacteriófago inyecta su ADN en la célula bacteriana. La bacteria se puede defender a sí misma si tiene enzimas de restricción que ataquen al ADN del bacteriófago. La célula bacteriana cuida que su propio ADN no sufra algun daño, modifi cándolo después de la replicación. Para ello, una enzima agrega un grupo metilo a una o más bases en cada sitio de restricción de tal forma que la enzima de restricción no pueda actuar en el ADN bacteriano. Las enzimas de restricción son una herramienta que permite a los científi cos cortar, de manera controlada, el ADN cromosómico en fragmentos más cortos. Muchas de las enzimas de restricción empleadas para estudios de ADN recombinante cortan secuencias palindrómicas (se leen igual en ambas direcciones), lo que signifi ca que la secuencia de bases de una cadena, como una molécula de doble cadena se diagrama como sigue:
Al cortar ambas cadenas del ADN, pero en forma escalonada, esas enzimas producen fragmentos con idénticos extremos complementarios de cadena simple:
Esos extremos se llaman extremos pegajosos porque se emparejan mediante enlaces de hidrógeno con los extremos de cadenas complementarias, de otras moléculas de ADN que han sido cortadas con la misma enzima. Una vez que los extremos pegajosos de las dos moléculas se han unido de esta manera, entonces se tratan con ADN ligasa, una enzima que une covalentemente a los dos fragmentos de ADN para formar una molécula de ADN recombinante estable.
Corte de ADN con una enzima de restricción Muchas enzimas de restricción, como la HindIII, cortan el ADN en secuencias que son palindrómicas, produciendo extremos pegajosos complementarios. Las pequeñas fl echas negras designan los sitios de escisión de la enzima.
El ADN recombinante se forma cuando el ADN está empalmado en un vector En la tecnología del ADN recombinante, los genetistas cortan el ADN que va a ser clonado y el ADN del plásmido mediante la misma enzima de restricción. Entonces las dos muestras de ADN son mezcladas bajo condiciones que faciliten el enlace de hidrógeno entre las bases complementarias de los extremos pegajosos, y las muescas en el ADN recombinante resultante se sellan por el ADN ligasa. Empalme de ADN ajeno (gen de interés) en un vector de clonación (en este ejemplo, un plásmido bacteriano) para producir ADN recombinante
Los plásmidos que ahora se utilizan en el trabajo del ADN recombinante han sido extensamente manipulados en el laboratorio para incluir características útiles para aislar y analizar el ADN clonado.
Entre éstos está un origen de replicación ), uno o más sitios de restricción, y genes que dejen a los investigadores seleccionar células transformadas mediante plásmidos recombinantes. Estos genes permiten que las células transformadas crezcan bajo condiciones específi cas en las cuales las células sin esta modifi cación, no pueden hacerlo. Típicamente, los plásmidos no contienen genes esenciales de las células bacterianas en condiciones normales. Sin embargo, con frecuencia transportan genes que son útiles bajo condiciones ambientales específi cas, como genes que confi eren resistencia a antibióticos particulares o que permiten que las células utilicen un nutriente específi co. Por ejemplo, las células transformadas con un plásmido que incluye un gen para resistencia al antibiótico tetraciclina pueden crecer en un medio que contiene tetraciclina, mientras que ahí las células no transformadas no pueden hacerlo.
Una propiedad limitante de cualquier vector es el tamaño del fragmento de ADN que puede transportar de manera efectiva. Es frecuente que el tamaño de un segmento de ADN se presente en kilobases (kb), con 1 kb igual a 1000 pares de bases. Normalmente, los fragmentos que son más pequeños que 10 kb son insertados en plásmidos para empleo en E. coli. Sin embargo, fragmentos mayores requieren el uso de vectores bacteriófagos, que pueden manejar hasta 23 kb de ADN. Otros vectores son vectores de clonación cósmidos, que son vectores de combinación con características de bacteriófagos y plásmidos, y cromosomas artifi ciales bacteriales (BAC), que acomodan fragmentos mucho más grandes de ADN. Un solo BAC puede incluir hasta 200 kb de ADN extra, una cualidad que hace a los BAC especialmente útiles en el Proyecto Genoma Humano. El ADN recombinante también se puede introducir en las células de organismos eucariotas. Por ejemplo, los genetistas emplean virus modifi cados como vectores, en células mamarias. Estos virus son desactivados para que no maten a las células que infecten. En su lugar, las moléculas de ADN viral, así como el ADN ajeno que transportan, quedan incorporados en los cromosomas de la célula después de la infección. Posteriormente se analizarán otros métodos que no requieren un vector biológico. -El ADN puede ser clonado en el interior de las células Debido a que un gen individual sólo es una pequeña parte del ADN total en un organismo, aislar el pedazo de ADN que contiene ese gen particular es igual a encontrar una aguja en un pajar: se necesita un poderoso detector. Actualmente, muchos métodos permiten a los biólogos aislar una secuencia específi ca de nucleótidos de un organismo. En seguida se presenta el análisis de métodos para clonar el ADN en el interior de las células bacterianas. Como ejemplo se utiliza la clonación del ADN humano, aunque el procedimiento es aplicable para cualquier organismo. El ADN total en una célula constituye su genoma. Por ejemplo, si el ADN se extrae de las células humanas, entonces se conoce como ADN genómico humano. Una biblioteca de ADN genómico es una colección de miles de fragmentos de ADN que representan a todo el ADN en el genoma. Cada uno de estos fragmentos se puede insertar en un plásmido, que a su vez normalmente se incorpora en una célula bacteriana. Así, una biblioteca de ADN genómico está almacenada en una colección de bacterias recombinantes, cada una con un diferente fragmento de ADN humano. Los científi cos emplean bibliotecas de ADN genómico para aislar y estudiar genes específi cos. Además, las bibliotecas de ADN genómico contienen un gran número de secuencias de bases que no codifi can proteínas. Los cromosomas individuales también se pueden aislar para elaborar una biblioteca cromosómica que contiene todos los fragmentos de ADN en ese cromosoma específi co. Si se conoce que un gen de interés está asociado con un
cromosoma particular, entonces es más fácil aislar ese gen de una biblioteca cromosómica que de la biblioteca de ADN genómico. Los métodos de clonación básicos apenas descritos se utilizan para elaborar ADN genómico o bibliotecas cromosómicas. Primero, el ADN se corta con una enzima de restricción, generando una población de fragmentos de ADN
Producción de una biblioteca de ADN genómico o una biblioteca cromosómica
Esos fragmentos varían en tamaño y en la información genética que transportan, pero todos ellos tienen extremos pegajosos idénticos. Los genetistas tratan al plásmido de ADN, que será empleado como un vector, con la misma enzima de restricción que convierte los plásmidos circulares en moléculas lineales con extremos pegajosos complementarios a aquellos de los fragmentos de ADN humano. Los plásmidos recombinantes se producen mezclando los dos tipos de ADN (humano y plásmido) bajo condiciones que promueven el enlace de
hidrógeno de las bases complementarias. Entonces, el ADN ligasa se utiliza para unir covalentemente los extremos emparejados del plásmido y del ADN humano, formando ADN recombinante. Inevitablemente, también se producen plásmidos no recombinantes (que no se muestran en la fi gura) porque algunos plásmidos revierten a su confi guración circular original sin incorporar el ADN ajeno, en este caso el humano. Mediante transformación, los genetistas insertan plásmidos en células bacterianas sensibles al antibiótico. Ya que la proporción de plásmidos a las células se mantiene muy baja, es raro que una célula reciba más de una molécula plásmida, y no todas las células reciben un plásmido. Normalmente los investigadores incuban células sensibles al antibiótico en un medio nutriente que incluye antibióticos; sólo crecen células que incorporan un plásmido que contiene un gen de resistencia al antibiótico. Además, normalmente el plásmido se ha modifi cado en formas que capacitan a los investigadores para identifi car las células con plásmidos recombinantes. Las bibliotecas de ADN genómico y cromosómicas contienen redundancias; es decir, ciertas secuencias de ADN humano han sido insertadas en plásmidos más de una vez, al azar. Sin embargo, cada plásmido recombinante individual, como un libro en la biblioteca, sólo contiene un único fragmento del genoma humano total. Para identifi car un plásmido que contiene una secuencia de interés, el investigador clona cada plásmido hasta que hay millones de copias para trabajar con ellas. Este proceso ocurre conforme la célula bacteriana crece y se divide. Una muestra diluida del cultivo bacteriano se esparce en un medio de crecimiento sólido (placas de agar), así las células quedan bastante separadas. Cada célula se divide muchas veces, produciendo una colonia visible, que es un clon de células genéticamente idénticas a partir de una célula individual. Todas las células de una colonia particular contienen el mismo plásmido recombinante, así durante este proceso también se clona una específi ca secuencia de ADN humano. La tarea importante es determinar qué colonia, de las miles, contiene un fragmento clonado de interés. Secuencias específi cas de ADN se identifi can en diversas formas.
Hoy en día gracias al desarrollo de la ingeniería genética, los investigadores pueden lograr que un sistema vivo o inclusive artificial, desarrolle alguna propiedad específica presente en otra especie, esto se logra aislando segmentos “pequeños” de la molécula de ADN de una fuente externa; se transforman y recombinan para finalmente introducirlos en células que expresarán el nuevo gen. En suma, la tecnología del ADN recombinante consiste en introducir un gen que contiene información para desarrollar cierta característica, en otro organismo que adquiere la condición deseada.
Hamilton Smith y Daniel Nathans logran el Aislamiento de la primera restrictasa, que es una enzima capaz de reconocer y cortar el ADN en una secuencia específica. La invención de la tecnología del ADN recombinante es el resultado de una serie de descubrimientos importantes realizados durante la década de los 70’s y 80´s. Tiene su origen con el aislamiento de la primera restrictasa (enzima capaz de reconocer y cortar el ADN en una secuencia específica), realizado por Hamilton Smith y Daniel Nathans en 1970 y cuya importancia radica en el hecho de que tal hallazgo impulso nuevas metodologías de investigación que ampliaron los horizontes de estudio de disciplinas como: la medicina, bioquímica, fisiología, genética molecular, fisicoquímica y biotecnología, entre otras áreas no menos importantes y más específicas como la fertilización de óvulos “in vitro”, la prevención y el tratamiento del cáncer y el diagnóstico prenatal, por citar algunas. Este trabajo les valió el Premio Nobel de Medicina en 1978. En síntesis, la Tecnología del ADN recombinante consiste en la integración de múltiples descubrimientos realizados por equipos de trabajo multidisciplinarios y que en términos generales se realizan (de acuerdo al objetivo de la investigación) en las siguientes fases, aunque no necesariamente en este orden:
Secuenciación: las enzimas de restricción se emplean para obtener fragmentos específicos de ADN.
Reasociación/Transformación: ligar covalentemente las moléculas para
obtener hebras continuas de ADN e introducirlas en un vector.
Amplificación: la producción de miles de secuencias idénticas de ADN recombinante.
Localización: ubicación de segmentos específicos de ADN.
BIBLIOGRAFÍA Solomon, E., Berg, L., Martin, D., Biología. Ed. McGraw-Hill Interamericana, 5ª. Ed, México, 2001, pp.1230.
Paginas: 323-336
