Biologia Celular LIBRO

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN ANTONIO ABAD DEL

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO ACADEMICO DE BIOLOGIA AREA DE BIOLOGÍA Y GENETICA

TEXTO UNI VERSI VERSI TARI O PARA PARA L A CARR CARRERA ERA PROF ROF ESI ESI ONAL DE BI OLOGI OLOGI A

M. Cs. Ramón Gustavo Quispe Montoya 2013

BI OLOGÍA OLOGÍA CEL UL AR

CONTENIDO

M . Cs. Cs. R.Gustavo R.Gustavo Qui spe M ontoya

UNIDAD DIDACTICA N° 01: ESTRUCTURA Y ORGANIZACIÓN MOLECULAR DE LAS CELULAS CELULA PROPIEDADES BASICAS DE LAS CELULAS TIPOS FUNDAMENTALES DE CELULAS EN LA NATURALEZA CELULA PROCARIOTICA ESTRUCTURA GENERAL DE UNA CELULA BACTERIANA ALGAS VERDE AZULES MICOPLASMAS RICKETTSIAS VIRUS VIROIDES PRION INTERFERON CELULA EUCARIÓTICA ESTRUCTURA Y ORGANIZACIÓN DIVERSIDAD MORFOLÓGICA DE LAS CELULAS EUCARIOTICAS TAMAÑO CELULAR VOLUMEN CELULAR BASES MOLECULARES DE LAS CELULAS ACIDOS NUCLEICOS COMPOSICIÓN QUÍMICA ESTRUCTURA DE LOS ACIDOS NUCLEICOS ORGANIZACIÓN MOLECULAR DEL ADN: MODELO DE WATSON Y CRICK NIVELES DE ORGANIZACIÓN MOLECULAR DEL ADN EN LA CELULA REPLICACIÓN DEL ADN ERRORES EN LA REPLICACIÓN REPARACIÓN DEL ADN ORGANIZACIÓN MOLECULAR DEL ARN TRANSCRIPCION O SÍNTESIS Y PROCESAMIENTO DE ARN ARN RIBOSÓMICO ARN DE TRANSFERENCIA ARN MENSAJERO ENZIMAS CELULARES ALTERACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS MEDIANTE MODIFICACIÓN COVALENTE SEPARACIÓN DE LAS VÍAS CATABÓLICA Y ANABÓLICA MECANISMOS DE CONTROL DE LA EXPRESIÓN DE LOS GENES TEORIA DEL OPERON CONTROL DE LA BIOSÍNTESIS PROTEICA MEDIANTE AMP CÍCLICO AMP CÍCLICO: SÍNTESIS Y DEGRADACIÓN CA ++ - CALMODULINA: REGULACIÓN DE LAS FUNCIONES CELULARES

5 5 6 6 7 12 13 13 14 16 16 17 18 18 18 19 19 20 21 21 22 24 26 27 34 36 37 37 38 38 39 42 44 45 47 47 49 50 51

UNIDAD DIDACTICA N° 02: MEMBRANA PLASMÁTICA: ORGANIZACIÓN Y FUNCIONAMIENTO MEMBRANA PLASMATICA FUNCIONES DE LA MEMBRANA PLASMATICA ORGANIZACIÓN MOLECULAR DE LA MEMBRANA CELULAR MODELO DEL MOSAICO FLUIDO: ARQUITECTURA Y ORGANIZACIÓN MOLECULAR COMPOSICIÓN QUÍMICA LAS MEMBRANAS LÍPIDOS DE LA MEMBRANA PROTEÍNAS DE LA MEMBRANA DISTRIBUCIÓN DE LAS PROTEÍNAS EN LA MEMBRANA PLASMATICA CARBOHIDRATOS DE LA MEMBRANA IMPORTANCIA DE LA FLUIDEZ DE LA MEMBRANA ASIMETRÍA DE LOS LÍPIDOS DE LA MEMBRANA NATURALEZA DINÁMICA DE LA MEMBRANA PLASMÁTICA DIFUSIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE LA MEMBRANA LUEGO DE LA FUSIÓN CELULAR RESTRICCIONES AL MOVIMIENTO DE LAS PROTEÍNAS DE MEMBRANA

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CONTROL DE LA MOVILIDAD DE LA MEMBRANA DOMINIOS DE MEMBRANA Y POLARIDAD CELULAR MEMBRANA PLASMÁTICA DE LOS ERITROCITOS PROTEÍNAS INTEGRALES DE LA MEMBRANA DEL ERITROCITO EL ESQUELETO DE LA MEMBRANA DEL ERITROCITO TRANSPORTE DE SUSTANCIAS A TRAVÉS DE MEMBRANAS CELULARES DIFUSION DE SUSTANCIAS A TRAVÉS DE MEMBRANAS PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS DE MEMBRANA: CLASES DIFUSIÓN DE AGUA A TRAVÉS DE LAS MEMBRANAS ACUAPORINAS ESTRUCTURA DE LAS ACUAPORINAS LAS ACUAGLICEROPORINAS ACUAPORINAS EN VEGETALES ELECTROLITOS EN LOS ESPACIOS EXTRA E INTRACELULARES: DIFUSIÓN DE IONES A TRAVES DE LAS MEMBRANAS DIFUSIÓN FACILITADA TRANSPORTE DE GLUCOSA A TRAVES DE LA MEMBRANA PLASMATICA TRANSPORTE DE GLUCOSA EN ENTEROCITOS TRANSPORTE ACTIVO ACOPLAMIENTO DEL TRASPORTE ACTIVO A LA HIDRÓLISIS DE ATP DINAMICA DE LA BOMBA DE NA+ Y K+ OTRAS BOMBAS EN LA MEMBRANA CELULAR Y MEMBRANAS DE ORGANELOS CELULARES BOMBA DE CA++ EN LA MEMBRANA CELULAR BOMBA DE PROTONES O H + BOMBA DE CL- EN LA MEMBRANA PLASMÁTICA FIBROLISIS QUISTICA TRANSPORTE EN MASA CAPTACIÓN CELULAR DE PARTÍCULAS Y MACROMOLÉCULAS FAGOCITOSIS ENDOCITOSIS LA ENDOCITOSIS A GRANEL LA ENDOCITOSIS MEDIADA POR RECEPTORES INTERNALIZACION DE MACROMOLECULAS, PARTICULAS Y RECICLAJE DE RECEPTORES DE MEMBRANA: CURL VESÍCULAS CUBIERTAS VESÍCULAS DESNUDAS EXOCITOSIS INTERACCIONES ENTRE LAS CELULAS Y SU ENTORNO EL ESPACIO EXTRACELULAR GLUCOCALIZ MATRIZ EXTRACELULAR (MEC) COMPONENTES DE LA MATRIZ EXTRACELULAR ANIMAL COLÁGENA PROTEOGLICANOS FIBRONECTINA, LAMININA Y OTRAS PROTEÍNAS DE LA MEC RELACIONES Y ADHERENCIA DE CÉLULAS A SUSTRATOS NO CELULARES INTEGRINAS FIJACIÓN DE CÉLULAS A SU SUSTRATO ADHERENCIAS FOCALES Y HEMIDESMOSOMAS ADHERENCIA DE CÉLULAS A OTRAS CÉLULAS SELECTINAS INMUNOGLOBULINAS E INTEGRINAS CADHERINAS FIJACIÓN DE UNA CÉLULA A OTRAS CÉLULAS LAS UNIONES ADHERENTES LOS DESMOSOMAS PAPEL DE LOS RECEPTORES DE ADHERENCIA CELULAR EN LAS SEÑALES TRANSMEMBRANA UNIONES HERMÉTICAS: SELLADO DEL ESPACIO EXTRACELULAR UNIONES COMUNICANTES O NEXOS 2

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BI OLOGÍA CEL UL AR

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PLASMODESMOSOMAS

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UNIDAD DIDACTICA N° 03: CITOPLASMA Y ORGANELOS CELULARES. MATRIZ CITOPLASMÁTICA CITOESQUELETO MICROTUBULOS ESTRUCTURA Y COMPOSICIÓN PROTEÍNAS RELACIONADAS CON MICROTÚBULOS MICROTUBULOS COMO AGENTES DE MOTILIDAD INTRACELULAR CINESINAS DINEINAS CITOPLASMÁTICAS CENTROS ORGANIZADORES DE MICROTÚBULOS CENTROSOMAS CORPÚSCULOS BASALES Y OTROS CENTROS ORGANIZADORES DE MICROTÚBULOS FACTORES QUE INFLUYEN EN EL ENSAMBLADO Y DESENSAMBLADO CILIOS Y FLAGELOS ESTRUCTURA DE CILIOS Y FLAGELOS FILAMENTOS INTERMEDIOS ENSAMBLADO Y DESENSAMBLADO DE FILAMENTOS INTERMEDIOS TIPOS Y FUNCIONES DE LOS FILAMENTOS INTERMEDIOS MICROFILAMENTOS ENSAMBLADO Y DESENSAMBLADO DE MICROFILAMENTOS MIOSINA: MOLÉCULA MOTORA DE LOS FILAMENTOS DE ACTINA MIOSINAS II MIOSINA I ORGANELOS CELULARES RIBOSOMAS BIOGÉNESIS DE LOS COMPONENTES DEL RIBOSOMA ESTRUCTURA DE LOS RIBOSOMAS BIOSÍNTESIS DE PROTEINAS MITOCONDRIAS ESTRUCTURA Y ULTRAESTRUCTURA REPRODUCCION DE LAS MITOCONDRIAS FUNCION MITOCONDRIAL OXIDACIÓN MITOCONDRIAL MITOCONDRIAS ESPECIALES RETICULO ENDOPLASMATICO MORFOLOGIA DEL RETICULO ENDOPLASMATICO CLASES DE RETICULO ENDOPLASMATICO RETICULO ENDOPLASMATICO RUGOSO (RER) TEORÍA DE LA SEÑAL RETICULO ENDOPLASMATICO LISO (REL) MODIFICACIONES DEL RETICULO ENDOPLASMATICO APARATO DE GOLGI COMPOSICION DEL APARATO DE GOLGI FUNCIONES DEL APARATO DE GOLGI COMPARTIMENTACION DEL COMPLEJO DE GOLGI ALGUNAS FUNCIONES ESPECIFICAS DEL APARATO DE GOLGI LISOSOMAS DIVERSIDAD FUNCIONAL DE LOS LISOSOMAS DIGESTION INTRACELULAR DIGESTION HETEROFAGICA DIGESTION AUTOFAGICA DIGESTION EXTRACELULAR INTERVENCION EN PROCESOS PATOLOGICOS ORIGEN DE LOS LISOSOMAS PEROXISOMAS FUNCIÓN ORIGEN VACUOLA VEGETAL

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FUNCIONES PLASTOS O PLASTIDIOS CLOROPLASTOS ESTRUCTURA DE LOS CLOROPLASTOS FUNCIÓN DE LOS CLOROPLASTOS FASE LUMINOSA FASE OSCURA

149 151 152 153 154 155 155

UNIDAD ACADEMICA N° 04: NÚCLEO CELULAR: ESTRUCTURA Y FUNCIONAMIENTO NUCLEO INTERFASICO ENVOLTURA NUCLEAR POROS NUCLEARES PASO DE MACROMOLÉCULAS A TRAVÉS DEL PORO NUCLEAR ARQUITECTURA NUCLEAR MONTAJE Y DESMONTAJE DE LA MEMBRANA NUCLEAR CROMATINA – CROMOSOMAS TIPOS DE CROMATINA CICLO CELULAR CONTROL DEL CICLO CELULAR ACTIVACION DE LA DIVISION CELULAR FRENOS DE LA DIVISION CELULAR LA FASE M SE PRODUCE CUANDO LA CICLINA MITOTICA ACTIVA A LA CDC2 MITOSIS FASES DE LA MITOSIS MUERTE CELULAR NECROSIS APOPTOSIS ASPECTOS MORFOLÓGICOS NUCLEOLO COMPOSICIÓN QUÍMICA CICLO NUCLEOLAR

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UNIDAD DIDACTICA N° 01: ESTRUCTURA Y ORGANIZACIÓN MOLECULAR DE LAS CELULAS CELULA. Las células y las estructuras que las forman, son demasiado pequeñas para verlas, escucharlas o tocarlas directamente. Existen alrededor de cinco millones de distintas especies de bacterias, hongos, protozoarios, vegetales y animales, cuya morfología, función y comportamiento son diferentes, sin embargo, si estudiamos a los organismos vivientes a nivel celular y molecular, muestran un plan maestro de organización único, el campo de la biología celular es precisamente el conocimiento de ese plan de organización unificado que tienen las células de todas las formas de vida. La célula es la forma más sencilla de organización biológica, considerada como la “unidad fundamental”

de la vida, es decir es unidad vital, morfológica, estructural o anatómica, fisiológica y genética de todo ser vivo. Se dice unidad vital ya que la célula es la forma de vida más pequeña y sencilla, con la que se forman los organismos ya sean unicelulares o multicelulares. Unidad morfológica ya que todas las células son similares es decir están formadas básicamente por una envoltura externa, la membrana plasmática, una región interna conocida como citoplasma y una región r egión dentro de esta con material genético conocido en algunos casos como región nucleoide y en otros como núcleo. Es unidad estructural o anatómica porque todos los seres vivos están constituidos por células, es unidad fisiológica porque las células poseen todos los mecanismos bioquímicos necesarios para permanecer vivas es decir la célula es capaz de realizar todas las actividades inherentes a los seres vivos. Es unidad genética porque todas las células derivan de otras células preexistentes es decir las células contienen la información genética del organismo en las secuencias de bases nitrogenadas de su ADN, el cual se hereda de generación en generación. PROPIEDADES BASICAS DE LAS CELULAS. La vida es la propiedad fundamental de las células y ellas son las unidades más pequeñas que muestran esta propiedad, entre otras propiedades fundamentales se tiene: 1. Las células poseen elevada complejidad y organización. La complejidad es una propiedad evidente en las células ya que estas presentan un conjunto diverso de partes según el tipo celular, estas partes deben estar en posiciones apropiadas para sus interacciones y por lo tanto lograr el funcionamiento celular, es decir que la célula tiene una elevada organización la que se puede observar a diferentes niveles así se tiene la organización de sus átomos en moléculas de tamaño pequeño, la organización de estas en polímeros gigantes (macromoléculas), la organización de diferentes tipos de macromoléculas en complejos macromoleculares (supramoléculas), que a su vez se organizan en organelos subcelulares y finalmente en células. c élulas. 2. Las células contienen su información genética en los genes. g enes. Los genes almacenan la información genética, constituyen las plantillas para construir estructuras celulares y contienen instrucciones para poner en marcha las actividades de la célula así como la información para reproducirse asimismos. Los organismos se generan a partir de la información codificada en un conjunto de genes, lo más sorprendente es que esta vasta cantidad de información se encuentra empacada en un conjunto de cromosomas que ocupan el espacio de un núcleo celular, miles de veces más pequeño que el punto sobre esta letra i. 3. Las células se Autoreproducen. Las células tienen la capacidad de desarrollarse y dividirse en este proceso el contenido de una célula “madre” se distribuyen entre dos células hijas, antes de la división el material genético se duplica con toda fidelidad y cada célula hija recibe una dotación completa e igual de información genética. En la mayor parte de los casos las dos células hijas poseen aproximadamente el mismo volumen. Sin embargo en algunos casos como ocurre durante la división del ovocito humano, una de las células puede retener casi todo el citoplasma aunque reciba sólo la mitad del material genético. 4. Las células captan y consumen energía. El desarrollo y la operación de funciones complejas requieren el ingreso continuo de energía. Las células toman las sustancias químicas del ambiente en el que viven, transforman estas sustancias en otras que les son útiles, liberan energía y eliminan sus productos de desecho. Toda la energía que requiere la vida del planeta proviene del sol, la energía lumínica es captada por las células fotosintéticas y convertida por fotosíntesis en energía química almacenada en carbohidratos. La energía atrapada en estas 5



moléculas sirve para poner en marcha casi todas las actividades de los organismos sobre la tierra. A la mayor parte de células animales la energía les llega empaquetada por lo general en forma de glucosa, esta se descompone y su contenido energético se almacena como ATP el que se emplea para poner en marcha las múltiples actividades que requieren energía dentro de la célula. Basándose en el mecanismo que utilizan las células y organismos para extraer energía podemos agruparlas en dos clases principales: los Autótrofos que utilizan el proceso de la fotosíntesis y los Heterótrofos que utilizan materia preformada sintetizados por los organismos autótrofos. 5. Las células tienen la capacidad de metabolizar. Las células efectúan cientos de diferentes transformaciones químicas, ninguna de las cuales ocurre a una tasa significativa en el mundo inanimado. La suma total de las reacciones químicas que ocurren dentro de una célula representa el metabolismo celular. 6. Las células poseen movimiento. Las células son sitios de actividad infatigable. Los materiales celulares son transportados de un sitio a otro, algunas estructuras se sintetizan y descomponen con rapidez y en muchos casos toda la célula se desplaza de un lugar a otro. Estas diferentes actividades dependen de cambios mecánicos dinámicos que ocurren en el interior de la célula. La mayor parte iniciados por alteraciones en la forma de ciertas proteínas “motoras”.

7. Las células tienen capacidad para responder a los estimulos. c élulas estan cubiertas c ubiertas con “receptores” Es decir las células se irritan y exitan, la mayor parte de las células que interactuan con las sustancias del medio o matriz extracelular de manera muy especifica, así poseen receptores a hormonas, factores de crecimiento, materiales extracelulares y también a sustancias situadas en la superficie de otras células. Los receptores constituyen entradas a través de la cual los agentes externos pueden generar respuestas específicas. A veces las células responden a un estimulo especifico alterando sus actividades metabólicas, preparándose para la división celular, desplazándose de un lugar a otro o incluso suicidándose. 8. Las células tienen capacidad de Autorregulación. En las células para mantener un estado complejo ordenado se requiere regulación continua, dentro de cada célula viva operan muchos mecanismos de control diferentes. La importancia de los mecanismos reguladores es más evidente cuando fallan. En la célula, las macromoleculas como proteínas deben actuar sin la ventaja de un control externo, así cada paso de un proceso debe ocurrir de manera espontánea y en forma tal que el siguiente paso se inicie automáticamente. TIPOS FUNDAMENTALES DE CELULAS EN LA NATURALEZA La vida en nuestro planeta se manifesta en millones de especies diferentes que poseen una morfología especial y propia, que contienen información genética especifica. Podemos ordenar las especies en grupos de organismos cada vez más amplios generos, familias, ordenes or denes hasta llegar al nivel de los reinos. Si examinamos las formas vivientes a nivel celular identificamos dos tipos básicos de células: Procariotas y Eucariotas y Eucariotas,, que pueden distinguirse por su tamaño y el tipo de sus estructuras internas u organelos que contienen. Unicamente las “moneras” (bacterias y algas verde azules) son células PROCARIOTICAS, mientras que todos los demás organismos: protistas, hongos, plantas y animales constan estructuralmente de células EUCARIOTICAS más complejas. La principal diferencia entre ambos tipos celulares es que los procariotas no tienen envoltura nuclear. El cromosoma procaríotico ocupa un espacio dentro de la célula denominado “nucleoide” y se halla en contacto directo con el resto

del protoplasma. Las células eucarioticas poseen un núcleo verdadero con una complicada envoltura nuclear, a través de la cual tienen lugar los intercambios nucleocitoplasmaticos. Desde el punto de vista evolutivo, se considera que los procariotas son antecesores de los eucariotas, los primeros aparecieron hace tres mil millones de años en tanto que los eucariotas aparecieron probablemente hace mil millones de años. CELULA PROCARIOTICA El termino PROCARIOTA proviene de los vocablos: Pro = anterior y Karion = núcleo (antes del núcleo o células que no poseen núcleo). Son las células mas primitivas, las mas sencillas y de menor tamaño que las células eucarioticas, sus representantes forman parte del Reino Monera, llamado también Reino 6



PROCARIOTAE (desde el punto de vista celular), que incluyen a organismos unicelulares como las Bacterias y las Algas verde azules. Características generales de la célula procariótica. 1. Ausencia de envoltura nuclear.- nuclear.- Carecen de envoltura nuclear por lo tanto no tienen núcleo definido, el material genético (ADN) se encuentra en contacto con el citoplasma, localizado en la región nuclear o Nucleoide. La ausencia de envoltura nuclear quizá sea la diferencia fundamental entre procariótas y eucariótas. 2. ADN sin protección proteinica.- El ADN de los organismos procarióticos carecen de hístonas es decir no esta asociado a proteínas, se encuentra suspendido en el citoplasma, el ADN es de doble cadena circular muy pequeño, el ADN en procariótas representa a un único cromosoma. 3. Carecen de organelos citoplasmáticos.- Las células procarióticas no presentan organelos en su citoplasma a exepción de los ribosomas, los cuales tienen un diámetro aproximado de 25 nm, se encuentran en forma libre o ligados a las moléculas de ARNm en forma de polirribosomas. 4. Ausencia de estructuras membranosas.- El citoplasma no esta muy diferenciado porque carece de estructuras membranosas que generen compartimientos. El pequeño tamaño de las bacterias probablemente se debe a la inexistencia de compartimientos separados por membranas. Los procariotas, sin embargo pese a su simplicidad estructural, son seres complejos que realizan funciones complejas y son diversificados desde un punto de vista bioquímico, lo que permite su adaptación a las más variadas condiciones de vida. ESTRUCTURA GENERAL DE UNA CELULA BACTERIANA. La Escherichia coli es es una de las bacterias más estudiadas y utilizadas en trabajos de investigación en biología molecular e ingeniería genética, presenta la ventaja de su facil manipulación in vitro y su facil cultivo, en una solución acuosa de glucosa y algunos iones inorgánicos a temperatura de 37 °C duplica su masa celular y se divide aproximadamente en 60 minutos y este tiempo puede ser reducido a 20 minutos si se agrega al medio nucleotidos y aminoácidos.

Las bacterias pueden encontrarse en forma individual o formando colonias, en general presentan reproducción asexual por fisión binaria o bipartición. Por su forma se clasifican en: cocos, bacilos, espirilos y espiroquetas. Los cocos pueden ser de varios tipos: monococos, diplococos, estreptococos o estafilococos. Presentan las siguientes estructuras: CAPSULA Es una estructura constituida por polisacáridos de elevado peso molecular por lo que se le considera que constituye un glicocaliz. Está formada por un material secretado por la propia bacteria que se adhiere a su superficie. Su espesor puede ser muy grande o ser una simple capa muy delgada (microcapsula). Aparentemente su función es prevenir la desecación del organismo dentro de condiciones adversas, así también se le atribuye función antigénica. En algunos casos como en la cavidad oral es responsable de la 7



adhesión a la superficie del diente, formando la placa dental, la cual es responsable del deterioro del diente. Por ejemplo Estreptococcus mutans responsable de las caries dental. PARED CELULAR Su estructura es químicamente diferente a las células eucarióticas vegetales y hongos. Es una estructura que proporciona fortaleza a la célula y es un componente estructural rígido que puede soportar la presión osmótica causada por altas concentraciones de iones inorgánicos de las células. Sin ella en condiciones normales del medio, las bacterias estallarían. Composición química: Está formada por peptidoglicano constituido por Mureina la cual esta formada por 2 moléculas: el N – acetilglucosamina (NAcGlu) y el ácido N- acetilmurámico (NAcMur). A cada molécula de ácido NAcMur se le une un tetrapéptido de 4 aminoácidos (L-alanina; D-isoglutamina; L-lisina y Dalanina). En algunas especies los residuos de L-lisina son reemplazados por el ácido diaminopimélico, aminoácido que se encuentra en la naturaleza sólo en las paredes de las células procarióticas. Para proporcionarle una rigidez adicional a éstas moléculas, puentes de aminoácidos (pentaglicinas) pueden atravesar y conectar los tetrapéptidos unidos al ácido NacMur.

Las bacterias pueden ser divididas por su pared en 2 grupos: Las bacterias Gram (+) y las bacterias Gram (-), en base a su diferente coloración frente a la tinción de Gram, debido a las diferencias que presentan sus paredes celulares. BACTERIAS GRAM (+): Su pared celular es gruesa (20 a 80 nm) y contiene un 60 a 80 % de peptidoglicano, además presentan los ácidos teicoicos que están unidos al ácido murámico de la capa de peptidoglicano. Los ácidos teicoicos se presentan en 2 formas: Ribitol ácido teicoico y Glicerol ácido teicoico. Los ácidos teicoicos son largos polímeros tanto de ribitol o glicerol unidos a traves de enlaces fosfodiester. Presentan grupos hidroxilos que están unidos a azucares o aminoácidos. Debido a que los ácidos teicoicos son altamente antigénicos, inducen en el huésped a producir anticuerpos que reaccionan con los ácidos teicoicos, dado que ellos se extienden a lo largo de la capa de peptidoglicano, exponiendo determinantes antigénicos, usados en la determinación serológica de muchos grupos de bacterias Gram (+). Son ejemplos de este grupo: Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Lactobacillus, Staphylococcus, Streptococcus. BACTERIAS GRAM (-): Su pared es químicamente más compleja que la de las bacterias Gram (+). La pared Gram (-) contiene menos peptidoglicano (10 a 20 %). Por fuera del peptidoglicano posee una segundo estructura membranosa compuesta de proteínas, fosfolípidos y lipopolisacáridos, este último es causante de la toxicidad en animales y se le ha llamado endotoxina, la cual es causante de fiebre elevada, disminución de la presión arterial y puede ocasionar la muerte en las infecciones causadas por organismos gram negativos. El lipopolisacárido (LPS) está formado por dos componentes: Un disacárido de glucosamina al cual están unidos ácidos grasos (denominados lípidos A) y una larga cadena de azucares y azucares fosforilados unidos a la zona del lípido A. Se conoce que la toxicidad reside en el lípido A. Cabe indicar que las gram (-) presentan porinas las que están constituidas por 6 a 8 subunidades polipeptidicas que forman 8



canales por los cuales difunden el soluto desde el espacio medio que lo rodea hasta el espacio periplasmático, son también proteínas de reconocimiento cuando un fago infecta a la bacteria. La membrana externa es considerablemente más rígida que las membranas celulares normales y es resistente a su disolución por detergentes. Las bacterias Gram (-) además contienen lipoproteínas que están unidas covalentemente a la capa de peptidoglicano (NAcMur) y a 3 ácidos grasos embebidos en la membrana externa, lo cual sirve para anclar esta membrana al peptidoglicano de la pared celular. Los individuos infectados por bacterias Gram (-) producen anticuerpos contra las cadenas de azucares del lipopolisacarido, lo cual sirve como un mecanismo de clasificación serologica. El peptidoglicano de la pared celular es sensible a enzimas, la mas comúnmente usada es la lizozima, la cual hidroliza la unión entre el NacGlu y el ácido NAcMur, y provoca que la pared celular se rompa en muchos pedazos. Son ejemplos de este grupo: Brucella, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Neisseria, Pasteurella, Salmonella, Shiguella, Vibrio y Yersinia.

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CARACTERISTICAS

GRAM ( + )

GRAM ( - )

Tinción GRAM

Retienen el cristal violeta y se Se decoloran y toman el color de tiñen de morado contraste safranina, tiñéndose de rosado

Capa de peptidoglucano

Gruesa (varias capas)

Delgada (una capa)

Contenido en LPS

Virtualmente ninguna

Alta

Contenido en lípidos y lipoproteínas

Baja (lípidos unidos al peptidoglucano)

Alta (debido a la membrana externa)

Acidos teicoicos

Presente

Ausente

Espacio Periplasmático

Ausente

Presente

Membrana externa

Ausente

Presente

Producción de toxinas

Principalmente exotoxinas

Principalmente endotoxinas

Resistencia a la rotura física

Alta

Baja

Sensibilidad de la pared celular Alta a la lisozima

Baja

MEMBRANA PLASMATICA. Conformada por una capa bilípidica con proteínas integrales, en ella abundan las cardiolipinas, cumple las siguientes funciones: 1) En organismos aeróbicos permite el transporte de electrones. 2) Contiene algunas de las enzimas necesarias para la síntesis y transporte del peptidoglicano, ácidos teicoicos y otros componentes de la membrana externa asimismo contiene enzimas que cumplen función en el metabolismo de la respiración celular. 3) Secreta enzimas hidrolíticas extracelulares. 4) Permite la duplicación del material genético (ADN). 5) Controla el transporte de los compuestos que entran o salen de la célula es decir desde el espacio periplasmático hasta el citoplasma bacteriano y viceversa. MESOSOMAS: Son invaginaciones de la membrana citoplasmática, que permiten incrementar la superficie de la membrana y son útiles en la respiración y el transporte. CITOPLASMA: Tiene naturaleza coloidal, presenta un 80 % de agua, además contiene ácidos nucleicos, proteínas, carbohidratos, lípidos, iones y compuestos de bajo peso molecular, presenta ribosomas y en algunos casos endosporas. CROMOSOMA BACTERIANO: Es simple, está constituido por una molécula circular de doble cadena de ADN que representa al unico cromosoma bacteriano, no está asociado a proteínas histonicas como es el caso del ADN de las celulas eucarioticas. El ADN de las bacterias esta constituido también por regiones exon e intron, las regiones exon son regiones activas que transcriben, codifican enzimas y proteínas, las regiones intron son regiones inactivas que no expresan, que no codifican. En las bacterias las regiones exon se encuentran en una sola barra o tira continua por lo tanto durante la transcripción se transcribe el ARNm constituyendo 10



genes que directamente deben expresarse, sintetizando proteínas y/o enzimas. Puede contener varios genes activos especificos, por esta razon los ARNm, ARNt, ARNr no requieren de procesos de modificación posterior a la transcripción. PLASMIDO: Llamado también episoma o plasmidio, son pequeños pedazos circulares de doble cadena de ADN que se separan del cromosoma bacteriano. Pueden replicarse autónomamente y tienen la función de transmitir resistencia a antibióticos al ser transferidos a otras bacterias a través del proceso de conjugación bacteriana. Su tamaño es de 2 a 5 Kb y admite hasta 8 a 9 Kb de ADN exógeno, E. coli presenta diferentes plasmidos. Son utilizados en ingeniería genética. El plasmido es un vector genético que tiene características específicas en las cuales se puede insertar o clonar un gen de un organismo superior. Los plasmidos presentan un sitio de origen de replicación, asimismo presentan marcadores es decir genes resistentes a antibióticos, presentan secuencias palindromicas, sobre las cuales actúan las enzimas de restricción. La E. coli presenta muchos plasmidos entre ellos tenemos al pBr 322.

RIBOSOMAS: Son organelos no rodeados de membrana como partículas globulares de unos 200 a 250 A° de diámetro, en numero de unos 10 000 a 30 000 que se emplean en la síntesis de las proteínas bacterianas, se encuentran libres y en forma de poliribosomas. Están constituidas por dos subunidades, las subunidades se diferencian por su velocidad de sedimentación (S = Coeficiente de velocidad de sedimentación, unidades Sverbeng), siendo de 30 S la menor y 50 S la mayor. La velocidad de sedimentación de un ribosoma es de 70 S. La subunidad menor tiene un peso molecular de 900,000 y esta constituida por una molécula de ARN de peso molecular de 600,000 y 21 proteínas diferentes. La subunidad mayor tiene un peso molecular de 1´600,000 y esta constituida por dos moléculas de ARN y 34 proteínas. Actúan en la síntesis de proteínas y funcionan igual que en las células eucariotas, con la única diferencia que los polirribosomas están libres en el citoplasma.

FLAGELOS: Permite que muchas bacterias puedan nadar a través del líquido, permitiendo que tengan movilidad propia. El flagelo está formado por subunidades de una proteína denominada flagelina por lo que su composición es diferente a la de las células eucarióticas. El flagelo está anclado a las dos membranas (bacteria gram negativa) a través de 4 anillos. El flagelo se mueve por rotación lo que provoca el desplazamiento de la bacteria. La fuerza que provoca la rotación aparenta ser el resultado del pasaje de protones del exterior del citoplasma a través del cuerpo basal del flagelo; la entrada de cada protón 11



causa la rotación del rotor en un grado determinado y se ha calculado que se requiere el flujo de 256 H+ por cada revolución que da el flagelo. Según el número de flagelos las bacterias se clasifican en: monotricas, lofotricas, anfitricas y peritricas. FIMBRIAS Y PILIS: Presentes en las bacterias gram negativas, son apéndices mucho más cortos y delgados que los flagelos. Las fimbrias cumplen funciones de adherencia, mientras que los pili son apéndices implicados en la transferencia de ADN durante la conjugación bacteriana. Los pili son menos numerosos (menos de 10) que las fimbrias, pero son mucho más largos que las fimbrias. ENDOSPORAS: Son producidas entre otras por 2 géneros de bacterias de importancia médica como Bacillus y Clostridium. Es una estructura pequeña y altamente duradera formada dentro de la célula y capaz de desarrollarse en un nuevo organismo. Debido a su gruesa pared es resistente al calor y a los agentes químicos, pues mientras las células vegetativas mueren a temperaturas de 60 a 70 ° C, las endosporas pueden sobrevivir en agua hirviendo por más de 1 hora. ALGAS VERDE AZULES. Llamadas también cianofíceas, cianobacterias o bacterias azul verdosas, son las bacterias fotosintéticas mas evolucionadas, entre estas están algunas comestibles como la llullucha o murmunta. Además de clorofila las cianobacterias poseen otros pigmentos denominados genéricamente ficobilinas. De estos la ficocianina (azul) y la ficoeritrina (roja) son los más comunes y responsables de la variedad de colores encontrados en las cianofíceas. Su estructura es básicamente la de una bacteria ya que presentan vaina o envoltura gelatinosa (musilaginosa), pared celular celulosica, membrana plasmatica de estructura lipoproteica, endoplasma con región nucleoide es decir con material genetico de doble cadena desnudo, ribosomas e inclusiones de fosfato, proteínas y lípidos. Llama la atención su sistema fotosintético, formado por sacos membranosos aplanados y concentricos (a manera de laminillas) entre los cuales se encuentran granulos de 40 nm de diámetro, incorporados a la pared externa de los sacos. Se sabe que esos gránulos los cianosomas, contienen ficocianina y ficoeritrina, mientras que la estructura membranosa contiene clorofila y otros compuestos del sistema fotosintetizador. La energia solar absorbida por la ficocianina y por la ficoeritrina es transferida hacia las membranas que contienen clorofila, donde se realiza la fotosíntesis. La ficocianina y la ficoeritrina aumentan el espectro de utilización de la luz solar, en comparación con la absorción proporcionada por la clorofila sola. Como en las demás bacterias, la división celular ocurre por elongación celular e invaginación de la pared celular pero la célula recien formada no se desprende debido a su cubierta musilaginosa que la mantiene unida generándose organismos de vida colonial (pluricelulares) por ejemplo: Spirulina, Anabaena, Nostoc. Las cianobacterias no presentan cilios ni flagelos.

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MICOPLASMAS Llamados también molicutes o PPLO (derivado de Pleuro Pneumoniae Like Organisms) son las bacterias más pequeñas están entre los organismos vivos que poseen la masa más pequeña. Tienen un diámetro de 0,1 a 0,25 micrometros por lo tanto, su tamaño corresponde al de algunos virus grandes. La importancia biológica de estos microorganismos radica en que su masa viviente es mil veces menor que el tamaño promedio de una bacteria y un millón de veces menor que el de una célula eucariota. Son organismos globulares pueden presentar formas ovoidales, esféricas, vesiculares, se caracterizan por carecer de pared celular, su estructura es muy sencilla, su citoplasma está separado del medio externo únicamente por una membrana unitaria y en su medio interno sólo existen una cadena de ADN (10 veces menor que en comparación con el de la mayoría de las bacterias). Este ADN también se presenta bajo la forma de nucleoide, conteniendo cerca de 500,000 pares de nucleótidos, lo suficiente para codificar de 300 a 550 proteínas. Contiene también ARNm, gran cantidad de ribosomas, algunas vacuolas, vesícula y gránulos. Sus funciones de nutrición son muy reducidas, conociéndose únicamente procesos de síntesis proteica y reacciones de oxidación de glúcidos. Además, posee una cadena de citócromos con los que pueden obtener ATP. Los demás elementos nutritivos debe obtenerlos a partir de las células a las que parásita. Producen enfermedades infecciosas en diferentes animales y en el hombre son especialmente conocidos los Micoplasma mycoides , causante de la pleuroneumonía bovina, el Micoplasma pneumoniae , causante de la neumonía atípica en seres humanos y los causantes de afecciones renales, también en los humanos (en la mujer puede causar afecciones al útero). Los micoplasmas tienen características de herencia, mutación y su reproducción se efectúa mediante una serie de biparticiones sencillas.

RICKETTSIAS Género de bacterias con un tamaño intermedio entre los virus y el resto de las bacterias. En general, reciben el nombre de rickettsias los microorganismos que pertenecen a la familia Rickettsiaceae, que incluye los géneros Rickettsia, Rochalimaea, Coxiella y Ehrlichia. Su nombre procede de su descubridor, el patólogo estadounidense Howard Taylor Ricketts. Son bacterias Gram negativas e inmóviles, con forma de cocos (redondas) o de bacilos (alargadas). Como los virus, sólo pueden vivir y multiplicarse en el interior de las células. Estos microorganismos se han encontrado en muchas especies de mamíferos y causan diversas enfermedades en la especie humana. Una especie que infecta a animales domésticos, como vacas y ovejas, puede ser transmitida a los seres humanos a través de la ingestión de leche cruda o por la inhalación de las partículas suspendidas en el aire procedentes de la leche, orina, heces o tejidos de los animales infectados. Hay numerosas especies de rickettsias que no causan enfermedades a los mamíferos aunque sí las producen en insectos. Las rickettsias crecen en el laboratorio sólo en cultivos de células vivas. Las enfermedades producidas por rickettsias reciben el nombre general de rickettsiosis e incluyen el tifus epidémico y endémico, la fiebre de las Montañas Rocosas, la fiebre Tsutsugamushi o el tifus de la maleza, la fiebre de las trincheras, la fiebre Q y la rickettsiosis pustulosa o vesicular. En general, las rickettsiosis comienzan de modo repentino y originan fiebre alta, malestar general, postración y, en casi todos los casos, un exantema característico.

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VIRUS Los virus son los agentes infecciosos más pequeños que existen, que se encuentran en el límite entre los organismos vivos y la sustancia inerte, se les considera dentro de lo inerte porque cristalizan cuando están fuera de la célula (fase extracelular). Son muy sencillos están constituidos por un ácido nucleico, una cápside proteica y en ocasiones una envoltura membranosa. Los virus carecen de metabolismo es decir no se nutren, no excretan no se reproducen por si mismos. Necesitan de una célula viva para reproducirse, estos son capaces de inyectar su material genético al interior celular haciendo que la célula sintetice enorme cantidades de virus (fase intracelular), por tanto todos los virus son considerados parásitos obligados y pueden parasitar a animales, vegetales e incluso procariontes (micoplasmas, bacterias y algas), pero un tipo de virus es muy especifico en cuanto a las células que puede parasitar. Los virus están constituidos por una sola clase de ácido nucleico ADN o ARN (nunca ambos), el cual puede ser de cadena simple o doble, lineal o circular. Aquellos que contienen al ARN son llamados retrovirus a partir de este ácido nucleico viral por acción de la enzima transcriptasa reversa se sintetiza el ADN. Los virus son tan pequeños que pueden pasar a través de los filtros que atrapan bacterias pueden medir desde 0.01 micrometros (10 milimicras) hasta 300 milimicras (20 – 300 nm), en algunos virus su tamaño no excede de los 2,500 Aº. No fue hasta la invención del microscopio electrónico que los científicos pudieron ver los virus. Son demasiado pequeños para que se puedan ver con un microscopio de luz. A las partículas víricas también se las denomina viriones. Estructura. A pesar de que los virus son muy diferentes unos de otros en forma y en tamaño (algunos son de forma cilíndrica, otros esféricos, cuboides, poliédricos, prismáticos etc., es decir de simetría geométrica compleja) comparten muchas estructuras características. El ácido nucleico se localiza en la parte central de un virus, el ADN es siempre una sola molécula, el ARN puede existir como una molécula o en varios fragmentos, con excepción de los retrovirus que son diploides, los virus son haploides; es decir contienen una sola copia de sus genes. El ácido nucleico esta rodeado por una cubierta proteinica llamada cápside juntos forman la nucleocapside. La capsidé esta constituido por la unión de proteínas globulares que vienen a ser subunidades denominadas capsómeros. Generalmente una cápside esta constituida por la repetición de un solo tipo de proteínas o capsomeros. La unión de estas origina tres tipos de cápsides: Icosaedrico, es una forma poliédrica de 12 vértices en donde los capsomeros se ordenan en 20 caras triangulares y 30 aristas formando una figura simétrica un icosaedro con la definición aproximada de una esfera. Un ejemplo podría ser un picornavirus como el virus de la poliomielitis cuya cápside esta compuesta por 32 capsomeros. Helicoidal, es aquel en que los capsomeros adoptan una ordenación en espiral hueco formando una estructura tubular en cuyo interior se sitúa el ácido nucleico, la hélice puede ser rígida o flexible por ejemplo el virus de la rabia o el virus del mosaico del tabaco. Complejo, este tipo de cápside lo poseen algunos virus especializados en parasitar bacterias por lo que reciben el nombre de bacteriofagos. Esta cápside se puede delimitar en dos partes: Cabeza de tipo icosaedrico y que contiene el ácido nucleico y la Cola adoptada para la inyección del ácido nucleico en el 14



interior de la bacteria. En la base de la cola pueden existir enzimas y ATP que tiene la función de destruir la pared bacteriana.

Un grupo de virus que infectan a animales como los que producen la rabia, la hepatitis, la gripe, la viruela y el virus del sida poseen una nucleocapside dentro de una envoltura. La envoltura es una membrana lipoproteínica compuesta de lípidos derivados de la membrana de la célula huésped y proteína viral especifica. Además a menudo se encuentran glucoproteínas en forma de proyecciones espiculares en la superficie que se adhieren a receptores de la célula huésped durante la entrada del virión a la célula. Otra proteína de la matriz media la interacción entre las proteínas de la cápside y la envoltura. En general la presencia de una envoltura confiere inestabilidad al virus (sensibles al calor, detergentes, solventes de lípidos). Las proteínas superficiales del virus sean de la cápside o glucoproteínas de la envoltura, son antigénos importantes contra los que el huésped “monta” su respuesta inmunitaria a los

virus.

Los virus son producidos en la célula huésped por un proceso de agregación macromolecular, lo cual significa que sus componentes son sintetizados separadamente en diferentes lugares de esa célula y luego reunidos de manera coordinada en otra parte de aquella. En los bacteriofagos, los fenómenos intracelulares que se suceden son muy rápidos y comienzan con la rotura del nucleoide y la hidrólisis enzimática del ADN de la célula huésped. Los nucleotidos resultantes son utilizados para sintetizar el ADN del fago. Luego son sintetizados el ARN y las proteínas estructurales del virus, y se necesitan unos 7 minutos para empaquetar y armar los fagos maduros dentro de la bacteria. En células eucariotas infectadas el proceso es más complejo. Por ejemplo, el ADN de los adenovirus se replica en el núcleo de la célula huésped, las proteínas virales se sintetizan en ribosomas citosólicos y luego las distintas partículas virales se combinan entre si en el interior de la célula. Un tipo especial es el representado por los virus tumorales, en los que la maduración se produce por gemación a partir de la membrana celular. El virus completo contiene una nucleocápside que está cubierta por una envoltura derivada de la membrana de la célula huésped en la cual se han insertado glicoproteínas virales.

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VIROIDES Partícula infecciosa diminuta que causa enfermedades en plantas superiores. Su tamaño es diez veces menor que el de los virus más pequeños conocidos. Se diferencian de éstos últimos porque sólo contienen ARN, además, los viroides carecen de cápside . La molécula de ARN no contiene genes que codifican proteínas, por lo que el viroide es totalmente dependiente de las funciones del hospedador para su replicación. Aunque los viroides se transmiten de una generación de plantas a la siguiente a través de los aperos de labranza, no se conoce su modo de replicación en el interior de las células, aunque se cree que se replican en el interior del núcleo. Las plantas afectadas muestran un desarrollo deficiente y decoloración, y pueden llegar a morir. Por ejemplo el viroide que produce una enfermedad en la papa, su molécula de ARN circular contiene 359 nucleótidos y puede multiplicarse e infectar a otros vegetales.

PRION Agente infeccioso que no contiene ácido nucleico, sino una forma anormal de glicoproteína, una proteína celular que normalmente se encuentra en el hospedador. De estructura más elemental que los virus, los priones causan enfermedades en los seres humanos y en los animales. Antes de la identificación de los priones, estas enfermedades, conocidas colectivamente como encefalopatías espongiformes transmisibles (patologías que cursan con degeneración del cerebro) estaban vinculadas sólo por la similitud de los síntomas; recientemente se ha demostrado que tienen una causa común. El camino que condujo al descubrimiento del prión comenzó con las investigaciones de las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET). En 1967 la científica británica Tikvah Alper y sus colegas del Hospital Hammersmith en Londres, extrajeron tejido del cerebro de una oveja infectada con scrapie. Intentaron tratar químicamente el tejido para aislar un virus, bacteria u otro agente potencialmente causante de la enfermedad. El tejido procesado fue entonces inyectado en una oveja sana para comprobar si la enfermedad era transmisible. La oveja sana contrajo el scrapie, lo que indicaba que el agente infeccioso estaba en el tejido del cerebro enfermo. Por tanto, este experimento mostró que el agente infeccioso podía reproducirse en animales sanos causando la enfermedad. Alper expuso entonces extractos de tejidos infectados con scrapie a radiacción ultravioleta (un tratamiento que normalmente destruye ácidos nucleicos) encontrando que los extractos mantenían su capacidad de transmitir la enfermedad. Al comienzo de la década de 1980, Stanley B. Prusiner, neurólogo y bioquímico estadounidense que trabajaba en la Universidad de California en San Francisco, encontró que extractos de tejidos similares a los utilizados por Alper no causaban enfermedad cuando se exponían a tratamientos que destruían proteínas. Prusiner concluyó, en un estudio publicado en 1982, que los agentes infecciosos responsables de las encefalopatías espongiformes transmisibles eran proteínas. Prusiner denominó a estas partículas proteicas infecciosas priones y sugirió que las proteínas causaban la enfermedad al replicarse en tejidos del sistema nervioso. En 1997 el bioquímico Stanley B. Prusiner recibió el Premio Nobel de Fisiología y Medicina por sus estudios sobre los priones, un trabajo revolucionario y nuevo pero todavía inacabado. La proteína infecciosa o prión, identificada con las siglas PrPSC es una forma anormal, con una configuración distinta, de la proteína prión (PrP C), componente normal de las membranas neuronales de los mamíferos. En los seres humanos la proteína prión se codifica por un gen (PrP) situado en el brazo corto del cromosoma 20. La función biológica de la proteína normal no se conoce con exactitud, aunque sí se han determinado las características de su 16



estructura. La proteína normal está compuesta por 253 aminoácidos plegados en tres largas espirales (semejantes al cable del teléfono) conocidas como hélices alfa. La forma infecciosa de esta proteína o prión presenta exactamente la misma secuencia de aminoácidos. No obstante, en lugar de plegarse en forma de hélice lo hace mediante un plegamiento plano, semejante al de un acordeón parcialmente abierto. La forma patógena se caracteriza por su resistencia parcial a las proteasas; además, es muy resistente a las altas temperaturas y no produce ningún tipo de reacción en el sistema inmunológico. No se sabe con exactitud cómo afecta el PrP SC al hospedador, pero puede replicarse transformando la proteína prión normal sintetizada por el hospedador en PrP anormal. Algunos científicos creen que la proteína alterada causa enfermedad simplemente cuando contacta con la proteína normal, obligando a ésta a cambiar su configuración, pasando de un plegamiento en forma de hélice a una forma aplanada y transformándola en una proteína patógena. Las nuevas proteínas pueden inducir el cambio de configuración en otras proteínas normales iniciando así una reacción en cadena. La enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), el síndrome de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS), el kuru y el insomnio familiar fatal son enfermedades originadas por priones que afectan a los seres humanos. Entre las enfermedades provocadas por priones que afectan a distintas especies animales se pueden citar el scrapie (o escrapie) de ovejas y cabras; las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) de visones, bovinos, felinos y antílopes; y la enfermedad del agotamiento crónico de mulas y ciervos en cautiverio. El prión causante de la enfermedad puede adquirirse por procedencia externa o por mutaciones del gen PrP (heredadas o esporádicas). Así, se ha observado la transmisión de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en trasplantes de córnea, inyecciones de hormona del crecimiento o en injertos de duramadre, todos ellos procedentes de donantes afectados. Incluso la nueva variante de ECJ se ha relacionado con la ingestión de carne contaminada. En otros casos la enfermedad puede deberse a una mutación espontánea del gen que codifica la proteína prión (responsable de la ECJ esporádica) o a la herencia de un gen alterado; este último caso se relaciona con algunas de estas patologías que se transmiten por herencia familiar (la ECJ familiar, el síndrome de GerstmannSträussler-Scheinker o el insomnio familiar fatal).

INTERFERON Nombre genérico de un grupo de proteínas antivirales producidas por los animales, entre ellos el ser humano, en respuesta a las infecciones provocadas por virus. El virólogo británico Alick Isaacs y su colega suizo Jean Lindenmann fueron los primeros en identificar, en 1957, una de estas proteínas, en células de embriones de pollo. Se vio que interfería o impedía la infección de las células corporales por los virus. La actividad antiviral no corresponde al interferón de forma directa, sino que se realiza a través de proteínas que producen otras células al ser estimuladas por el interferón. Se han identificado algunas de estas proteínas, aunque no se conoce con exactitud su modo de acción. El interferón se puede clasificar en tres grupos: el interferón  (leucocítico), producido por los glóbulos blancos; el interferón β (fibroblástico), producido por las células de la piel; y el interferón  (inmunológico), producido por los linfocitos cuando son estimulados por los antígenos. Durante la década de 1960, los médicos intentaban tratar algunas enfermedades producidas por virus, sobre todo los resfriados comunes, mediante la administración de interferón, pero este enfoque no era práctico debido al elevadísimo coste que supone extraer esta sustancia de glóbulos blancos humanos (siempre en pequeñas cantidades). El siguiente paso consistió en intentar estimular al organismo para que produjera 17



interferón: se empleaban inductores sintéticos como los ácidos nucleicos. Estos inductores cumplían su función, pero pronto se desarrollaba tolerancia, y dejaban de ejercer su efecto. En 1980 se empezó a disponer de interferón en cantidades más importantes gracias al desarrollo de las técnicas de ingeniería genética, y al año siguiente ya empezaron a realizarse ensayos clínicos para establecer los niveles, las dosis y los efectos secundarios. Hasta la fecha, sólo se ha avanzado en las pruebas con algunos interferones del grupo alfa. Se revelan como un tratamiento prometedor frente a un gran número de infecciones virales. También son un tratamiento valioso en una de las formas de la esclerosis múltiple, pero los resultados han sido variables frente a diversos tipos de cáncer, leucemias y algunos linfomas. Hasta cierto punto podrían ser eficaces frente al melanoma maligno, el cáncer de células renales, la hepatitis C, ciertas verrugas, y una minoría de los sarcomas de Kaposi relacionados con el SIDA. Los efectos secundarios pueden ser leves o muy graves. Los interferones β y  no han sido aún suficientemente probados, pero podrían demostrar ser más eficaces que el interferón . CELULA EUCARIÓTICA ESTRUCTURA Y ORGANIZACIÓN La célula eucariótica es la que esta constituyendo a los organismos de los reinos: Protista, Fungi, Vegetal y Animal, presentan estructura compleja por tanto cumplen funciones muy complejas, las células complejas son las únicas que pueden formar tejidos. Son células con núcleo definido en cuyo interior se halla la cromatina es decir que el núcleo constituye un compartimiento separado limitado por la envoltura nuclear que aísla el material genético (ADN) de los componentes citoplasmáticos. La célula eucariótica presenta tres regiones: la membrana celular o plasmática, el citoplasma y el núcleo, la región de mayor complejidad es el citoplasma el cual esta altamente diferenciado por que contiene estructuras membranosas, encontrándose en el citoplasma la matriz citoplasmática, las inclusiones, el sistema de endomembranas y los organelos algunos de los cuales tienen membranas independientes como mitocondrias, plastidios, lisosomas, peroxisomas, aparato de Golgi, vacuolas, retículo endoplasmático y otros que carecen de membranas como los ribosomas y centriolos. Además en el citoplasma se encuentra microfilamentos y microtubulos que forman el citoesqueleto. Cabe indicar que las células vegetales y fúngicas tienen una estructura externa sobre la membrana llamada pared celular y en el caso de las células animales se encuentra el glucocaliz estas estructuras tienen sobre todo funciones protectoras. La presencia del núcleo caracteriza a la celula eucariótica este presenta un contenido denominado cromatina que es un compuesto complejo constituido por ADN al que se asocia fuertemente las histonas (proteínas basicas), todo esto asemejándose a las cuentas de un collar. El ADN en eucariontes es lineal representa a múltiples cromosomas combinados con proteínas.

DIVERSIDAD MORFOLÓGICA DE LAS CELULAS EUCARIOTICAS Las células de un organismo multicelular complejo tienen forma y estructura variables y se diferencian de acuerdo con la función específica de los distintos tejidos y órganos. Esta especialización hace que las células adquieran características singulares, aun cuando en todas ellas persiste un modelo de organización común. Así por ejemplo algunas células como las amebas y los leucocitos cambian de forma frecuentemente, los hepatocitos del hígado presentan formas poliédricas hasta de 14 caras (tetracaedros), el tejido muscular estriado presenta formas cilíndricas (alargadas con extremos romos 18



polinucleados), las células nerviosas presentan formas estrelladas (con ramificaciones, presentan dendritas), los óvulos y glóbulos rojos presentan forma esférica, las células del folículo tiroideo (epitelio glandular) presenta formas cúbicas, el tejido muscular liso presenta formas fusiformes, las células del endotelio y de la mucosa bucal presentan células planas, los espermatozoides presentan forma filiforme (con cabeza y cola). Por consiguiente la forma de las células en los diversos organismos varía y esta depende de: 1. Las funciones que cumplen las células o de sus adaptaciones funcionales, es decir que las formas celulares son típicas en cada tipo de tejido y órgano porque cada uno de los órganos cumple funciones diferentes. 2. La viscosidad del protoplasma. 3. La tensión superficial de la membrana plasmática es decir la rigidez de la membrana plasmática. 4. La presión física o fuerza mecánica que ejercen las células adyacentes al constituir un agregado de células o tejido. 5. La presencia de microfilamentos, filamentos intermedios y microtubulos que se distribuyen o disponen longitudinalmente, transversalmente, radialmente constituyendo al citoesqueleto que mantiene la forma celular. TAMAÑO CELULAR Las dimensiones de las células eucarioticas puede variar en relación con su complejidad, actividad y funciones, desde las células de protozoarios hasta las células de estructuras más complejas que presentan los organismos superiores así por ejemplo: Amoeba proteus

1mm Célula eucariótica 10 – 30  Célula animal promedio 15  Eritrocito 7 – 8  Linfocito 10 – 12  Neuronas humanas 200  Neuronas de jirafa >1m Fibra muscular 40 mm Célula Vegetal promedio 40  (100 ) Tubos laticiferos de Euforbiáceas varios metros Excepciones huevos de aves, peces y reptiles, así : Ovulo de gallina 3 cm Ovulo de avestruz 8 – 16 cm Huevo de pez 1 – 2 mm La mayor parte de las células son microscópicas visibles sólo al microscopio, asimismo las células generalmente son translúcidas por tanto requieren coloraciones para ser observadas. VOLUMEN CELULAR En general, el volumen de las células eucarioticas es bastante constante para un determinado tipo celular y es independiente del tamaño del órgano o del organismo del que forman parte por ejemplo las células del riñón o del hígado (hepatocitos) en un elefante, caballo y ratón tienen casi el mismo volumen y tamaño. La diferencia de la masa total del órgano depende de la cantidad de células (numero de células) y no del volumen de éstas. Por consiguiente el volumen celular es casi constante en los diversos organismos a está caracter ística se le denomina la “ley del volumen celular constante”. SEMEJANZAS ENTRE ORGANISMOS PROCARIOTICOS Y EUCARIÓTICOS A pesar de las diferencias entre procariotas y eucariotas hay semejanzas importantes en su organización molecular y en sus funciones: 1) En su organización molecular.- Todos los organismos vivos utilizan el mismo codigo genético. Es decir que los procariontes y los eucariontes presentan su material genético ADN debidamente codificado en forma de codones o tripletes (triadas) y en esta forma codificada también se transcribe 19



al ARNm, el cual traduce el mensaje genético a proteínas también en forma codificada. Inclusive los virus presentan su material genético o genoma en forma codificada. 2) Función.- Todos los organismos vivos tienen una maquinaria similar para la síntesis de proteínas. Es decir tanto las células procarioticas y eucarioticas presentan ribosomas y toda la maquinaria biosíntetica similar para la síntesis de proteínas. TABLA 01: ORGANIZACIÓN CELULAR EN PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS. Células procariotas Células eucariotas Envoltura nuclear ADN Cromosomas Nucléolos División Ribosomas Endomembranas Mitocondrias Cloroplastos Pared celular Exocitosis y endocitosis Locomoción

Ausente Desnudo Unicos Ausentes Amitosis 70 S (50 S + 30 S) Ausentes Enzimas respiratorias y fotosintéticas en la membrana plasmática Ausentes No celulosica Ausentes Fibrilla única, flagelo

Presente Combinado con proteínas Multiples Presentes Mitosis o meiosis 80 S (60 S + 40 S) Presentes Presentes Presentes en células vegetales Celulosica en células vegetales Presentes Cilios y flagelos

BASES MOLECULARES DE LAS CELULAS: ACIDOS NUCLEICOS Características Los ácidos nucleicos son macromoléculas orgánicas que constituyen del 5 al 15 % del peso en seco de todas las células, fueron descubiertos en 1868 por Miescher en glóbulos blancos de secreción purulenta, luego aislados por primera vez del núcleo celular donde se descubrió su carácter ácido. Biológicamente son importantes en los seres vivos porque dirigen la síntesis de todas las proteínas, determinan la gran variabilidad individual dentro de una especie, constituyen la materia prima de la evolución y porque permiten transmitir características de una a otra generación. Están compuestos por: carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrogeno y fósforo en cual se encuentra en una cantidad constante (10 % en peso). Los ácidos nucleicos están constituidos por una o dos cadenas de miles de unidades estructurales llamadas nucleótidos, por ello tienen elevado peso molecular. Según sea la pentosa ribosa o desoxiribosa que se encuentre en los ácidos nucleicos se distinguen dos tipos: el ácido desoxiribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN) respectivamente. El ADN constituye el depósito fundamental de la información genética. Esta información es copiada o transcripta en las moléculas de ARN, cuyas secuencias de nucleótidos contienen el código para las secuencias especificas de aminoácidos. Entonces se produce la síntesis de proteínas, en un proceso llamado traducción del ARN. Esta serie de fenómenos ha recibido el nombre de Dogma central de la biología molecular , que puede resumirse de la siguiente manera.

En las células superiores el ADN se halla principalmente en el núcleo integrando los cromosomas. Una pequeña cantidad se encuentra en el citoplasma, dentro de las mitocondrias y los cloroplastos. El ARN se localiza tanto en el núcleo, donde se forma, como en el citoplasma, donde tiene lugar la síntesis proteica.

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ACIDOS NUCLEICOS ____________________________________________________________________________ ACIDO DESOXIRIBONUCLEICO ACIDO RIBONUCLEICO ____________________________________________________________________________ Localización Principalmente en el núcleo Principalmente en el citoplasma También en mitocondrias y cloroplastos También en nucléolo (núcleo) Bases purinicas Adenina Adenina Guanina Guanina Bases pirimidicas Citosina Citosina Timina Uracilo Pentosas Desoxirribosa Ribosa Papel en la célula Información genética Síntesis de proteínas ____________________________________________________________________________ COMPOSICIÓN QUÍMICA La hidrólisis del ADN o del ARN genera: Acido Fosfórico.- (H3PO4) El ácido fosfórico utiliza dos de sus tres grupos ácidos en las uniones 3’, 5’ – diéster. El grupo restante confiere al polinucleótido sus propiedades ácidas y permite que la molécula forme uniones iónicas con proteínas básicas llamadas histonas con las que forma un complejo nucleoproteico denominado cromatina. Dicho grupo ácido libre también hace que los ácidos nucleicos sean basófilos (se colorean con colorantes básicos).

El ácido fosforico es vital en la polimerización de nucleótidos. En los ácidos nucleicos se encuentra como anión fosfato (PO 4-3). El fosfato puede encontrarse como monoéster o diéster.

Pentosas.- son de dos tipos: ribosa en el ARN y desoxiribosa en el ADN. La única diferencia entre estos dos azúcares es que la desoxiribosa tiene un átomo menos de oxigeno, pues se forma por desoxigenación del grupo hidróxilo que está unido al carbono 2 (C 2). Se puede utilizar una reacción citoquímica específica para la desoxiribosa llamada reacción de Feulgen para visualizar el ADN con el microscopio óptico.

Bases Nitrogenadas.- Son biomoléculas orgánicas de naturaleza aromática heterocíclica ya que sus anillos están constituidos de carbono y nitrógeno. Su carácter básico se debe a los grupos amino (NH 2). Son de dos tipos: Bases Puricas.- o purinas, son bases nitrogenadas derivadas de la purina. La purina es una base que a su vez deriva de la pirimidina que se ha unido a un anillo de imidazol. Es decir son bases heterocíclicas constituidas por dos anillos y son la Adenina (A) y la Guanina (G).

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Bases Pirimidicas.- o pirimidinas, son bases nitrogenadas derivadas de la pirimidina constituidas por un anillo heterocíclico y son la Citosina (C), Timina (T) y el Uracilo (U).

La timina solo se encuentra en el ADN mientras que el uracilo solo se halla en el ARN. La diferencia de las bases pirimidinicas permite usar timidina radiactiva como marcador especifico del ADN y uridina radiactiva para el ARN. ESTRUCTURA DE LOS ACIDOS NUCLEICOS Nucleosidos.- Los nucleósidos se forman mediante la unión de una pentosa con una base nitrogenada, estableciéndose un enlace N – glucosídico entre el primer carbono (C 1) de la pentosa y el primer nitrógeno (N1) de la base nitrogenada si esta es una base pirimidica o el noveno nitrógeno (N 9) si es una base purica.

Nucleótido.- Los nucleótidos se forman uniéndose una molécula de ácido fosfórico con un nucleósido a través del grupo hidroxilo (OH) del quinto carbono (C 5) de la pentosa mediante enlace del tipo fosfoester o ester fosfórico, se trata pues de un ester fosforico del nucleósido. Los nucleótidos tienen por ello un fuerte carácter ácido debido al grupo fosfato que se ioniza.

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Además de actuar como bloques en la edificación de los ácidos nucleicos, los nucleótidos como por ejemplo el ATP son utilizados para depositar y transferir energía química. Las dos uniones fosfato terminales del ATP contienen gran cantidad de energía. Cuando se produce la hidrólisis en estas uniones, la energía liberada puede ser usada por la célula para realizar sus actividades. La unión P de alta energía permite que la célula acumule gran cantidad de ella en un espacio muy pequeño y que la mantenga lista para usarla en el momento en que sea necesaria. Otros nucleótidos como citosina trifosfato (CTP), uridina trifosfato (UTP), guanosina trifosfato (GTP) y timidina trifosfato (TTP), tienen también uniones de alta energía, pero la fuente original de energía es el ATP.

Una molécula de ácido nucleico es un polímero lineal en el cual los monómeros son nucleotidos que están ligados por medio de uniones fosfodiester este es el enlace característico de los ácidos nucleicos. Resulta de la reacción entre el ácido fosfórico de un nucleótido con el grupo oxidrilo de la pentosa de otro nucleótido, en el proceso se libera una molécula de agua. El enlace se establece entre el carbon o 3’ y el carbono 5’ de dos pentosas adyacentes. En consecuencia, el eje de un ácido nucleico está formado

por pentosas y fosfatos y las bases nitrogenadas están unidas a las pentosas del eje. El extremo de la molécula que contiene la pentosa con el carbon o 5 libre se llama extremo 5’ y el que posee la pentosa con el carbono 3 libre, extremo 3’.

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Las bases heterocíclicas absorben luz ultravioleta a 260 nm. En una célula fotografiada con esa longitud de onda se ve que el nucléolo, la cromatina y las regiones del citoplasma que contienen ARN absorben dicha luz intensamente. En efecto, la manera más simple de determinar la concentración de ácido nucleico en una solución es medir la absorbancia a 260 nm. El ADN se encuentra en los organismos vivos como moléculas lineales de muy alto peso molecular. Por ejemplo, la Escherichia coli tiene una sola molécula de ADN circular de 3’400,000 pares de bases y una longitud total de 1,4 mm. La cantidad de ADN en los organismos superiores puede ser varios cientos de veces mayor, 1200 veces en el caso del hombre. Así, el ADN completamente extendido de una célula diploide humana puede tener una longitud total de 1,7 metros. Toda la información genética de un organismo vivo se encuentra acumulada en la secuencia lineal de las cuatro bases del ácido nucleico. La estructura primaria de todas las proteínas (es decir, la cantidad y la secuencia de sus 20 aminoácidos) debe estar codificada por un alfabeto de cuatro letras (A, T, G, C). Uno de los descubrimientos más extraordinarios en biología molecular fue la interpretación de este código genético. Un paso previo a ese descubrimiento que tuvo influencia directa en la dilucidación de la estructura del ADN fue el hallazgo de que, si bien la composición de las bases variaba de una especie a otra, la cantidad de adenina es igual a la cantidad de timina (A = T) y la cantidad de citosina es igual a la de guanina (C = G). En consecuencia, el número total de purinas es idéntico al de pirimidinas (osea A + G = C + T). No obstante, la relación AT/GC varía considerablemente entre las especies (por ejemplo, en el hombre la relación es de 1,52 y en la Escherichia coli es de 0,93). ORGANIZACIÓN MOLECULAR DEL ADN: MODELO DE WATSON Y CRICK En 1953, sobre la base de los datos obtenidos por Wilkins y Franklin mediante difracción de rayos X, Watson y Crick propusieron un modelo para la estructura del ADN, el cual está formado por dos cadenas de ácidos nucleicos helicoidales con giro a la derecha, que estructuran una doble hélice alrededor de un eje central imaginario. Las dos cadenas son antiparalelas, lo cual significa que sus uniones 3’, 5’ – fosfodiéster siguen direcciones opuestas, además, las bases nitrogenadas están situadas en el interior de la hélice en un plano perpendicular al eje helicoidal. Ambas cadenas se hallan unidas entre si por medio de puentes de hidrógeno, establecidos entre los pares de bases.

Puesto que entre dos pentosas de las cadenas opuestas existe una distancia fija, sólo ciertos pares de bases pueden darse dentro de la estructura, los únicos pares posibles son A – T, T – A, C - G y G – C. entre la adenina y la timina se forman dos puentes de hidrógeno y entre la citosina y la guanina tres, en consecuencia, el par C – G es más estable que el par A – T. Junto a los puentes de hidrógeno, también las interacciones hidrofóbicas entre las bases reviste importancia para mantener estabilizada la doble estructura helicoidal. Las secuencias axiales de las bases a lo largo de las cadenas de polinucleótidos pueden variar considerablemente, pero ambas secuencias deben ser complementarias. Debido a esta propiedad, al separarse una cadena de la otra durante la duplicación del ADN, cada una sirve de molde 24



para la síntesis de una nueva cadena complementaria. De este modo se generan dos moléculas hijas de ADN de doble cadena que tienen la misma constitución molecular que la doble cadena progenitora.

Aun cuando la mayor parte del ADN contenido en una célula se presenta con su doble hélice girando hacia la derecha (B – ADN) que es la configuración más estable, también existen dobles hélices de ADN con giro a la izquierda. Esta forma se denomina Z – ADN, por la disposición en zigzag del eje de fosfatoribosa de la cadena. En está configuración quedan expuestas partes diferentes de la molécula, lo que puede tener consecuencias biológicas. En efecto, esta configuración alternativa sugiere que el ADN es una molécula flexible, que puede adoptar formas diferentes. Se ha sugerido que las zonas de Z – ADN podrían ser los sitios donde los carcinógenos se unen al ADN y provocan en éste mutaciones.

Teniendo en cuenta que la estructura de doble hélice en el ADN es mantenida por interacciones débiles (puentes de hidrógeno entre las bases enfrentadas), es posible separar ambas cadenas por medio del calor y otros tratamientos, como el pH alcalino. Este proceso se denomina desnaturalización del ADN. Como la temperatura necesaria para romper el par C – G es mayor que la requerida para romper el par A – T (con dos puentes de hidrógeno), la temperatura a la cual se separan las cadenas del ADN llamada punto de fisión depende de la relación CG/AT. Si el ADN desnaturalizado se enfría lentamente, las cadenas complementarias se aparean en forma ordenada, y se restablece la conformación original de la molécula. Este proceso se denomina renaturalización o templado.

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NIVELES DE ORGANIZACIÓN MOLECULAR DEL ADN EN LA CELULA. Las moléculas de ADN se encuentran organizadas dentro de las células en estructuras muy compactas, de manera que ocupan el volumen comparativamente pequeño del núcleo. El primer nivel de condensación del ADN se da por la interacción del ADN con unas proteínas básicas llamadas histonas. En general, las proteínas de la cromatina se dividen en tres clases principales: a) histonas nucleosomales: H2A, H2B, H3 y H4; b) histonas internucleosomales o H1 y c) proteínas no histonicas. Las histonas tienen una gran proporción de residuos de aminoácidos con carga positiva como arginina y lisina, lo que permite su enlace electrostático al ADN cargado negativamente. Las no histonas comprenden un número grande de clases diferentes de proteínas; sin embargo, en la cromatina se encuentran en menor proporción que las histonas. Estas proteínas son importantes para regular la expresión genética y para organizar a la cromatina.

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Las histonas nucleosomales se organizan en una estructura octamérica que contiene dos copias de cada histona. Este octámero forma un centro alrededor del cual el ADN se enrolla de manera toroidal (dos vueltas (1.65 vueltas) de 146 pb) para generar unidades discretas conocidas como nucleosomas (repetición nucleosomal 185 – 200 pb). Los nucleosomas estan unidos entre sí por puentes de 20 a 80 pb (humano 38 – 53 pb), para formar lo que se conoce como “collar de perlas” o fibra de 10 nm. En un segundo nivel de condensación, la histona H1 (y otras proteínas de tipo no histona) se enlaza al ADN que une a cada nucleosoma, generando una estructura helicoidal de 30 nm de diámetro o solenoide. Cada vuelta de un solenoide contiene seis nucleosomas con una molécula de H1 asociada a cada unidad nucleosomal. Posteriormente, esta fibra se enrolla sobre si misma para formar una fibra más gruesa de cromatina, la que, a su vez, se organiza en asas (300 nm). Actualmente, aunque aún se desconoce mucho de la organización de la cromatina, se empieza a entender la organización de las fibras de solenoides y de las asas, durante la interfase y la mitosis. Si los cromosomas metafasicos se tratan con detergentes polianiónicos, se desprende la mayoria de las proteínas del ADN y se observa que la cromatina se descondensa y forma asas enormes de aproximadamente 60 kb de ADN. Estas asas se encuentran unidas a una estructura proteica o esqueleto cromosomal cuya principal proteína es la enzima topoisomerasa II. Las secuencias de ADN que se unen a este esqueleto o SAR, son relativamente resistentes a enzimas que degradan al ADN o ADNasas. Algunas secuencias SAR de Drosophila se unen de manera específica a la topoisomerasa II, lo cual podria explicar el anclaje de las asas de ADN al esqueleto cromosomal. Se ha propuesto tambien la presencia de un esqueleto proteico, menos definido, parece ser importante para mantener la organización de los cromosomas dentro del núcleo. Como en el caso de los cromosomas metafásicos, las fibras de ADN de la cromatina de la célula en interfase parecen estar unidas a la matriz nuclear a través de secuencias específicas o MAR.

En oposición al concepto previo de un ADN prácticamente “desnudo” en las bacterias y a un ADN

recubriendo a las proteínas en los eucariontes, actualmente se considera que el ADN en todas las células se organiza como cromatina; es decir, como una estructura compacta y dinámica formada de moléculas de ADN, proteína y ARN. Esta estructura compacta tiene, sin embargo, la plasticidad suficiente para que se lleven a cabo las funciones esenciales del ADN: replicación, reparación, recombinación, transposición y segregación del genoma, así como para permitir la expresión regulada de la información genética. 27



REPLICACIÓN DEL ADN Al cabo de la división celular las células hijas heredan la misma información genética contenida en la célula progenitora. Como esa información se halla en el ADN, cada una de sus moléculas debe generar previamente dos moléculas de ADN idénticas a la del ADN originario para ser repartidas de manera equitativa entre las dos células hijas. Esta duplicación, gracias a la cual el ADN se propaga en las células de generación en generación, lleva el nombre de replicación. La vida de las células transita por dos etapas que se alternan cíclicamente, conocidas con los nombres de interfase y división celular. La interfase se subdivide en tres periodos, llamados Gl, S y G2. En la fase S se produce la replicación del ADN. La síntesis del ADN se produce en dirección 5' 3' y utiliza como molde una cadena de ADN preexistente. Además, enzimas llamadas ADN polimerasas, que agregan los sucesivos nucleótidos también de a uno por vez en el extremo 3' de la cadena en crecimiento. Las ADN polimerasas catalizan las uniones fosfodiéster entre el grupo OH en el C3' de la desoxirribosa de un nucleótido y el grupo fosfato en el C5' del nucleótido recién arribado. En la síntesis del ADN no queda ningún segmento de este sin duplicar, la replicación exige un numero considerablemente mayor de enzimas que la transcripción. En consecuencia, a partir de la doble hélice de una molécula de ADN se originan dos moléculas de ADN, dos dobles hélices, ambas compuestas por una cadena heredada del ADN progenitor y una cadena recién sintetizada. Como al cabo de la división mitotica cada célula hija recibe moléculas de ADN cuyas dobles hélices están integradas por una cadena original (preexistente) y una cadena nueva (recién sintetizada), se dice que el mecanismo de replicación del ADN es semiconservador.

Replicación semiconservadora del ADN. Si para sintetizarse el ADN comenzara su replicación por uno de los extremos del cromosoma y avanzara uniformemente a lo largo de éste hasta concluir en el otro extremo, el proceso de síntesis tardaría en promedio unos 30 días. No obstante, la duración de la fase S es decir, el tiempo que tarda el ADN en replicarse es de unas 7 horas aproximadamente. La rapidez con que lo hace se debe a que aparecen a lo largo del ADN múltiples orígenes de replicación, entre 20 y 80 por cada lazo de cromatina de 30 nm. Cada origen de replicación se gesta al separarse localmente las dos cadenas del ADN, hecho que se produce, como dijimos, en muchísimos puntos de la molécula a la vez. No obstante, no todos los orígenes nacen simultáneamente, ya que el momento de su aparición depende de las características de la cromatina en los distintos sectores del cromosoma. En los orígenes de replicación hay secuencias de ADN especiales formadas por cientos de nucleótidos diferentes en cada origen. Sin embargo, en medio de ellas todos los orígenes tienen en común secuencias conservadas de alrededor de una docena de nucleótidos, denominadas SAR (por autonomous replication sequence). Los pares de nucleótidos correspondientes a esas secuencias especiales se separan al ser inducidos por factores proteicos aun no caracterizados. Del mismo modo que los factores reguladores de la transcripción, estas proteínas reconocen singularidades químicas expuestas en el surco mayor del ADN, es decir, en la superficie exterior de la doble hélice.

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Al abrirse la doble hélice se forma una estructura llamada burbuja de replicación, cuyo tamaño aumenta a medida que avanza la separación de las dos cadenas del ADN, fenómeno que se produce en forma simultanea en los dos extremos de la burbuja. Se establece de esta manera, en cada uno de esos extremos, una estructura con forma de Y llamada horquilla de replicación, cuyos dos brazos representan a las cadenas del ADN ya separadas y el tronco a la doble hélice en vías de separación.

La replicación es bidireccional (horquilla de replicación). Así, cada burbuja tiene dos horquillas de replicación que a partir de un punto de origen común avanzan en direcciones opuestas. Las horquillas desaparecen cuando se integran con sus similares de las burbujas contiguas, al colisionar después que culmina el acercamiento progresivo entre ellas. Respecto de las horquillas que recorren el último tramo de los telómeros en ambos extremos del cromosoma, se extinguen cuando se produce la separación del último par de nucleótidos. El tramo de ADN que se sintetiza a partir de un origen de replicación con sus dos horquillas recibe el nombre de replicón. En consecuencia, la replicación concluye cuando se conectan entre si los sucesivos replicones. La acción cooperativa de miles de ellos es la que permita que el ADN se sintetice en un tiempo relativamente breve para el ciclo de vida de la célula.

Esquema de dos replicones y los puntos donde se origina la replicación. Las dos cadenas del ADN son antiparalelas, esto crea una primera dificultad durante la síntesis, ya que a nivel de cada horquilla de replicación, conforme sus dos cadenas se separan, una presenta sus nucleótidos corriendo en dirección 5'-3' y la otra en dirección 3'-5', de modo que la primera, al ser copiada, deberá gestar una cadena hija que crezca en dirección 3'-5´, algo que ninguna ADN polimerasa puede hacer. 29



La célula resuelve esta situación utilizando estrategias distintas en la construcción de las dos cadenas nuevas. La cadena hija que adopta como molde a la cadena progenitora que corre en dirección 3'- 5’ se construye, al crecer en dirección 5'-3' en forma continua mediante el agregado de nucleótidos en su extremo 3' a medida que avanza la horquilla de replicación. En cambio, la otra cadena hija, cuyo molde es la cadena del ADN progenitor que corre en dirección 5'-3', es sintetizada de un modo singular, ya que para poder crecer en esa dirección debe sintetizarse en dirección opuesta al avance de la horquilla de replicación. El problema se supera haciendo que la síntesis sea discontinua, lo cual significa que la nueva cadena se construye en pequeños tramos llamados fragmentos de Okazaki, los cuales se unen entre si a medida que se generan.

Cada fragmento de Okazaki se sintetiza mediante la copia de un tramo de la cadena progenitora relativamente alejado del ángulo de la horquilla, "por detrás" del último fragmento de Okazaki construido. Así el tramo progenitor mas cercano a la horquilla permanece sin copiar, aunque a esa altura la cadena continua ya fue copiada. Por tal motivo, a la cadena que se sintetiza en forma continua se la conoce con el nombre de “adelantada” y a la discontinua se la llama “retrasada”.

Cadena adelantada y retrasada durante la replicación. La replicación del ADN es un proceso bidireccional no sólo porque se produce en dos direcciones divergentes a partir de una misma burbuja de replicación, sino también porque las cadenas de la doble hélice son sintetizadas en direcciones opuestas. Además es asimétrica, ya que, tomando como referencia a una de las dos cadenas del ADN, de un lado de la burbuja la replicación es continua, mientras que en el otro lado es discontinua. La síntesis continua avanza en la misma dirección en que lo hace la horquilla de replicación, mientras que la discontinua lo hace en dirección contraria. En síntesis, cada replicación tiene cuatro áreas generadoras de ADN, dos que crecen de manera continua (una en cada cadena del ADN progenitor) y dos de manera discontinua (también una en cada cadena del ADN progenitor, pero cruzadas con las primeras). Todos estos procesos tienen lugar en forma simultánea. Más aun, las enzimas que intervienen en su dirección se encuentran asociadas formando un complejo multienzimatico que se comporta como una verdadera maquinaria de replicación. 30



Para iniciar la síntesis de una cadena complementaria de ADN, además de una cadena de ADN molde, la ADN polimerasa necesita un cebador, que consiste en una pequeña pieza de ARN de unos 10 nucleótidos de largo. La formación del cebador es catalizada por una ARN polimerasa especifica, la ARN primasa que genera ARN cortos que quedan asociados al tramo de ADN que copian. Formado el cebador, la síntesis del ADN prosigue si la ADN polimerasa dispone de suficientes nucleótidos, que pasan al núcleo bajo la forma de desoxiribonucleósidos trifosfato (dATP, dTTP, dCTP y dGTP). Estos se agregan secuencialmente a la cadena en crecimiento de acuerdo con los nucleótidos presentes en la cadena de ADN que sirve de molde. La mayor parte de la energía requerida para los procesos que tienen lugar durante la replicación es tomada de los propios desoxiribonucleósidos trifosfato, que se hidrolizan con liberación de energía cuando se ligan entre si. Al iniciarse la síntesis continua del ADN, en cada origen se forman, dada la naturaleza bidireccional de la replicación, dos cebadores orientados divergentemente, uno en cada cadena de la doble hélice. Seguidamente, la ADN polimerasa , enzima que cataliza la síntesis de la cadena continua, agrega un nucleótido en el extremo 3’ del cebador y luego hace lo propio con los sucesivos nucleótidos en el extremo 3’ de la cadena en crecimiento, hasta llegar la horquilla al extremo del replicón.

Una características saliente de las ADN polimerasas es su tendencia a desprenderse del ADN. No obstante, mientras hacen su trabajo permanecen unidas a este debido a que son sostenidas por un aro proteico deslizante. El aro se une a la polimerasa y no al ADN, de ahí que impida el desprendimiento de la enzima pero no su deslizamiento. Esta formado por tres subunidades monomericas cada una integrada por un par de dominios topológicamente identicos que al combinarse componen el anillo. El aro se libera de la ADN polimerasa apenas esta detiene su movimiento, cuando alcanza el extremo del replicón. Solo entonces la enzima se desprende del ADN. La proteína que compone el anillo se denomina PCNA (por proliferating cell nuclear antigen).

Unión del aro de PCNA a la ADN polimerasa. Una vez que la horquilla de replicación arriba al extremo del replicón, la cadena continua recién formada toma contacto con la cadena discontinua del replicón adyacente, que avanzaba en dirección contraria. Entre ambas cadenas, otra enzima, la ADN ligasa, une el extremo 3’ de la primera con el extreme 5’ de

la segunda. Como es obvio, esto no puede ocurrir en los extremos de los telómeros, de ahí que en ellos la replicación culmine de un modo distinto. Entre tanto, donde se inició la síntesis de la cadena continua, el cebador es removido por una nucleasa reparadora, y su lugar es reemplazado por una pieza de ADN equivalente, generada con ayuda de una ADN polimerasa especial, la ADN polimerasa . Finalmente, esta pieza de ADN se conecta con el resto de la cadena continua también mediante la ADN ligasa. La cadena continua necesita un solo cebador, que se forma apenas aparece la horquilla al comienzo de la replicación. En cambio, la cadena discontinua requiere varios, uno para cada fragmento de Okazaki. La ARN primasa que sintetiza tales cebadores se desliza junto a la ADN polimerasa responsable de la síntesis discontinua del ADN, que es la ADN polimerasa . Esta enzima, tras agregar el nucleótido adecuado en el extremo 3’ del cebador, coloca los sucesivos nucleótidos en el extremo 3’ del fragmento

de Okazaki en crecimiento, interrumpiéndose su labor cuando ese extremo colisiona con el cebador del fragmento formado precedentemente. El cebador es eliminado por una nucleasa reparadora y su lugar 31



lo ocupa una pieza de ADN equivalente, sintetizada por la ADN polimerasa . El proceso culmina al actuar la ADN ligasa, que conecta el extremo 3’ de esa pieza de ADN con el extremo 5’ de la cadena

discontinua. Los fragmentos de Okazaki alcanzan una longitud media de alrededor de 200 nucleótidos. La ARN primasa y la ADN polimerasa  necesitan unos 4 segundos para construir el cebador y agregar esos 200 nucleótidos. Una vez completada la síntesis de un fragmento, ambas enzimas se liberan de la doble hélice y juntas retornan hacia el ángulo de la horquilla de replicación, dejando atrás los 200 nucleótidos del fragmento que acaban de sintetizar mas otros tantos del ADN molde, los cuales se usaran para copiar el próximo fragmento de Okazaki. Como ocurre con la ADN polimerasa  en movimiento, la ADN polimerasa  no se desprende del ADN debido a que se le asocia un aro de PCNA. Dada la pequeñez de los fragmentos de Okazaki, la ADN polimerasa  se mantiene prendida al ADN por periodos muy breves. Hemos visto que en los orígenes de replicación cada una de las cadenas de la doble hélice da lugar a una cadena que crece en forma continua y otra que lo hace en dirección contraria en forma discontinua. Como resultado de la singular constitución de la cadena discontinua, su extremo 3’ es el extremo 3’ del primer fragmento de Okazaki sintetizado, y su extremo 5’, el extremo 5’ del último fragmento formado. Este fragmento, una vez eliminado su cebador, se liga por su extremo 5’ al extremo 3’ de la

cadena continua del replicón adyacente, que avanzaba en dirección contraria. Por su parte, el fragmento formado en primer termino se liga por su extreme 3’ al extremo 5’ de la cadena continua del mismo

replicón, en el lugar en que se inició la síntesis de ambas en direcciones divergentes. Como se señalo, el primer fragmento de Okazaki de la cadena discontinua se forma en el nacimiento de la horquilla de replicación tras haberse sintetizado un trecho de la cadena continua. Dado que el desfase se prolonga hasta el fin de la replicación, a la cadena discontinua se la llama también “retrasada”. Como consecuencia de este retraso, la rama de la horquilla que sirve de molde para la

síntesis de la cadena discontinua muestra en forma permanente un tramo de ADN sin replicar, comprendido entre el cebador del ultimo fragmento de Okazaki y el ángulo de la horquilla, este tramo de ADN es cubierto por unas proteínas llamadas SSB (por single-strand DNA binding), que tienen la propiedad de asociarse en forma cooperativa con cadenas de ADN simples. La presencia de estas SSB le confiere cierta rigidez al tramo en cuestión lo cual impide la formación de apareamientos indeseables entre bases complementarias de la propia cadena. No obstante, como las bases de los nucleótidos permanecen expuestas, ese tramo de ADN puede ser utilizado como molde para la construcción de un nuevo fragmento de Okazaki. A medida que la ADN polimerasa  agrega los sucesivos nucleótidos en el extremo 3’ de este fragmento, las proteínas SSB se van desprendiendo del ADN y vuelven a asociarse al ADN simple que va quedando expuesto conforme avanza la horquilla de replicación. En los telómeros, la conclusión de la síntesis de la cadena discontinua tiene características particulares. Una vez eliminado el ultimo cebador en la punta del telómero, la ADN polimerasa  no puede construir la pieza de ADN que lo reemplaza pues carece de un grupo 3’ preexistente a partir del cual esa pieza

pueda crecer. Como consecuencia, en las sucesivas divisiones celulares, con cada salida del cebador se pierde un tramo de ADN de igual tamaño, lo que provoca el progresivo acortamiento del telómero. Naturalmente, si las células no le pusieran límite a este acortamiento, a partir de un momento comenzarían a perder información genética. Esto se evita porque periódicamente los tramos de ADN perdidos son reconstruidos, lo cual depende de una singular secuencia de nucleótidos presente en la cadena 5’ -3’ de los telómeros y de un complejo enz imático llamado telomerasa, integrado por una pequeña pieza de ARN y varias proteínas.

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La cadena 5’ -3’ de los telómeros contiene, varias veces repetid a,

la secuencia de nucleótidos GGGTTA, que es la que se pierde una por vez en cada división celular. La reconstrucción del telómero comienza cuando la telomerasa se une al extremo 3’ de esa cadena, pero colocándose en el lado de la cadena 3’ -5’. La cadena 5’-3’ crece en la dirección correcta merced a que tiene todo lo necesario para hacerlo: un grupo 3’ libre y una secuencia de nucleótidos que le sirve de molde, cedida por el ARN de la telomerasa.

Obsérvese que de ese ARN queda expuesto el oligonucleótido CCCAAU, complementario de la secuencia GGGTTA correspondiente a la cadena 5’ - 3’' del telómero. El proceso se reitera una y otra vez, hasta que la cadena 5’ -3’ recupera las perdidas de ADN experimentadas en las replicaciones anteriores. A continuación, la ADN polimerasa , partiendo del grupo 3’ del ARN de la telomerasa en reemplazo del cebador sintetiza el tramo telomérico faltante en la cadena 3’ -5’ (discontinua) usando como molde el ADN de la cadena 5’ -3’ recién sintetizado. Por ultimo, la ADN ligasa conecta el extremo 3’ de ese tramo con el extremo 5’ de la cadena 3’ -5’, y la telomerasa se libera. Debe señalarse que no existe un balance exacto entre las perdidas teloméricas y sus recuperaciones periódicas, de ahí que el largo de los telómeros sea diferente en los distintos cromosomas.

La separación de las cadenas de la molécula de ADN es dirigida por una enzima especifica llamada helicasa, la cual, situándose en la horquilla de replicación por delante de la ADN polimerasa , se encarga de eliminar los puentes de hidrogeno que unen las bases complementarias de las dos cadenas de la doble hélice. Este proceso requiere energía, que es cedida por el ATP. A medida que avanza la horquilla de replicación, la helicasa deja tras de sí tramos de las dos cadenas del ADN con sus nucleótidos expuestos. Recordemos que para dar lugar a la cadena discontinua, los nucleótidos de la cadena progenitora 5' —>3' permanecen un tiempo sin replicar y deben combinarse con las proteínas SSB para evitar que se produzcan apareamientos entre ellos. La helicasa no puede abrir la doble hélice del ADN como si abriera un cierre relámpago. La causa de esa restricción deriva de la naturaleza helicoidal del ADN, conforme las cadenas del ADN se separan a nivel de la horquilla de replicación, se va acumulando por delante de esta en la doble hélice no abierta todavía un enrollamiento cada vez mayor. Como es de suponer, por arriba de cierto nivel el enrollamiento hace inviable la separación de las cadenas por la helicasa. Por lo tanto, para que la enzima no sea frenada, es necesario compensar ese superenrollamiento con un desenrollamiento equivalente, a fin de prevenir excesivas tensiones torsionales en el segmento no replicado de la doble hélice. El desenrollamiento es llevado a cabo por dos enzimas específicas la topoisomerasa I y la girasa (o topoisomerasa II). Ambas, utilizando energía provista por el ATP, remueven cada una de las vueltas en exceso mediante un mecanismo que se cumple en tres pasos. Comencemos por la topoisomerasa I: primero corta una de las cadenas de la doble hélice; luego la cadena cortada gira una vuelta en torno de su propio eje; finalmente los extremos cortados se vuelven a unir. La girasa, en cambio, en el primer paso no corta una sino las dos cadenas del ADN, las cuales, luego de girar una vuelta alrededor del eje de la doble hélice, restablecen sus uniones. Así, ambas enzimas primero se comportan como nucleasas (cortan al ADN a nivel de las uniones fosfodiester) y luego como ligasas (reconectan las piezas cortadas, después de haber rotado el ADN). La topoisomerasa I y la girasa se diferencian no solo porque la primera corta una de las cadenas del ADN y la segunda corta las dos, sino además por sus 33



efectos, ya que el desenrollamiento del ADN producido por la topoisomerasa I es de corto alcance y el conseguido por la girasa abarca una extensión de ADN bastante mayor. Por sus mecanismos de acción, la topoisomerasa I y la girasa no son responsables del desenrollamiento de los distintos grados de compactación de la cromatina causados por la asociación del ADN con las histonas, no hay dudas de que la compactación del ADN afecta la replicación, ya que la heterocromatina, a diferencia de la eucromatina, se replica muy tardiamente en la fase S. Las cadenas de la doble hélice progenitora, al separarse para su replicación, se reparten por igual en ambos cromosomas hijos. En cambio, no se sabe como se segregan las historias. Es posible que al cabo de la replicación sean heredadas totalmente por uno de los cromosomas hijos, caso en el cual el otro cromosoma hijo debe proveerse de histonas sintetizadas recientemente. En su mayor parte las nuevas histonas se sintetizan en la fase S y se incorporan al cromosoma apenas su ADN es formado. Dado que las cadenas recién construidas permanecen con las cadenas moldes, quedan formadas dos nuevas dobles hélices de ADN, por consiguiente al concluir la replicación los cromosomas contienen una doble dotación de ADN y las moléculas gemelas es decir, las cromátidas permanecen unidas por el centrómero. Podemos decir que la replicación del ADN constituye el prólogo de la división celular. ERRORES EN LA REPLICACIÓN El material genético se halla en constante peligro de ser alterado no sólo por la acción de diversos agentes ambientales, sino también espontáneamente, por ejemplo, como consecuencia de errores durante la replicación. Cuando las alteraciones del genoma involucran a uno o a unos pocos nucleótidos se denominan mutaciones génicas. Otras veces las alteraciones son de tal magnitud que afectan al propio cariotipo, motivo por el cual adquieren el nombre de aberraciones cromosómicas. Estas aberraciones pueden ser estructurales o numéricas. En las estructurales son afectadas partes extensas de uno de los cromosomas, que pueden perderse (deleción) o sufrir una inversión, una duplicación o una translocación. En las numéricas, en cambio, el cariotipo exhibe un número mayor o menor de cromosomas. Las mutaciones génicas más comunes consisten en la sustitución de un nucleótido por otro, en la pérdida (deleción) de uno o varios nucleótidos, o en la inserción (intercalación) de uno o varios nucleótidos en la molécula de ADN. Cualquiera que sea el tipo de mutación, genera un cambio en la información contenida en el gen y lleva a la producción de una proteína distinta de la esperada o a su falta de producción. Como se sabe, el cambio de un nucleótido en un gen da lugar a un codón diferente y, en consecuencia, a la presencia en la proteína de un aminoácido que no corresponde (salvo que el nuevo codón sea “sinónimo”

y, por lo tanto, codifique al mismo aminoácido). Muchas veces el cambio de un solo aminoácido en una molécula proteica produce alteraciones sustanciales en sus funciones, ya que al modificarse su estructura primaria se alteran también sus estructuras secundaria y terciaria. La deleción o la intercalación de un nucleótido en un gen modifican el "encuadre" de los codones en el ARNm desde el sitio de la mutación hasta el codón terminal. Ello suele traducirse en la producción de una proteína aberrante o, más comúnmente, en la interrupción de su síntesis, al aparecer un codón de terminación antes del lugar que corresponde. Las mutaciones pueden producirse en las células somáticas o en las germinativas. En el primer caso, si bien pueden afectar el fenotipo de los individuos, no pasan a la descendencia. En cambio, cuando se instauran en las células germinativas suelen transmitirse a la descendencia de generación en generación. Para los individuos las mutaciones suelen ser perjudiciales. En efecto, cuando corresponden a proteínas involucradas en la morfogénesis, las mutaciones se traducen en malformaciones congénitas anatómicas. Otras veces las proteínas modificadas dan lugar a alteraciones funcionales o a trastornos metabólicos (como ejemplos de las primeras pueden mencionarse las hemoglobinopatías, en las que la presencia en la hemoglobina de un solo aminoácido inadecuado suele generar graves disfunciones sanguíneas). En los trastornos metabólicos se alteran enzimas que participan en distintos procesos metabólicos de la célula. Las mutaciones también pueden afectar a genes imprescindibles para la supervivencia de las células o a genes involucrados en el control de la multiplicación celular; en el último caso suele descontrolarse la proliferación de las células, con la consiguiente aparición de cuadros cancerígenos. Consideradas desde el punto de vista biológico general, las mutaciones génicas tienen un lado positivo, ya que al acumularse en el genoma forjan a veces las condiciones para la creación de individuos mejor adaptados al medio ambiente, base de la evolución de las especies. 34



La mayor parte de las mutaciones génicas que afectan a las células se producen espontáneamente durante la replicación del ADN. Ello se debe a que mientras se sintetizan las cadenas hijas suelen insertarse nucleótidos incorrectos, o nucleótidos de menos o de más. La célula ha desarrollado mecanismos especiales para corregir tales errores y así lograr la mayor fidelidad posible en la duplicación del ADN. Esos mecanismos eliminan el 99,9% de los errores producidos durante la replicación, de modo que, de los numerosísimos nucleótidos incorrectamente insertados cada vez que se copian los millones de pares de nucleótidos en el genoma humano, en promedio persisten errados sólo tres. Existen otras clases de mutaciones génicas espontáneas, no vinculadas con la replicación del ADN. Una de ellas producida como consecuencia de un proceso llamado desaminación deriva de la facilidad que tienen la bases de algunos nucleótidos para perder sus grupos amino. Cuando la citosina se desamina se convierte en uracilo, que se aparea con la adenina y no con la guanina. Si la célula no corrigiera el error, reemplazando el uracilo por una citosina, en la próxima replicación, al asumir la cadena hija alterada el rol de cadena progenitora, haría que se inserte una adenina en lugar de una guanina, lo cual consolidaría la mutación. Algo análogo ocurre también espontáneamente, cuando se desamina la adenina, que al convertirse en hipoxantina se aparea con la citosina en vez de la timina.

Otra clase de mutación génica espontánea llamada apurínización se produce cuando una purina se desprende de su desoxirribosa, de modo que el nucleótido afectado pierde su base. Como consecuencia, queda en el gen un punto llamado sitio AP (por "apurínico"), sin información a pesar de no haberse cortado el ADN.

Existen tres grupos de agentes ambientales que al actuar sobre las células inducen la aparición de mutaciones: 1) los químicos, que son los más difundidos; 2) las radiaciones ionizantes, por ejemplo, la radiación ultravioleta de la luz solar, los rayos  y los rayos X, y 3) ciertos virus capaces de introducir piezas de ADN foráneo en los genes. Algunos de estos agentes incrementan la aparición de las mutaciones que se dan espontáneamente (sustituciones de bases, deleciones, intercalaciones, desaminaciones, apurinizaciones), mientras que otros generan en el ADN otras clases de cambios. Así, tanto los rayos  como los rayos X producen roturas en el ADN. Por su lado, la luz ultravioleta desencadena la formación, en una de las cadenas de la doble hélice, de varios tipos de dímeros entre pirimidinas adyacentes, de los cuales los mas comunes son los dimeros de timina; la unión covalente entre dos timinas vecinas distorsiona su apareamiento con las adeninas de la cadena opuesta, lo cual, al interferir la replicación normal del ADN conduce a la aparición de mutaciones. 35



Formación de dímeros de timina por acción de la luz ultravioleta. REPARACIÓN DEL ADN Para cada tipo de alteración del ADN existe un mecanismo de reparación particular, dirigido por un conjunto de enzimas específicas. En la mayoría de los casos se basan en la información genética complementaria existente entre las dos cadenas del ADN, de modo que si una de ellas sufre alguna alteración (mutación), puede ser reparada a partir de la información normal contenida en la otra cadena. Como en todo proceso biológico, los mecanismos reparadores de errores en el ADN pueden fallar, de ahí la aparición de mutaciones génicas. Durante la replicación del ADN, para que un nucleótido pueda ser agregado en el extremo 3’ de la

cadena hija en crecimiento, es imprescindible que el nucleótido incorporado precedentemente sea el adecuado, ya que si la ADN polimerasa inserta en forma accidental un nucleótido incorrecto, "percibe" el error y no agrega nuevos nucleótidos, lo cual detiene transitoriamente el crecimiento de la cadena. El error es resuelto por la propia enzima mediante el ejercicio de una propiedad adicional que posee, conocida como "lectura de pruebas". Así, la ADN polimerasa, ante la presencia de un nucleótido incorrectamente insertado, retrocede y lo elimina, utilizando la actividad exonucleolítica 3’ -5’ de una de sus subunidades. Luego, una vez eliminado el nucleótido, la síntesis del ADN progresa normalmente. Como vemos, durante la replicación la ADN polimerasa controla y resuelve los errores que ella misma comete.

Sin embargo, dada la importancia de la integridad del ADN, si fallara esta "lectura de pruebas" se pone en marcha un segundo sistema de reparación, que se cumple en tres pasos. Primeramente, el o los nucleótido erróneos son removidos por una nucleasa reparadora la misma que remueve a los cebadores en la síntesis continua y discontinua del ADN, para lo cual la nucleasa corta las uniones fosfodiester donde se ligan los nucleótidos correctos con los incorrectos. A continuación, el espacio que queda vació es llenado por los nucleótidos adecuados mediante una reacción conducida por la ADN polimerasa . El proceso se completa cuando la ADN ligasa conecta el extremo 3’ del nuevo ADN con el extremo 5’ del

ADN cortado. Debe existir alguna señal que le permita a la nucleasa reparadora distinguir en cual de las dos cadenas del ADN se encuentra el nucleótido incorrecto. En los procariotas, tal reconocimiento se 36



basaría en una diferencia transitoria en la metilación de ciertas adeninas de las dos cadenas, ya que transcurre un tiempo entre la síntesis de la cadena hija y esa metilación y los errores serían reparados durante ese periodo. Fuera de la replicación, la aparición en el ADN de uracilos en lugar de citosinas como consecuencia de desaminaciones espontáneas desencadena un mecanismo de reparación distinto, que utiliza una ADN glicosilasa especifica. Esta reconoce y corta la conexión química entre la base errónea y la desoxirribosa ligada a ella, de modo que deja al nucleótido sin su base. En forma similar, otra ADN glicosilasa especifica remueve las hipoxantinas surgidas al desaminarse las adeninas. Cada desoxiribosa sin base o sitio AP (en ese caso, por "apurínico" o por "apirimidínico") es reconocida, y por lo tanto removida, por dos enzimas que actúan en forma sucesiva. En primer termino interviene una AP endonucleasa, que corta el extremo 5’ del sitio AP. Luego lo hace una fosfodiesterasa que al cortar el extremo 3’ de ese sitio remueve la desoxirribosa del AD N. A continuación, la ADN polimerasa  coloca

el nucleótido correcto en el lugar vacio y la ADN ligasa pone fin a la reparación. Los sitios AP apurínicos que se producen al perderse alguna purina en forma directa son reconocidos y reparados por las mismas enzimas correctoras de los sitios AP surgidos tras las desaminaciones. La mayor parte de las mutaciones inducidas por agentes ambientales son reparadas por los mismos mecanismos que se utilizan en la corrección de las mutaciones espontáneas. En cambio, los dimeros de timina generados, por la luz ultravioleta son removidos por un sistema de enzimas especiales que hidrolizan simultáneamente dos uniones fosfodiester, una a cada lado de la lesión. Así, luego de reconocer la distorsión provocada por la presencia del dimero, sendas nucleasas cortan en la cadena

afectada la quinta y la vigesimocuarta unión fosfodiester, contadas a partir del dimero en dirección 3’ y 5’, respectivamente. A continuación, el segmento de 29 nucteotidos que obviamente incluye al dimero es

separado de la cadena normal por la ADN helicasa que al cortar los puentes de H entre los nucleótidos de ambas cadenas libera a ese segmento del ADN. La reparación se completa cuando el lugar vació es rellenado con la ayuda de una ADN polimerasa, y el e xtremo 5’ del nuevo ADN es ligado por la ADN ligasa.

ORGANIZACIÓN MOLECULAR DEL ARN El ARN esta constituido por ribonucleótidos (4 diferentes nucleotidos de ribosa) los mismos que se repiten en toda la secuencia polinucleotidica, estos nucleotidos estas unidos entre si mediante enlaces fosfodiester en sentido 5’ – 3’ al igual que en el ADN. El ARN es sintetizado dentro del núcleo a partir

de una sola de las cadenas del ADN. Las moléculas del ARN se diferencian del ADN en tres aspectos fundamentales: 1. Los nucleotidos del ARN estan formados por la pentosa ribosa en lugar de la desoxirribosa del ADN. 2. El ARN presenta la base nitrogenada uracilo en lugar de la timina del ADN. 3. Las moléculas del ARN son de una sola cadena de polinucleotidos. La única cadena que constituye al ARN con frecuencia presenta regiones donde hay bases nitrogenadas complementarias, en las cuales se establecen uniones de hidrógeno entre pares de adenina – uracilo y guanina – citosina como consecuencia de esto llegan a conformar estructuras bicatenarias semejantes al ADN, existen plegamientos donde el apareamiento de las bases se lleva a cabo en forma tautomerica. Las estructuras secundarias y terciarias del ARN consisten en que la cadena al plegarse sobre sí misma constituye las asas, loops o brazos y asimismo conforman plegamientos o estructura de hojas plagadas. TRANSCRIPCION O SÍNTESIS Y PROCESAMIENTO DE ARN. Las células eucariotas poseen tres enzimas transcriptoras distintas, cada una encarga de la síntesis de diferentes grupos de ARN. La ARN polimerisa I sintetiza ARN ribosómico grande; la ARN polimerisa II sintetiza ARN mensajero y la mayor parte de los ARN nucleares pequeños; y la ARN polimerisa III sintetiza ARN de bajo peso molecular, incluyendo varios ARN de transferencia y el ARN ribosómico 5S. No se han encontrado procariotes con ARN polimerisas múltiples. Los tres principales tipos de ARN, se derivan de moléculas de un precursor de ARN considerablemente mucho mayor que el producto ARN “maduro”. La molécula de ARN inicialmen te sintetizada, de longitud equivalente a la longitud completa del ADN transcrito, se denomina transcrito primario, o pre-ARN. El segmento de ADN correspondiente sobre el cual se transcribe el transcrito primario se denomine unidad de transcripción. Típicamente, los transcritos primarios tienen existencia fugaz y son 37



procesados para formar ARN funcional más pequeño mediante una serie de reacciones de procesamiento.

ARN RIBOSÓMICO (ARNr) Las células eucariotas contienen millones de ribosomas, cada uno con varias moléculas de ARNr junto con docenas de proteínas ribosómicas. En realidad, más de 80% del ARN de una célula consta de ARN ribosómico. Para suministrar a la célula un número tan grande de transcritos, las secuencias de ADN que codifican ARNr normalmente se repiten cientos de veces. Este ADN ribosómico, de ordinario se agrupa en una o unas pocas regiones del genoma. En la célula en interfase, los racimos de ADN ribosómico se agrupan como parte de una o más estructuras nucleares de forma irregular denominadas nucléolos, que funcionan como estructuras productoras de ribosomas. Por consiguiente, las regiones del cromosoma que contienen ADN ribosómico se denominan organizadores nucleolares. Los ribosomas eucariotas tienen cuatro ARN ribosómicos distintos, tres en la subunidad grande y uno en la subunidad pequeña. En el hombre la subunidad grande contiene una molécula ARN 28S, una 5.8S y una 5S, en tanto que la subunidad pequeña contiene una molécula ARN 18S. Tres de estos ARNr (28S, 18S y 5.8S) se derivan de un solo transcrito primario (denominado pre-ARN). El ARNr 5S se sintetiza a partir de un precursor ARN separado fuera del nucléolo. El ARN 45S es precursor de las moléculas 28S, l8S y 5.8S. La longitud combinada de los tres ARNr maduros es de aproximadamente 7000 nucleótidos, poco más de la mitad del transcrito primario. Esté ARN precursor a su vez sufre procesos de modificación post-transcripcional ya que paulatinamente se va produciendo los recortes de las regiones intron las mismas que son extirpadas por lo tanto el ARN 45S se transforma en ARN 32S y ARN 20S a su vez el ARN 32S se transforma en 28S y 5.8S, en tanto que el ARN 20S se transforma en 18S. El nucléolo no sólo es sitio de procesamiento de ARNr, sino también de ensamblado de las dos subunidades ribosómicas, tiene estructura simple y carece de un componente membranoso, la parte central fibrilar del nucléolo consiste en transcriptos de ADN ribosómico y ARNr nacientes. Los gránulos que rodean este centro constan de subunidades ribosómicas en varias etapas de maduración, lo que indica que son los sitios de síntesis de ARN.

El ARNr 5S, de 120 nucleótidos de largo aproximadamente, forma parte de la subunidad ribosómica mayor conjuntamente que 28S y 5.8S. En células eucariotas, los genes ARNr 5S están totalmente separados de los genes que codifican los otros ARNr y se localizan fuera del nucléolo en una región 38



especifica del núcleo. La ARN polimerasa III transcribe los genes ARNr 5S. Luego de su síntesis, el ARNr 5S se transporta al nucléolo para unirse a los otros componentes que participan en el ensamblado de subunidades ribosómicas. La función del ARNr es la de participar en la síntesis de proteínas cuando la subunidad mayor (28S, 5.8S y 5S + RNP) y la subunidad menor (18S + RNP) de los ribosomas se encuentran en el citoplasma celular constituyendo los poliribosomas o polisomas. ARN DE TRANSFERENCIA (ARN t). Se estima que las células eucariotas tienen aproximadamente 60 especies diferentes de ARN de transferencia, cada una codificada por una secuencia de ADN repetida varias veces dentro del genoma. El grado de repetición varía con el organismo. El ARN de transferencia se sintetiza a partir de genes localizados dentro de pequeños grupos dispersos alrededor del genoma es decir se transcribe en el núcleo a partir de una solo cadena de ADN. Un solo grupo típicamente contiene múltiples copias de diferentes genes de ARNt e inversamente, la secuencia de ADN que codifica un ARNt de ordinario se encuentra en más de un grupo. La ARN polimerasa III transcribe los ARNt, el transcrito primario de una molécula de ARN de transferencia o pre-ARNt es mayor que el producto final, esté pre-ARNt sufre modificaciones post-transcripcionales diferentes para luego convertirse en ARNt maduro.

Las modificaciones post-transcripcionales consisten en los cortes de las regiones intron en el cual participan las endonucleasas y exonucleasas, seccionandose los fragmentos sobre ambos extremos 5’ y 3’ del ARNt precursor (y un fragmento interior en algunos casos) de manera que los ARNt maduros

queden con 90 nucleotidos. El ARN de transferencia o de transporte presenta estructura secundaria, semejante a la hoja de un trebol, la síntesis del ARNt se inicia del extremo 5’ a su vez plegándose y formando la primera asa o brazo denominado “D” por conten er dihidroxiuridina, la asa central viene

hacer el brazo del anticodón el cual en el extremo de dicho brazo presenta 3 bases complementarias a los codones del ARNm. El anticodón tiene como función reconocer los codones del ARNm durante la síntesis de proteínas, luego se forma el tercer brazo “T” porque presenta una pseudotimina y pseudouridina, terminando en el extremo 3’ a la que se denomina brazo o tallo aceptor porque a este se

enlazan aminoácidos activados. Este extremo tiene siempre la secuencia CCA, los tres nucleótidos se añaden por medio de enzimas luego de procesar el ARNt, por último presenta un brazo pequeño pentanucleotidico. La función del ARNt es la de transportar los aminoácidos activados hasta los poliribosomas durante la síntesis de proteínas. ARN MENSAJERO (ARNm). El ARNm se sintetiza como parte de moléculas mucho mayores de ARN nuclear heterogéneo (ARNnh) es decir es precursor de los ARNm citoplasmáticos, este ARN sólo se encuentra en el núcleo, presenta un peso molecular elevado en conjunto, corresponde a ARN con diversas secuencias de nucleótidos (heterogéneos). Por lo tanto aunque el ARNm y sus precursores ARN nucleares heterogéneos sólo constituye un pequeño porcentaje del ARN total, en la mayor parte de las células eucariotas significa, en todo momento, un elevado porcentaje del ARN sintetizado en dichas células. El ARNnh es sumamente inestable (por su rápido procesamiento en el núcleo); el ARNm es relativamente inestable (debido a su descomposición en el citoplasma); los ARNr y ARNt son relativamente estables, y por lo tanto se acumulan gradualmente y así llegan a ser la especie predominante dentro de la célula. 39



La ARN polimerasa II sintetiza a todos los ARNm precursores con ayuda de algunas proteínas auxiliares denominadas factores generales de transcripción, el promotor de la polimerasa II se sitúa en el lado 5’ de la unidad de transcripción. En la mayo r parte de los genes estudiados, presenta una porción denominada elemento promotor central. Esta región contiene una secuencia de bases idéntica a otra del oligonucleótido 5’ -TATAAA- 3’, también conocida como compartimiento TATA. El compartimiento TATA del ADN es el sitio donde se ensambla un complejo preinicial que contiene los factores generales de transcripción y la polimerasa. De igual manera que el segmento Pribnow de los procariotas, al cual se parece, el segmento TATA determina el sitio preciso donde se inicia la transcripción.

Los ARN mensajeros contienen una secuencia continua de nucleótidos que codifica un polipéptido específico; se encuentran en el citoplasma y están fijos a ribosomas o tienen capacidad para unirse a ellos para ser traducidos, los ARNm eucariotas presentan modificaciones especiales en sus extremos terminales 5’ y 3’ no observadas en los mensajeros procariotas. El extremo 5’ de un ARNm eucariota tiene un “casquete” de guanosina metilada en tanto que el extremo 3’ tiene una cadena de 50 a 250

residuos de adenosina que forman un apéndice poli(A).

El análisis de la transcripción del genoma reveló que la secuencia principal 5’ no es complementaria de

una secuencia repetida y, más aún, ni siquiera es complementaria de un tramo continuo de nucleótidos en la plantilla de ADN. En vez de eso, la secuencia principal se transcribe a partir de segmentos de ADN distintos y separados. Las regiones de ADN situadas entre estos bloques son conocidas como secuencias interpuestas y están ausentes en el ARNm correspondiente. Se demostró que la presencia de genes con secuencias interpuestas, llamados genes cortados, es mas la regla que la excepción. Las partes de un gen cortado que contribuyen a un producto ARN maduro se denominan exones. En tanto que las partes que corresponden a las secuencias interpuestas se denominan intrones. Entonces en el transcrito primario estan presentes los segmentos correspondientes a los intrones. Esta explicación 40



también suministra una razón acerca del tamaño mucho mayor de las moléculas de ARNhn en comparación con las moléculas de ARNm que finalmente producen. Estudios subsecuentes han revelado que los intrones de un gen promedian 4 a 10 veces la longitud de los exones, y por esta razón las moléculas del ARNnh en condiciones típicas son mucho mas largas que las de ARNm. La formación del ARNm ocurre por supresión de la secuencia interna de ribonucleótidos a partir de un pre - ARNm mucho más grande. La ARN polimerasa II ensambla un transcripto primario complementario del ADN de toda la unidad de transcripción, a continuación este transcripto se procesa en el núcleo para formar ARNm maduro que se transporta al citoplasma. Los transcriptos de ARN se asocian a diferentes proteínas huéspedes y a numerosas particulas distintas mientras aún se encuentran en proceso de síntesis. Estas partículas constan de proteínas y ribonucleoproteínas, e incluyen los agentes encargados de convertir el transcrito primario en el mensajero maduro. Los primeros pasos de este proceso de conversión incluyen la adición en el extremo 5’ del ARN de un casquete o capuchon de metilguanosina (Guanidil 7 metil trifosfato). Las modificaciones enzimáticas en el extremo 5’ del tra nscrito primario ocurren con gran

rapidez, mientras la molécula de ARN todavía se encuentra en las etapas iniciales de síntesis. Además de la metilación de los nucleótidos terminales del precursor ARNm, varios residuos de nucleótidos internos también pueden ser metilados o no serlo. Se cree que el casquete de metilguanosina tiene varias funciones: evita que el extremo 5’ del ARNm sea digerido por nucleasas, ayuda a transportar

ARNm hacia fuera del núcleo y desempeña un papel importante para iniciar la traducción del ARNm.

El extremo 3’ de un ARNm contiene una cadena de residuos de adenosina que forman un apéndice poli

(A). Este apéndice invariablemente se encuentra a unos 15 nucleotidos hacia abajo de una secuencia AAUAAA que sirve como sitio de reconocimiento para una nucleasa que desdobla el pre ARNm situado justamente hacia abajo de este sitio, una enzima llamada polimerasa poli (A) añade las adenosinas que componen el apendice poli (A), este participa en la estabilización del ARNm dentro del citoplasma protegiéndolo del desdoblamiento prematuro. Puesto que un porcentaje considerable del ARNm carece de apéndice poli(A) (incluyendo los que codifican histonas), la presencia de esta modificación no es requisito para la síntesis, procesamiento, transporte o traducción de un ARNm eucariota. Las partes de un transcrito primario que corresponden a secuencias de ADN interpuestas (intrones) se eliminan mediante un proceso complejo conocido como empalme del ARN. Para empalmar un ARN se debe introducir una pausa en la cadena a nivel de los bordes 5’y 3’(o sitios de desdoblamiento) de cada intron y los exones situados a ambos lados de los sitios de empalme deben unirse mediante enlaces covalentes (ligados). Es imperativo que el proceso de empalme ocurra con absoluta precisión, puesto que la presencia o ausencia de un solo nucleótido anormal en cualquiera de las uniones de empalme cambia el cuadro de lectura del mensaje y causa errores de traducción. Conforme las moléculas grandes de ARNnh se transcriben, cada intrón se asocia a un complejo macromolecular llamado espliceosoma.

El pre ARNm de células animales no se puede empalmar por si mismo, sino que requiere múltiples ARNnp 41



nucleares y sus proteínas relacionadas. Las proteínas ejercerían un papel complementario, por ejemplo, mantener la estructura tridimensional apropiada de los ARNnp para transportar a los ARNm empalmados a la envoltura nuclear y actuar como sitios de interacción con factores reguladores. Puesto que la mayor parte de los genes contienen algunas secuencias interpuestas, las reacciones de empalmado mostradas deben ocurrir repetidas veces sobre un solo transcrito primario para eliminar todos los intrones del pre ARNm, las pruebas sugieren que los intrones se eliminaran en un orden preferido generando intermediarios específicos de procesamiento cuyo tamaño varia entre el del transcripto primario y el ARNm maduro. La función del ARNm es la de recibir el mensaje de la información genética (caracteres hereditarios) contenida en el ADN, dicha transcripción ocurre en forma codificada, en forma de codones o tripletes, dicho ARNm emerge del núcleo para traducir el mensaje recepcionado al lenguaje de proteínas. ENZIMAS CELULARES Las enzimas son proteínas globulares que actúan como biocatalizadores, es decir, son sustancias que aceleran la velocidad de las reacciones químicas en los seres vivos sin modificarse. El sustrato es toda molécula sobre la que actúa una enzima, la energía necesaria para transformar un sustrato en producto se denomina Energía de Activación, el tiempo que demora en transformarse un sustrato en producto se denomina Tiempo de Reacción. Las enzimas disminuyen la energía de activación y el tiempo de reacción por consiguiente aceleran la velocidad de las reacciones químicas.

Las enzimas (E) son proteínas que tienen uno o más lugares denominados sitios activos, a los cuales se une el sustrato (S). El sustrato es modificado químicamente y convertido en uno o más productos (P). Como esta reacción es generalmente reversible puede ser expresada de la siguiente manera: E

+

S

(E S)

E + P

Donde (E S) es un complejo enzima-sustrato intermediario. Las enzimas aceleran la reacción hasta que se alcanza un equilibrio y pueden ser tan eficientes como para que la velocidad de la reacción sea de un millón (10 6) a un trillón (10 12) de veces más rápida que en ausencia del catalizador. Todavía más notable es que esto se logra a temperaturas y pH sumamente bajos presentes en la célula. Muchas de las enzimas son proteínas conjugadas o sea, contienen elementos no proteicos denominados cofactores, que pueden ser inorgánicos (metales) u orgánicos (coenzimas). Los cofactores participan de manera importante en la función de la enzima y casi siempre cumplen tareas para las cuales los aminoácidos son inadecuados. Una característica muy importante de la actividad enzimática es su especificidad, de manera que cada enzima particular actúa sólo sobre un determinado sustrato. Las enzimas suelen ser tan específicas que son incapaces de actuar sobre sustancias estrechamente relacionadas, por ejemplo sobre un estereoisómero de la misma molécula. Ademas como todo verdadero catalizador, las enzimas muestran las siguientes propiedades:

42



a) Gran capacidad catalítica, lo que hace que esten presentes en pequeñas cantidades es decir las cantidades infinitesimales son suficientes para la transformación de una sustancia reactante en producto. b) No sufren alteraciones irreversibles en el curso de la reacción y por lo tanto cada molécula de enzima puede participar en muchas reacciones individuales, lo que significa que puede ser utilizada una y otra vez (reutilización de la enzima). c) Presentan sensibilidad, es decir debido a su naturaleza proteica las enzimas están sujetas a la desnaturalización y pérdida de su actividad catalítica. d) No tienen efecto sobre la termodinámica de la reacción, es decir no determinan si una reacción es termodinámicamente favorable (exergónica) o desvaforable (endergónica) y tampoco determinan cuál es la relación en el equilibrio entre productos y reactantes. Las enzimas son mediadoras del metabolismo encargadas prácticamente de toda reacción que ocurra en una célula. Sin enzimas, las reacciones metabólicas procederían tan lentamente que serian imperceptibles; en ausencia de enzimas, la vida seria imposible. En este sentido el Metabolismo es el conjunto de reacciones bioquímicas que ocurren dentro de una célula, el cual incluye gran diversidad de conversiones moleculares. Estas reacciones se pueden agrupar en vias metabólicas que contienen una secuencia de reacciones químicas, en las cuales cada reacción es catalizada por una enzima específica. Las enzimas que constituyen una vía metabólica de ordinario se confinan a una porción específica de la célula, como las mitocondrias y el citoplasma. Cada vez hay más pruebas que sugieren que las enzimas de una vía metabólica están físicamente unidas entre si, caracteristica que permite entregar el producto de una enzima directamente como sustrato al sitio activo de la siguiente enzima en la secuencia de reacciones. Los compuestos formados en cada paso a lo largo de la vía son intermediarios metabólicos (o metabolitos) que en último término conducen a la formación de un producto final. Los productos finales son moléculas con un papel particular en la célula, como un aminoácido que puede incorporarse a un polipéptido, o un azúcar que se puede consumir por su contenido energético. Las vías metabólicas de una célula están interconectadas en diferentes puntos, de modo que un compuesto generado en una vía se puede repartir en varias direcciones según las necesidades de la célula en ese momento. Las vías metabólicas se pueden dividir en dos tipos muy amplios: Vías catabólicas, que conducen a la descomposición de moléculas complejas para formar productos más simples. Estas Vías tienen dos funciones: poner a disponibilidad la materia prima a partir de la cual se pueden sintetizar otras moléculas y suministrar la energía química requerida para muchas actividades de la célula. La energía liberada por las vías catabólicas se almacena transitoriamente en dos formas: como fosfatos de alta energía (sobre todo ATP) y como electrones de alta energía (en particular en el NADPH). Vías anabólicas, que conducen a la síntesis de compuestos más complejos. Las vías anabólicas requieren energía y utilizan la energía química almacenada que se libera en vías catabólicas exergónicas. Las vías para la degradación de los diversos componentes de las macromoléculas varián según el compuesto particular que debe catabolizarse. Sin embargo, finalmente todas estas moléculas se convierten en una variedad de pequeños compuestos que se metabolizan de manera similar. Así, aunque las sustancias empiezan como macromoléculas con estructuras muy diferentes a través de las vías catabólicas, se convierten en los mismos metabolitos de bajo peso molecular. Por esta razón, se dice que las vías catabólicas son convergentes. Ambas vías, catabólica y anabólica, incluyen reacciones clave en las cuales se transfieren electrones de un reactante al otro. Las reacciones que implican cambios en el estado electrónico de los reactantes se denominan reacciones de oxidorreducción (o redox). Los cambios de este tipo se acompañan de ganancia o pérdida de electrones, cuando un átomo pierde uno o más electrones se dice que se oxida, cuando un átomo gana uno o más electrones se dice que se reduce. La oxidación de un reactante debe acompañarse de la reducción simultánea de algún otro reactante, y viceversa. La sustancia que pierde electrones durante una reacción de oxidorreducción, o sea, la que se oxida, se denomina agente reductor, y la sustancia que gana electrones, o sea, la que se reduce, se denomina agente oxidante. 43



La oxidación y la reducción de sustratos orgánicos durante el metabolismo celular implica átomos de carbono enlazados en forma covalente a otros átomos. En un enlace C – H, el átomo de carbono tira con mayor fuerza de los electrones, por lo que se puede decir que el átomo de carbono se encuentra en estado reducido. Por lo contrario, si un átomo de carbono está enlazado a un átomo más electronegativo como en los enlaces C – O o C – N, los electrones son empujados con mayor fuerza para separarse del átomo de carbono, que por lo tanto se encuentra en estado oxidado. Puesto que el carbono tiene cuatro electrones en su capa más externa que puede compartir con otros átomos, puede existir en varios estados de oxidación que van desde el estado completamente reducido en un metano (CH 4) hasta un estado completamente oxidado en el dióxido de carbono (CO 2). El estado de oxidación relativo de una molécula orgánica por lo general se puede determinar contando el número de átomos de hidrógeno en comparación con los átomos de oxígeno y de nitrógeno por cada átomo de carbono. El estado de oxidación de los átomos de carbono en una molécula orgánica constituye una medida del contenido de energía libre de la molécula. El grado de reducción de un compuesto también se mide a partir de su capacidad para efectuar trabajo químico dentro de la célula. Cuanto mayor sea el número de átomos de hidrógeno que se puedan separar de una molécula “combustible”, mayor será la cantidad de ATP que

finalmente se forma. Así, por ejemplo los carbohidratos son ricos en energía química debido a que contienen hileras de unidades de H – C – OH. Como único componente, tanto del almidón como del glucógeno, la glucosa es una molécula clave en el metabolismo energético tanto de plantas como de animales. La energía que se libera por oxidación completa de la glucosa es muy grande siendo esta de 686 Kcal / mol.

C6H12O6

+

6 O2

6 CO2

+

6 H2O

En comparación, la energía libre requerida para formar ATP a partir de ADP es relativamente pequeña siendo esta de 7.3 Kcal / mol.

ADP + Pi

ATP + H2O

De estas cifras es evidente que la oxidación completa de una molécula de glucosa para formar CO 2 y H2O puede liberar bastante energía para formar ATP en gran cantidad. En las condiciones presentes en la mayor parte de las células se pueden formar hasta 36 moléculas de ATP por molécula de glucosa oxidada. C6H1206 I Glucolisis Acido piruvico Organismos anaerobios

Organismos aerobios

Acido láctico (bacterias)

II Matriz mitocondrial

Etanol (levaduras)

Acetil CoA 44



Ciclo de Krebs

III Fosforilación Oxidativa Alteración de la actividad de las enzimas mediante modificación covalente. A mediados del decenio de 1950, Edmond Fischer y Edwin Krebs, de la universidad de Washington, estudiaron la fosforilasa, una enzima presente en células musculares que descompone el glucógeno en subunidades de glucosa. La enzima puede existir en sus formas activa e inactiva. Fischer y Krebs prepararon un extracto crudo de células musculares y observaron que las moléculas de enzima inactiva del extracto podían convertirse en activas simplemente añadiendo ATP al tubo de ensayo. Un análisis posterior reveló una segunda enzima en el extracto, la “enzima convertidora”, como ellos l a llamaron, que transfiere un grupo fosfato del ATP a uno de los 841 aminoácidos que constituyen la molécula de la fosforilasa. La presencia del grupo fosfato altera la forma del sitio activo en la molécula de la enzima e incrementa su actividad catalitica. Una investigación subsecuente demostró que la modificación covalente de las enzimas, por la adición de fosfatos, es un mecanismo general para activar (o inactivar) enzimas.

Las enzimas que transfieren grupos fosfatos a otras proteínas se denominan proteincinasas y participan en la regulación de actividades tan diversas como la acción de hormonas, la división celular y la expresión de genes. Hay dos tipos básicamente diferentes de proteincinasas: un tipo añade grupos fosfato a residuos especificos de tirosina en una proteína de sustrato, el otro tipo añade fosfatos a residuos especificos de serina o treonina en el sustrato. Las enzimas al estar fosforiladas tienen actividad enzimatica mucho más reactivas que otras no fosforiladas, la actividad de algunas proteincinasas se estimulan por el AMPciclico a su vez el AMPciclico es regulado por hormonas que actuan sobre receptores de membrana. Proteina

+

ATP

Proteína fosforilada + ADP

Separación de las vías catabólica y anabólica. 45



Un breve examen de la vía anabólica que conduce a la formación de glucosa (gluconeogenesis) ilustra algunos aspectos importantes acerca de las vías sintéticas. ¿Cómo se puede sintetizar glucosa a partir de piruvato en una célula que normalmente oxida glucosa como su principal fuente de energía química?. El primer punto importante es: aunque las enzimas pueden catalizar una reacción en ambas direcciones, la formación de glucosa no puede iniciarse simplemente invirtiendo las reacciones de la glucólisis. La vía glucolítica contiene tres reacciones termodinámicamente irreversibles. Si se comparan las vías para degradar la glucosa (glucólisis) con la vía para sintetizarla (gluconeogenesis), se observa que algunas reacciones son idénticas aunque ocurran en direcciones opuestas, en tanto que otras son muy diferentes. Empleando enzimas diferentes para catalizar distintas reacciones clave en dos vías opuestas, la célula puede asi, resolver los problemas termodinámicos y de regulación inherentes a su capacidad para elaborar y degradar a las moléculas mismas. ENZIMAS EN LAS ESTRUCTURAS CELULARES Y FUNCIONES QUE CUMPLEN ESTRUCTURA 1. MEMBRANA PLASMATICA

ENZIMA 

Permeasas Translocasas



Bombas (ATPasas)



Bombas que no son ATPasas





Adenil ciclasa (superficie interna de membrana) Acetil colinesterasa (superficie externa de la membrana) Bombas de glucosa (transportadores de glucosa) Glucoliticas Aminoacil sintetasa



Glucogeno sintetasa



Glucogeno fosforilasa



Oxidasas flavinicas Peroxidasas Uratoxidasas Catalaza Muchas enzimas algunas del ciclo de Krebs



 

2. CITOPLASMA

ORGANELOS 3. PEROXISOMAS

FUNCION Transporte de macromoléculas desde el espacio extra al intra celular o viceversa. Transporte de iones con aporte de energía proveniente del ATP. Transporte de iones o electrolitos con ayuda o impulso de otros iones.



  

4. GLIOXISOMAS (vegetales)



5. RIBOSOMAS (Sub unidad mayor)



Peptidiltransferasa

6. RETICULO ENDOPLASMATICO LISO 7. APARATO DE GOLGI



Lipasa

 

Glucosiltransferasas Manosidasas

8. MEMBRANA EXTERNA DE MITOCONDRIAS 9. MATRIZ MITOCONDRIAL



Muchas enzimas.



10. CRESTAS MITOCONDRIALES

 

Aconitasa, fumarasa, sintetasa, etc. Carnitina ATPasa Citocromos



46

Sintetiza AMPc a partir de ATP. Receptora de los neurotransmisores. Transportar a la glucosa. Participan en la glucólisis. Activación de los Aminoácidos para la síntesis de proteínas. Síntesis de glucógeno a partir de monómeros de glucosa. Glucogenolisis. Síntesis de peroxido de hidrógeno

En la vía catabólica del H2O2. Ciclo del Glioxilato (degradación de lípidos para transformarse en carbohidratos). Catalizan el enlace peptídico del Aminoácido entrante localizado en el sitio A con el aminoácido de la cadena polipeptidica localizado en el sitio P. Síntesis de lípidos, triglicéridos, fosfolipidos, hormonas esteroideas. Glucosilación de lípidos y proteínas. Degradan a las manosas de las colas oligosacaridas de las glucoproteínas y glucolipidos. Oxidación de lípidos en carbohidratos citrato Ciclo de Krebs. Fosforilación oxidativa.


11. NUCLEO


      

ADN polimerasas ARN polimerasas Endonucleasas ADN asas ARN asas ADN ligasas Topoisomerasas

Replicación del ADN. Transcripción de los ARNs. Reparación del ADN. Hidrólisis de ADNs. Hidrólisis de ARNs. Union de fragmentos de ADN. Desenrrollamiento de las cadenas del ADN.

MECANISMOS DE CONTROL DE LA EXPRESIÓN DE LOS GENES. Las células no están constantemente sintetizando todos los tipos de proteínas sobre las cuales tienen información. Si así fuera se produciría un caos metabólico. Es evidente, que debe existir un sistema de regulación. Como la cantidad de proteínas sintetizadas depende directamente de la cantidad de ARNm presente en el citoplasma y como la vida media de éste es muy corta (minutos), la cantidad de ARNm sintetizado es la que regula los niveles enzimáticos en el medio. El descubrimiento de cómo se controla la síntesis de ARNm se inició a partir del llamado “efecto glucosa” observado por Jacques Monod en 1947. Si a un medio de cultivo bacteriano con Escherichia coli y lactosa se añade glucosa, el nivel de la enzima  - galactosidasa disminuye sensiblemente. Ello es

lógico, puesto que para conseguir glucosa ya no es preciso desdoblar la lactosa en glucosa y galactosa, reacción que cataliza la  - galactosidasa. Las enzimas aparecen sólo cuando son necesarias y luego son degradadas. Posteriormente, durante los años cincuenta, Francois Jacob y Jacques Monod, trabajando con E. coli , descubrieron que las enzimas reprimidas en el experimento anterior eran tres: la  - galactosidasa, la  - galactósido-permeasa y la  - galactósido-transacetilasa. Todas ellas están relacionadas con el metabolismo de la lactosa. De este hecho se concluyó que el sustrato (glucosa) no sólo reprimía una enzima, sino todo el conjunto de enzimas que intervienen en una misma vía metabólica. TEORIA DEL OPERON La teoría del operón es un modelo que explica como se efectúa el control de la biosíntesis proteica. En las bacterias, los genes que contienen la información para ensamblar las enzimas de una vía metabólica se agrupan en el cromosoma en un complejo funcional denominado operón. Todos los genes del operón son coordinados mediante un mecanismo de control descrito por primera vez en 1961 por F. Jacob y J. Monod, del instituto Pasteur de Paris. Un operón bacteriano típico consta de genes estructurales, una región promotora, una región operadora y genes reguladores.

Organización de un operón bacteriano

Operón de Escherichia coli Los genes estructurales son los que codifican las proteínas estructurales y las proteínas enzimáticas. Los genes estructurales de un operón de ordinario se situan adyacentes entre sí y una ARN polimerasa se desplaza de un gen estructural al siguiente, transcribiendo todos los genes a un solo ARNm. Este ARNm gigante se traduce después en polipéptidos distintos que se convierten en las diferentes enzimas de la vía metabólica. Por consiguiente, al ponerse en marcha un gen activa a todos los productores de enzimas de un operón. 47



La zona promotor es el sitio activo donde la ARN polimerasa se une al ADN antes de iniciar la transcripción. La ARN polimerasa en organismos eucariotas tiene estructura compleja, constituida por 9 a 10 subunidades proteinicas, en procariotas existe una sola enzima, la ARN polimerasa ADN dependiente, enzima simple tetramerica, constituida por 4 subunidades polipeptidicas que conforman el núcleo de la enzima a la cual se une otra sub unidad denominada factor sigma cuya función es reconocer al promotor.

El promotor presenta 2 sub regiones: Sub región Priobnow box.- que contiene 6 nucleótidos y se encuentra antes del punto donde se inicia la transcripción. Sub región de Concenso.- que esta constituida por 35 nucleótidos y está sub región también se encuentra antes del punto de inicio de transcripción.

La zona operador se sitúa entre el promotor y el primer gen estructural donde sirve como sitio de enlace para una proteína, denominada represor. El represor es un ejemplo de proteína reguladora de un gen capaz de reconocer una secuencia específica de pares de bases dentro del ADN y enlazarse a dicha secuencia con afinidad elevada. Las proteínas enlazasas al ADN, como los represores bacterianos, desempeñan un papel predominante para determinar si un segmento particular del genoma es transcripcionalmente activo o silencioso. Los genes reguladores son los que codifican las proteínas cuya misión es controlar la actividad de los genes estructurales, estas proteínas se denominan represores. La clave para la expresión del operón estriba en el represor. Cuando el represor se enlaza al operador el promotor queda protegido de la polimerasa y la transcripción de los genes estructurales se interrumpe. Si el represor puede enlazarse o no al operador depende de la forma de dicho represor, la cual a su vez, depende de la presencia o ausencia de un compuesto clave en la vía metabólica (como lactosa, histidina o triptofano). La concentración de esta sustancia metabólica clave determina si el operón es activo o inactivo en cualquier momento dado. La interacción entre estos diferentes elementos se puede evidenciar con el operón lac, el grupo de genes que regula la producción de las enzimas necesarias para metabolizar lactosa en las células bacterianas. Este operón funciona según la denominada inducción enzimática, ya que existen unas moléculas denominadas inductores, que en este caso son las moléculas de lactosa que induce la transcripción de genes estructurales. Cuando la lactosa entra a la célula se une al represor, cambiando la conformación del represor e incapacitándolo para fijarlo al ADN del operador. En este estado, los genes estructurales se transcriben, se sintetizan las enzimas y las moléculas de lactosa se consumen. Así, en un operón inducible, como el operón lac, la proteína represora es capaz de enlazarse al ADN sólo en ausencia del inductor. Conforme disminuye la concentración de lactosa en el medio, el disacárido se separa de su sitio de enlace sobre la molécula represora. La liberación de lactosa permite al represor enlazarse al operador, lo que físicamente bloquea a la ARN polimerasa y le impide alcanzar a los genes estructurales, interrumpiendo la transcripción efectuada por el operón. 48



Operón lac en estado normal.

Operón lac en presencia de lactosa. Existen otros operones que funcionan según la denominada represión enzimática (operón represible). Por ejemplo el operón his de E. coli responsable de la síntesis de histidina. Si al medio se añade histidina, desaparecen todas las enzimas necesarias para dicha síntesis. Este tipo de regulación también se denomina represión por producto final. En ella el represor en estado normal es inactivo es decir el represor no puede enlazarse por si mismo al operador del ADN, pero si aparece otra molécula especifica denominada correpresor, en este caso histidina, el represor se vuelve activo y el complejo represor – correpresor se fija sobre la zona promotor y reprime la síntesis enzimática. CONTROL DE LA BIOSÍNTESIS PROTEICA MEDIANTE AMP CÍCLICO. Además del control de la biosíntesis debido al operón, se han descrito otros tipos de regulación. Entre ellos cabe citar la regulación por el AMP cíclico (AMPc). El nucleótido AMP cíclico impide, por ejemplo, la actuación del represor en el operón lac. Para actuar necesita el concurso de una proteína, denominada proteina activadora del gen catabólico (CAP). El complejo CAP-AMPc tiene una gran afinidad por una zona que hay en el promotor, cerca del gen regulador del operón y a la izquierda del lugar donde se sitúa la ARN polimerasa. Parece ser que actúa aumentando la afinidad entre el ADN y la ARN polimerasa (la presencia de la CAP enlazada provoca un cambio en la conformación del ADN). Según se descubrió durante una de las primeras investigaciones del fenómeno denominado efecto glucosa, cuando se suministra esta sustancia a las células bacterianas y también algunos otros tipos de sustratos, como lactosa o galactosa, las células metabolizan la glucosa e ignoran los otros compuestos. La glucosa en el medio actúa para suprimir la producción de diferentes enzimas catabólicas necesarias para descomponer estos otros sustratos. Se ha comprobado que el nivel del AMP cíclico disminuye en el núcleo cuando es utilizado en la membrana para realizar el transporte activo es decir transporte con consumo de ATP de la glucosa y también por excreción celular. Estos dos mecanismos, al disminuir el nivel del AMP cíclico en el núcleo, ejercen un control sobre el ritmo de la biosíntesis proteica. Puede establecerse así una relación entre la glucosa que entra en la célula y la cantidad de enzimas necesarias para metabolizar la lactosa.

Control mediante AMP cíclico. 49



Control positivo: Se dice que un sistema está bajo control positivo cuando el producto del gen regulador activa la expresión de los genes, actúa como un activador . Control negativo: se dice que un sistema está bajo control negativo cuando el producto del gen regulador reprime o impide la expresión de los genes, actúa como un represor .

AMP cíclico: Síntesis y Degradación. El AMP cíclico tiene estructura cerrada, se encuentra en forma libre en el citoplasma de organismos procarioticos y eucarióticos en forma de AMPc 3’ - 5’. Se sintetiza a partir del ATP sobre el que actúa la adenil ciclasa interviniendo como cofactor el Mg++ provocando la hidrólisis de los dos últimos grupos fosfato del ATP que se liberan.

La adenil ciclasa se encuentra en la superficie interna de la membrana plasmatica donde se activa cuando se presentan hormonas en la superficie externa de la membrana plasmatica y dichas hormonas son reconocidas por sus receptores formando complejos receptor – hormona, sitio donde la adenil ciclasa se activa y actúa sobre el ATP que se encuentra en el citosol y a partir del cual se forma el AMPc, por lo tanto este recibe el mensaje de la hormona (primer mensajero) y por esta razón al AMPc se le denomina segundo mensajero porque es el que transporta el mensaje hasta el núcleo.

50



Cuando se produce la estimulación de hormonas a nivel de superficie externa de la membrana celular, se produce un incremento en la concentración del AMPc en el citosol, pero cuando la hormona deja de actuar con el receptor de membrana, los niveles de concentración de AMPc se encuentran en reposo. Degradación del AMP cíclico. Se produce a partir de las enzimas fosfodiesterasas que la transforman en 5’ AMP, las

fosfodiesterasas están unidas al protoplasma como a la membrana interna, algunas fosfodiesterasas pueden ser reguladas por otros sistemas de hormonas o segundos mensajeros que no actúan mediante AMP cíclico. Funciones del AMP cíclico. El AMPc regula el metabolismo de los carbohidratos, es decir participa en la glucogenolisis, en el hígado la presencia de adrenalina y glucagón induce a la glucogenolisis, ambas hormonas por su acción receptora con las proteínas de membrana estimulan a la adenil ciclasa para elevar la concentración de AMPc dicho aumento produce o causa la degradación del glucogeno, pero el AMPc previamente modifica el metabolismo de algunas proteínas actuando sobre las proteinoquinasas fosforiladas. Las síntesis de glucogeno es afectada por el AMPc en este caso la glucogeno sintetasa participa en la glucogenesis pero la glucogeno sintetasa fosforilada es inactiva para sintetizar glucogeno por consiguiente el AMPc eleva la degradación de glucogeno y se activa la síntesis en el hígado. Este es el mecanismo molecular por el cual la adrenalina que se segrega en momentos de estrés, euforia, depresión, etc. eleva los niveles de glucosa en la sangre y debido a ello se produce la diabetes emotiva. Un aumento de AMPc interviene en la síntesis de esteroides en la corteza suprarenal el AMPc esta involucrado en estados patológicos de la toxina de V ibrio cholerae la que estimula a la adenil ciclasa en el intestino produciendo gran perdida de agua, sales, iones y electrolitos lo que conduce a las diarreas que causan la muerte. También se ha determinado que las células cancerigenas presentan bajos niveles de AMPc y en cultivos in vitro de células cancerigenas al agregarles AMPc dichas células se recuperan en algunas de sus estructuras. El AMPc 2’ 3’ generalmente se encuentra en procariontes, es importante porque re gula el metabolismo de carbohidraos, mientras el AMPc 5’ 3’ se encuentra en eucariontes.

Ca ++ - CALMODULINA: REGULACIÓN DE LAS FUNCIONES CELULARES. El complejo Ca++ - calmodulina está acoplado al sistema AMPc y una de las funciones del complejo Ca++ calmodulina es regular el metabolismo de los carbohidratos en las células, también regula el metabolismo de los nucleótidos cíclicos en el citoplasma celular. El Ca ++ es un ion indispensable en las células de todos los organismos puesto qué cumple diversas funciones entre estas intervienen en la contracción muscular por ende en el corazón y su funcionamiento, interviene en conferirle mayor permeabilidad a la membrana plasmática luego actúa dentro del movimiento de las células, asimismo interviene en los procesos de endocitosis qué realiza la célula, en la coagulación de la sangre, durante la división celular, etc. La concentración de Ca ++ en el citoplasma de las células animales es de 10 -7 molar. A esta concentración las células animales cumplen normalmente sus funciones, mientras qué en los espacios extracelulares, la concentración de Ca++ es de 10 –5 molar.

La CALMODULINA, es una proteína abundante que se encuentra en el citoplasma de todas las células en general. La calmodulina presenta cuatro sitios específicos donde se fija el Ca++ es decir la función que cumple la calmodulina en el citoplasma celular es: Fijar el Ca++ que ingresa a la célula durante esta fijación la calmodulina sufre cambios de conformación, mostrando regiones hidrofóbicas, dichas regiones son suceptibles a que se adhieran drogas como 51



TRIFLUORO PERACINA que inhibe la acción de la calmodulina, asimismo estás regiones se pueden usar para fijar otras proteínas aceptoras como las CALCINEDINAS que fueron descritas recientemente dentro de la biología. UNIDAD DIDACTICA N° 02: MEMBRANA PLASMÁTICA: ORGANIZACIÓN Y FUNCIONAMIENTO MEMBRANA PLASMATICA. La célula tiene una composición diferente a la del medio que la rodea. Por ejemplo, el contenido iónico de nuestras células es muy diferente del que tiene el plasma o el fluido de las matrices extracelulares. Esta diferencia es mantenida durante toda la vida de la célula, en general con un importante gasto de energía, por una delgada membrana superficial: la membrana plasmática o celular , que regula el intercambio de iones y moléculas entre la célula y el medio extracelular. Esta membrana es tan delgada que no puede ser observada con el microscopio óptico, hasta el advenimiento del microscopio electrónico, los científicos no pudieron apreciar adecuadamente la complejidad de la organización celular, entre cuyos componentes se incluye a la membrana plasmática y a un elaborado sistema de membranas internas que desempeñan una multitud de tareas especializadas. Todas estas membranas poseen una composición química y una arquitectura molecular similares, pero no idénticas.

La membrana plasmatica es una barrera de permeabilidad altamente selectiva entre el interior y el exterior de la célula lo qué permite que el espacio intracelular o citoplasma se mantenga en condiciones homeostaticas, asimismo la membrana plasmatica impide el libre intercambio de un lugar a otro pero también proporciona el medio para comunicarse de un espacio con otro. La membrana celular garantiza que las sustancias apropiadas penetren al citoplasma, desde el espacio extracelular y las sustancias inapropiadas salgan de la célula consiguientemente la membrana plasmatica actúa como una barrera selectiva permeable, la permeabilidad selectiva depende de la presencia de canales, bombas selectivas qué a través de estas se mantienen las concentraciones adecuadas de iones, moléculas especificas dentro de la célula, mientras qué los residuos son liberados, expulsadas por las células, la barrera sensible viene a ser la membrana plasmatica qué permite qué la célula reaccione ante su ambiente. FUNCIONES DE LA MEMBRANA PLASMATICA Cumple muchas funciones entre estas: 1.- MECANISMOS DE TRANSPORTE.- Se refiere al transporte de los diversos solutos que ingresan del exterior al interior de la célula o viseversa, entre estos mecanismos de transporte tenemos: - Transporte o difusión simple - Transporte facilitado - Transporte activo - Transporte en masa 2.- RESPUESTAS A SEÑALES EXTERNAS.- La membrana celular cumple funciones importantes en la respuesta de la célula a los estímulos externos, proceso que se conoce con el nombre de transducción de señales, la membrana celular posee receptores específicos de membrana (proteínas especificas) qué se sitúan en la parte externa de la membrana, se comunica con otras macromoléculas denominados ligandos formando complejos receptor – ligando que se encuentran en el medio externo, los ligandos son 52



las hormonas, factores de crecimiento y neurotransmisores estas se unen a los receptores de membrana pero no pueden atravesar la membrana plasmatica por tanto la interacción de ligando con el receptor, provoca que la membrana genere una nueva señal que estimula o inhibe las actividades de la célula ejemplo: las señales generadas en la membrana puede indicar a la célula qué elaboren mas glucógeno o se prepare para la división celular o libere Ca++ de sus reservas internas o posiblemente induce a que las células se suiciden. 3.- INTERACCIÓN CELULAR. Situada en la frontera de la célula viviente, la membrana plasmatica media las interacciones qué ocurren entre células de un organismo multicelular, la membrana también permite a las células, reconocerce entre si, adherirse cuando es apropiado e intercambiar materiales e información cuando las células lo requieren. Organización molecular de la membrana celular. En 1855 Naegeli denominó ”membrana plasmática” a un a película invisible que envolvía a las células y seria la responsable de los fenómenos osmóticos que observo en células vivas. Como las moléculas liposolubles penetran con facilidad a través de la membrana plasmática, en 1902 Overton sostuvo que la membrana plasmática estaría compuesta probablemente por una delgada capa de lípidos, cuyo espesor seria muy inferior al límite de resolución del microscopio óptico. En 1925, Corter y Grendell propusieron la existencia de una bicapa fosfolipídica al observar que la cantidad de fosfolípidos de la membrana de los eritrocitos era suficiente para formar una doble capa de moléculas sobre toda la superficie celular. Estas teorías también fueron alentadas por mediciones eléctricas que indicaron una alta impedancia a nivel de la membrana plasmática, y por la dificultad que tienen los iones para penetrar una capa lipídica. Asimismo, se obtuvo información indirecta sobre la estructura molecular de la membrana, indicativa de que también existirían proteínas en ella, a partir del estudio de la tensión superficial de diferentes células. Esta es mucho mas baja que a nivel de una interfase agua-aceite pura, y es comparable a la obtenida cuando se agrega una pequeña cantidad de proteína a un sistema lípido-agua. Para explicar estas propiedades, en 1935 Danielli y Davson postularon que la membrana plasmática contenía una bicapa lipídica con proteínas formando capas continuas sobre ambas superficies. Esta modelo, aunque incorrecto, pareció confirmarse inicialmente mediante el estudio de sistemas lipídicos artificiales, y años mas tarde por la observación con el microscopio electrónico, que mostró por primera vez que todas las células están rodeadas por una membrana plasmática de 6 a 10 nm de espesor. La estructura se repite en todas las membranas biológicas y esta constituida por una capa central clara de aproximadamente 3,5 nm, flanqueada a ambos lados por dos capas densas de unos 2 nm.

Sobre la base de estas observacio nes, en 1959 Robertson propuso el modelo que él denominó “unidad de membrana”, interpretando la imagen microscópica según el modelo de Danielli -Davson, por lo cual se pensó que las líneas densas corresponderían a las supuestas capas proteicas continuas que se creía que estaban adosadas a los lípidos de la bicapa central. Ahora sabemos que esas líneas densas resultan principalmente del deposito de osmio (utilizado como fijador y colorante electrónico) sobre los extremos polares de los fosfolípidos. A principio de la década del sesenta, el método de la congelaciónfractura y replica utilizado en microscopia electrónica hizo accesible el estudio morfológico del interior de la membrana y llevo a una interpretación completamente diferente de su estructura. Ya que evidenció la existencia de numerosos glóbulos proteicos dentro del plano de la membrana. 53



Modelo del Mosaico fluido: Arquitectura y organización molecular. En 1972, Singer y Nicholson propusieron el “Modelo del Mosaico Fluido” , que ha sido firmemente reconocido como la estructura básica de la totalidad de las membranas, según el modelo la membrana está constituida por una doble capa de fosfolípidos, en la cual hay proteínas asociadas; las que se encuentran insertadas en la bicapa se llaman integrales o intrínsecas y las que se ubican en la superficie externa o interna de la membrana plasmatica se llaman perifericas o extrínsecas. Esto da a la membrana plasmatica el aspecto de un mosaico.

Las proteínas especializadas cumplen con la mayor parte de las funciones específicas de las membranas, pero la unidad estructural fundamental de toda la membrana biológica es la bicapa lipídica, a la que debe su integridad. Tanto los lípidos como las proteínas presentan considerables desplazamientos en el plano estructural de la membrana lo que determina su propiedad clave de fluidez . Una de las características importantes de la organización molecular de las membranas es la asimetría de todos sus componentes químicos, lo que significa que en ambas mitades de la bicapa los componentes se distribuyen de manera dispar, esta asimetría es aún más evidente por el hecho de que las cadenas de oligosacaridos hacen su presencia solo hacia la superficie extraceluar de la membrana plasmática, o hacia el interior del compartimiento de cisternas, vacuolas o vesículas en el caso de las membranas internas. Composición química las membranas. Para estudiar la composición molecular de la membrana celular, el primer paso consiste en su aislamiento del resto del citoplasma en la forma más pura que sea posible. Luego, la membrana aislada se puede estudiar por métodos bioquímicos y biofísicos. Se han empleado diferentes métodos para aislar membranas plasmáticas de una gran variedad de células, aunque estas preparaciones suelen estar contaminadas con membranas de organoides citoplasmáticos. Por esta razón una buena parte de los estudios sobre membranas fueron efectuados con las de los eritrocitos, ya que este tipo celular, al carecer de organoides brinda membranas plasmáticas con alto grado de pureza. Todas las membranas biológicas, independientemente de su origen, están constituidas por lípidos y por proteínas . La mayor parte de ellas también poseen carbohidratos unidos a las proteínas y a los lípidos. Las proporciones en que están presentes estos tres componentes en los diversos tipos de membranas varían enormemente. Los carbohidratos en general representan menos del 10% del total de la masa de la membrana, y aun pueden estar ausentes, como en las membranas mitocondriales internas. En lo que atañe a la relación lípidos/proteínas, en ciertas membranas cerca de las tres cuartas partes del peso están compuestas por estas últimas, mientras que en la mielina, que esta formada por las membranas plasmáticas superpuestas de células neurogliales, casi el 80% son lípidos. En la membrana del eritrocito humano las proteínas constituyen el 52% de su masa, los lípidos el 40% y los hidratos de carbono el 8%. Estos últimos están representados por oligosacáridos unidos a proteínas y a lípidos con los que forman glucoproteínas y glucolípidos, respectivamente.

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Lípidos de la membrana La composición lipídica varía ampliamente entre las diversas clases de membranas. Los principales son los fosfolípidos, de diferentes tipos, aunque la mayor parte de las membranas posee también colesterol , especialmente en el caso de la membrana plasmática, donde puede representar una cuarta parte o mas del total lipidico. Fosfolípidos. Son moléculas anfipáticas. Anfipático es un termino de origen griego que significa doble sensibilidad, y este caso se aplica al doble carácter que presentan estas moléculas, por un lado hidrofílicas (polares o afines al agua) y por el otro hidrofóbicas (no polares o que repelen el agua). Poseen una denominada “cabeza polar” y dos cadenas hidrofóbicas hidrocar bonadas, generalmente representadas por dos ácidos grasos de longitud variable. Debido a la naturaleza anfipática de los fosfolípidos, en un medio acuoso estos tienden espontáneamente a agruparse formando micelas o bicapas similares a las celulares.

En los fosfolípidos, el glicerol esta conectado por un grupo fosfato con una de varias moléculas hidrofílicas pequeñas (los grupos polares) y con dos ácidos grasos virtualmente en todos los casos. Estos últimos poseen un número par de átomos de carbono que varia comúnmente entre los 16 y los 22, la viscosidad de la bicapa será mayor cuantas mas largas sean las cadenas hidrocarbonadas. Otro factor importante que afecta la fluidez es la existencia de dobles ligaduras en las cadenas, ya que los carbonos no saturados imparten una desviación a la cadena que impide que las moléculas se adosen estrechamente y aumenten su viscosidad. Por lo general, en los fosfolípidos de las membranas uno de los ácidos grasos es saturado y el otro no lo es. La principal diferencia entre los distintos fosfolípidos depende del grupo polar o cabeza hidrofílica. Los más comunes son la etanolamina, la colina y la serina, que forman parte de la cefalina, la lecitina y la fosfatidilserina, respectivamente. La esfingomielina posee colina, pero su alcohol no es el glicerol sino la esfingosina (un aminoalcohol).

A pH neutro los grupos polares de los fosfolípidos no poseen carga eléctrica, con la excepción principal de la fosfatidilserina, que tiene carga negativa. Otros fosfolípidos menos abundantes, como los fosfoinosítoles, la cardiolipina, el fosfatidilglicerol y los sulfolipidos, también poseen carga negativa, y en su conjunto se denominan fosfolípidos ácidos, a diferencia de los fosfolípidos neutros o no cargados que son la mayor parte. Otros aun más raros pueden poseer carga positiva. Los diferentes tipos de grupos polares y de ácidos grasos constituyentes determinan la existencia de más de cien tipos diferentes de fosfolípidos en las membranas. Estos no se distribuyen por igual entre ambas hojas de la bicapa, ya que la fosfatidiletanolamina y los fosfolípidos ácidos (cargados negativamente) tienden a ubicarse en la hoja de las membranas en contacto con el citosol, con un intercambio de lípidos prácticamente nulo a través de ambas hojas. La presencia de estos lípidos cargados en el lado citosólico es de fundamental importancia para comprender los fenómenos de fusion de membranas que ocurren, por ejemplo, en los procesos de exocitosis y endocitosis. Como veremos mas adelante, el cation calcio desempeña un papel fundamental 55



en estos procesos, y provoca entre otros fenómenos que estos fosfolípidos cargados negativamente se separen de los demas y se agrupen en regiones en fase de gel, mientras que el resto de la membrana queda muy fluida, enriquecida de fosfolípidos neutros y positivos. Colesterol. La mayor parte de las membranas biológicas de los eucariotas posee colesterol como componente importante. En particular, la membrana plasmática animal tiene tantas moléculas de colesterol como de fosfolípidos, entre las cuales se intercalan. En la mayor parte de los procariotas el colesterol esta ausente, y el bajo contenido de este esteroide en las membranas mitocondriales (de alrededor del 4%) tal vez refleje el origen procariótico postulado para las mitocondrias.

Este esteroide anfipático posee una pequeña cabeza polar (el oxidrilo del carbono 3) dirigida hacia la superficie acuosa, mientras que el resto de la molécula es hidrofóbico y permanece confinado en el interior de la bicapa. El anillo esteroideo interactúa con la porción inicial de las cadenas de los ácidos grasos, a los que inmoviliza parcialmente. Esto produce dos importantes efectos: por un lado se incrementa la impermeabilidad de la bicapa a las moléculas hidrofílicas, y por otro decrece la flexibilidad y fluidez de la membrana a la temperatura central del organismo de 37ºC. Pero ante eventuales disminuciones de la temperatura, la presencia de colesterol previene la transición de fase de cristal líquido a gel, como ocurriría si la bicapa fuera enteramente fosfolipídica. En resumen, el colesterol aumenta la impermeabilidad de la capa bilipídica, aumenta su viscosidad a 37ºC y mantiene la fluidez ante una disminución de la temperatura.

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Proteínas de la membrana. Según el tipo de célula y el organelo particular del interior de dicha célula, una membrana puede contener desde una docena hasta más de 50 proteínas diferentes. Las proteínas representan el componente funcional fundamental de las membranas biológicas. Desempeñan un importante papel no sólo en la estructura de la membrana, sino también en su permeabilidad , ya sea como canales o como transportadores. Entre las proteínas de membrana también se encuentran gran número de enzimas, de receptores para diversas señales, para la adhesión celular y para una variedad de funciones especificas. Cada clase de membrana, según su localización en la célula y el tipo celular, posee una dotación proteica específica. Así, la membrana plasmática de una neurona, de un fibroblasto o de un eritrocito ostentan sustanciales diferencias. Aún más marcadas son las diferencias entre el componente proteico de las membranas plasmáticas y el de las membranas internas, como por ejemplo las mitocondriales o las de los discos fotorreceptores de la retina. Distribución de las proteínas en la membrana plasmatica . Las proteínas no se disponen al azar dentro de la membrana, sino que cada una se localiza y orienta en una posición particular respecto de la bicapa de lípidos. Es digno de notar que todas las proteínas de la membrana se sitúan asimétricamente de modo que las propiedades de la porción externa de la membrana son muy diferentes a las de la porción interna. Como resultado de esta "lateralidad" de la membrana, las proteínas de partes de la membrana que interactúan con otras células o con ligandos extracelulares, como hormonas o factores de crecimiento, se enfrentan al exterior, en tanto que las proteínas de las partes de la membrana que interactúan con moléculas citoplásmicas, como proteínas G o proteincinasas, enfrentan el interior de la célula. Las proteínas de la membrana se pueden agrupar en tres tipos distintos según la intimidad de su relación con la bicapa de lípidos, estos grupos son: Proteínas integrales o intrínsecas. Las proteínas integrales son en su

mayoría transmembranosas , vale decir que parte de su molécula permanece confinada en el espesor de la bicapa lipídica, con dos dominios que se proyectan por lo general hacia ambas superficies. Casi invariablemente, las proteínas transmembranosas son glucoproteínas.

En algunos casos las proteínas integrales no son transmembranosas, pero están unidas de forma covalente a los lípidos de membrana del lado citosólico o del extracelular, en especial al glucosil fosfatidil inositol o a grupos isoprenoides. Las proteínas integrales, que representan más del 70 % del total, permanecen tenazmente ancladas a la bicapa tanto durante su vida en la célula como cuando se intenta aislarlas para su estudio; para obtenerlas se requieren tratamientos enérgicos como la aplicación de detergentes o solventes orgánicos que destruyen la integridad de la membrana.

En ocasiones, la acción de algunas fosfolipasas celulares puede desprender de sus enlaces lipídicos a ciertas proteínas integrales no transmembranosas, las que podrían así quedar libres en el citosol. Este hecho llevó a algunos investigadores a considerar como proteínas intrínsecas solamente a las transmembranosas, pese a existir numerosos ejemplos (como el caso de la proteína ras) de anclajes sumamente estables. Para comprender mejor el modo en que las proteínas transmembranosas se mantienen insertadas en el espesor de la membrana, se debe recordar que como resultado del plegamiento proteico, en las 57



proteínas extrínsecas (que son hidrosolubles) los aminoácidos hidrofílicos quedan expuestos a la superficie de la molécula, en contacto con el medio acuoso extracelular o con el del citosol, mientras que los hidrofóbicos permanecen ocultos en el interior del plegamiento. En las proteínas transmembranosas, por el contrario, los aminoácidos hidrofóbicos están más expuestos en la superficie de la molécula, por lo que deben permanecer en el interior de la bicapa fosfolipídica, donde las interacciones hidrofóbicas con los ácidos grasos los mantienen en su sitio, mientras que sólo las partes hidrofílicas asoman al medio acuoso de ambas superficies de la membrana.

Por poseer dominios hidrofóbicos e hidrofílicos se considera que estas proteínas son moléculas anfipáticas. Existen proteínas transmembranosas de paso único y de paso múltiple; en este último caso la cadena polipeptídica cruza la bicapa varias veces. Además, las proteínas transmembranosas pueden desarrollar enlaces iónicos con las cabezas polares de los fosfolípidos y quizás ambos mecanismos contribuyan a la estabilidad de su posición. Las proteínas integrales se pueden clasificar de la siguiente manera: 1. Proteínas monotópicas integradas a la bicapa de lipidos y expuestas en una sola superficie de la membrana. Estas proteínas son raras, si en realidad existen. Se cree que el citocromo b 5 una proteína de las membranas citoplásmicas, es una proteína monotípica, pero no hay acuer do unánime.

2. Proteínas bitópicas que poseen un segmento dentro de la membrana y por lo tanto la atraviesan una

sola vez y están expuestas en ambos lados de la membrana. Esta clase incluye gran variedad de receptores de la membrana plasmática que enlazan diferentes ligandos en su superficie externa (por ejm., un factor de crecimiento, un péptido hormona o un antigeno) y transmiten un mensaje a través de la membrana hacia el citoplasma por medio del segmento que atraviesa dicha membrana.

3. Proteínas politópicas que

poseen más de un segmento dentro de la membrana y por lo tanto se entrelazan avanzando y retrocediendo a lo largo de la membrana. Esta clase incluye las proteínas que forman canales para el paso de iones y solutos a través de la membrana plasmática y también proteínas con otras funciones (por ejm., el receptor para la partícula señal del receptor del retículo endoplásmico, el receptor adrenérgico que se enlaza a la epinefrina, el pigmento fotosensible de los bastoncillos de la retina, y los polipéptidos M y L del centro de reacción fotosintética de las bacterias. 58



Proteínas periféricas o extrínsecas.

Estas no penetran en el interior hidrofóbico de la bicapa lipídica (no son transmembranosas) y se asocian con la membrana mediante interacciones débiles, del tipo de las uniones iónicas u otras (enlaces electrostáticos), tanto con las proteínas integrales como con las cabezas hidrofílicas de los fosfolípidos, del lado citosólico o del extracelular. Cumplen con sus funciones en la membrana o cerca de ésta, y algunas pueden disociarse de la membrana en ciertas condiciones de la actividad celular. Esto se refleja en que para su aislamiento bioquímico son fácilmente separables con procedimientos suaves, como soluciones salinas concentradas, pH elevado o agentes quelantes de cationes bivalentes. Las proteínas periféricas de ordinario se solubilizan mediante extracción con soluciones acuosas salinas concentradas o pH alcalino. En realidad, la distinción entre proteínas integrales y periféricas es incierta, porque muchas proteínas de membrana contienen varios polipéptidos, algunos de los cuales penetran en la bicapa de lípidos y otros permanecen en la periferia.

Las proteínas periféricas mejor estudiadas (principalmente de la familia espectrina) se localizan en la superficie interna de la membrana plasmática. Estas proteínas forman una red fibrilar que actúa como "esqueleto" flexible para suministrar apoyo mecánico a la membrana cuando se producen cambios rápidos en la morfología celular y también para fijar las proteínas integrales de la membrana. Otras proteínas periféricas sobre la superficie interna de la membrana funcionan como enzimas o factores transmisores de señales a través de la membrana. La superficie extracelular de la membrana plasmática también puede contener proteínas periféricas, pero estas proteínas están menos bien definidas. Proteínas de membrana ancladas a lípidos .

Se distinguen dos tipos de proteínas de membrana ancladas a lípidos, según los tipos de anclaje al lípido y la superficie de la membrana sobre la cual están expuestos. Varias proteínas presentes en la cara externa de la membrana plasmática se enlazan a ésta mediante un oligosacárido corto unido a una molécula de glucofosfatidilinositol (GFI) integrada a la hoja externa de la bicapa de lípidos, la presencia de estas proteínas ancladas al GFI fue descubierta cuando se demostró que ciertas proteínas de la membrana podían liberarse mediante una fosfolipasa que reconocía y rompía específicamente a los fosfolípidos que contienen inositol.

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Otro grupo de proteínas presentes en el lado citoplásmico de la membrana plasmática se encuentra anclado a la membrana mediante largas cadenas de hidrocarburos integradas a la hoja interna de la bicapa de lípidos. Al menos dos proteínas relacionadas en esta forma con la membrana plasmática (Src y Ras) han sido implicadas en la transformación de células normales a estados malignos. Asimetría de las proteínas . Cada

tipo de proteína de membrana posee una determinada orientación en dicha estructura. Esta asimetría otorga características diferentes a ambas superficies de las membranas. El caso más evidente tal vez lo constituyan las glucoproteínas; en la inmensa mayoría de éstas, los oligosacáridos están orientados hacia el medio extracelular (o hacia su equivalente topológico, que como ya vimos lo constituye el interior del sistema de endomembranas). Existen unas pocas excepciones, como ciertas glucoproteínas de los complejos de poros nucleares, cuyos glúcidos se proyectan hacia la superficie citosólica. Es importante tener en cuenta que las proteínas, si bien pueden rotar sobre su eje y moverse lateralmente, no cambian de posición dentro de la bicapa, vale decir que no pueden volverse de modo que el dominio externo pueda pasar a ser citosólico, y viceversa. En las membranas plasmáticas se han descrito decenas de enzimas, para cada una de ellas su sitio activo reside constantemente en una determinada cara de la membrana. Por ejemplo, en la cara extracelular se halla la actividad de acetilcolinesterasa, la disacaridasa en los enterocitos, y los sitios de unión al potasio y al digitálico para el caso de la bomba de sodio-potasio. En la superficie membranosa citosólica se puede encontrar el dominio ATPásico de la bomba de sodio-potasio, la adenilato ciclasa y la actividad quinásica de los receptores transmembranosos, entre otros muchos ejemplos. Para el caso de las proteínas de las membranas internas, tales como la glucosa 6-fosfatasa del retículo endoplasmático, la ATP sintetasa de la mitocondria o la bomba protónica de los endosomas, la orientación asimétrica también es un requerimiento absoluto. Carbohidratos de la membrana. Los hidratos de carbono de las membranas biológicas se presentan en forma de oligosacáridos, o menos frecuentemente de monosacáridos, unidos en forma covalente a lípidos (glucolípidos) o a proteínas (glucoproteínas) de membrana. En ambas moléculas el compuesto hidrocarbonado es semejante o idéntico. Otros componentes glucídicos de las membranas celulares son los glucosaminoglucanos (GAGs) unidos a las proteínas (proteoglucanos). Los GAGs son polímeros lineales de subunidades de disacáridos, de los cuales uno por lo menos es un aminosacárido. Los distintos disacáridos determinan la existencia de diversos tipos de GAGs, algunos de los cuales son ácidos o sulfatados. Contribuyendo significativamente a la asimetría de las membranas, los glúcidos se ubican casi en forma exclusiva en la hoja superficial de la membrana plasmática y en su equivalente topológico, que es la monocapa interior del sistema de endomembranas. La abundancia de glucolípidos es, con todo, mucho mayor en la membrana plasmática que en los componentes endomembranosos, y lo mismo puede decirse para las glucoproteínas. Los proteoglucanos son casi exclusivos de las membranas plasmáticas.

La mayor parte de los glucolípidos de las células animales, o glucoesfingolípidos, poseen dos cadenas hidrofóbicas; una de ácido graso y la otra de esfingosina. Como en el caso de la esfingomielina, la 60



molécula resultante se denomina ceramida. Esta permanece confinada en el interior hidrofóbico de la hoja externa de la bicapa y hacia el exterior hidrofílico se ubica un componente glucídico variable, unido covalentemente a la esfingosina. Tanto la ceramida como los carbohidratos presentan gran variedad estructural, en especial estos últimos. En las cerebrósidos, que son los glucolípidos más simples, el glúcido puede ser un solo monosacárido como la glucosa o la galactosa, pero en forma característica los glucolípidos poseen una enorme variedad de oligosacáridos que difieren en longitud, ramificaciones, clases de monosacáridos y tipos de uniones entre éstos. En el caso de los glangliósidos, que son los glucolípidos más complejos, uno de los componentes constantes de los oligosacáridos que se proyectan hacia el espacio extracelular es el ácido siálico o N-acetilneuramínico (NANA), lo que imparte a la cubierta celular de la que forman parte una carga negativa que tiende a atraer cationes del medio hacia la superficie de la membrana. Fluidez de la membrana. El estado físico de los lípidos de una membrana puede describirse por su fluidez (o viscosidad). Igual que muchas otras sustancias, los lípidos pueden existir en fase sólida cristalina o en fase liquida de viscosidad variable, según la temperatura. Por ejemplo, consideremos una sencilla bicapa artificial hecha de fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina cuyos ácidos grasos son principalmente insaturados. Si la temperatura de la bicapa se mantiene relativamente alta (por ejm. 37°C), el lípido existe en estado relativamente fluido, semejante al líquido , A esta temperatura, la bicapa de lípido se describe mejor como un cristal líquido bidimensional. Igual que en un cristal, las moléculas aún mantienen una orientación especifica; en este caso, los ejes longitudinales de las moléculas permanecen prácticamente paralelos entre sí, pero los fosfolípidos individuales son capaces de girar o desplazarse lateralmente en el plano de la bicapa. Si la temperatura disminuye lentamente, se alcanza un punto donde ocurre un cambio distintivo en la naturaleza de la bicapa . El lípido pasa de su estado normal semejante a líquido a un gel cristalino “con gelado" donde el movimiento de los fosfolípidos está muy restringido. La temperatura a la cual ocurre este cambio se denomina temperatura de transición. La temperatura de transición de una bicapa particular depende de los lípidos particulares que la constituyen. El determinante de mayor importancia es el grado de insaturación de las cadenas ácidas acilo de los fosfolípidos, o sea, el contenido en dobles enlaces (específicamente enlaces cis). La temperatura de transición y la fluidez son determinadas por la capacidad de la molécula para compactarse. Aunque los ácidos grasos saturados tienen forma de barras rectas y los ácidos grasos cis insaturados presentan incurvaciones en la cadena donde se localizan los dobles enlaces, los fosfolípidos con cadenas saturadas pueden compactarse más firmemente que los que contienen cadenas insaturadas. Cuanto mayor sea el grado de insaturación de los ácidos grasos de la bicapa, menor será la temperatura necesaria para que la bicapa pase al estado de gel. El límite dentro del cual los diferentes lípidos cambian de fase es muy amplio. Por ejemplo, se pueden sintetizar varias fosfatidilcolinas y emplearlas para formar bicapas cuya temperatura de transición varía desde temperaturas menores de 0ºC hasta mayores de 60°C. Las moléculas de colesterol alineadas con las cadenas lípidas acilo de los fosfolípidos de la bicapa afectan la fluidez de la membrana al alterar la manera de comportarse de las cadenas de hidrocarburos. Como resultado, el colesterol tiende a evitar temperaturas de transición brusca, y también puede incrementar la estabilidad y disminuir la permeabilidad de la membrana. Importancia de la fluidez de la membrana.

¿Qué papel representa el estado físico de la bicapa de lípidos en las propiedades biológicas de la membrana? Al parecer, la fluidez de la membrana corresponde a un compromiso perfecto entre estructura rígida ordenada sin posibilidad de movimientos y líquido no viscoso totalmente fluido en el cual los componentes de la membrana no pueden mantener una orientación determinada y carecen de oportunidad para organizarse y suministrar apoyo mecánico. La fluidez es importante porque permiten que ocurran interacciones dentro de la membrana. Por ejemplo, gracias a la fluidez de la membrana algunas proteínas se ensamblan en un sitio particular de la membrana y forman estructuras especializadas como uniones intercelulares, compuestos que captan luz y sinapsis. La transferencia de señales a través de la membrana plasmática requiere de la interacción de receptores transmembrana que se unen a ligandos sobre la superficie externa de la membrana y estimulan enzimas situadas en la 61



superficie interna de la misma. Debido a la fluidez de la membrana, las moléculas que interactúan pueden reunirse, efectuar la acción necesaria y separarse. La fluidez también tiene relación con el ensamblado de la membrana. Las membranas solo se originan a partir de las membranas preexistentes y crecen mediante un proceso que añade componentes lipídicos y proteínas a la matriz líquida de una hoja membranosa. Muchos de los procesos celulares más básicos, incluyendo movimiento celular, crecimiento de la célula y división de la misma, formación de uniones intercelulares, secreción y endocitosis, depende de los componentes de la membrana y tal vez no serían posibles si la membrana fuera una estructura rígida no fluida. ASIMETRÍA DE LOS LÍPIDOS DE LA MEMBRANA La bicapa de lípidos consta de dos hojas distintas y no hay razón para suponer que la composición de los lípidos en ambas mitades deba ser idéntica. De hecho hay numerosas pruebas que indican que los lípidos de la membrana plasmática se distribuyen en un patrón muy asimétrico. Una serie de experimentos que han conducido a esta conclusión tiene la ventaja de que las enzimas que digieren lípidos no penetran la membrana plasmática y, por consiguiente, solo digieren los lípidos que residen a la hoja externa de la bicapa. Si se somete a un eritrocito humano a la acción de una fosfolipasa que hidroliza fosfogliceridos, casi 70 % de la fosfatidilcolina de la membrana se libera en el medio, pero sólo se libera 20 % de la fosfatidiletanolamina de la membrana y menos de 10 %º de la fosfatidilserina de dicha membrana. Estos datos indican que, en comparación con la hoja interna, la capa externa posee una concentración desproporcionadamente alta de fosfatidilcolina (y de esfingomielina) y una baja concentración de fosfatidiletanolamina y de fosfatidilserina. De esto se deduce que la bicapa de lípidos puede imaginarse como estructura compuesta de dos monocapas independientes, más o menos estables, con diferentes propiedades físicas y químicas.

Dada la asimetría de los fosfolípidos, surge la pregunta ¿hasta que grado hay intercambio de fosfolípidos a través de la bicapa? Mediciones de diferentes tipos de fosfolípidos marcados indican que la vida media de una molécula de fosfolípidos que permanece fija dentro de una capa, en oposición a la que se mueve a través de la otra capa, se mide en horas o días . En contraste, un fosfolípido puede desplazarse lateralmente dentro de la misma capa con bastante facilidad. Se estima que un fosfolípido puede difundir de un extremo al otro de una bacteria en uno o dos segundos. Por lo tanto, de todos los posibles movimientos que puede efectuar un fosfolípido, el paso desde un lado al otro de la membrana es el más restringido.

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Este dato no es sorprendente, pues para que eso ocurra, el grupo de la cabeza hidrófila del lípido tendría que pasar a través de la capa hidrófoba interna de la membrana, lo cual es termodinámicamente desfavorable. Sin embargo, hay células que contienen enzimas, llamadas Flipasas, que mueven activamente ciertos fosfolípidos desde una capa de la membrana hasta la otra. Estas enzimas pueden participar en el establecimiento de la asimetría de los lípidos y también revertir la velocidad de los lentos movimientos pasivos que ocurren a través de la membrana. NATURALEZA DINÁMICA DE LA MEMBRANA PLASMÁTICA A partir del análisis previo se deduce que la bicapa de lípidos puede existir en un estado relativamente fluido. La movilidad de las moléculas individuales de lípidos dentro de la membrana de la bicapa plasmática puede observarse directamente uniendo partículas doradas a las cabezas polares de los lípidos y siguiendo el movimiento de dichas partículas con el microscopio. Puesto que los lípidos constituyen la matriz en la cual están embebidas las proteínas integrales de las membranas, el estado físico de estos lípidos también es un importante factor determinante de la movilidad de dichas proteínas integrales. La demostración de que las proteínas integrales puedan moverse dentro de la membrana plasmática fue una de las piedras angulares para formular el modelo de mosaico fluido. Las propiedades dinámicas de las proteínas de la membrana se revelan de diferentes maneras. DIFUSIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE LA MEMBRANA LUEGO DE LA FUSIÓN CELULAR La fusión celular es una técnica para unir dos células de diferentes tipos o célula de dos especies distintas y producir una célula con un citoplasma común y una sola membrana plasmática continua. La fusión se logra haciendo “pegajosa” la superficie externa de las células, de m odo que sus membranas plasmáticas se adhieran entre sí. La fusión celular se puede inducir añadiendo ciertos virus inactivados que se une a la superficie de la membrana o agregando el compuesto polietilenoglicol. La fusión de las células ha desempeñado un importante papel en biología celular y en la actualidad es parte de la técnica para preparar anticuerpos específicos. En los primeros experimentos para demostrar que las proteínas de la membrana tenían capacidad de movimiento en el plano de la membrana se empleó la fusión celular, y fueron publicados en 1970 por L.D. Frye y Michael Edidin, de la Universidad Johns Hopkins. En estos experimentos se fusionaron células de ratón y de humanos, y luego se observo la localización de proteínas específicas de la membrana plasmática una vez que las dos membranas se volvieron continuas. Para seguir la distribución de las proteínas de la membrana, de ratón o humanos, en diferentes momentos después de la fusión se prepararon anticuerpos contra uno u otro tipo de proteínas y se unieron mediante enlaces covalentes a colorantes fluorescentes. Los anticuerpos contra proteínas de ratón formaron complejos con un colorante que produce fluorescencia verde y los anticuerpos contra proteínas humanas con uno que produce fluorescencia roja. Cuando se añadieron los anticuerpos a las células fusionadas se enlazaron a las proteínas humanas o de ratón y pudo determinarse su localización bajo microscopio de fluorescencia. En el momento de la fusión, la membrana plasmática podía considerarse mitad humana y mitad ratón; o sea, las dos proteínas permanecieron separadas en su propio hemisferio. Después de la fusión, conforme transcurrió el tiempo, se observó que las proteínas de la membrana se desplazan lateralmente dentro de la misma hacia el hemisferio opuesto. Unos 40 minutos después, las proteínas de cada especie estaban distribuidas uniformemente alrededor de toda la membrana celular híbrida. Cuando se efectúa el mismo experimento a temperatura más baja, la viscosidad de la bicapa de lípidos aumenta y la movilidad de las proteínas de la membrana disminuye.

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Restricciones al movimiento de las proteínas de membrana. La fusión celular mostró por primera vez las características dinámicas de las proteínas integradas a la membrana, pero hay otras técnicas más adecuadas para medir la extensión y velocidad de los movimientos de las proteínas. Las técnicas empleadas comúnmente son recuperación de la fluorescencia después de fotoblanqueamiento (RFDF) y seguimiento de particula única (SPU). La rapidez de difusión de las proteínas dentro de una membrana depende de varios factores, incluyendo viscosidad de la matriz lipida a través de la cual debe desplazarse la proteína; cuanto más fluida la bicapa, mayor la movilidad. Otro factor es la masa de la proteína; a mayor peso molecular de la proteína menor será la velocidad de difusión. Si la movilidad de la proteína dependiera estrictamente de estos parámetros físicos: viscosidad del lipido y tamaño de la particula, podría esperarse que las proteínas se desplazaran con coeficientes de difusión cercanos a 10 –9 cm/segundo (en comparación con casi 10 –8 cm/segundo para las moléculas de lípidos más pequeñas y más moviles de la bicapa). Sin embargo, cuando se estudian los movimientos de las proteínas en una membrana natural mediante técnicas RFDF y otras, de ordinario se observa que se mueven con mayor lentitud que la pronosticada antes. Los coeficientes de difusión tipicos para las proteínas de la membrana varian de 10 –10 a 10 –12 cm/segundo, según la especie de proteína y la membrana. En realidad, cierto porcentaje de las moléculas de la proteína parecen estar completamente inmóviles e incapaces de difusión alguna. Control de la movilidad de la membrana.

Es evidente que las proteínas de la membrana no son totalmen te libres para moverse al azar en el “mar” lípido, sino que están sujetas a influencias “restrictivas” que inhiben su movilidad. Algo de la restricción

puede ser resultado de interacciones en la propia membrana. Por ejemplo, muchas proteínas integrales existen como complejos oligoméricos, cuyo peso molecular puede ser muy grande, y en consecuencia su coeficiente de difusión pequeño. Otras veces, las proteínas integrales se unen a materiales presentes en la superficie interna o la externa de la membrana. Las membranas plasmáticas de muchas células poseen una cadena fibrilar o “esqueleto” de proteínas periféricas situado en su superficie interna. Cierta proporción de las proteínas integrales de la membrana parecen estar fijas e inmovilizadas en el esqueleto de la membrana. Aún si las proteínas integrales no estuviesen firmemente ancladas, las proteínas periféricas de la membrana pueden formar vallas alrededor de ciertas partes de la membrana y establecer dominios que restringen la distancia que puede recorrer una proteína. Al seguir la movilidad de proteínas individuales se observa la presencia de estas barreras. Los dominios de membrana pueden mantener combinaciones específicas de proteínas en estrecha proximidad, lo suficiente para facilitar su interacción. La movilidad de las proteínas integrales también puede ser restringida por materiales presentes en la superficie externa de la membrana. Esto se demuestra con mayor claridad en experimentos con células que poseen genes que codifican proteínas de membrana alteradas. Por ejemplo, si mediante manipulaciones se introduce a la célula un gen que codifica un polipéptido transmembrana que carece de la porción que normalmente se proyecta fuera de la membrana, la velocidad de difusión lateral de la proteína mutante puede ser mucho mayor que su contraparte normal. Este resultado sugiere que el movimiento de una proteína transmembrana a través de la bicapa puede ser más lento por la presencia de materiales extracelulares que se enredan en la porción más externa de la proteína. 64



Dominios de membrana y polaridad celular.

Incluso entre membranas que se caracterizan por difusión lateral extensa, hay muchos ejemplos en los cuales se mantiene una organización o disposición particular de las proteínas de membrana. Las diferencias topográficas son particularmente evidentes en células de tejidos organizados, donde las diferentes superficies celulares tienen funciones distintas. Por ejemplo, las células epiteliales que revisten la pared intestinal o constituyen los microscópicos túbulos del riñón son células muy polarizadas cuyas diferentes superficies efectúan distintas funciones. Así, la membrana plasmática apical, que absorbe selectivamente sustancias de la luz del túbulo, posee enzimas diferentes en comparación con la membrana plasmática de la superficie lateral, que interactúa con células epiteliales vecinas o de la superficie basal que se adhiere a un sustrato extracelular subyacente (membrana basal) y cuya función es intercambiar sustancias con el torrente torrente sanguíneo.

En otros ejemplos, los receptores para neurotransmisores se concentran en regiones de la membrana plasmática localizadas entre las sinapsis y los receptores para lipoproteínas de baja densidad se concentran en placas placas de la membrana plasmática plasmática especializa para facilitar su penetración al interior. De los diferentes tipos de células de mamífero, los espermatozoides tienen la estructura más altamente diferenciada. Un espermatozoide maduro se puede dividir en cabeza, cuerpo o pieza central y cola, cada uno con su propia función especializada. Aunque dividido en varias partes distintas, el espermatozoide está cubierto por una membrana plasmática continua que, según han revelado numerosas técnicas, consta de un mosaico de diferentes tipos de dominios localizados. Por ejemplo, cuando el espermatozoide es tratado con varios anticuerpos específicos, cada anticuerpo se combina con la superficie de la célula en un patrón topográfico único que refleja la distribución única del antigeno particular en la membrana plasmática. MEMBRANA PLASMÁTICA DE LOS ERITROCITOS. De los diferentes tipos de membrana, la membrana plasmática del eritrocito humano es la más estudiada y mejor comprendida. Hay varias razones para la popularidad de esta membrana. Las células son poco costosas y rápidamente disponibles en cantidades enormes a partir de sangre completa. Ya se encuentran aisladas como células únicas y no es necesario disociarlas de un tejido complejo. Las células son extremadamente simples en comparación con otros tipos, carecen por completo de membrana nuclear y citoplasmáticas, que inevitablemente contaminan las membranas plasmáticas preparadas a partir de otras células. Además, se puede obtener la membrana plasmática purificada intacta del eritrocito colocando simplemente las células en soluciones salina diluida (hipotónica). Las células responden a este choque osmótico captando agua e hinchándose, fenómeno denominado hemólisis. Conforme aumenta la superficie celular, su contenido, compuesto casi en su totalidad por hemoglobina l a membrana plasmática intacta. disuelta, fluye hacia fuera de la célula y deja un “fantasma” de la Una vez aislada la membrana del eritrocito se pueden solubilizar y separar (fraccionar) las proteínas para tener una mejor idea de su diversidad dentro de la membrana. El fraccionamiento de las proteínas de membrana se efectúa mejor empleando electroforesis en gel de poliacrilamina en presencia del 65



detergente iónico dodecilsulfato de sodio (DSS). El DSS mantiene soluble la proteína integral y además añade gran número de cargas negativas a las proteínas con las que se une, aunque el número de moléculas DSS por unidad de peso de proteínas tiende a ser relativamente constante, las moléculas se separan según su propio peso molecular. Las proteínas de mayor tamaño se desplazan más lentamente a través del tamiz molecular del gel. Cuando se aplica la técnica DSS-EGPA, las principales proteínas de la membrana del eritrocito se separan en casi una docena de d e bandas. Un examen más detenido de la membrana plasmática del eritrocito ilustrará los tipos de funciones que pueden desempeñar estas proteínas. Entre ellas se encuentran varias enzimas (incluyendo gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa, deshidrogenasa, una enzima necesaria para producir energía durante la glucólisis), proteínas de transporte (para transporte (para iones, aminoácidos y azúcares) y proteínas esqueléticas (por esqueléticas (por ejemplo: espectrina). Las diferentes proteínas de la membrana plasmática del eritrocito se pueden correlacionar con el papel de estas células en el transporte de oxígeno y de dióxido de carbono y con la resistencia física que estas células encuentran durante su circulación a través del cuerpo. Proteínas integrales de la membrana del eritrocito

La membrana contiene dos proteínas integrales principales, ambas son proteínas que rodean a la membrana y que contienen carbohidratos, denominadas banda 3 y glucoforina A. La banda 3 que 3 que ocurre como dimero compuesto de dos subunidades idénticas, rodea a la membrana cuando menos una docena de veces y contiene una cantidad relativamente pequeña de carbohidratos (6 a 8% del peso de la molécula). La banda 3 desempeña una función en el movimiento de aniones . Conforme la sangre circula a través de los tejidos, el dióxido de carbono se disuelve en el líquido del torrente sanguíneo (plasma) y luego se disocia según la reacción. H2O +CO2

HCO3- + H-

H2CO3

Los iones bicarbonato (HCO 3-) penetran a los eritrocitos intercambiándose por iones cloro , los cuales salen de la célula. En los pulmones, donde se libera dióxido de carbono, ocurre la reacción inversa y los iones bicarbonato abandonan el eritrocito intercambiándose por iones cloro. El movimiento recíproco de HCO3- y Cl- ocurre a través de un canal situado en el centro de cada dimero de d e la banda 3 . La glucoforina A A fue la primera proteína de membrana en la que se determinó la secuencia de aminoácidos. A diferencia de la banda 3, la glucoforina A rodea la membrana sólo una vez y contienen una porción muy amplia de carbohidratos que consta de 16 cadenas de oligosacáridos que en conjunto constituyen casi 60% del peso de la molécula. Se cree que la función primaria de las glucoforinas se deriva del gran número de cargas negativas que se originan en los extremos de sus cadenas de carbohidratos. Debido a estas cargas, los eritrocitos se repelen entre sí, evitando la formación de grumos conforme los eritrocitos circulan a través de los vasos de menor calibre . Es digno de mencionar que las personas que carecen de las glucoforinas A y B en sus eritrocitos no muestran efectos patológicos por su ausencia, peor las proteínas de la banda 3 están más intensamente glucosiladas, lo que al parecer compensa la ausencia de cargas negativas necesarias para evitar la interacción de célula a célula. El esqueleto de la membrana del eritrocito

Las proteínas periféricas de la membrana del eritrocito se localizan en su superficie interna y constituyen el esqueleto fibrilar de la membrana que actúa para mantener la forma del eritrocito y restringir el movimiento de las proteínas integrales de la membrana. El principal componente del esqueleto es la espectrina , una proteína fibrosa flexible de casi 100 nm de longitud compuesta de dos subunidades: una α y una β enrolladas una sobre otra. En su estado nativo dentro de la membrana, dos moléculas (cuatro subunidades) de espectrina se encuentran enlazadas cabeza con cabeza para formar un filamento de 200 nm. La espectrina se fija a la superficie interna de la membrana por medio de enlaces no covalentes a otra proteína periférica. La anquirina que a su vez se unen por enlaces no covalentes a la porción citoplasmática de una molécula de la banda 3, las porciones correspondientes a la cola de las moléculas espectrina se unen entre sí en disposición pentagonal o hexagonal mediante una batería de proteínas, incluyendo las proteínas actina y tropomiosina, que en condiciones típicas participan en actividades contráctiles. Numerosas enfermedades genéticas caracterizadas por 66



eritrocitos frágiles de forma anormal se atribuyen a mutaciones que alteran la estructura y función de la anquirina o de la espectrina.

Cuando se retiran las proteínas periféricas de los fantasmas de eritrocitos, las membranas se fragmentan y forman vesículas pequeñas, lo que indica que la red interna de proteínas es necesario para mantener la integridad de la membrana. Los eritrocitos son células circulantes que sufren considerable presión al atravesar los microscópicos capilares cuyo diámetro es mucho menor que el de los propios eritrocitos. Para atravesar estas vías tan estrechas, y tener que hacerlo todos los días, el eritrocito debe ser muy deformable, durable y capaz de resistir fuerzas de corte que tienden a desintegrarlo. Se piensa que la red de espectrina y actina confiere a la célula la resistencia, rigidez y plegabilidad necesarias para efectuar la función que se le demanda. Cuando se descubrió por primera vez el esqueleto de la membrana del eritrocito se pensó que era una estructura única adecuada para la forma y necesidades mecánicas únicas de este tipo de célula. Sin embargo, conforme se examinaron otras células se observaron esqueletos de membrana de tipo similar que contenían miembros de la familia de la espectrina y la anquirina, lo que indica, que el esqueleto interno de la membrana es una estructura ampliamente distribuida. TRANSPORTE DE SUSTANCIAS A TRAVÉS DE MEMBRANAS CELULARES. Puesto que el contenido de una célula está rodeado en toda su extensión por la membrana plasmática, toda comunicación entre la célula y el medio extracelular debe ser a través de esta estructura. En cierto sentido, la membrana plasmática tiene doble “responsabilidad”. Por un lado, debe retener los materiales disueltos dentro de la célula, de modo que no salgan de la misma por simple escurrimiento hacia el medio; por otra parte, debe permitir el intercambio necesario de materiales hacia adentro y hacia fuera de las células. La bicapa de lípidos de la membrana es ideal para prevenir la pérdida de solutos polares con carga eléctrica de una célula, pero deben tenerse algunas precauciones en relación con el ingreso de nutrientes y la salida de productos de lípidos relativamente impermeables. La membrana plasmática es una barrera con permeabilidad selectiva; es decir, no es igualmente permeable a todo tipo de solutos. Esta selectividad permite que la concentración de sustancias dentro de las células sea notablemente diferente de su concentración en el exterior, condición necesaria para la vida de la célula. Para entender la naturaleza selectivamente permeable de la membrana plasmática es necesario considerar como atraviesan esta estructura las moléculas individuales. Básicamente hay dos medios para dicho movimiento por difusión pasiva o por algún tipo de transporte activo acoplado a energía. Ambos tipos de movimiento pueden producir flujo neto de un ion o compuesto particular. El término flujo neto indica que el movimiento de la sustancia al interior de la célula (flujo interno) y hacia fuera de la misma (flujo externo) no está en equilibrio, sino que más bien uno excede al otro.

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Se conocen varios procesos mediante los cuales se desplazan sustancias a través de las membranas: difusión simple a través de la bicapa de lípidos; difusión simple a través de un canal acuoso revestido de proteínas; difusión facilitada, y transporte activo.

DIFUSION DE SUSTANCIAS A TRAVÉS DE MEMBRANAS Un no electrólito debe satisfacer dos condiciones para difundir al interior de una célula a través de la membrana plasmática. La sustancia debe estar presente en concentraciones más elevadas fuera de la célula y la membrana debe ser permeable a la sustancia. Una membrana puede ser permeable a un soluto determinado: 1) Porque el soluto pasa directamente a través de la bicapa de lípidos. 2) Porque dicho soluto es capaz de atravesar un poro acuoso situado en el espesor de la membrana que impide el contacto del soluto con las moléculas lípidas de la bicapa. Consideramos primero la ruta en la cual una sustancia se disuelve en la bicapa de lípidos para atravesar la membrana. El análisis de esta ruta obliga a considerar la polaridad de un soluto. Una medida simple de la polaridad de una sustancia es su coeficiente de partición , o sea la porción entre su solubilidad en aceite y su solubilidad en agua. El coeficiente de partición para un compuesto se mide disolviendo la sustancia en aceite y en agua por separado, mezclando luego los dos solventes inmiscibles con la sustancia disuelta agitándola, lo que permite que se separen en dos fases y se mida la concentración del soluto en cada fase. El coeficiente de participación es la concentración en aceite dividida entre la concentración en agua. Es evidente que a mayor liposolubilidad la penetración es más rápida. A finales del siglo XIX, observaciones de este tipo suministraron el primer indicio de que la frontera externa de la célula podía contener una capa de lípidos. Otro factor que determina la velocidad de penetración, de un compuesto a través de una membrana es su tamaño. Las moléculas de menor tamaño tienden a penetrar en la bicapa de lípidos de una membrana con mayor rapidez en comparación con las moléculas más grandes. Moléculas sin carga y muy pequeñas penetran rápidamente a través de las membranas celulares. Por consiguiente, las membranas son muy penetrables a moléculas inorgánicas pequeñas, como O 2, CO 2, NO y H 2O, que parecen deslizarse entre fosfolípidos adyacentes. En contraste, moléculas polares más grandes, como azúcares, aminoácidos e intermediarios fosforilados, muestran poca penetrabilidad en la membrana. Por consiguiente, la bicapa de lípidos de la membrana plasmática suministra una eficaz barrera que evita la difusión de estos metabolitos esenciales hacia el exterior de la célula. Puesto que algunas de estas moléculas (por ejemplo azúcares y aminoácidos) deben entrar a las células procedentes del torrente sanguíneo, al parecer no lo hacen por 68



simple difusión. En vez de eso deben disponer de mecanismos especiales para penetrar a través de la membrana plasmática. Estos mecanismos permiten a una célula controlar el movimiento de sustancias a través de la barrera situada en su superficie.

PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS DE MEMBRANA: CLASES Estas son las que participan en los mecanismos de transporte ó difusión de las moléculas grandes, solutos y de los electrolitos. Analizando los procesos de la difusión de diversos solutos a través de la membrana se puede afirmar que la membrana celular permite el paso de sustancias liposolubles y moléculas polares pequeñas sin carga por difusión simple, pero no todas pasan a través de la capa bilipidica, agua, azucares, ácidos entre otras, estas serán transportadas a través de proteínas de membranas a las que se conocen con el nombre de proteínas de transporte de un determinado compuesto aunque algunas lo hacen en grupos moleculares muy comunes, la proteína de transporte según el mecanismo que utiliza para cumplir su función se dividen en 3 grupos: 1. proteínas uniporte 2. proteínas simporte 3. proteínas antiporte 

Proteinas uniporte.- Son aquellas proteinas que permiten el paso de una sustancia de uno al otro lado de la membrana y también se les conoce como proteínas de transporte sencillo.

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Proteinas Simporte.- Son aquellas proteínas que utilizan sistemas de cotransporte unidimensional, estas proteínas para transportar un soluto simultáneamente y secuencialmente cotransportan otro soluto en el mismo sentido.

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Proteina antiporte.- Utilizan también proteínas de cotransporte bidimensional de intercambio, vale decir que para transportar un soluto en un sentido deberán transportar simultanea o secuencialmente otro soluto pero en sentido opuesto.

DIFUSIÓN DE AGUA A TRAVÉS DE LAS MEMBRANAS. Las moléculas de agua se desplazan con mucha mayor rapidez a través de una membrana celular que los iones y pequeños solutos polares comúnmente presentes en las células, los cuales son casi impenetrables. Debido a esta diferencia de penetrabilidad del agua en comparación con solutos se dice que las membranas son semipermeables. El agua se mueve rápidamente a través de una membrana semipermeable desde una región de baja concentración hasta otra de alta de concentración de soluto. 69



Este proceso se denomina ósmosis y puede demostrarse fácilmente colocando la célula en una solución con una concentración de soluto diferente de la presente en el interior de la propia célula. Cuando una membrana semipermeable separa dos compartimientos con concentración diferente de un soluto, se dice que el compartimiento de concentración más alta es hipertónica (o hiperosmótico) en relación con el compartimiento de concentración más baja de soluto que se describe como hipotónico (o hiposmótico). Si se coloca una célula en una solución hipotónica, la célula gana agua con rapidez por ósmosis y se hincha. A la inversa, una célula colocada en una solución hipertónica rápidamente pierde agua por ósmosis y se encoge. A partir de estas sencillas observaciones es evidente que el control del volumen celular depende sobretodo de la relación entre concentración de solutos en el interior de la célula en comparación con la concentración en el medio extracelular. La mayor parte de las células mantienen un volumen apropiado al desplazar iones hacia adentro y afuera de la célula hasta que la concentración interna del soluto (incluyendo una concentración elevada de proteínas disueltas) sea igual a la concentración del soluto externo. En estas condiciones, los líquidos interno y externo son isotónicos (isosmóticos) y no hay movimiento neto de agua hacia adentro o afuera de la célula. La ósmosis en un factor importante para numerosas funciones del cuerpo . Por ejemplo, el tubo digestivo secreta varios litros de líquido que se reabsorbe osmóticamente en las células que revisten el intestino. Si este proceso de reabsorción no ocurre, como en el caso de la diarrea intensa, se corre el riesgo de una rápida deshidratación. Las plantas aprovechan la ósmosis de diferentes maneras. Cuando una célula vegetal permanece en una solución hipotónica, gana agua y se hinchan, igual que una célula animal. La célula animal finalmente estalla en el medio hipotónico, pero la célula vegetal, que posee una pared celular externa rígida, alcanza un volumen máximo y en vez de estallar genera presión interna (turgencia) aplicada contra la pared que le rodea. Si la célula vegetal se coloca en un medio hipertónico su volumen disminuye conforme la membrana plasmática tira de la pared celular que le rodea, proceso conocido como plasmólisis. La presión desarollada gracias al fenómeno de la turgencia suministra apoyo a las plantas no leñosas y a ciertas partes de las plantas leñosas, como las hojas. La pérdida de agua por ósmosis hace que las plantas pierdan turgencias y se marchiten. ACUAPORINAS. El agua es una molécula suficientemente pequeña como para poder atravesar la bicapa lipídica de las membranas celulares, “infiltrándose” entre las cadenas desordenadas de los ácidos grasos. Hasta no hace mucho tiempo éste era el único mecanismo conocido de pasaje de agua a través de las membranas biológicas. Era conocido que el agua poseía una elevada permeabilidad en la mayoría de las membranas biológicas y las atravesaba en respuesta a mínimas diferencias osmóticas que permitían que los líquidos intra y extracelular mantuvieran la isotonicidad, necesaria para la homeostasis intracelular. Sin embargo, los mecanismos que posibilitaban este hecho indiscutible eran motivo de controversia. El agua puede atravesar la membrana por difusión simple o a través de poros acuosos, aunque por muchos años se asumió que dicho transporte ocurría sólo por medio del primer mecanismo. Debido a la baja solubilidad del agua en la fase lipídica de la membrana, este proceso requiere una elevada energía de activación (Ea>10 kcal/mol), lo cual originó que se planteara la existencia de otros mecanismos que aceleraran esta difusión en algunas circunstancias.

En 2003, Peter Agre, investigador de la Universidad Johns Hopkins (Baltimore, USA), recibió el Premio Nobel de Química por haber identificado una proteína que permite el pasaje selectivo de agua a través de la membrana celular, a la cual denominó “acuaporina”. Du rante la tarea de purificar el antígeno Rh de 70



eritrocitos humanos, los análisis señalaban la presencia de una “impureza” de características similares a las halladas en células tubulares renales. Guiado por el conocimiento que ambos tipos celulares son muy permeables al agua, la “impureza” fue investigada y resultó ser una proteína tetramérica de 28 kD que opera como canal selectivo para el tránsito de agua. La hipótesis fue confirmada al inyectar material genético de eritrocitos a un ovocito de anfibio (célula impermeable al agua), la cual adquirió la capacidad de permitir el pasaje de moléculas de agua. Posteriormente a su clonación y secuenciación, fue sugerido el nombre de acuaporina –1 (AQP1) para esta proteína, el cual fue adoptado oficialmente por la Human Genome Organization en 1997. Luego se describieron varias proteínas del mismo tipo, las cuales han recibido el mismo nombre seguido de un número secuencial en relación con la cronología de su descubrimiento. En mamíferos, hasta el momento se han descrito once tipos de AQP (0 al 10), las cuales comparten similitudes estructurales y se relacionan con una diversidad de enfermedades en diversos sistemas. Estructura de las acuaporinas. Las AQP son proteínas transmembranosas que delimitan un canal de 2 nm de largo por 0,3 nm de ancho, por lo cual solamente puede ser atravesado por moléculas de agua. Los iones, incluso el ión hidróxido y los protones, no pueden pasar a través de este canal, cuyo diámetro de aproximadamente 0,28 nm, es sensiblemente menor al tamaño de cualquier ion hidratado. Se calcula que las AQP son capaces de transportar 3 mil millones de moléculas de agua por segundo. Así, una porción de membrana de 10 cm 2 filtraría un litro de agua en unos 7 segundos. El canal es hidrofóbico, por lo cual las moléculas de agua formarían una fila estableciendo puentes de hidrógeno con aminoácidos polares específicos dispuestos a lo largo del camino de permeabilidad. En el centro del canal, el diámetro es ligeramente mayor al de una molécula de agua. Aunque la longitud de esta restricción es sólo la de un aminoácido, ello bastaría para bloquear el paso de iones y otros solutos más grandes, ya que no existe la estructura necesaria para despojarlos de sus capas de hidratación. La barrera para el paso de protones está constituida por un fuerte dipolo formado por dos segmentos proteicos que contienen la secuencia asparagina –prolina– alanina (NPA), que reorienta las moléculas de agua disrrumpiendo las interacciones entre una molécula y la siguiente, lo cual elimina la posibilidad del transporte simultáneo de protones. Las dos asparaginas del triplete NPA contienen residuos polares para la formación de puentes de hidrógeno y producen una reorientación transitoria del dipolo de la molécula de agua. Así, las moléculas de agua que penetran en el poro disponen sus oxígenos hacia abajo, pero al interactuar con ambas asparaginas giran y continúan su paso con el oxígeno mirando hacia arriba. En la zona más estrecha del canal existe una cisteína cuyo grupo sulfhidrilo determina la sensibilidad a los iones mercurio. Todas las AQP presentan una similitud estructural bastante notable, tienen sus segmentos amino terminal y carboxilo terminal intracelulares, están conformadas por dos mitades muy semejantes entre sí, unidas por el loop C, exhiben 6 segmentos transmembrana y los loop B y E son esenciales para la permeabilidad al agua del canal, es decir, son vitales en la formación del poro. Todas son tetraméricas, aunque algunas pueden formar oligómeros más pequeños, como AQP4. Se ha demostrado que la AQP1 bovina, al igual que la humana, también responde a una estructura homotetramérica. Las AQP son reguladas por diversos factores intracelulares, entre los cuales son fundamentales el pH y la fosforilación, principalmente mediada por proteinquinasa –A. La mayoría son inhibibles por compuestos mercuriales, aunque el Hg puede activar algunas AQP. Su permeabilidad al agua es alta, del orden de 3×10 9 moléculas/segundo y su energía de activación es baja, requiriendo unas 5 kcal/mol o menos. Entre los factores que regulan la cinética de apertura – cierre de las AQP, se conoce que AQP0 se activa a pH ácido y se inactiva por iones de calcio; AQP3 se inactiva a pH bajo y AQP6, localizada en las vesículas citosólicas de las células intercaladas de los túbulos colectores, se activa a pH bajo. En células eucariotas, además del pH, muchas AQP son reguladas por fosforilación, osmolaridad o unión con otras moléculas. La selectividad al paso del agua es muy alta en las AQP; la estructura del poro acuoso impide que el agua protonada (H3O+) sea capaz de atravesar la barrera formada por el residuo Arg –195, el cual está conservado en todos los miembros de la familia y ocupa una posición preponderante en el poro. Existe una segunda barrera al paso de protones, formada por un fuerte dipolo en el centro del poro, formado por dos segmentos que contienen la secuencia NPA, la cual reorienta las moléculas de agua al pasar, evitando las interacciones entre una molécula y la siguiente, lo cual elimina la posibilidad del transporte de protones simultáneamente. La presencia de un residuo alternativo a His –180, como Gly, está asociada con un mayor diámetro del poro, como sucede en las acuagliceroporinas, lo cual permite el paso de glicerol y otros solutos. 71



Las acuagliceroporinas De las once AQP conocidas, cuatro de ellas (AQP3, AQP7, AQP9 y AQP10) forman la sub –familia de las acuagliceroporinas, que son permeables también a glicerol, urea y otros solutos de tamaño reducido. La selectividad de las acuagliceroporinas no depende sólo del diámetro del poro. En algunas, como AQP3, la permeabilidad al glicerol es mucho mayor que a la de urea, cuya molécula es de menor tamaño. En AQP10, los aminoácidos dotados de carga eléctrica de los dos segmentos alfa –hélice que conforman el paso del canal, se orientan con sus polos positivos hacia el centro del poro. Esto genera un importante campo electrostático positivo que repele protones y otros cationes, mientras que admite el paso de solutos neutros. La acuagliceroporina AQP3 se expresa en riñón, piel y ojo, AQP7 en el tejido adiposo (donde transporta el glicerol generado tras la degradación metabólica de los triglicéridos) y AQP9 se expresa en los hepatocitos (incorpora glicerol al hígado, donde se convierte en glucosa). La expresión hepática de AQP9 aumenta marcadamente por el ayuno y en la diabetes mellitus no controlada. Recientemente se ha establecido una vinculación entre las acuagliceroporinas y el control del peso corporal y la adiposidad. En 2005 se comprobó que al eliminar la acuagliceroporina específica del tejido adiposo (AQP7), el glicerol no puede salir de la célula grasa y se va acumulando en el interior, produciendo hipertrofia del adipocito y contribuyendo al desarrollo de obesidad. Acuaporinas en vegetales Durante los últimos años se han caracterizado AQP en más de 30 especies vegetales, incluyendo mono y dicotiledóneas. Como en los animales, presentan una estructura tetramérica y cada monómero posee un poro funcional individual; algunas son inhibibles por mercuriales. Su gran abundancia en plantas, comparada con las de los animales, sugiere varias posibilidades. Una de ellas es que las AQP en plantas se puedan encontrar distribuidas en membranas de los diferentes compartimentos celulares (mitocondria, cloroplasto, peroxisoma, retículo endoplásmico, Golgi y diferentes tipos de vacuolas y vesículas). La presencia de AQP en los diferentes compartimentos pudiera ser el mecanismo que las células utilizan para regular los cambios en el potencial osmótico que sufren durante los diferentes tipos de estrés a los que las plantas se ven continuamente sometidas. Una segunda posibilidad sería que la expresión de algunas AQP puede depender, ya sea del estado de desarrollo de la planta, o de las condiciones ambientales a las que está expuesta. ELECTROLITOS EN LOS ESPACIOS EXTRA E INTRACELULARES: DIFUSIÓN DE IONES A TRAVES DE LAS MEMBRANAS. La bicapa de lípidos que forma el centro de las membranas biológicas es muy permeable a sustancias con carga eléctrica, incluyendo iones pequeños como Na -, K -, Ca2- y Cl -. Incluso el movimiento (conductancia) de estos iones a través de las membranas desempeñan un papel crítico en múltiples actividades celulares, que comprenden generación y propagación de impulsos nerviosos, secreción de sustancias hacia el espacio extracelular, contracción muscular, regulación del volumen celular y abertura de los poros de los estomas situados en las hojas de las plantas. En la actualidad, los biólogos han identificado un sorprendente número de canales iónicos, cada uno formado por proteínas integrales de la membrana que rodean un poro acuoso. La mayor parte de los canales iónicos son sumamente selectivos y solo permiten el paso de un tipo particular de ion. Igual que en la difusión de otros tipos de solutos a través de membranas, la difusión de iones por un canal siempre es “cuesta abajo”, o sea, desde un estado de mayor energía a otro de menor energía. Los

canales iónicos son bidireccionales, permiten el paso de iones en ambas direcciones y el flujo neto del ion depende del gradiente electroquímico. Comparando la secuencia de aminoácidos en las proteínas que forman diferentes tipos de canales iónicos en organismos tan diversos como bacterias, plantas y animales, se observa que todos los canales 72



iónicos pertenecen a un pequeño número de superfamilias gigantes. Aunque los miembros de una superfamilia dada pueden mostrar selectividad muy diferente para cada ion, todas muestran bastante similitud en la secuencia de aminoácidos y estructura total al indicar que provienen de una sola proteína que existió hace miles de millones de años. La mayor parte de estos canales iónicos que se han identificado pueden tener conformación abierta o cerrada, se dice que estos canales son las compuertas. El cambio de conformación cerrada a abierta, o sea, la abertura de la compuerta, puede ser inducida por varios factores, que dependen del canal en particular. Se han identificado dos categorías principales. 1. Canales operados por voltaje cuyo estado de conformación depende de la diferencia de carga iónica en ambos lados de la membrana. 2. Canales operados por sustancia químicas cuyo estado de conformación depende del enlace con una sustancia particular. Algunos canales operados químicamente se abren (o cierran) luego del enlace de un ligando a la superficie externa del canal, otros se abren (o cierran) luego que un ligando se enlaza a la superficie interna del canal. Por ejemplo, los neurotransmisores como acetilcolina actúan sobre la superficie exterior de ciertos canales catiónicos, en tanto que los nucleótidos cíclicos como AMPc actúan sobre la superficie interna de ciertos canales iónicos para calcio.

Aunque los biólogos todavía deben cristalizar la proteína de un canal iónico y por difracción de rayos X obtener la imagen de su disposición tridimensional en la membrana, ya es mucho lo que se sabe acerca de la estructura de estas moléculas. El siguiente análisis se centrará en los canales que median el paso del ion potasio. Se han aislados genes que codifican diferentes canales para K - y se ha investigado la anatomía molecular de sus proteínas. La mayor parte de estas proteínas poseen la estructura básica bidimensional. Los dominios N-terminal y C-terminal se sitúan en el lado citoplasmático de la membrana, en tanto que la porción media del polipéptido contienen seis segmentos que rodean la membrana. Un canal de K - único consta de cuatro polipéptidos homólogos (subunidades) dispuestos simétricamente alrededor de un poro central conductor de iones. Por lo contrario los canales para Na - y Ca2- de la misma superfamilia constan de un solo polipéptido gigante con cuatro dominios hidrófilos separados, cada uno con seis segmentos que rodean la membrana. Los canales de potasio pueden existir en conformación abierta o cerrada, según el voltaje a través de la membrana. Alterando sistemáticamente la secuencia de aminoácidos de la proteína mediante mutagénesis dirigida a un sitio, Richard Aldrich y sus colegas, de la Universidad Stanford obtuvieron pruebas de que el canal se cierra por medio de “una esfera atada a una cadena”. Los 19 aminoácidos que forman la porción N- terminal del polipéptido actúan como “esfera” oscilante que puede cerrar la boca

del canal y bloquear el paso de iones. Se cree que una hélice S4 transmembrana que contiene 7 residuos aminoácidos con carga positiva situados cada tercer residuo a lo largo de la cadena del polipéptido regula la abertura y cierre del canal. Se ha determinado que esta porción de la proteína actúa como sensor de voltaje. Los cambios de carga iónica a través de la membrana alteran las interacciones de los residuos cargados positivamente situados en la hélice S4 con residuos con carga negativa situados sobre hélices vecinas, lo que provoca cambios de conformación en el polipéptido que conducen a liberar la “esfera” y abrir la boca del poro. Una vez abierto el poro pueden pasar a través del canal más de un

millón de iones potasio por segundo. Debido a este gran flujo iónico, la abertura de un número 73



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relativamente pequeño de canales K puede tener un impacto significativo sobre las propiedades eléctricas de la membrana.

Algunos estudios indican que el canal K - mide alrededor de 3 A° (0.3 nm) de diámetro en su punto más estrecho, justo el calibre suficiente para permitir el paso de un solo ion potasio luego de despojarse de la capa de agua que lo rodea. Se cree que cada canal tiene cuando menos tres sitios capaces de enlazarse selectivamente a un ion potasio. Estos sitios tal vez se localicen en el segmento H5 del polipéptido, que puede formar parte de la pared del poro hidrófilo. La repulsión electrostática entre varios iones K + sumamente próximos proporciona el mecanismo para impulsar los iones a través del poro con tal rapidez. Una sola célula puede poseer varios canales K + diferentes que se abren y cierran en respuesta a diversos voltajes. Además, el voltaje requerido para abrir o cerrar un canal K + particular puede variar según si la proteína del canal está fosforilada o no, lo que a su vez es regulados por hormonas y otros factores. Es evidente que la función del canal iónico se encuentra bajo control de un complicado conjunto de diversos agentes reguladores. Nuestra mejor comprensión de la estructura tridimensional de un canal iónico se ha logrado por análisis con microscopio electrónico de alta resolución del receptor nicotínico para acelticolina, un canal operado por ligando. DIFUSIÓN FACILITADA La difusión facilitada se encuentra dentro de los mecanismos de transporte pasivo, la difusión de una sustancia a traves de una membrana siempre ocurre desde una región de mayor concentración a otra de menor concentración en el otro lado de la membrana, (pero las sustancias no siempre difunden a través de la bicapa de lípidos o de un canal abierto). En este caso la sustancia que debe difundir primero se une selectivamente a una proteina que atraviesa la membrana, denominada facilitador del transporte, encargada de facilitar el proceso de difusión. Se cree que el enlace del soluto a un facilitador de transporte sobre un lado de la membrana desencadena un cambio de conformación en la proteína que expone al soluto en la otra superficie de la membrana a partir de la cual puede difundir cuesta abajo siguiendo su gradiente de concentración. La difusión facilitada como se denomina a este proceso, se asemeja en gran parte a una reacción catalizada por enzimas, igual que las enzimas los facilitadores de transporte son especificos para las moléculas que transportan, además muestran cinética de tipo 74



saturación. A diferencia de los canales iónicos que pueden conducir millones de iones por segundo, la mayor parte de los facilitadores de transporte sólo pueden desplazar a través de la membrana cientos o miles de moléculas de solutos por segundo. La actividad de la difusión facilitada puede regularse para satisfacer las necesidades de la célula en determinado momento, es particularmente importante para mediar la entrada y la salida de solutos polares como azúcares y aminoácidos que no pueden penetrar la bicapa de lípidos. Debido a que los facilitadores de transporte operan pasivamente, o sea, sin acoplarse a un sistema capaz de liberar energía, pueden mediar el movimiento en forma satisfactoria en ambas direcciones (utilizan la energía almacenada en gradientes iónicos). La dirección del flujo neto depende sólo de la concentración relativa de la sustancia en ambos lados de la membrana. Las proteinas o permeasas que intervienen en el transporte facilitado se les denomina como translocasas porque clásicamente se pensaba que estas por la superficie externa de la membrana se unian al soluto para transformarse formando un complejo que se intercambia dentro de la capa bilipidica realizando una translocación verdadera es decir invirtiendo su cara donde se encontraba la union permeasa soluto, de manera que se aperturaba su compuerta hacia el citosol dejando en libertad al soluto y luego libre la permeasa realizando otro movimiento de translocación verdadera para volver a localizarse hacia la superficie externa como originalmente se encontraba, pues estos movimientos vendrían hacer movimientos de flip – flop los cuales termodinámicamente no estan permitidos. Los mecanismos modernos de translocación que se aceptan en la actualidad involucran proteínas integradas a la membrana formadas o constituidas por varias unidades polipeptidicas que presentan caras de unión para el soluto o también que estas proteínas integrales esten interactuando con proteínas perifericas de la superficie externa y estas son las que presentan las caras de unión para el soluto. A su vez en ambos casos la unión del soluto en las caras de unión constituyen o forman el complejo proteasa-soluto dando lugar a cambios de conformación que permiten que la cara de unión con el soluto se habra hacia el citosol de esta manera libera al soluto hacia el citoplasma. Existen 2 estadios de conformación de las proteínas en la membrana plasmatica, es decir estados de conformación en que se encuentran las proteínas transportadoras, entre estos estados tenemos: 1.- En el que los centros de unión para el soluto estan descubiertos hacia el espacio extracelular y en los que se unira el soluto, a este estado se denomina estado PONG de las proteinas. 2.- En el estado PING de las proteínas, cuando los centros unidos al soluto quedan descubiertos o expuestos hacia el lado interno o hacia el citosol, de manera que las proteínas se invierten del estado Ping – Pong o viceversa.

TRANSPORTE DE GLUCOSA A TRAVES DE LA MEMBRANA PLASMATICA. La glucosa es la principal fuente de energía directa para el cuerpo y la mayor parte de las células contienen una proteína de membrana que facilita la difusión de glucosa desde la corriente sanguínea al interior de la célula. El gradiente favorable para la difusión continua de glucosa hacia el interior de las células se mantiene por fosforilación del azúcar luego que penetra al citoplasma, por lo que desciende la concentración intracelular de glucosa. Los seres humanos y otros mamíferos estudiados tienen cuando menos cinco proteínas relacionadas que actúan como facilitadoras del transporte de glucosa (estas variantes genéticas se refieren como isoformas). Las isoformas denominadas GLUT1 – GLUT5 se diferencian por los tejidos en los cuales se localizan y también por su cinética y características reguladoras. 75



La insulina, hormona producida por las células endocrinas del páncreas, desempeñan un papel clave para mantener una concentración apropiada de azucar en la sangre. Una de las principales acciones de la insulina es favorecer la captación de glucosa proveniente de la sangre por las células musculares, en cuyo interior se almacena como glucógeno o se emplea directamente como combustible para la actividad muscular y por las células adiposas donde la glucosa se convierte en grasa. Los músculos cardiaco y esquelético y las células adiposas comparten una isoforma común de proteína facilitadora del transporte de glucosa, en especial GLUT4. Si la concentración de insulina es baja, estas células contienen relativamente pocos transportadores de glucosa en su superficie. Por lo contrario, dichos transportadores se encuentran en la membrana de las vesículas citoplasmáticas. Cuando la concentración de insulina se eleva, esta hormona actúa sobre células específicas para estimular la translocación de las vesículas desde el citoplasma hasta la superficie celular. Como resultado, los transportadores se incorporan a la membrana plasmática donde pueden actuar para eliminar glucosa de la sangre. TRANSPORTE DE GLUCOSA EN ENTEROCITOS. El establecimiento de gradientes de concentración, como los de Na +, K+, H+, constituye un medio para almacenar energía en las células. La célula emplea de varias maneras la energía potencial almacenada en gradientes iónicos para efectuar trabajo, incluyendo transporte de otros solutos. Consideremos las funciones del intestino, en su luz, las enzimas desdoblan polisacáridos de peso molecular elevado para producir azúcares más simples, los cuales deben desplazarse a través de todo el espesor de las células epiteliales (enterocitos) que revisten al intestino y alcanzar la corriente sanguínea. El movimiento de glucosa a través de la membrana plasmática apical (membrana de las células epiteliales frente a la luz del intestino) contra un gradiente de concentración ocurre mediante cotransporte con iones sodio. La concentración de Na + se mantiene muy baja dentro de las células por acción del sistema de transporte activo primario (ATPasa de Na + - K+), localizado en la membrana plasmática basal y lateral que bombea iones sodio fuera de la célula contra un gradiente de concentración. La tendencia de los iones sodio para difundir hacia adentro a través de la membrana plasmática apical siguiendo su gradiente de concentración es “controlada” por las células epiteli ales que dirigen el cotransporte de moléculas de glucosa hacia adentro de la célula contra un gradiente de concentración. (Se dice que las moléculas de glucosa son impulsadas por un sistema de transporte activo secundario). En este caso, la proteína de transporte se enlaza tanto al sodio como a la glucosa en la superficie externa de la membrana plasmática apical (estado pong). La union de glucosa y Na + en la bomba de glucosa hace que ocurra cambios de conformación de la permeasa, por el cual las caras unidas con los solutos glucosa-Na queden expuestas o abiertas hacia el citosol. Dichos cambios de conformación consisten en la apertura de un canal para liberar al Na y a la glucosa hacia el citosol. Cuando el ion sodio se libera en la célula dentro de una solución de menor concentración, la conformación de la proteína aparentemente cambia, de modo que pierde su afinidad por la molécula de glucosa, la cual entonces es liberada dentro de la célula (estado ping). Una vez adentro, las moléculas de glucosa difunden por toda la célula y se desplazan a través de la membrana basal mediante difusión facilitada. 76



El transporte de glucosa al interior de las células epiteliales del intestino (y al interior de las células que revisten los túbulos del riñón mediante un sistema similar) es un ejemplo de proteínas simporte, en el cual las dos especies transportadas (Na + y glucosa) se mueven en la misma dirección. En bacterias tanto los carbohidratos, azucares simples, aminoácidos son transportados tambien mediante transporte facilitado pero impulsado por el ión H +.

TRANSPORTE ACTIVO. En condiciones típicas, la concentración interna de K + en las células de mamíferos es de casi 100 mM, en tanto que fuera de la célula sólo es de unos 5 mM. En consecuencia hay un gradiente de concentración de K + muy pronunciado a través de la membrana plasmática que favorece la difusión de K + hacia afuera de la célula, Los iones sodio también se distribuyen de manera muy desigual a través de la membrana plasmática, pero el gradiente se establece en sentido opuesto: la concentración de Na + es de casi 150 mM en el lado externo de la célula de l0 a 20 mM en el lado interno de la membrana plasmática. La diferencia de concentración para Ca +2 todavía es mayor la concentración tipica de 10 -7 mM en el citoplasma es 1000 a 10000 veces menor que la concentración en el exterior de la célula. La capacidad de una célula para generar estos pronunciados gradientes de concentración a través de su membrana plasmática no puede depender de difusión simple o facilitada. Estos gradientes se generan más bien por el Transporte activo.

Igual que la difusión facilitada, el transporte activo depende de proteínas integradas a las membranas capaces de unirse selectivamente a un soluto particular y desplazar dicha sustancia a través de la 77



membrana impulsada por cambios en la conformación de la proteína. Sin embargo, a diferencia de la difusión facilitada, el movimiento de un soluto contra un gradiente requiere acoplar el ingreso de energía. En consecuencia, el movimiento endérgónico de iones o de otros solutos a través de la membrana contra un gradiente de concentración debe acoplarse a un proceso orgánico, como hidrólisis de ATP, absorción de luz, transporte de electrones o flujo de otras sustancias a favor de un gradiente. ACOPLAMIENTO DEL TRASPORTE ACTIVO A LA HIDRÓLISIS DE ATP En 1957, el fisiólogo danés Jeans Skou descubrió una enzima que hidroliza ATP en las células nerviosas del cangrejo que solo era activa en presencia de iones sodio, potasio y también Mg 2+, que actúa como cofactor Skou propuso y estuvo en lo correcto, que esta enzima encargada de la hidrólisis de ATP era la misma proteína que actuaba en el transporte activo de iones, la enzima se denominó ATPasa Na + K+ o bomba sodio y potasio. Los investigadores interesados en descubrir las propiedades de la ATPasa Na +-K+ pronto volvieron su atención a los fantasmas de eritrocitos utilizando este sistema se observó que el transporte activo solo ocurre cuando hay iones potasio fuera de la célula y iones sodio dentro de la misma. También debe haber ATP disponible dentro del fantasma restablecido; si el ATP se aplica externamente la bomba no puede operar. De igual manera se determinó que la ouabaina un inhibidor de transporte activo de cationes ampliamente estudiado, sólo era eficaz cuando se aplicaba de forma externa sobre los fantasmas recuperados, la ouabaina es un esteroide cardiotónico con estructura similar a los glicósidos digitalicos un esteroide obtenido de la digital empleado durante más de 20 años como tratamiento para la insuficiencia cardiaca congestiva. La digital aumenta la fuerza de contracción del corazón inhibiendo la bomba de Na +-K+ que desencadena una serie de acontecimientos que incrementan la disponibilidad de Ca2+ dentro de las células del músculo cardiaco. En años recientes se han acumulado pruebas de que las células normalmente contienen tipos similares de compuestos denominados endou abainas. DINAMICA DE LA BOMBA DE Na + y K+. Los experimentos con fantasmas de eritrocitos ilustran claramente la naturaleza asimétrica de la bomba de sodio y potasio. Esta asimetría es una de las características más importantes de todos los sistemas de transporte activo. A diferencia del movimiento mediado por proteínas en los sistemas de difusión facilitada, que pueden transportar la sustancia igualmente bien en ambas direcciones, los sistemas de transporte activo se acoplan a una fuente de energía de tal manera que sólo pueden impulsar el movimiento de iones en una sola dirección. Numerosos estudios indican que la proporción de Na + - K+ bombeada por la ATPasa Na +-K+ no es de 1:1, sino de 3:2. En otras palabras, por cada ATP hidrolizado se bombean tres iones sodio afuera y sólo dos iones potasio adentro de la célula. Debido a esta proporción de bombeo, la ATPasa Na +-K+ es electrógena lo que significa que contribuye directamente a separar cargas eléctricas a través de la membrana. La ATPasa Na+ - K+ es un tetrámero que consta de dos tipos de subunidades, una subunidad alfa de mayor tamaño encargada de la actividad de transporte y una subunidad beta más pequeña que al parecer funciona sobre todo en la maduración y ensamblado de la bomba dentro de la membrana. Ambas subunidades atraviesan la membrana; la subunidad alfa contiene 8 a 10 segmentos transmembrana semejantes, en tanto que la subunidad beta solo contiene uno. La APTasa Na+-K+ es un ejemplo de bomba tipo P para iones. La "P" significa “fosforilación” e indica que durante el ciclo de bombeo la hidrólisis de ATP transfiere un grupo fosfato a uno de los aminoácidos de la proteína de transporte, lo que a su vez provoca un cambio de conformación esencial dentro de la proteína. Los cambios de conformación son necesarios para modificar la afinidad de la proteína por los dos cationes que transporta. Consideremos la situación que confronta la proteína. Debe captar iones sodio o potasio en una región donde están presentes en concentración baja, lo que significa que la proteína debe poseer una afinidad relativamente alta por estos iones. A continuación la proteína debe liberar los iones en el otro lado de la membrana frente a una concentración mucho mayor de iones Para esto, la afinidad de la proteína por dicho ion debe disminuir. Por lo tanto, la afinidad para los iones debe ser diferente en ambos lados de la membrana, lo cual puede explicarse mejor mediante un cambio en la forma de la molécula de la proteína. Cuando la proteína se une a tres iones Na + en el lado interno de la célula, sufre la fosforilación y cambia de la conformación E1 a la conformación E2. En ése momento, los sitios de enlace quedan expuestos al compartimiento extracelular y la proteína pierde su afinidad por los iones Na + que entonces se liberan 78



fuera de la célula. Una vez liberados los tres iones de sodio, la proteína capta dos iones potasio, se desfosforíla y regresa a su conformación original. En ese estado, el sitio de enlace se abre en la superficie interna de la membrana y su afinidad por iones K + disminuye liberando estos iones dentro de la célula, entonces el ciclo puede repetirse. La importancia de la bomba de sodio y potasio es evidente si consideramos que consume alrededor de un tercio de la energía producida por la mayor parte de las células animales y 2 tercios de la energía producida por las células nerviosas.

OTRAS BOMBAS EN LA MEMBRANA CELULAR Y MEMBRANAS DE ORGANELOS CELULARES Bomba de Ca++ en la Membrana Celular El calcio se encuentra en menor concentración en el espacio intracelular por tanto existen estados funcionales en la célula que requieren mas Ca + produciéndose para estos procesos la difusión pasiva por lo tanto se produce un aumento de Ca + en el medio intracelular. Consiguientemente el Ca + que ha incrementado su concentración debe ser expulsado de la célula para lo cual se activa las bombas de calcio que se encuentra en la membrana plasmática; se han determinado 2 tipos de bombas de Ca + en las membranas biológicas. 1) Bomba de Ca ++ ATPasa (Bomba ATPASA de Ca+): Es una bomba de tipo P (proteína intermedia fosforilada), la bomba de calcio de la membrana plasmática es una proteína de 138KDa que cataliza la hidrólisis de una molécula de ATP. La energía liberada por dicha reacción es acoplada al transporte de calcio a través de la membrana en contra de su potencial electroquímico, de manera que gracias a la actividad de esta proteína la concentración de calcio es 10000 veces menor que en el interior celular. La bomba de Ca ++-ATPasa de la membrana plasmática es estimulada por calmodulina (CaM), su modulador proteico natural, fosfolípidos acídicos y ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga.

También puede ser estimulada mediante fosforilación por la proteinquinasa A y por la proteinquinasa C. En algunas células, como los eritrocitos, la bomba de calcio está localizada en la membrana celular y su función es transportar Ca ++ fuera de la célula. Sin embargo, en las células musculares, la bomba Ca ++ATPasa se encuentra en la membrana del retículo sarcoplásmico. La bomba transporta el Ca ++ desde el 79



citosol hacia el interior del orgánelo, que concentra y almacena el calcio. La salida del Ca ++ del retículo sarcoplásmico al citosol muscular origina la contracción de la célula y se requiere una rápida eliminación de este calcio hacia fuera del citoplasma, ya sea al espacio extracelular o a la luz del Retículo Endoplasmatico. 2) Bomba de Ca+ estimulado por Na +: Es un sistema de proteína Antiporte, sodio - calcio, llamado también intercambiador Na +/Ca+ es una proteína transmembranosa que cotransporta Ca 2+ y Na+ de una manera bidireccional en respuesta a un cambio en el gradiente electroquímico de concentración para el Na+. En el modo directo, esta proteína bombea Ca + intracelular hacia fuera de la célula con una estequiometría de 3 Na+ por 1 de Ca2+ generando con ello una corriente entrante, sin embargo la velocidad y dirección del flujo de Ca 2+ dependen de los respectivos gradientes de concentración para ambos iones, así como también del potencial de la membrana. El intercambiador Na +/Ca2+ es un mecanismo de contra transporte electrogénico y reversible con un papel bien establecido en la homeostasis del Ca2+ en gran variedad de células, incluyendo aquellas de músculo esquelético. En su modo directo, transporta Ca 2+ contra su gradiente electroquímico transmembranal, haciendo uso del gradiente electroquímico para el Na+.

BOMBA DE PROTONES O H+ Existen varias clases, existen algunos de ellos asociadas a las membranas plasmáticas y otras a organelos membranosos, como lisososomas, endosomas y vacuolas de células vegetales y de eucariotas inferiores. En el interior de los endolisosomas determina una concentración de iones hidrógeno que lleva el pH a valores inferiores a 5.

Las células vegetales dependen sobre todo del transporte de H por medio de una bomba tipo P situada en la membrana plasmática. Esta bomba de protones desempeña en las plantas un papel clave en el transporte secundario de solutos, en el control de pH del citosol y tal vez en la regulación del crecimiento celular mediante acidificación de la pared de las células vegetales. A diferencia las bombas tipo V, utilizan la energia del ATP sin formar una proteína intermedia fosforilada. Las bombas tipo V transportan activamente iones hidrógeno a través de las paredes vegetales. 80



Las ATPasas de clases F de los procariotas, cloroplastos y mitocondrias también son bombas proteinicas, (pero en el caso de las mitocondrias suelen funcionar en reverso sintetizando ATP). BOMBA DE Cl- EN LA MEMBRANA PLASMÁTICA. La bomba de Cloro es una proteína que se encuentra en la membrana plasmática es una ATPasa es decir funciona con gasto de energía proveniente de la célula. Esta bomba esta considerada como una proteína compleja que esta constituida por varios polipéptidos que vienen a ser los transportadores de Cl -. Igual que otros transportadores de esta súper familia esta proteína compleja contiene dos dominios situados entre la bicapa de lípidos, cada una con seis segmentos que atravesan la membrana y dos dominios que unen nucleótidos (DUN) proyectados al interior del citoplasma. A diferencia de otros miembros de la súper familia, la proteína implicada en la fibrosis quistica incluye un dominio regulador (R) que contienen varios residuos de serina que pueden ser fosforilados por una proteincinasa (denominada PKA) activada por un AMP cíclico segundo mensajero.

Esta proteína recibió el nombre de regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quistica (RTFQ), termino ambiguo que refleja el hecho de que los investigadores aun no están seguros de su verdadera función, si es un canal de cloro (a diferencia de otros miembros de la súper familia que son transportadores activos) o una proteína que regula de alguna manera la conductancia del cloro a través de otros canales de membrana. El problema se resolvió solo después de purificar la proteína, incorporarla a bicapas de lípidos artificiales y demostrar que actúa como canal de cloro regulado por AMP cíclico. Para abrir la compuerta aparentemente se requieren dos hechos independientes: la fosforilación del dominio R dependiente de AMP cíclico y el enlace de ATP al dominio de enlace con el nucleótido. La razón para este doble control sobre la conductancia del Cl -, todavía es incierta. FIBROLISIS QUISTICA Una de cada 25 personas, en promedio, descendiente de ancestros del norte de Europa posee una copia del gen causante de la fibrosis quística. En otras palabras, estas personas son heterocigotos en ese locus genético. Puesto que no presentan síntomas del gen mutante, la mayor parte de los heterocigotos desconocen que son portadores (a menos que su ADN se someta a los procedimientos recientes de selección). En consecuencia, alrededor de uno de cada 2500 lactantes de esa población caucásica son homocigotos recesivos en este locus y nacen con fibrosis quística. La fibrosis quistica es una enfermedad por secreción anormal de líquido. Aunque varios órganos están afectados, incluyendo intestino, páncreas, glándulas sudoríparas y el conducto reproductor, de ordinario en el sistema respiratorio es donde se observan los efectos más grades. Las víctimas de fibrosis quistica, producen moco viscoso, resistente, muy difícil de expulsar de las vías respiratorias. Como resultado, estos individuos sufren infección pulmonar crónica que progresivamente daña la función respiratoria. 81



En 1984 se demostró que las células cultivadas procedentes de pacientes con fibrosis quistica muestran flujo externo anormalmente bajo de iones cloro lo que sugiere que el defecto puede residir en un gen que codifica un canal un transportador de iones. Puesto que el movimiento de agua hacia afuera de las células epiteliales por ósmosis está directamente afectado por el movimiento de sales, no es sorprendente que una reducción del flujo externo de cloro conduzca a un incremento de la concentración y por lo tanto de la viscosidad de las secreciones corporales. En 1989 se aisló el gen de la fibrosis quistica. Por primera vez, las víctimas de esta enfermedad vieron un rayo de luz al final de un largo y oscuro túnel: surgió la esperanza de encontrar una cura para su incapacitante enfermedad. Una vez determinada la secuencia del gen de la fibrosis quistica y la secuencia de aminoácidos del correspondiente polipéptido se comprobó que el polipéptido era un transportador ABC.

En años recientes los investigadores aislaron alrededor de 200, mutaciones diferentes que ocasionan fibrosis quítica y se estudió el efecto de cada una de estas alteraciones sobre la estructura y función de la proteína. Como resultado, ahora se sabe más acerca de las bases moleculares de la enfermedad que de las bases fisiológicas de la patología acompañante en tejidos y órganos. En Estados Unidos, 70% de los alelos causantes de fibrosis quística contienen la misma alteración genética (designada AF508), y todos ellos carecen de tres pares de bases de ADN que codifican una fenilalanina en la posición 508 dentro de uno de los dominios de unión a nucleótidos del polipéptido RTFQ. Investigaciones frecuentes han revelado que los polipéptidos RTFQ que carecen de este aminoácido particular no pueden procesarse normalmente dentro de las membranas del retículo endoplásmico el complejo Golgi y en realidad nunca alcanzan la superficie de las células epiteliales. En consecuencia, los pacientes con fibrosis quistica homocigotos para el alelo AF508 carecen por completo del canal de cloro RTFQ y padecen una forma grave de la enfermedad otros pacientes con fibrosis quística con formas menos graves poseen alelos mutantes que codifican una RTFQ capaz de alcanzar la superficie de las células, pero sólo pueden mediar una reducida conductancia al cloro. Las formas más leves se caracterizan por infertilidad, con daño escaso o ausente a órganos mayores. A partir del aislamiento del gen causante de fibrosis quística, la meta de los investigadores ha sido desarrollar una cura mediante genoterapia, o sea, sustituir el gen defectuoso por un gen normal. La fibrosis quística es buen candidato para genoterapia debido a que los peores síntomas de la enfermedad son causados en células que revisten las vías respiratorias y, por lo tanto, son accesibles a sustancias susceptibles de administrar por inhalación en aerosol. Hasta ahora los ensayos clínicos iniciados utilizan dos diferentes sistemas de administración. En un grupo de análisis, el gen normal RPFQ se incorporó al ADN de un adenovirus defectuoso, un tipo de virus que normalmente produce infección en vías respiratorias superiores. A continuación se permite que las partículas del virus recombinante infecten célula de las vías respiratorias y envíen el gen normal a célula generalmente deficientes. En otros ensayos, el ADN que codifica al gen RTFQ normal se introduce a liposomas. Cuando se introducen en pulmones vías respiratorias, los liposomas se fusionan con membranas plasmáticas de células epiteliales y liberan su contenido de ADN en el interior del citoplasma. Hasta ahora, ambos métodos han tenido éxito para corregir transitoriamente el defecto genético en las células de vías respiratorias. Quizá los liposomos tengan ventaja sobre los virus como sistema de administración por la menor probabilidad de estimular una respuesta inmunológica destructiva dentro del paciente luego de tratamientos repetidos. TRANSPORTE EN MASA Ocurre con particulas grandes que no pueden difundir la membrana plasmática por ningun mecanismo de transporte antes mencionado por consiguiente el transporte en masa utiliza otro mecanismo llamado 82



endocitosis en el cual se forma una vesicula endocitada mediante la membrana plasmática y en cuyo interior contiene macromoleculas. CAPTACIÓN CELULAR DE PARTÍCULAS Y MACROMOLÉCULAS. Para satisfacer la necesidad de las células de captar materiales demasiado grandes, evolucionaron mecanismos que captan materiales del medio extracelular dentro de vesículas derivadas de pliegues, o invaginaciones, de la membrana plasmática. La captación de materiales extracelulares en vesículas citoplásmicas se dividen en dos categorías separadas, fagocitosis y endocitosis, que ocurren por mecanismos diferentes. La fagocitosis es la captación de partículas materiales y la endocitosis es la captación de líquidos, solutos disueltos y macromoléculas suspendidas. Las vesículas formadas por la fagocitosis son típicamente casi 10 veces más grandes (1 a 2 micras de diámetro) en comparación con las formadas por endocitosis (0.1 a 0.2 micras de diámetro). FAGOCITOSIS La fagocitosis (“células que comen”) es ejecutada extensamente por unos pocos tipos de células

especializadas en captar partículas materiales del ambiente y entregarlas al lisosoma. Los organismos heterótrofos unicelulares, como amebas y ciliados, se mantienen vivos atrapando partículas nutrientes y organismos más pequeños, y aprisionándolos en pliegues de la membrana plasmática. Los pliegues se fusionan para formar fagosoma que se desprende de la membrana plasmática. El fagosoma se fusiona con un lisosoma y así el material se digiere en el interior de la célula. En casi todos los animales evolutivamente desarrollados, la fagocitosis es un mecanismo protector y no una manera de alimentarse. Los mamíferos poseen varias células fagocitarias, incluyendo macrófagos y neutrófilos, cuya función es vagar por la sangre y los tejidos fagocitando organismos invasores, células dañadas, eritrocitos envejecidos y desperdicios. La actividad contráctil de microfilamentos subyacentes a la membrana plasmática que contiene actina controla el engullimiento de partículas materiales por fagocitosis.

La fagocitosis la realizan células excepcionales como son los leucositos o globulos blancos, macrófagos que se caracterizan por que dichas células ingieren un material sólido de gran tamaño denominado antígenos como por ejemplo: bacteria, virus, esporas de hongos por esta razón el nombre Phagein=comer. El fagosoma es transportado hasta los lisosomas para que las hidrolasas ácidas actúen sobre este material sólido. En cambio la pinocitosis consiste en la ingestión de partículas pequeñas en moléculas de H 2O, es decir se incorpora líquido, por esta razón la pinocitosis deriva de la palabra Phagein=beber. La pinocitosis lo realizan las células en general de organismos inferiores, mientras en organismos superiores la pinocitosis toma el nombre de endocitosis. ENDOCITOSIS La endocitosis se puede dividir de manera muy general en dos categorías: La endocitosis a granel o endocitosis sin mediación de receptores de membrana, consiste en la captación de líquidos extracelulares que la superficie de la membrana no reconoce. Cualquier molécula, grande o pequeña, incluida en el líquido también penetra a la célula. Esta endocitosis se puede visualizar añadiendo sustancias al medio de cultivo, como el colorante amarillo luciferina o la enzima peroxidasa de rábano silvestre, que son captadas por las células de manera inespecífica. La endocitosis a granel puede ocurrir de manera continua en muchos tipos de células y su función primaria puede centrarse en la 83



recuperación de membrana plasmática luego de periodos de secreción o durante el ingreso de líquido extracelular. En este tipo de endocitosis las partículas a ser incorporadas primeramente deben absorberse a nivel de superficie externa en el glucocaliz de la membrana celular que va a endocitar puesto que una de las funciones del glucocaliz es la adhesividad, por lo tanto la endocitosis presenta 2 fases. 1.-Fijación: Consiste en la concentración de partículas, de macromoléculas que van a ser endocitadas, dicha concentración se realiza en un sitio específico de la membrana celular. 2.- Ingestión: Consiste en que las partículas o macromoléculas van a ser incorporadas dentro de la célula a través de la formación de una vesícula endocitada. Los procesos moleculares en la endocitosis o pinocitosis no ocurren en cualquier lugar de la membrana plasmática, la concentración de macromoléculas o partículas pequeñas se produce en sitios específicos de la membrana donde existe una foceta o depresión ligera de la membrana, a su vez esta foceta por la superficie interna de la membrana esta cubierta por una cesta de clatrina (proteína periférica de superficie interna) la misma que interactúa con microfilamentos de actina y miosina, realizan movimientos de tracción en la profundidad del citosol ocasionando que se incremente dicha depresión, invaginandose hacia el citoplasma celular y constituyendo una vesícula endocitada que contienen a las macromoléculas, a dicha vesícula también se le denomina endosoma hasta que dicho endosoma se desliga de la membrana y la misma que será transportada hasta los lisosomas primarios. Por otra parte para que ocurran estos movimientos de tracción de actina y miosina y se produzca la foceta, la célula requiere mayor concentración de calcio en el citosol así mismo ATP, para lo cual se produce la apertura de canales de calcio, a nivel de membrana plasmática por los que difunde pasivamente el calcio del espacio extra al intracelular.

La endocitosis mediada por receptores

(EMR) consiste en la captación de macromoléculas extracelulares específicas (ligandos) luego de unirse a receptores en la superficie exterior de la membrana plasmática. Internalizacion de macromoleculas, particulas y reciclaje de receptores de membrana: CURL La endocitosis mediada por receptores proporciona un medio para la captación selectiva y eficiente de macromoléculas que pueden estar presentes en concentraciones relativamente bajas dentro del líquido extracelular. Las células poseen receptores para captar muchos tipos diferentes de sustancias, incluyendo hormonas, factores de crecimiento, enzimas y proteínas plasmáticas. Los ligandos que entran a la célula por medio de EMR se unen a los receptores que se agrupan en regiones especializadas de la membrana plasmática, conocidos como fosillas revestidas. Algunos receptores se agrupan en las fosillas revestidas en concentración equivalente a 100 veces la del resto de la membrana plasmática. Las fosillas revestidas se reconocen en el microscopio electrónico como sitios donde la superficie está indentada y la membrana plasmática cubierta en su cara citoplasmática por una capa de material velludo electrónicamente denso constituida por la proteína clatrina , la misma proteína que participa en la formación de vesículas revestidas de clatrina en la red trans de Goldi. Una fosilla revestida sobre la membrana plasmática se invagina al interior del citoplasma y forma una vesícula que adelgaza su tallo para liberarse de la membrana plasmática que la cubre. Al examinar la estructura del recubrimiento y de las moléculas que las componen se puede tener un mejor conocimiento del proceso de formación de las vesículas revestidas. La construcción geométrica de la cubierta se deriva de la estructura de sus bloques de construcción de clatrina. Cada molécula de clatrina se compone de tres cadenas pesadas y tres cadenas ligeras reunidas 84



para formar un ensamblado de tres extremidades denominados trisquelion. Un trisquelion constituye un módulo notablemente adaptable con el cual una célula puede construir rejillas poligonales. Durante la invaginación, el enrejado relativamente plano de la fosilla revestida se incurva rodeando la vesícula en formación.

Una rejilla compuesta de trisqueliones es una estructura muy adecuada para sufrir el tipo de redisposición estructural requerida para transformar una rejilla plana en una estructura en forma de caja. En realidad, los trisqueliones purificados de clatrina se auto ensamblan para formar cajas vacías similares a las enredaderas en una vesícula revestida. Igual que las vesículas revestidas de clatrina formadas por gemación de la Red Trans de Golgi (RTG), las vesículas revestidas formadas durante la endocitosis también contienen una capa de complejos adaptadores situada entre la rejilla de clatrina y la superficie de la membrana vesicular que enfrenta el citoplasma. Lo mismo que en las vesiculas revestidas de la RTG, los adaptadores son los que específicamente se unen a los receptores de la membrana plasmática. Se cree que la unión ocurre entre adaptadores y “señales específicas de endocitosis” localizadas en las colas citoplasmáticas de los

receptores que deben llevarse al interior. Estos enlaces aseguran que los receptores (y sus ligándos enlazados) queden incluidos dentro de la vesícula revestida en formación y no permanezcan en la membrana plasmática. Las moléculas de adaptina empleadas en la membrana plasmática para formar vesículas revestidas de las incorporadas en las vesículas revestidas formadas por gemación partir de la red trans de Golgi. Al minuto de su formación, la vesícula endocitica revestida pierde su cubierta de clatrina y se convierte en una vesícula de superficie lisa que de ordinario se fusiona con un endosoma temprano. En la mayor parte de los casos, el pH bajo del compartimiento endosomico temprano provoca la liberación del ligando de su receptor. Se cree que la mayor parte de los receptores no enlazados se concentran en una porción de la membrana que los separa del endosoma y retorna los receptores a la membrana plasmática donde pueden participar en otro turno de endocitosis. En algunos casos, igual que con la captación del factor de crecimiento epidérmico (FCE), tanto el receptor como el ligando pueden transportarse al lisosoma para su desdoblamiento. En estos sistemas, la endocitosis sirve como medio para regular el número de moléculas del receptor localizadas en la superficie de la célula. La vesícula revestida (y la vesícula no revestida que se origina de ella) se puede imaginar como un sistema de entrega que transporta un ligando específico desde el espacio extracelular a un sitio particular dentro de la célula. En la mayor parte de los casos, el ligando finalmente se entrega a un lisosoma para procesamiento metabólico adicional. Los mamíferos recién nacidos dependen de la leche de su madre, que les suministra anticuerpos contra posibles patógenos. Estos anticuerpos se captan en el conducto digestivo donde se enlazan a receptores localizados en fosillas revestidas situadas en la superficie apical del epitelio intestinal. En vez de ser transportados a un endosoma, las vesículas revestidas que contienen anticuerpos se transportan a través de todo la longitud de la célula epitelial, 85



donde se fusionan con la membrana plasmática basal y liberan los anticuerpos en el torrente sanguíneo del lactante.

VESÍCULAS CUBIERTAS: Son las vesículas que estas cubiertas por una cesta de clatrina, dichas vesículas cubiertas son transportadas a sitios definidos del citoplasma celular es decir estas vesículas interactuan con filamentos de actina y miosina y estos los movilizan a lugares definidos. Existen vesículas cubiertas que permiten la interaccion de organelos membranosos citoplasmáticos de manera que las vesículas cubiertas formadas por endocitosis seran transportadas hasta las areas lisosomicas. La clatrina es una proteína de la superficie interna que esta constituida por polipéptidos hexagonales, pentagonales que forman cubiertas de una vesícula endocitada. La clatrina no es una proteína de reconocimiento por esta razón las vesículas cubiertas que se desplazan a lugares definidos paulatinamente pierden su clatrina. VESÍCULAS DESNUDAS: Son aquellas que carecen de clatrina y dichas vesículas desnudas no tienen lugares fijos de llegada es decir estas vesículas de dirigen a sitios no definidos en la célula, estas vesículas son transportadas por microtubulos y se dirigen indistintamente al interés de la célula. EXOCITOSIS El transito vesicular no está confinado al interior de la célula, se extiende hacia la membrana plasmática y desde ella. Es justificado considerar en este punto la secrecion celular en relacion con el retículo endoplasmatico y el aparato de Golgi, porque estos organelos intervienen directamente en la síntesis, transporte y liberación de las macromoleculas que seran excretadas por la celula. La secrecion no esta limitada a las celulas animales, puesto que las vegetales secretan polisacaridos y proteinas para fabricar la pared celular. Las proteínas de fabricación reciente, los lípidos y los carbohidratos se envian desde el retículo endoplasmático, por el aparato de Golgi, hasta la superficie celular por medio de vesículas de transporte que se fusionan con la membrana plasmática. Las celulas que participan en la secrecion regulada tipicamente contienen un gran número de vesículas secretorias, estas se originan de vesículas recubiertas de clatrina que sufren gemacion en la Red Trans de Golgi. Conforme las vesículas se desplazan a la superficie apical de la celula, el contenido de las vesículas se concentra cada vez más a medida que el agua sale de las vesículas hacia el citoplasma.

Para que una vesícula secretoria descargue su contenido es necesario que la membrana de la vesícula y la membrana plasmática suprayacente entre en contacto y en seguida se fundan, generando asi una abertura a traves de la cual se puede liberar el contenido de la vesícula, este proceso de fusion de 86



membranas y descarga del contenido, se denominado exocitosis que requiere iones de calcio y la producción de ATP. Las etapas de la exocitosis son un proceso todavía no bien comprendido, el contacto entre la membrana de una vesícula secretoria y la membrana plasmática es mediado por algunas de las llamadas “proteinas de fusion” situadas en la superficie y dentro de la membrana. La fu nción aparente de estas proteinas es establecer contactos a corta distancia entre membranas específicas destinadas a interactuar y fusionarse. Se cree que el contacto entre las membranas puede causar la formación de un pequeño “poro de fusion” revestido de proteina, que rapidamente se dilata para formar una abertura

para descargar. Cualquiera que sea el mecanismo de fusion de la membrana, cuando una vesícula citoplasmática se fusiona con la membrana plasmática, la superficie interna de la membrana vesicular entra a formar parte de la superficie externa de la membrana plasmática, en tanto que la superficie externa de la membrana vesicular formara parte de la superficie interna de la membrana plasmática. Cada molécula que viaja a lo largo de esta vía pasa a través de una secuencia fija de compartimientos delimitados por membranas y con frecuencia sufre modificaciones químicas durante su marcha. La endocitosis y la exositosis son mecanismos acoplados por lo tanto existen leyes fundamentales en la vida de la célula como los mecanismos acoplados es decir si por un lado de la membrana ocurre la endocitosis donde la célula pierde membrana, con la exocitosis gana membrana restituyéndola.

INTERACCIONES ENTRE LAS CELULAS Y SU ENTORNO Aunque la frontera entre una célula viviente y su entorno no viviente es la membrana plasmática, los materiales presentes por fuera de dicha membrana desempeñan un papel muy importante en la vida de la célula. En organismos multicelulares, la mayor parte de las células se organizan en tejidos cuyas células componentes mantienen una relación predecible entre sí y con los materiales extracelulares situados entre las células. Aún células sin relación fija dentro de un tejido sólido, como los leucocitos de la sangre que viaja por todo el cuerpo, deben interactuar de manera muy específica con otras células y los materiales extracelulares con los cuales se ponen en contacto. Estas interacciones regulan actividades tan diversas como migración celular, crecimiento y diferenciación de la célula y organización tridimensional de los tejidos y órganos que aparecen durante el desarrollo embrionario. EL ESPACIO EXTRACELULAR Glucocaliz.| Desplazándose hacia fuera de la membrana plasmática se pueden examinar los elementos extracelulares que rodean los diferentes tipos de células, casi todas las proteínas integrales de membrana y también los lípidos, poseen cadenas cortas de azúcares proyectadas hacia afuera de la membrana plasmática. Estos carbohidratos forman parte de una capa íntimamente aplicadas sobre la superficie exterior de la membrana plasmática denominada glucocáliz (o cubierta celular). Además de los carbohidratos de la membrana, el glucocáliz por lo general contiene otros materiales extracelulares secretados por la célula hacia el espacio externo, donde permanecen íntimamente relacionados con la superficie celular. Este material extracelular es muy prominente en algunos tipos de células, como las epiteliales que revisten el conducto digestivo de los mamíferos. Además de desempeñar un papel clave en las interacciones célula-célula y célula-sustrato, el glucocáliz puede suministrar protección mecánica a la célula y servir como barrera contra las partículas que llegan hasta la membrana plasmática.

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Matriz Extracelular (MEC). Muchos tipos de célula contienen una matriz extracelular, red organizada de materiales extracelulares que se halla más lejos de la vecindad inmediata de la membrana plasmática. A veces, la matriz extracelular consta de una mezcla amorfa mal definida de proteínas y polisacáridos, como se puede observar en el espacio extracelular del tejido conectivo laxo, o puede tomar la forma de una estructura distinta cuyo contorno puede observarse con el microscopio de luz. La MEC es algo más que un material pasivo protector inerte; puede desempeñar un papel clave en la morfología y actividades de la célula. Una de las matrices extracelulares mejor definida es la membrana basal (o lámina basal), capa engrosada de unos 50 a 200 nm que rodea las células musculares y adiposas y que cubren la superficie basal de tejidos epiteliales, como la piel, el revestimiento interno de los conductos digestivo y respiratorio, y de los vasos sanguíneos. Se piensa que la membrana basal puede participar en el mantenimiento de la polaridad de las células epiteliales; en definir la vía de migración celular; en separar tejidos adyacentes, ayudando así a compartamentalizar un órgano en desarrollo, y en actuar como barrera al paso de las macromoléculas. En esta última función, la membrana basal desempeña un papel importante al evitar que las proteínas salgan de la sangre cuando fluyen a través de los poros de las paredes capilares. Esto tiene particular importancia en el riñón, donde la sangre se filtra a través de la doble membrana basal que separan los capilares del glomérulo de las paredes del túbulo renal. La membrana basal también sirve como barrera contra la invasión por células cancerosas er rantes.

Las matrices extracelulares más extensas se observan en tejidos conectivos como cartílago, hueso, tendones y el estroma de la córnea. En estos tejidos, las células que secretan la MEC solo equivalen a una fracción del volumen tisular. La matriz extracelular, más bien que las propias células es la que confiere a estos tejidos sus propiedades identificables: dureza para la matriz ósea, resistencia y flexibilidad para la matriz del cartílago, resistencia a la tensión para la matriz del tendón y transparencia para la matriz del estroma corneal. Componentes de la matriz extracelular animal. Aunque la matriz extracelular puede adoptar diferentes formas en diferentes tejidos y organismos, los materiales que constituyen la MEC pertenecen a un número relativamente pequeños de familias moleculares; cada una de dichas familias pueden contener varias moléculas relacionadas. Iniciaremos aquí con una de las moléculas más importantes y ubicuas de la MEC, la glucoproteina colágena. 88



Colágena Las colágenas son una familia de glucoproteinas fibrosas que forman parte exclusivamente de matrices extracelulares a las que confieren sus propiedades funcionales. Se observan en todo el reino animal y son notables por su alta resistencia a la tensión, que puede medirse como resistencia a fuerzas de tracción. Las colágenas constituyen la proteína simple mas abundantes en el cuerpo humano (mas de 25% de toda la proteína), hecho que refleja la importancia y amplia distribución de las matrices extracelulares. La colágena se produce principalmente en los fibroblastos, células presentes en diferentes tipos de tejidos conectivos y en células epiteliales. Hasta ahora se han identificado más de 15 tipos distintos de colágena. Cada tipo de colágena se restringe a un sitio particular dentro del cuerpo, pero a menudo hay dos o más diferentes tipos reunidos en la misma MEC. Aunque hay grandes diferencias entre los miembros de la familia de la colágena, todos comparten ciertas características estructurales importantes. Toda molécula de colágena es un trímero que consta de tres cadenas de polipéptidos denominadas cadenas . Algunos tipos de moléculas de colágena contienen tres cadenas  idénticas, en tanto que otros son heterotrimeros que contienen dos o tres cadenas diferentes. Por ejemplo, una molécula de colágena tipo I consta de dos cadenas 1 y una cadena 2. Cuando menos en una parte de su longitud, las tres cadenas de polipéptidos que forman una molécula de colágena se enredan sobre sí misma formando una triple hélice característica. Numerosas colágenas, incluyendo los tipos I, II, III, se describen como colágenas fibrilares debido a que se ensamblan en fibrillas semejantes a cables, que a su vez se ensamblan a fibras más gruesas, de ordinario lo bastante grande para observarlas con el microscopio de luz. Las moléculas individuales de colágena no se alinean al mismo nivel en una fibrilla, sino que se escalonan más o menos a la altura de la cuarta parte de la longitud de sus vecinas. Esta disposición escalonada en las moléculas componentes incrementa la resistencia mecánica del complejo y produce los patrones de banda característicos de las fibrillas de colágeno. Las fibrillas aumentan todavía más su resistencia mediante uniones covalentes transversales formadas entre glicina e hidroxilisina de moléculas adyacentes de colágena. Cuando se rompe estos enlaces intermoleculares cruzados, como a veces ocurre en animales que ingieren aminopropionitrilo, una sustancia tóxica presente en semillas de chícharos dulces, el tejido conectivo puede debilitarse mucho.

Entre los diferentes componentes de la MEC, las moléculas de colágena proporcionan al armazón insoluble que determina muchas de las propiedades mecánicas de la matriz. En realidad, las propiedades de un tejido particular con frecuencia se pueden correlacionar con la organización tridimensional de sus moléculas de colágeno. Por ejemplo, los tendones, que conectan los músculos a los huesos, deben resistir tremendas fuerzas de tracción durante los momentos de la contracción muscular. Los tendones contienen una MEC en que las fibras de colágeno se alinean paralelas al eje mayor del tendón, y por lo tanto paralelas a la dirección de las fuerzas de tracción. La córnea también es un tejido notable; debe servir como capa protectora durable en la superficie del globo ocular, pero también ser transparente para permitir el paso de la luz a través del cristalino en dirección a la retina. La gruesa capa media de la córnea es el estroma, que contiene fibrillas de colágeno relativamente cortas organizadas en distintas capas. La estructura en capas del estroma es similar a la corteza de un árbol; las fibrillas de cada capa son paralelas a las otras fibrillas de la misma capa, pero perpendiculares a las fibrillas de las capas situadas en ambos lados. 89



Esta estructura parecida a la corteza de un árbol suministra resistencia a este delicado tejido, en tanto que la uniformidad de tamaño y la disposición de las fibras favorecen la transparencia del tejido.

No todas las colágenas forman fibrillas. Una de las colágenas no fibrilares es el tipo IV, cuya distribución se restringe a las membranas basales. Las membranas basales son láminas de apoyo muy delgadas y las moléculas de colágena tipo IV se organizan formando una red aplanada que sirve como estructura para el depósito de otros materiales extracelulares. A diferencia de la colágena I, que consta de una triple hélice larga ininterrumpida, los trímeros de la colágena IV contiene segmentos no helicoidales interpuestos a lo largo de la molécula y de los dominios globulares en cada extremo. Los segmentos no helicoidales confieren a la molécula flexibilidad, en tanto que los extremos globulares sirven como sitios de interacción entre moléculas que dan al complejo su carácter tipo reticular Proteoglicanos Además de la colágena, las matrices extracelulares típicamente contienen una gran cantidad de un tipo distintivo de complejo proteinicopolisacárido denominado proteoglicano. Un proteoglicano consta de una molécula proteínica central a la cual se unen cadenas de glucosaminglicanos (GAG). Cada cadena de glucosaminglicano se compone de un disacárido repetitivo; o sea, posee una estructura A-B-A-B-A, donde A y B representan dos azúcares diferentes. Los GAG son muy ácidos debido a la presencia de grupos sulfato y carboxilo unidos a los anillos de los azúcares. El papel del colágeno y de los proteoglicanos en la estructura y función de la matriz extracelular se puede ilustrar en el tejido cartilaginoso. El cartílago consta principalmente de una matriz extracelular secretada por condrocitos vivientes que quedan aprisionados en sus propias secreciones. Las moléculas de colágena forman fibrillas distintas, en tanto que los proteoglicanos constituyen un material amorfo a su alrededor que llena el espacio extracelular. Los proteoglicanos de la matriz cartilaginosa están ensamblados en un complejo gigantesco por la unión de las proteínas centrales a una molécula de ácido hialurónico, un GAG no sulfatado.

Debido a las cargas negativas generadas sobre los GAG, los proteoglicanos pueden enlazarse a numerosos cationes, que a su vez arrastran abundantes moléculas de agua. Como resultado, los proteoglicanos forman un gel poderoso hidratado que actúa como “material de empaque” para resistir 90



fuerzas de compresión (aplastamiento). Esta propiedad complementa a las de moléculas adyacentes de colágena que resisten fuerzas de tracción, y suministran un bastidor de apoyo para los proteoglicanos. En conjunto, colágenas y proteoglicanos suministran al cartílago, y a otras matrices extracelulares, fuerza y resistencia a la deformación (se puede obtener una “sensación” de las propiedades mecánicas del cartílago comprimiéndose una oreja o el puente de la nariz). La matriz extracelular del hueso también se compone de colágena y proteoglicanos, pero se endurece por impregnación de sales de fosfato de calcio. Una familia de proteoglicanos, los heparan sulfato proteoglicanos (HSPG), además de ser el principal componente de la MEC, también desempeña algunas funciones en la superficie celular. Los miembros de esta familia incluyen sindecanos, betaglicanos y el CD44. La proteína central de estos proteoglicanos rodea la membrana plasmática, en tanto que los GAG se unen al dominio extracelular de la proteína. Se cree que el dominio citoplasmático de la proteína central interactúa con el citoesqueleto, y que el dominio extracelular (particularmente el GAG unido a este extremo de la proteína) interactúa con varias proteínas de la MEC. Además al fijar las células de la MEC, el dominio extracelular del HSPG puede enlazarse a una gran variedad de moléculas difusibles, incluyendo enzimas y factores de crecimiento. El HSPG es uno de los diferentes tipos de macromoléculas que forman un puente entre los medios externo e interno de la célula. Como tal, esta molécula se encuentra en posición ideal para transmitir señales a través de la membrana plasmática. Dichas señales pueden influir en muchos aspectos de la conducta de la célula, incluyendo cambios en la morfología celular, motilidad, adherencia, crecimiento y diferenciación de la célula.

Fibronectina, laminina y otras proteínas de la MEC . El término “matriz” implica una estructura formado por una red de elementos que interactúan. Este término es muy adecuado para la matriz extracelular, que además de colágena y proteoglicanos contienen varias proteínas que interactúan entre sí con mucha precisión y de manera definida. La fibronectina es una de las proteínas extracelulares mejor estudiadas y revela muchas de las características observadas en la mayor parte de los componentes de otras matrices. Por ejemplo, la fibronectina, igual que otras proteínas de la MEC, contiene una cantidad de dominios distintos, cada uno con funciones particulares. Cada cadena de polipéptido que forma una molécula de fibronectina contiene: 1. Sitios de enlace para otros componentes de la MEC, incluyendo colágenas y glucosaminoglicanos específicos, que ayudan a unir estas diversas moléculas en una red estable interconectada. 2. Sitios de enlace para receptores situados sobre toda la superficie de la célula, que sirve para mantener una unión estable entre la MEC y la célula. Desde hace mucho tiempo se emplea fibronectina en la MEC es muy evidente cuando los tejidos participan en actividades dinámicas, como las observadas durante el desarrollo embrionario. El desarrollo se caracteriza por oleadas de migración celular que obligan a las células a seguir diferentes rutas de una a otra parte del embrión. Muchos estudios indican que las fibrillas con fibronectina a menudo se sitúan en las vías que las células prefieren para desplazarse. Por ejemplo, las células de la cresta neural, que se desplazan afuera del sistema nervioso en desarrollo hacia el interior de casi todas las partes del embrión, atraviesan vías ricas en fibronectina. Estos movimientos celulares pueden 91



inhibirse si se inyectan anticuerpos al embrión, que se enlazan a sitios de reconocimiento de las moléculas de fibronectina y los bloquean. La importancia de la fibronectina en el desplazamiento de la cresta neural puede demostrarse fácilmente in vitro. No es sorprendente que los ratones que carecen de un gen funcional para fibronectina sean incapaces de sobrevivir después de las primeras etapas del desarrollo embrionario.

Otra glucoproteína de la MEC es la laminina, cuyos polipéptidos, igual que los de fibronectina contienen dominios distintos con sitios de enlaces específicos. Además de enlazarse fuertemente a los receptores de la superficie celular, la laminina se puede enlazar a otras moléculas de laminina, a heparansulfato proteoglicanos y a colágena tipo IV, un componente ubicuo de las membranas basales. Se cree que la laminina y las moléculas de colágena del tipo IV se entrelazan con una armazón porosa. Además de su papel estructural, la laminina puede actuar en la capacidad reguladora e influir en el potencial de crecimiento y diferenciación de la célula. La laminina ha sido mejor estudiada en relación con su papel como guía del trayecto de los axones conforme crecen fuera del sistema nervioso central durante el desarrollo embrionario. La laminina esta presente a lo largo de muchas de estas vías en el embrión, y cuando aparece sobre la superficie de un cultivo de neurablastos promueve activamente el desarrollo del axón. Entre otras proteínas de la MEC se incluyen tenascina, entactina y trombospondina. La tenascina es una glucoproteína oligomérica grande que se observa principalmente sobre la superficie de las células embrionarias y varias células tumorales. A diferencia de la fibronectica, que promueve la adherencia celular, la tenascina parece que actúa principalmente como componente antiadherente. Sin embargo, los ratones que se desarrollan sin copias de genes funcionales para tenascina no parecen mostrar efectos patológicos por la ausencia de la proteína. La entactina , componente de la membrana basal donde se enlaza la laminina, puede desempeñar un papel importante en la adherencia y penetración del embrión primitivo de mamífero en el revestimiento del útero durante la implantación. Una gran variedad de células secretan trombospondina en la MEC, y es particularmente en la matriz que rodea el revestimiento de vasos sanguíneos maduros en donde la trombospondina parece inhibir la neoformación de vasos sanguíneos (angeogénesis). La combinación única de los diferentes componentes de la MEC contribuye a las características específicas de cada tipo de tejido. La mayor parte de los componentes de la MEC son grandes macromoléculas compuestas de subunidades con estructura modular y poseen sitios de enlace entre sí. Por consiguiente, las interacciones entre los materiales de la MEC pueden ser muy complejas. Incluso algunas moléculas pueden poseer sitios de enlace con actividades opuestas, por ejemplo, un sitio que promueve la adherencia celular y otro que la inhibe. En estos, la organización supramolecular de los diferentes componentes puede determinar en último término el efecto sobre la conducta de la célula, efecto dinámico que puede cambiar de un momento a otro. RELACIONES Y ADHERENCIA DE CÉLULAS A SUSTRATOS NO CELULARES Ciertos componentes de la MEC, incluyendo fibronectina, laminina y colágeno, tienen capacidad para enlazarse a receptores situados sobre la superficie de la célula. El grupo más importante de receptores que fijan la célula a su microambiente extracelular son las integrinas. Integrinas Las integrinas son una superfamilia de proteínas integrales de membrana compuestas de cadenas de polipéptidos que abrazan toda la membrana, una cadena  y una cadena  unidades mediante enlaces no covalentes. Cuando menos se han identificado 15 diferentes subunidades  y ocho diferentes subunidades . Teóricamente, pueden existir más de 100 pares posibles de subunidades  y  en forma 92



de heterodímeros, aunque el verdadero número está bastante restringido. En la superficie de la célula solo se han identificado unas 20 integrinas diferentes, cada una con distribución tisular específica predecible. Ambas subunidades de integrina,  y , poseen una gran porción extracelular donde se encuentran los sitios de enlace para ligandos específicos; un segmento corto, único, que rodea a la membrana, y un pequeño dominio citoplasmático (40 a 50 aminoácidos de largo) que contiene sitios de enlace para componentes del citoesqueleto. Por lo tanto, las integrinas tienen capacidad para enlazarse a sustancias en ambos lados de la membrana plasmática. De hecho, el nombre “integrina” concuerda con el concepto de que estas proteínas pueden transmitir señales entre los compartimientos extracelular e intracelular como una manera de “integrar” sucesos externos e interno.

En el cuadro 1 se presenta una lista de las integrinas conocidas y de los ligandos claves que se unen a ellas. Puesto que las células individuales pueden expresar varias integrinas diferentes en su superficie dichas células tienen capacidad de enlazarse a distintos componentes extracelulares. En muchos casos, una combinación de integrinas que reconocen diferentes dominios de un ligando extracelular puede ser la que determine el efecto de la MEC sobre la conducta de la célula. Por ejemplo, las células situadas en la capa inferior de la epidermis contienen las integrinas 21, 31 y 51, las cuales pueden ayudar a unir estas células a componentes de la membrana basal subyacente. La liberación de estas células de la membrana basal, requerida para que se desplacen hacia la superficie de la piel, se correlaciona con la pérdida de expresión de las tres integrinas. CUADRO 1: Clasificación de los receptores de integrina según el reconocimiento de las secuencias RGD ____________________________________________________________________________ RGD reconocidas RGD no reconocidas _________________________________ ____________________________________ Receptor de integrina Ligandos clave Receptor de integrina Ligandos clave ____________________________________________________________________________ 3 1 5 1

Fibronectina Fibronectina

11 2 1

v1

Fibronectina

3 1

M 2

Leishmania

4 1

Fibrinógeno Fibronectina Factor Von Willebrand Vitronectina Fibrinógeno Fibronectina Factor Von Willebrand Vitronectina Vitronectina

6 1

11b 3

v3

v5

Colágena Colágena Laminina Colágena Laminina Fibronectina MACV Laminina

12

ICAM-1 ICAM-2

M2

Fibrinógeno ICAM-1

Fibronectina ____________________________________________________________________________ La mayor parte de las proteínas extracelulares que se enlazan a las integrinas lo hacen debido a que contienen la secuencia de aminoácidos arginina-glicina-ácido aspártico (o en la nomenclatura abreviada de aminoácidos RGD). Esta secuencia de tripéptidos se presenta en los sitios de enlace a la célula de fibronectina, laminina y colágena, y de otras proteínas extracelulares. Como ya se mencionó, muchas células se adhieren firmemente a un plato de cultivo recubierto con fibronectina. Si las células se añaden en presencia de un péptido sintético que contiene la secuencia RGD, la célula ya no puede unirse al plato de cultivo; el péptido sintético tiene capacidad para competir con éxito con las secuencias RGD de las moléculas de fibronectina por los sitios de enlace sobre las vb

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integrinas de la superficie celular. Se estima que casi la mitad de todas las integrinas contienen sitio de enlace de RGD. Por consiguiente, las proteínas extracelulares específicas son capaces de enlazarse a varios miembros diferentes de la familia de las integrinas y viceversa. Dada esta redundancia y el hecho de que la afinidad de las integrinas por sus ligandos puede variar según condiciones locales, el tema de las interacciones integrina-ligando es complicado y todavía no comprendido en su totalidad. El enlace de todo los ligandos a las integrinas, sea por secuencias RGD y otras secuencias, requiere la presencia de iones bivalentes, ya sea Mg 2 o Ca2 . El descubrimiento de la importancia de la secuencia RGD en la actividad de la integrina planteó la posibilidad de nuevos tratamientos para padecimientos que afectan la superficie celular. La formación de un coágulo sanguíneo (trombo) en un vaso no dañado puede interrumpir el flujo de sangre a través de órganos vitales y es una de las principales causas de ataque al corazón y accidente vascular cerebral. Uno de los primeros pasos en la formación de un coágulo sanguíneo es la agregación de plaquetas, fragmentos celulares no nucleados que circulan en la sangre. La agregación de plaquetas requiere la interacción de una integrina específica de plaquetas con proteínas solubles de la sangre que contengan RGD, como el fibronógeno y el factor de Von Willebrand, que actúan como uniones para mantener juntas a las plaquetas. Experimentos con animales indican que péptidos sintéticos provistos de RGD pueden inhibir la coagulación de la sangre y son agentes antitrombóticos eficaces en el ser humano. Es evidente que estos agentes deben administrarse con sumo cuidado puesto que pueden interferir con muchos otros procesos mediados por integrinas. Esto puede ilustrarse con una familia de toxinas presentes en el veneno de ciertas serpientes que contienen proteínas con secuencias RGD. Estas toxinas actúan al impedir el enlace a integrinas (por esa razón se les denomina desintegrinas).

Además de su papel en el enlace a materiales extracelulares y la transmisión de señales a través de la membrana plasmática, las integrinas también participan en la formación de dos tipos de estructuras adherentes especializadas: las adherencias focales y los hemidesmosomas. Fijación de células a su sustrato Adherencias focales y hemidesmosomas: Es mucho más fácil estudiar la interacción de las células con la parte inferior de un plato de cultivo que con una matriz extracelular de un animal. Por consiguiente, gran parte de nuestro conocimiento en esta área se obtuvo del estudio de células que se adhieren in vitro a diferentes sustratos. Al principio, la célula tiene forma esférica, como generalmente ocurre en células suspendidas en medios acuosos. Una vez que la célula entra en contacto con el sustrato envía hacia afuera prolongaciones que forman uniones cada vez más estables. Con el tiempo, las células se aplanan y extienden sobre sí mismas hacia afuera del sustrato. La expansión se acompaña de un cambio espectacular en la organización del citoesqueleto, tal vez mediada por un mecanismo de señales transmembrana que comunica el citoplasma con el medio externo.

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Cuando los fibroblastos o las células epiteliales se propagan hacia la superficie inferior de un plato de cultivo, la parte de debajo de la célula no se comprime uniformemente contra el sustrato. En vez de ello, la membrana celular entra en estrecho contacto (casi 10 nm) con la superficie del plato sólo en sitios discretos, dispersos, llamados contactos focales . En la región de contacto focal, la membrana plasmática contiene grupos de integrinas (con mayor frecuencia 51) que conectan el material extracelular que reviste el plato de cultivo con el sistema de microfilamentos del citoesqueleto que contiene actina. La presencia de contactos focales guarda relación inversa con el movimiento de la célula sobre el sustrato; cuanto mayor sea el número de contactos focales, menos movible será la célula.

Los contactos focales son estructuras adherentes características de células cultivadas adheridas a la superficie del plato de cultivo. En el interior del cuerpo se observan uniones firmes entre células y la matriz celular a nivel de la superficie basal de las células epiteliales, donde se unen a la membrana basal subyacente mediante una estructura adherente especializada denominada hemidesmosoma . Los hemidesmosomas consisten en una placa densa situada en la superficie interna de la membrana plasmática con filamentos que corren al interior del citoplasma. A diferencia de los filamentos de los contactos focales, que contienen actina, los filamentos del hemidesmosoma son más gruesos y contienen queratina. Los filamentos que contienen queratina se clasifican como filamentos intermedios, que sirven principalmente para funciones de apoyo; se distinguen de los microfilamentos más delgados que contienen actina y cuya función es contráctil. Los filamentos de queratina del contacto focal se unen a la matriz extracelular mediante integrinas que rodean a la membrana, incluyendo 64.

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La importancia de los hemidesmosomas se puede apreciar en una rara enfermedad, el pénfigo bulloso, en el cual se producen anticuerpos que se enlazan a una proteína presente en estas estructuras adherentes. Las enfermedades causadas por anticuerpos dirigidos contra nuestros propios tejidos se denominan enfermedades autoinmunitarias y son causa de una gran variedad de padecimientos. En casos de pénfigo bulloso, los anticuerpos se enlazan a una proteína antígeno penfigoide bulloso, localizada en las placas de los hemidesmosomas. Esto causa que la capa inferior de la epidermis se separe de la membrana basal subyacente y por lo tanto de la capa de tejido conectivo de la dermis. El paso del líquido al espacio situado debajo de la epidermis provoca graves ampollas en la piel. Adherencia de células a otras células El examen de un delgado corte transversal que pase por los principales órganos revela una compleja arquitectura que implica diversos tipos de células. La formación de estos complicados patrones celulares tridimensionales dentro de los órganos en desarrollo sin duda depende principalmente de interacciones de tipo selectivo entre células similares y no similares. Las pruebas indican que las células pueden reconocer las superficies de otras células porque “saben” con cuales deben interactuar y a

cuales deben ignorar. Es muy difícil estudiar las interacciones de adherencia que ocurren en las partes microscópicas de órganos minúsculos conforme se desarrollan en el embrión. Los primeros intentos para aprender algo acerca de cómo las células se reconocen y adhieren entre si se llevaron a cabo al eliminar un órgano en desarrollo de un embrión, disociando el tejido para formar una suspensión de células únicas y determinando la capacidad de las células para reagruparse en cultivo. En experimentos donde se disociaron y mezclaron células de dos órganos diferentes en desarrollo, inicialmente se aglutinaron para formar una masa mixta. Sin embargo, con el tiempo, las células se desplazaron dentro del agregado y se “autoclasificaron”, de modo que cada célula solo se adhiere a células de su mismo tipo.

Un método experimental diferente, también demuestra que las células de preferencia tienden a adherirse a otras células de su mismo tipo. En este estudio, células en suspensión marcadas con isótopos radiactivos se añadieron a un plato de cultivo cuya superficie estaba cubierta por una monocapa de células, y se permitió que las células marcadas se asentaran sobre la monocapa durante cierto tiempo; a continuación se lavó el plato para liberarlo de células no adheridas y se midió la radiactividad producida por las células adheridas al plato. En experimentos de este tipo, generalmente se observa que el número de células marcadas adheridas al plato es mucho mayor si las células inmóviles de la monocapa son del mismo tipo que las células en suspensión comparadas con células de diferente tipo. Poco se sabía sobre la naturaleza de las moléculas que median la adherencia entre células hasta el desarrollo de técnicas para purificar proteínas integrales de membrana y, más recientemente, aislamiento y clonación de los genes que codifican estas proteínas. Hasta ahora se ha demostrado que cuatro distintas familias de proteínas de membrana median la adherencia de una célula a otra: 1) selectinas; 2) ciertos miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF); 3) ciertos miembros de la superfamilia de las integrinas, y 4) cadherinas. Selectinas Durante el decenio de 1960 se descubrió que los linfocitos eliminados de ganglios linfáticos periféricos, marcados con isótopos radiactivos e inyectados de nuevo al cuerpo, retornaban a sus sitios de origen, fenómeno denominado “regreso a casa de los linfocitos” . Posteriormente se observó que el regreso a casa podía estudiarse in vitro al permitir que los linfocitos se adhieran a cortes congelados de tejido linfoide. En estas condiciones experimentales los linfocitos se adhieren selectivamente al revestimiento endotelial de las vénulas (las venas más pequeñas) de los ganglios linfáticos periféricos. La unión de linfocitos a vénulas podía impedirse con anticuerpos que se enlazan a una glucoproteína específica sobre la superficie del linfocito. Este receptor de linfocitos se denominó LEU-CAM I y posteriormente selectina-L.

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Las selectinas son una familia de glucoproteínas integrales de membrana que reconocen disposiciones específicas de grupos carbohidratos proyectados de la superficie de otras células y se unen a ellos. El nombre de este tipo de receptor de la superficie celular se deriva de la palabra “lectina”, término que describe un compuesto capaz de enlazarse a grupos carbohidrato específicos. Las selectinas poseen un pequeño dominio citoplásmico, un dominio simple que rodea a la membrana, y un gran segmento extracelular que consta de algunos dominios separados, incluyendo el más externo que actúa como lectina. Se conocen tres selectinas: selectina E, que se expresa en las células endoteliales; selectina P, expresada sobre plaquetas y células endoteliales, y selectina L, que se expresa en todo tipo de leucocitos. Estas tres selectinas reconocen un grupo similar de cuatro azúcares presente en los extremos de ciertas cadenas de carbohidratos de glucoproteínas o glucolípidos. El enlace de selectinas a sus ligandos carbohidrato depende de calcio. Como grupo, las selectinas median interacciones transitorias entre leucocitos circulantes y la pared vascular en sitios donde hay inflamación y coagulación. Inmunoglobulinas e integrinas Una de las piedras angulares en el conocimiento de la respuesta inmunológica fue el descubrimiento, en los años 1960, de la estructura molecular de los anticuerpos de origen sanguíneo (IgG). Se observó que las moléculas de anticuerpos constan de una cadena de polipéptidos compuesta de varios dominios similares. Cada dominio Ig, como se llamó, se compone de 70 a 110 aminoácidos organizados en una estructura firmemente plegada. Con el tiempo, fue evidente que los dominios de tipo Ig se encuentran en gran variedad de proteínas que en conjunto constituyen la superfamilia de las inmunoglobulinas, o IgSF. La mayor parte de los miembros de las IgSF son proteínas integrales de membrana presentes en la superficie de los linfocitos que participan en diferentes etapas de la función inmunológica. Algunas de estas proteínas integrales median la adherencia célula-célula independiente de calcio. En realidad, el descubrimiento de dominios semejantes a Ig en moléculas que participan en la adherencia celular en los invertebrados, animales que carecen de un sistema inmunológico típico, sugiere que originalmente las proteínas similares a Ig evolucionaron a partir de mediadores de la adherencia celular y solo en forma secundaria adquirieron funciones como efectores del sistema inmunológico de los vertebrados.

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La mayor parte de las moléculas IgSF de adherencia celular median interacciones específicas de linfocitos con células por ej., macrófagos, otros linfocitos y células blanco requeridas para la respuesta inmunológica. Sin embargo, algunos miembros IgSF, como moléculas de adherencia a células neurales (MACN) median la adherencia entre células no inmunológicas, incluyendo células nerviosas y musculares embrionarias. A partir del modelo de la molécula MACN, es evidente que igual que fibronectina y muchas otras proteínas implicadas en la adherencia celular, las moléculas IgSF para la adherencia de células poseen una estructura modular constituida por dominios individuales compartidos con otras proteínas. Las moléculas de adherencia a células neurales participan en diferentes etapas del desarrollo del sistema nervioso, incluyendo agregación de células migrantes de la cresta neural para formar agregados que posteriormente se desarrollan como ganglios simpáticos, interacción estrecha entre células nerviosas y células de sostén que las rodean, y en la formación de contactos sinápticos entre células nerviosas y sus células específicas. Por ejemplo, si se inyectan anticuerpos contra MACN en un embrión de pollo en desarrollo, se puede interrumpir cada uno de estos procesos. Diferentes tipos de proteínas sirven como ligandos para las moléculas IgSF de la superficie celular. Una proteína IgSF sobre una célula puede enlazarse a la misma proteína IgSF o a una diferente sobre otra célula, por ejemplo, una molécula MACN sobre una célula puede enlazarse al mismo tipo de MACN sobre otra célula, la mayor parte de las integrinas facilitan la adherencia de células con su sustrato, pero unas pocas integrinas median la adherencia de una célula con otra al enlazarse a proteína IgSF en células opuestas. Por ejemplo, la integrina 41 en la superficie de los leucocitos se une a la molécula de adherencia a células vasculares (MACV), una proteína IgSF de la superficie de células endoteliales. Cadherinas Las cadherinas son una familia de cuando menos 12 glucoproteínas relacionadas que median la adherencia celular dependiente de Ca 2+. Los miembros de la familia de las cadherinas se pueden distinguir entre sí por el tipo de células en las cuales se presentan; los miembros mejor estudiados son: cadherina E (epitelial), cadherina N (neural) y cadherina P (placentaria). Estas cadherinas contienen un segmento extracelular relativamente grande que consta de 4 dominios, un segmento único transmembrana y un dominio citoplásmico único.

Las cadherinas se unen a células similares entre sí y de manera preferencial a la misma cadherina presente en la superficie de la célula vecina. Esta propiedad de autoasociación se puede demostrar en 98



células manipuladas por ingeniería genética para que expresen una variedad de las diferentes cadherinas y luego mezclar las células en diferentes combinaciones. Cuando se efectúa este experimento, las células que expresan una especie de cadherina se adhieren preferencialmente a otras células que expresan la misma cadherina. La capacidad de las cadherinas para mediar la adherencia de células semejantes puede explicar los resultados de los primeros estudios, en el cual las células de agregados mixtos “se clasificaron” para formar agrupamientos de células de tipo similar. En realidad, las cadherinas pueden ser el factor aislado más importante para mantener las células reunidas en tejidos firmemente cohesivos. El desarrollo embrionario se caracteriza por cambios en la expresión del gen, en la forma de la célula, en la motilidad celular, en la adherencia de células, y así sucesivamente. Las cadherinas desempeñan un papel clave en algunos de estos cambios. Por ejemplo, durante el desarrollo embrionario algunos sucesos morfogenéticos implican cambiar un grupo de células de la mesénquima (células laxas principalmente no adhesivas) a un epitelio (capa celular organizada fuertemente adherente), o viceversa. Esta transición mesénquima-epitelio se ilustra por el movimiento de células mesodérmicas durante la etapa de gastrulación. En condiciones típicas las células se separan de una capa cohesiva en la superficie de la gástrula primitiva y vagan en regiones interiores como células mesenquimatosas. Después de algún tiempo, muchas de estas mismas células adquieren propiedades adherentes y se ensamblan en un epitelio como los somitas formados a lo largo de la línea media dorsal del embrión. A continuación, en una etapa posterior, las células de ciertas partes del somita pierden su adhesividad y comienzan una vez más a vagar como mesénquima en las extremidades en desarrollo para formar músculo o cartílago, o debajo de la epidermis en desarrollo para formar tejidos dérmicos. La agregación de células en un epitelio, como los somitas, se correlaciona con la aparición de cadherina N sobre la superficie de las células, una propiedad que debe promover la adhesividad mutua entre las células. En contraste, la dispersión de células a partir de un epitelio se correlaciona con la desaparición de cadherina N (y la posible aparición de integrinas que median la adherencia ente una célula y su matriz extracelular). Fijación de una célula a otras células. Uniones adherentes y desmosomas: Las células de ciertos tejidos, particularmente epitelios y músculo cardíaco, son notoriamente difíciles de separar debido a que se mantienen firmemente unidas ente sí por uniones adherentes especializadas. Hay dos tipos principales de uniones adherentes: uniones adherentes y desmosomas . Además de estas uniones, las células epiteliales a menudo contienen otros tipos de uniones célula a célula localizadas a lo largo de su superficie lateral cerca de la luz apical. Considerada en conjunto, esta especie de superficie especializada se denomina complejo de unión intercelular.

Las uniones adherentes (o zonula adherens ) se observan en varios sitios del cuerpo. Son particularmente comunes en epitelios como el que reviste el intestino, donde adoptan la forma de un “cinturón” que rodea a cada célula cerca de su superficie apical, enlazándola a sus vecinas. Las

membranas plasmáticas de una unión adherente están separadas por un espacio de 20 a 35 nm, sitio donde se concentran moléculas de cadherinas. Estas células al parecer se mantienen juntas por uniones dependientes de calcio formadas entre los dominios extracelulares de moléculas de cadherina que 99



sirven de puente entre las brechas de células vecinas. El dominio citoplasmático de las moléculas de cadherina de las uniones adherentes se une mediante miembros de una familia de proteínas citoplasmática, denominadas cateninas, con filamentos de actina del citoesqueleto. Por lo tanto, igual que las integrinas de contacto focal, las cadherinas de la unión adherente conectan el ambiente externo con el citoesqueleto intracelular.

Los desmosomas (o maculae adherens ) son uniones adherentes discoides observadas en varios tejidos, pero más notablemente en epitelios, donde se presentan en situación basal respecto de las situaciones adherentes. Las membranas plasmáticas de un desmosoma están separadas por 20 a 35 nm. La región entre las células ( desmoglea) esta llena con el material ligeramente teñido que se cree actúa como “pegamento” de colágena viscosa. Las placas citoplasmáticas densas sobre la superficie interna de la

membrana plasmática sirve como sitios de fijación para filamentos intermedios en asa (no microfilamentos, como en las uniones adherentes) que se extienden al interior del citoplasma. Estos filamentos intermedios abrazan toda amplitud de la célula interconectando la superficie de los desmosomas situados sobre lados opuestos de la célula. Las desmosomas son particularmente abundantes en tejidos sujetos a esfuerzo mecánico, como la piel y el cuello uterino. La red de filamentos intermedios semeja una cuerda y suministra continuidad estructural y resistencia tensil a toda la capa de células. Las membranas plasmáticas de un desmosoma contiene varios miembros de la familia de la cadherinas (desmogleinas y desmocolinas) que se cree conectan el material extracelular situado entre membranas plasmáticas en aposición con los filamentos intermedios de las placas citoplásmicas. La importancia de las cadherinas para mantener la integridad estructural de un epitelio se ilustra por una enfermedad autoinmunitaria ( el pénfigo vulgar) , en la cual se produce anticuerpos contra una de las desmogleinas, llamados antígeno del pénfigo vulgar. La enfermedad se caracteriza por pérdida de la adherencia de célula a célula en la epidermis y la presencia de grandes ampollas sobre la piel.

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Papel de los receptores de adherencia celular en las señales transmembrana. El esquema muestra cada uno de los cuatro tipos de moléculas de adherencia celular y sus interacciones con los materiales extracelular y citoplásmico. Uno de los papeles de las proteínas integrales de membrana es transmitir información a través de la membrana plasmática, proceso conocido como transmembrana. Por ejemplo, integrina y cadherinas pueden transmitir información entre el medio extracelular y el citoplasma por su capacidad para formar enlaces con el citoesqueleto . Reunión de una integrina con su ligando puede inducir varias respuestas dentro de una célula, incluyendo cambios de pH citoplasmático, concentración de Ca 2+, fosforilación de proteínas y expresión de genes. Estos cambios, a su vez, puede alterar el potencial de crecimiento celular, la actividad migratoria o el estado de diferenciación. La importancia de dichos receptores se puede ilustrar al desarrollar células epiteliales de glándula mamaria en ausencia de glucoproteínas extracelulares, como fibronectina y laminina. Estas células muestran un aspecto aplanado, indiferenciado y producen leche con muy poca proteína. Cuando se añade laminina al cultivo esta proteína se une a las integrinas situadas en la superficie de las células, estimula una transformación de las células para diferenciarlas en células mamarias e induce un incremento 50 veces mayor en la producción de proteínas de la leche. Inversamente, los cambios en el citoplasma pueden generan señales transferibles al exterior a través de la membrana plasmática. Las demostraciones de señales “de adentro hacia fuera” provienen de

estudios efectuado con integrinas cuya conformación puede cambiar según el estado fisiológico de las células. Por ejemplo, las plaquetas de la sangre circulante normalmente no se unen a moléculas de fibrinógeno en la sangre. Sin embargo, cuando se activan en un sitio de lesión vascular, las integrinas 2 3 situadas en la superficie de las plaquetas sufren un cambio de conformación que aumenta su afinidad a fibrinógeno. El enlace de fibrinógeno a integrinas activadas provoca agregación de plaquetas y taponamiento de la herida. La formación de placas de colesterol en la pared de una arteria también puede activar plaquetas y conducir a la formación de un coágulo sanguíneo capaz de obstruir una artería coronaria y provocar ataque al corazón. Uniones herméticas: Sellado del espacio extracelular. Desde hace varios decenios los biólogos saben que cuando se colocan ciertos tipos de epitelio como piel de rana o pared de la vejiga urinaria, entre dos compartimientos que contiene diferentes concentraciones de soluto, la difusión de iones o soluto de un compartimiento al otro a través del epitelio es muy escasa. Dada la impermeabilidad de las membranas plasmáticas no es sorprendente que los solutos no pueden difundir libremente a través de las células de una capa epitelial, pero ¿por qué estas sustancias no pueden atravesar los espacios situados entre las células? La razón se demostró en la época de 1960 a 1970, cuando se describieron contactos especializados denominados uniones herméticas, formadas entre células epiteliales vecinas. 101



Estas uniones ocurren en el extremo más alejado del borde apical de los complejos de unión entre células epiteliales adyacentes. Se cree que los puntos de contacto celular representan sitios donde las proteínas integrales de dos membranas adyacentes se encuentran en el espacio extracelular. Recientemente se purificó la proteína integral de las uniones herméticas y se les denomino ocludina.

El análisis de fracturas por congelación, que permite observar la cara interna de la membrana, muestra que las membranas plasmáticas de la unión hermética contienen fibras interconectadas que corren paralelas entre sí y con la superficie apical del epitelio. Las fibras (o surcos en la cara opuesta de la membrana fracturada) corresponden a hileras de proteínas integrales de membrana alineadas. Las hileras de proteínas de membrana forman una banda continua que rodea por completo la célula como un empaque, haciendo contacto por todos lados con las células vecinas. En consecuencia, las uniones herméticas son uniones ocluyentes; o sea, forman una barrera continua de impermeabilidad que sella el espacio extracelular sobre uno de los lados del epitelio en relación con el otro lado. Las uniones herméticas con gran número de fibras tienden a establecer un mejor sellado en comparación con las uniones de fibras escasas. La capacidad de las uniones herméticas para impedir el paso de moléculas entre las células se puede demostrar sumergiendo un pedazo de tejido en un material electrónicamente denso, como el metal pesado lantano. Cuando se examina posteriormente el tejido en el microscopio electrónico, se observan que el lantano penetra entre las células pero sólo hasta los bordes superior e inferior de las uniones herméticas. Las uniones herméticas que unen las células endoteliales de los capilares cerebrales forman la barrera hematoencefálica, que impide el paso de sustancias de la corriente sanguínea al interior del tejido cerebral. La barrera hematoencefálica protege al cerebro de la penetració n de solutos “indeseados”, pero también evita el acceso de muchos fármacos al sistema nervioso central. Por consiguiente, uno de los objetivos de la industria farmacéutica es desarrollar técnicas para “abrir” las uniones herméticas

del cerebro y permitir el paso de agentes terapéuticos de peso molecular elevado. Es digno de mencionar que algunos iones pequeños e incluso moléculas de agua no pueden penetrar ciertas uniones herméticas, pero en cambio las células del sistema inmunológico capaces de penetrar a los tejidos inflamados pueden atravesar capas epiteliales a través de estas uniones. Se cree que estas células envían una señalan que abre la unión, permitiéndoles el paso. Puesto que durante el paso de los leucocitos no disminuye la resistencia eléctrica de la capa epitelial, se cree que las uniones herméticas deben abrirse alrededor de los leucocitos y mantener estrecho contacto con las células inmunológicas que las atraviesan. Uniones comunicantes o Nexos. Llamados tambien uniones de abertura, uniones con espacio o con hendidura, son sitios entre células animales especializadas para la comunicación intercelular esencial para la coordinación de actividades; ademas, durante el desarrollo son necesarias para la propagación de señales que controlen el crecimiento y diferenciación. Las micrografías electrónicas revelan que estas uniones comunicantes son sitios donde las membranas plasmáticas de células adyacentes se ponen en estrecho contacto entre sí (a una distancia aproximada de 3 nm), pero no entran en contacto directo. En vez de ello, la abertura entre las células es atravesada por “fibras” sumamente finas que en realidad son “cañerías” moleculares

que pasan a través de membranas plasmáticas adyacentes y se abren en el citoplasma de células 102



vecinas. Las uniones comunicantes unen células de casi todos los tejidos de mamíferos; las principales excepciones son el músculo esquelético y la mayor parte del tejido nervioso.

En comparación con otras uniones intercelulares, las uniones con hendidura o nexos muestran una composición molecular simple; consisten casi en su totalidad en una proteína integral de membrana denominada conexina. Las conexinas se agrupan en la membrana plasmática para formar un complejo de múltiples subunidades denominado conexón, que rodea completamente la membrana. Cada conexón se compone de seis subunidades de conexina dispuesta alrededor de un agujero o anillo central de aproximadamente 1.5 nm de diámetro que corresponde al canal hidrofilico. Los conexones poseen un diámetro de unos 8 nm, son ensamblados en algún punto desde que se sintetizan los polipéptidos conexina en el retículo endoplasmatico rugoso, pero antes de llegar a la membrana plasmática. Las conexinas son miembros de una familia multigenica cuando menos se ha aislado una docena de conexina procedentes de diferentes tejidos y también se han clonado sus genes algunas células sintetizan más de un tipo de conexina pero todavía no se ha demostrado de manera concluyente si un solo conexon puede contener más de un tipo de subunidad de conexina. Durante la formación de las uniones con hendidura, los conexones de membranas plasmática de células opuestas se unen entre sí a través de interacciones de dominios extracelulares de las subunidades de proteína. Una vez alineados, los conexones de células adyacentes forman canales completos que conectan el citoplasma de una célula con el citoplasma de una vecina. A veces los conexones se agrupan en regiones especificas formando placas de uniones comunicantes que se visualizan mejor en las replicas de fracturas por congelación. Las uniones con hendidura son sitos de comunicación entre el citoplasma de células adyacentes. La existencia de comunicación intercelular por unión de abertura (CIUA) se manifiesta por el paso de corrientes iónicas o de colorantes debajo peso molecular, como fluoresceína, desde una célula a sus vecinas. Las uniones comunicantes de mamíferos permiten la libre difusión de moléculas con peso molecular aproximado a mil daltons o menos. En contraste con los canales iónicos altamente selectivos que conectan una célula con el medio externo, los canales de las uniones comunicantes son notablemente no selectivos: si la molécula es bastante pequeña pasa a través de la cañería. Las uniones con hendirura desempeñan un papel importante en el paso de corrientes iónicas de una célula a sus vecinas, como se ilustra por ondas de excitación que viajan a través de los músculos cardiaco y liso. Una de las manifestaciones de la interaccion celular es el acoplamiento electrico, las celulas estan eléctricamente acopladas es decir tienen regiones de baja resistencia por las cuales fluye con bastante libertad una corriente electrica transportada por iones. El acoplamiento electrico depende de las uniones con hendidura o nexos. La contracción del corazón de mamífero puede ser estimulada por un impulso eléctrico generado en una pequeña región de tejido muscular especializado llamado nódulo sinoauricular, que actúa como marcapaso del corazón. Los impulsos se propagan con rapidez a través de las células que constituyen la pared del corazón, pasando de cada célula muscular cardiaca al interior de células vecinas por medio de uniones con hendidura que conectan las células. De 103



igual manera, el flujo de corriente a través de las uniones con hendidura que conectan las células de músculo liso en la pared del esófago o del intestino genera ondas peristálticas coordinadas que se desplazan lentamente en dirección caudal al lado de la pared. El hecho de que las uniones comunicantes pueden reunir gran número de células en íntimo contacto citoplasmático constituye en realidad un compartimiento gigantesco relacionados con moléculas de tamaño suficientemente pequeño para pasar a través de los canales de comunicación. Seria de esperar que esta condición tuviese consecuencias fisiológicas muy importantes, ya que algunas moléculas reguladoras sumamente activas, como el AMP cíclico y otros segundos mensajes, son lo bastante pequeñas para atravesar los canales de las uniones comunicantes. Por consiguiente se puede concluir que las uniones comunicantes integran las actividades de células individuales de los tejidos en una unión funcional capaz de responder de manera simultánea aunque sea una parte de las células se expongan al estímulo directo. Las uniones con hendidura también permiten la cooperación metabólica entre las células porque comparten metabolitos clave, como ATP, azucares fosfato, aminoácidos, nucleotidos, vitaminas, iones y muchas coenzimas lo bastante pequeña para atravesar los conductos intracelulares. Plasmodesmosomas Las plantas carecen de uniones especializadas como las observadas en tejidos animales, pero la mayor parte de células vegetales se conectan entre sí por medio de plasmodesmosomas. Los plasmodesmosomas son conductos citoplasmáticos cilíndricos, de 30 a 60 nm de diámetro extendido entre células adyacentes a través de la pared celular interpuesta. Los plasmodesmosomas están revestidos de una membrana plasmática y de ordinario contiene una varilla central densa, el desmotúbulo, derivado de retículo endoplasmático liso de las dos células en contacto. Igual que las uniones de abertura entre células animales, los plasmodesmosomas sirven como sitios de comunicación intercelular que une a las células de un tejido vegetal para formar una unidad metabólica.

La vía de paso entre células vegetales adyacentes presumiblemente se limita al estrecho espacio entre la superficie externa del desmotúbulo y la superficie interna de la membrana plasmática. Estudios acerca del movimiento de colorantes inyectados desde una célula al interior de sus vecinas sugiere, que igual que las uniones de abertura, los plasmodesmosomas normalmente son impermeables a moléculas mayores de unos 1000 daltons. Sin embargo, infecciones por virus, como el virus del mosaico del tabaco, incrementan la permeabilidad de los plasmodesmosomas. Como resultado, las partículas virales intactas a sus ácidos nucleicos pueden pasar entre las células, propagando la infección a través de la planta. UNIDAD DIDACTICA N° 03: CITOPLASMA Y ORGANELOS CELULARES. MATRIZ CITOPLASMÁTICA La matriz citoplasmática o citoplasma fundamental de la célula eucariótica contiene el mismo tipo de componente que una bacteria es decir, moléculas de ARN proteínas celulares, enzimas, etc. Las células superiores poseen, además nuevos componentes que sugirieron por el proceso evolutivo representados principalmente por los elementos citoesqueleticos y por las membranas intracelulares. Estas últimas comprenden el sistema vascular o endomembranoso y los organoides formados por membranas pero que no se consideran parte de aquel, como mitocondrias cloroplastos o peroxisomas. En consecuencia, en la célula eucariótica aparecen diversos comportamientos y subcompartimientos. En términos de dicha compartimentación se pueden reconocer en el citoplasma dos territorios principales: por un lado el interior del sistema de organoides y estructuras membranosas, y por el otro el exterior de este, representando por la matriz citoplasmática o citosol verdadero medio interno de la 104



célula que rellena todos los espacios. El citosol es especialmente notable en las células poco diferenciadas ya que estas poseen un desarrollo relativamente escaso de endomembranas. Las propiedades coloidales de la célula, como las transformaciones básicas del sol o las modificaciones de la viscosidad, dependen fundamentalmente de la matriz citoplasmática amorfa.

En el citosol se produce la mayor parte de las funciones citoplasmáticas, en el se encuentran numerosas macromoléculas, enzimas, ribosomas, la trama del citoesqueleto y un numero variable de cuerpos de inclusión o inclusiones citoplasmáticas que son estructuras inconstantes (deposito de glucógeno, góticas lipídicas o cristales) no rodeadas por membranas. Al realizar el procedimiento de fraccionamiento celular una vez separadas las fracciones nucleares mitocondrial y microsomal se obtiene la fracción sobrenadante soluble o citosol que es la que contiene las proteínas y las enzimas solubles del citoplasma. En sentido estricto, entonces citosol es el término bioquímico o de fraccionamiento celular que designa al componente citoplasmático amorfo denominado matriz citoplasmática. La matriz citoplasmática contiene agua, iones, metabólicos de bajo peso molecular y macromoléculas. Entre estas ultimas se encuentran gran cantidad de proteínas, por lo general del 20 al 25% de las proteínas totales de la célula pertenecen a la matriz citoplasmática, aunque en algunos tipos celulares llegan el 50%. Entre ellas se encuentra las enzimas de múltiples reacciones metabólicas como las de las glucólisis anaerobia, las de las síntesis de proteínas que incluye la totalidad del ARN mensajero, los ARN solubles y los factores y enzimas relacionados con este proceso. CITOESQUELETO. El esqueleto de un animal es un conocido sistema de órganos que consta de elemento endurecido que apoyan a los tejidos blandos del cuerpo y desempeñan un papel clave en la mediación de los movimientos corporales. Las células también tienen un sistema esquelético el citoesqueleto con funciones análogas.

El citoesqueleto se compone de tres estructuras filamentosas bien definidas: microtubulos, microfilamentos y filamentos intermedios, que en conjunto forman una compleja red interactiva . Los microtubulos son estructuras cilíndricas huecas cuya pared se compone de subunidades formados a partir de la proteína tubulina. Los microfilamentos son estructuras finas, sólidas, compuestas de actina y miosina. Se cree que los filamentos intermedios son fibras semejantes a acuerdas compuestas de varias proteínas con estructuras similares.

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Los elementos que constituyen el citoesqueleto funcionan en algunas actividades interrelacionadas: Como bastidor que suministra apoyo estructural que ayuda a mantener la forma de las células por  ejemplo, los enterocitos de mamífero mantiene su forma discoidal gracias al citoesqueleto de espectrina y actina situada sobre la superficie interna de las membranas plasmática de dichas células. Como armazón interno encargado de mantener la posición de diferentes organelos en el interior de  la célula. Esta función particularmente evidente en células epiteliales polarizadas, donde los organelos se disponen siguiendo un patrón definido a lo largo de un eje que va del extremo apical y al eje basal de la célula. Como parte de un mecanismo necesario para el movimiento de los materiales y organelos dentro de  las células, ejemplos de esta función incluye el moviendo de las vesículas de transporte de retículo endoplasmático al complejo de Golgi, la invaginacion de la membrana plasmática durante la formación de la vesículas fagocitarías; la separación de los cromosomas durante la mitosis, y el moviendo de vesículas que contiene neurotransmisores a lo largo de células nerviosas desde el sitio donde se sintetizan en el cuerpo celular hasta el sitio donde se utilizan en el extremo terminal de la célula. Como elementos generadores de fuerzas encargados del movimiento de células de un sitio a otro.  Los organismos unicelulares de o rdinario ejecutan locomoción celular “arrastrándose” sobre la superficie de un sustrato sólida o impulsándose por si mismos a través de su ambiente acuoso con ayuda de estructuras locomotrices especializadas (cilios y flagelos) que sobresalen de la superficie celular. Los animales multicelulares contienen células capaces de amplios desplazamientos, estos diferentes tipos de motilidad celular dependen de los elementos citoesqueleticos. Como sitios para fijar ARN mensajeros y facilitar su traducción a polipéptidos. Cuando las células  se extraen con detergentes no ionicos, que dejan relativamente intacto el citoesqueleto, gran parte del mecanismo de traducción de la célula permanece en el citoesqueleto. Como traductor de señales además de la función mecánica mencionada antes, el citoesqueleto que  con frecuencia entra en contacto con la superficie interna de la membrana plasmática, desempeña un papel clave en la transmisión de señales del ambiente extracelular al interior de la célula. Debemos recordar que aunque los componentes del citoesqueleto en las microfotográfias parecen estructuras estáticas e inmutables, en realidad son dinámicas capaces de reorganizarse con rapidez espectacular. Además, gran parte de las funciones del citoesqueleto requieren muchas proteínas accesorias que no forman parte de los propios filamentos. MICROTUBULOS Estructura y composición Como su nombre indica, los microtúbulos son estructuras cilíndricas huecas que ocurren en casi toda célula eucariota observada con microscopio electrónico. Los microtúbulos son elementos con diversas 106



disposiciones en estructuras además del citoesqueleto, las cuales incluyen el uso mitótico de las células en división y el núcleo central de cilios y flagelos. Los microtúbulos tienen diámetro externo de 24 nm, una pared cuyo espesor es de unos 5 nm y longitud que puede extenderse a todo lo largo a ancho de una célula. Un examén ultra estructural cuidadoso de los microtúbulos muestra que su par es un polímero compuesto de subunidades globulares. Cada subunidad globular consta de una sola molécula de la proteína tubulina. Las subunidades se disponen en hileras longitudinales llamadas protofilamentos, alineados paralelamente al eje mayor del túbulo. En un corte transversal se nota que los microtúbulos casi siempre contienen 13 subunidades que rodean la circunferencia de la pared. Aunque la pared del microtúbulos parece estar formada por subunidades globulares, el ensamble de los microtúbulos ocurre por incorporación de bloques de construcción dimericos cada uno de estos bloques es una unidad que consta de dos moléculas ensambladas de tubulina, una α -tubulina y una ß-tubulina, cada unidad contiene dos componentes (un heterodimero) por lo que el protofilamento integro presenta una estructura asimétrica α -tubulina y una ß-tubulina en un extremo y de una ß-tubulina y α -tubulina en el otro por lo que todos los protofilamentos de un microtúbulos tienen la misma polaridad.

Cuando un polímero se forma de componentes asimétricos todos orientados en la misma dirección (cabeza con cola) a lo largo del eje (αß… αß) entonces el polímero en si es una estructura polarizada con un extremo que contiene moléculas ß-tubulina, distinguible del otro extremo que contiene moléculas α tubulina un extremo del microtúbulo se conoce como extremo mas y el otro como extremo menos . La polaridad estructural de microtúbulos es un factor importante en el ensamblado de estas estructuras y de su capacidad para participar en actividades mecánicas dirigidas. Proteínas relacionadas con microtúbulos Los microtúbulos pueden formarse in Vitro a partir de preparaciones purificadas de tubulina pero los microtúbulos obtenidos de células ordinarias contiene proteínas adicionales denominadas proteínas relacionadas con microtúbulos (PRM) la mayor parte de las PRM que se han identificado solo se observa en el tejido cerebral pero una de estas proteínas denominada PRM 4 es de amplia distribución. Con el microscopio se puede observar que algunas PRM tienen una porción globular o cabeza que se fija al lado del microtúbulo y una porción filamentosa o cola que se extiende hacia fuera de la superficie del microtúbulo. Las PRM pueden interconectar microtubulos para formar ases visibles como puentes transversales que conectan a los microtúbulos entre si, otras PRM a veces incrementan las estabilidad de los microtúbulos alteran su rigidez o influyen en la velocidad de ensamblado. La actividad de las diferentes PRM es controlada por adición y eliminación de grupos fosfato por proteinsinasas en un residuo particular de aminoácidos. Función: Los microtúbulos desempeñan diferentes tareas: 1. Sirve como esqueleto o armazón que proporciona apoyo estructural y ayuda a mantener la posición de los organelos citoplasmáticos. 107



2. Forman parte del mecanismo que desplaza materiales y organelos de una parte a otra de la célula . 3. Son elementos móviles de cilios y flagelos. 4. Son componentes primarios de los mecanismos encargados de la mitosis y la meiosis . Proteínas relacionadas con microtubulos PROTEINAS PESO MOLECULAR FUENTE (KD) PRMIA 350 Tejido nervioso PRMIB 325 Tejido nervioso Vesiquina 295 Tejido nervioso PRM2A, PRM2B 270 Tejido nervioso PRM4 200 Ampliamente distribuido PRM3 180 Ampliamente distribuido Dinamina 100 Tejido nervioso PRM2C 70 Tejido nervioso 50-65 Tau Tejido nervioso Los microtúbulos son lo bastante rígidos para resistir fuerzas de comprensión o de tracción sobre la fibra. Esta propiedad permite a los microtúbulos suministrar apoyo mecánico de manera no muy diferente o como las vigas de acero apoyan un alto edificio de oficinas. Por ejemplo los microtúbulos evitan que las contracciones del citoplasma deformen las células. La distribución de los microtúbulos citoplásmicos en una célula por lo general define la morfología de la misma. También se cree que los microtúbulos participan en el mantenimiento de la organización interna de la célula. El tratamiento de la célula con fármacos fragmentador de microtúbulos puede afectar gravemente la ubicación de los orgánelos membranosos, en particular del complejo de Golgi, este complejo casi siempre se localiza cerca del centro de la célula justo fuera del núcleo. El tratamiento de la célula con nocodazol o colchicina puede dispersar los elementos de Golgi hacia las regiones periféricas de la célula, cuando se elimina el fármaco y los microtúbulos vuelven a ensamblarse las membranas de Golgi regresan al centro de la célula. Microtubulos como agentes de motilidad intracelular Las células vivientes muestran intensa actividad conforme las macromoléculas y los organelos se desplazan dirigiéndose de un sitio a otro, con el microscopio de luz se puede apreciar este “ir y venir ” de partículas materiales dentro de una célula viviente pero el proceso subyacente rara vez resulta fácil de estudiar por la falta de un citoesqueleto altamente ordenado en la mayor parte de los tipos de célula por ejemplo, se sabe que el transporte de vesícula de un compartimiento de la membrana a otro depende de la presencia de microtubulos, porque la interrupción de estos elementos citoesqueleticos con frecuencia detiene el movimiento. Se han aislado dos tipos de proteínas motoras encargadas de los movimientos de materiales citoplasmáticos. Cinesinas En 1985 se asilo unas proteínas motoras del axon gigante de calamar implicada en el desplazamiento de vesículas membranosas y otros organelos desde el cuerpo celular hacia las terminales sinápticas. A esta proteína se le dio el nombre de cinesina, es una proteína grande compuesta de varios dominios distintos incluyendo un par de cabezas globulares que actuando como motores generadores de fuerza y una cola en forma de abanico que se enlaza a la carga que debe arrastrar . La cinesina no es más que un miembro de una superfamilia cada vez más extensas de proteínas parecidas a cinesina, las cabezas o dominio motor de las proteínas parecidas a cinesinas tienen una secuencia semejante que refleja la similitud de su papel en el desplazamiento a lo largo de los microtúbulos, en tanto que las colas tienen secuencias diversas, lo que indica la variedad de cargas que estas proteínas pueden arrastrar. Las rutas seguidas por las vesículas citoplasmáticas son definidas principalmente por microtúbulos. La cinesina tiene una participación muy importante como agente generador de las fuerzas que impulsan el movimiento de estas vesículas. La cinesina también se relaciona con el movimiento de vesículas 108



derivadas del RE, endosómas, lisosomas y gránulos secretorios, en la mayor parte de las células los microtúbulos se organizan con sus extremos positivos situados fuera del centro de la célula, de modo que la cinesina tiende a desplazar vesículas y organelos hacia afuera en dirección a la membrana plasmática de la célula. Dineinas citoplasmáticas La primera proteína motora relación con los microtúbulos se descubrió en 1963 como causante del movimiento en cilios y flagelos. A esta proteína se le denomino dineina, de inmediato se sospechó la existencia de la forma citoplasmática pero transcurrieron más de 20 años antes de purificar y caracterizar una proteína semejante a dineina en el tejido cerebral de mamíferos. Pronto se identificaron proteínas relacionadas en gran variedad de células no nerviosas e igual que la cinesina en la actualidad se cree que la dineina citoplasmática, como se le denomino, es una proteína motora ubicua en células eucariotas. La dineina citoplásmica es una proteína enorme (peso molecular mayor de un millón de daltons) compuesta de cadenas de polipéptidos. La molécula contiene dos grandes cabezas globulares que actúan como motores generadores de fuerza. Ensayos de motilidad in Vitro indican que, en contraste con la cinesina, la dineina citoplasmática se mueve a lo largo del microtúbulo hacia el extremo menos del polímero. Las pruebas sugieren cuando menos 2 papeles para la dineina citoplasmática: 1. Agente generador de fuerza para el movimiento de cromosomas durante la mitosis. 2. Motor dirigido al extremo menos del microtúbulo para mover vesículas y orgánelos membranosos a través del citoplasma. Se cree que en células nerviosas la dineina citoplasmática participa en el movimiento retrogrado de orgánelos citoplasmáticos, ósea, desplazamiento hacia el cuerpo celular de la neurona. En la célula fibroblastica la dineina citoplasmática quizás arrastre orgánelos, incluyendo vesículas de Golgi, ribosomas y endosomas, hacia el centro de la célula. Según este punto de vista, tal vez demasiado simplista la cinesina y la dineina citoplasmática sirvan para mover materiales similares en direcciones opuestas sobre la misma red de vías.

Centros organizadores de microtúbulos La función de un microtúbulo dentro de una célula viviente depende de su localización y su orientación ; por esto es importante entender porque un microtúbulo se forma en un sitio y no en otro. La formación de microtúbulos a partir de los dímeros α y ß-tubulina, ocurre en dos fases distintas; una más lenta de nucleación, en la cual inicialmente se forma una pequeña porción de los microtúbulos y una fase más rápida de alargamiento. La nucleación de los microtúbulos in Vitro ocurre junto con otras estructuras especializadas que debido a su papel en la formación de los microtúbulos se denominan centros organizadores de microtúbulos (COMT). Centrosomas En células animales, los microtúbulos del citoesqueleto de ordinario se forman junto con el centrosoma estructura compleja que contiene dos centríolos en forma de barril rodeado por un material peristrional electrónicamente denso y amorfo. Los centríolos son estructuras cilíndricas de casi 0.2 nm de diámetro y generalmente casi el doble de largo . Con muy pocas excepciones los centríolos contiene 9 fibrillas regularmente espaciadas, en sección transversal cada una aparece como una banda de tres microtúbulos designados túbulos A, B y C conectados al centro del orgánelos mediante un rayo radial . 109



Solo el túbulo A esta completo, cada banda de tres microtúbulos se inclina en ángulo con la superficie de la estructura, dando a los centríolos un aspecto característico de rehilete. Los centríolos casi siempre se encuentran en pares, con los miembros de la pareja situados en ángulo recto entre sí . Típicamente el centrosoma se sitúa cerca del centro de la célula justo por fuera del núcleo. El examen cuidadoso de cortes efectuados a través de la región de centrosoma muestra que es sitio donde convergen numerosos microtúbulos.

Corpúsculos basales y otros centros organizadores de microtúbulos Los centrosomas no son los únicos COMT en la células, por ejemplo, los microtúbulos que forman las fibras de un cilio o de un flagelo se originan de una estructura denominada corpúsculo basal, residente en la base de la estructura en fase de prolongación. Los corpúsculos básales tienen estructura idéntica a la de un centríolo y de hecho los corpúsculos básales y los centríolos pueden originarse entre sí. El flagelo de un espermatozoide, por ejemplo se forma a partir de un corpúsculo basal derivado de un centríolo que fue parte del uso meiotico del espermatozoito del cual se originó el espermatozoide .

Propiedades dinámicas de los microtúbulos Aunque los microtúbulos morfológicamente parecen muy similares, cualquiera que sea su localización dentro de la célula, hay diferencias notables e inestabilidad de estos polímeros. Los microtúbulos del uso mitótico o del citoesqueleto son sumamente lábiles , ósea, susceptibles de destrucción. Los microtúbulos de neuronas maduras son mucho menos lábiles, en tanto que los de cilios y flagelos son muy estables . Las células vivientes pueden someterse a gran variedad de tratamientos que provocan desensamblado de los microtúbulos citoesqueleticos sin interferir con la mayor parte de las otras estructuras celulares. Estos tratamientos incluyen temperaturas frías, presión hidráulica, concentración elevada de Ca2 y ejemplo de varias sustancias químicas, incluyendo colchicina, vinblastina, vincristina, nocodasol y podofilotoxina. El fármaco taxol interrumpe las actividades dinámicas de los microtúbulos por un mecanismo muy diferente; se enlaza al polímero del microtúbulo y evita su desensamblado. 110



La labilidad de los microtúbulos refleja que son polímeros originados por asociaciones no covalentes de los bloques dimericos de construcción. Los tratamientos mencionados antes destruyen causando su despolimerización. Esta facilidad para despolimerizarse revela el potencial de los microtúbulos del citoesqueleto de una célula viviente para sufrir cambios dinámicos en su estado de organización estructural. Los microtúbulos del citoesqueleto en general están sujetos a despolimerización y repolimerización conforme cambian las necesidades de la célula de un momento a otro. Este ciclo de desensamblado y reensamblado puede observarse fácilmente en células cultivadas. Factores que influyen en el ensamblado y desensamblado Los primeros estudios in Vitro establecieron que se requiere GTP para el ensamblado de microtúbulos. El ensamblado de los dímeros de tubulina requiere la unión de una molécula de GTP a la subunidad ßtubulina. No se necesita la hidrólisis de ATP para la verdadera incorporación del dímero al extremo de un microtúbulo, más bien el GTP se hidroliza a GDP poco después que el dímero se incorpora al microtúbulo y entonces el GDP permanece enlazado al polímero ensamblado. Cuando un dímero de un microtúbulo se libera durante el desensamblado y entra a la reserva soluble, el GDP intercambiable es sustituido por un GTP, este intercambio de nucleótidos “recarga” el dímero y le permite servir una y otra vez como bloque de construcción para n microtúbulos.

El ensamblado de un microtúbulo requiere la hidrólisis de GTP y por lo tanto no es una actividad celular sin costo ¿Por qué evoluciono una vida de polimerización tan costosa? la respuesta más probable es que permite a una célula controlar la velocidad de reacciones opuestas, ensamblado y desensamblado, de manera independiente. Un dímero que se va añadiendo a un microtúbulo se encuentra enlazado a GTP, en tanto que el dímero que se libera del microtúbulo se halla unido al GDP. Estos dos tipos de subunidades poseen conformación diferente y por lo tanto distinta afinidad para otras subunidades del microtúbulo. Los dímeros de tubulina y GTP muestran mayor afinidad entre sí que los dímeros de tubulina y GDP, como resultado sería de esperar que la presencia de tubulina y GTP en el extremo de un protofilamento favoreciera la fijación de otra tubulina y GTP en tanto que la presencia de un dímero de tubulina y GDP en esa posición favorecería su liberación del microtúbulo . Recordemos que la hidrólisis 111



de GTP se retrasa un poco respecto de la incorporación de la subunidad, por lo tanto durante momentos de rápido crecimiento de microtúbulos, los dímeros de tubulina se añaden con mayor rapidez que la hidrólisis de su GTP. La presencia de una cubierta de dímeros de tubulina y GTP de alta afinidad en los extremos de los protofilamentos debe favorecer la adicción de más subunidades y el crecimiento de microtúbulos. En contraste cuando la velocidad de hidrólisis de GTP conserva el paso con la tasa de la adicción de subunidades, se favorece el encogimiento del polímero en vez de su crecimiento. El acortamiento de los microtúbulos puede ocurrir con notable rapidez, lo que permite a una célula desensamblar su citoesqueleto microtubular a gran velocidad y anticiparse a un cambio en actividad biológica. Cilios y flagelos Quien quiera que observe una gota de agua del estanque con un microscopio e intente evitar que un protozoario se aleje nadando del campo del microscopio, apreciara la actividad de cilios y flagelos. Cilios y flagelos son estructuras móviles en forma de pelos proyectados desde la superficie de gran variedad de células eucariotas. También las bacterias poseen estructuras conocidas como flagelos pero los flagelos de los procariotas son simples filamentos sin relación evolutiva con su contraparte de células eucariotas. Cilios y flagelos son dos versiones de la misma estructura que pueden distinguirse mejor por su patrón de movimiento. Un Cilio por lo general debe de compararse con un remo cuando la célula se mueve en dirección perpendicular al propio cilio. Durante su latido de potencia el cilio se mantiene en estado rígido, conforme empuja contra el medio que lo rodea. En su latido de recuperación el cilio se toma flexible y ofrece poca resistencia al medio. Los cilios tienden a presentarse en gran número sobre la superficie de una célula y de ordinario su actividad está coordinada en organismos multicelulares, los cilios se utilizan para desplazar líquido, partículas materiales a través de diferentes conductos por ejemplo en el hombre el epitelio ciliado que reviste el conducto respiratorio impulsa hacia afuera de los pulmones el moco y los desperdicios atrapados.

En condiciones típicas, los flagelos son más largos que los cilios y se presentan en menor número sobre la superficie de una célula, a diferencia de los cilios el latido de los flagelos es ondulatorio con varias ondas presentes a cada momento a lo largo de cada flagelo . El latido de un flagelo genera una fuerza que impulsa hacia adelante o arrastra una célula en dirección paralela en dirección longitudinal del flagelo. En organismos multicelulares los flagelos se presentar principalmente en la cola del espermatozoide donde su movimiento impulsa a la célula productiva hacia la superficie del ovulo . Estructura de cilios y flagelos. Una microfotografía electrónica de la sección transversal de un cilio o de un flagelo es una de las imágenes más familiares en biología celular. Toda la extensión del cilio o del flagelo está cubierta por una membrana que se continúa con la membrana plasmática de la célula. El centro del cilio denominado axonema consta de 9 microtúbulos periféricos doble. Todos los microtúbulos del axonema tienen la 112



misma polaridad: su extremo más se encuentra en la punta de la prolongación y su extremo menos en la base. Cada doblete periférico consta de un microtúbulo completo. La estructura básica del axonema fue descrita por primera vez en 1954 por Don Fawcetr y Ketth Porter, de la universidad de Harvard. Conforme la resolución del microscopio electrónico aumentaba, algunos elementos menos evidentes se hicieron visibles. Se observaron túbulos centrales incluidos dentro de prolongaciones que forman la parte central, conectada a los túbulos A de los dobletes periféricos mediante un conjunto de rayos radiales. Los dobletes se conectan entre sí por un puente ínter doblete compuesto de una proteína elástica, la nexina. De particular importancia fue la observación de que un par de brazos, un brazo externo y un brazo interno se proyectan desde el túbulo A en dirección anterógrada (cuando se observa el cilio desde la base hacia la punta). Un corte longitudinal, ósea una sección del axonema paralela a su eje longitudinal, revela la naturaleza continua de los microtúbulos y la naturaleza discontinua de los otros elementos: los rayos radiales por ejemplo ocurren típicamente en grupos de tres repetidos cuando mucho a 96nm.

Filamentos intermedios Durante muchos años el microscopio electrónico revelo la presencia de gran número de células con filamentos sólidos no ramificados de superficie lisa y un diámetro de 10 nm intermedio entre los microtúbulos y los microfilamentos. Dadas las dimensiones relativas de estas estructuras se les denomino filamentos intermedios (FI). Los filamentos intermedios se ramifican a través del Citoplasma de gran variedad de células animales y con frecuencia muestran un patrón espacial semejante a microtúbulos con los cuales pueden conectarse, hasta ahora, los filamentos intermedios solo se han identificado con certeza en células animales. A diferencia de microfilamentos y microtúbulos, los FI son un grupo de estructuras químicas heterogéneas codificadas en el ser humano cuando menos por 60 genes diferentes. Con base en su distribución en los tejidos, también según criterios bioquímicos, genéticos e inmunológicos, las subunidades del polipéptido de los FI se pueden dividir en 6 clases principales. La mayor parte de los polipéptidos, si es que todos, comparten disposición similar de dominios que les permite formar filamentos muy parecidos. Los más notable es que cada polipéptido, contiene un dominio central alfa helicoidal en forma de barra de longitud similar y secuencia homologa de aminoácidos. Este dominio posee a cada lado dominios globulares de tamaño y secuencia variable. Dos de estos polipéptidos interactúan espontáneamente conforme sus barras alfa-helicoidales se entrelazan en una bobina enrollada para formar un dímero parecido a una cuerda de 45 nm de longitud aproximadamente. Los dos polipéptidos se alinean paralelos entre sí con la misma orientación, por lo que el dímero presenta polaridad con un extremo definido por el C Terminal de los polipéptidos y el extremo opuesto por el N Terminal.

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Ensamblado y desensamblado de filamentos intermedios. A diferencia de los microtúbulos y microfilamentos que se ensamblan siguiendo una sola vía, los filamentos intermedios al parecer puede formarse en varias vías encargadas de sintetizar filamentos de espesor y numero de subunidades variables. Además el ensamblado de los FI no se acompaña de nucleótidos. Se cree que la unidad básica de ensamblado es un tetrámero formado por los dímeros que permanecen alienados lado a lado en disposición escalonada con sus extremos N y C terminales apuntando en dirección opuesta (antiparalela), puesto que los dímeros apuntan en dirección opuesta, el tetrámero carece de polaridad. Los tetrámeros se reúnen en ambos lados y ambos extremos para forman intermediarios mal descritos que se ensamblan para formar el filamento final, como bloques de construcción tetramericos carecen de polaridad, lo mismo ocurre con el filamento ensamblado, otra característica que distingue a los filamentos intermedios de otros elementos citoesqueleticos.

Tipos y funciones de los filamentos intermedios Los filamentos intermedios observados en células epiteliales (incluyendo células epidérmicas, hepatocitos, y células acinares pancreáticas) se componen de 2 tipos de queratina. Tipo 1 acida y tipo 2 neutra y básica. Se han identificado unos 15 miembros de cada tipo de queratina. Los filamentos intermedios queratinizados siempre constan de heterodimeros que contienen un miembro de cada tipo de polipéptido de queratina. Los filamentos de queratina de las células epiteliales forman una elaborada red semejante a una canasta que rodea al núcleo y se ramifica a través del citoplasma. Muchos filamentos terminan en placas citoplásmicas de los desmosomas y hemidesmosomas que fijan estas células y a la membrana basal subyacente. Además de microtúbulos y microfilamentos, el citoplasma de las neuronas se encuentra lleno de haces de filamentos intermedios laxamente empacados cuyos ejes largos se orientan en forma paralela al axón de la célula nerviosa, a estos filamentos intermedios o neurofilamentos como se les denomina se componen de por lo menos 3 tipos distintos de proteínas (NF-L, NF-H y NF-M, todas del grupo tipo 4) que se copolimerizan para forman el filamento intacto, esta red de neurofilamentos tal vez constituya el principal componente del armazón estructural que apoya a los largos axones de una extensa neurona mielinizada. Los intentos para demostrar las funciones de los diferentes tipos de filamentos intermedios no siempre han sido satisfactorios. En algunos de los primeros estudios, se inyectaron anticuerpos contra proteínas de filamentos intermedios en células cultivadas provocando una desorganización espectacular de la 114



disposición normal de los FI sin causar incapacidad fisiológica o alguna evidencia de las células tratadas. Esta observación, junto con el hecho de que los filamentos intermedios al parecer están ausentes en células vegetales, protistas y algunas células animales, sugiere que los filamentos intermedios no participan en procesos esenciales, como la mitosis y la citocinesis. En vez de ello se concluyó que los FI proporcionan estabilidad mecánica a las células y realizan funciones especiales en tejidos específicos. Los recientes esfuerzos para conocer la función de los filamentos intermedios se apoyan en salones manipulados con ingeniería genética que producen polímeros FI alterados a mayores cantidades que lo normal. Aunque estos estudios no aclaran, necesariamente el papel preciso de los filamentos intermedios, ilustran la importancia de estas estructuras para la vialidad de las células. Microfilamentos Las células muestran motilidad notable, por ejemplo la cresta neural de las células de un vertebrado sale del sistema nervioso en desarrollo y atraviesa toda la amplitud del embrión formando productos tan diversos como las células pigmentadas de la piel y el cartílago de las mandíbulas. De manera similar, legiones de leucocitos patrullan los tejidos del cuerpo en busca de desperdicios y microorganismos. Algunas partes de las células muestran igual motilidad en el borde de una herida, amplias prolongaciones de las células epiteliales actúan como dispositivos móviles que ayudan a empujar la capa de células sobre la región dañada y sellar la herida. De manera similar, el borde delantero de un axón envía prolongaciones microscópicas que reconocen el sustrato y guían a la célula hacia un objetivo sináptico. Todos estos diferentes ejemplos de movilidad comparten cuando menos un elemento común: dependen de la presencia de microfilamentos, que es el tercer tipo en importancia de elementos citoesqueleticos. Los microfilamentos miden cerca de 5 a 7 nm de diámetro y se componen de la proteína actina. En 1990 se dio un gran paso en la investigación del citoesqueleto, cuando Kenneth Colmes y sus colegas del Max Planck instituto de Alemania, determinaron la estructura tridimensional de la actina del músculo de conejo a nivel de resolución atómica mediante cristalografía de rayos X. Cada molécula de actina tiene la forma de un cacahuate con dos dominios separados por una hendidura profunda y conectados entre sí por una corta sección o bisagra del eje longitudinal. En presencia de ATP, estas subunidades de actina o actina G se polimerizan siguiendo un patrón de cabeza y cola para formar un filamento flexible compuesto de 2 cadenas de moléculas de actina entrelazadas en una doble hélice. Los términos “filamentos de actina”, “microfilamento” y actina F son todos sinónimos para este tipo de filamento de doble cadena. Puesto que cada subunidad de actina tiene polaridad y todas las subunidades del filamento de actina apuntan en la misma dirección, el microfilamento entero también tiene polaridad, según el tipo de células y la actividad en la que participan los filamentos de actina, se pueden organizar en disposiciones altamente ordenadas redes laxamente definidas o haces apretados. La actina se identificó desde hace más de 50 años como una de las principales proteínas contráctiles de la célula muscular. Desde entonces la actina se identifica como una proteína principal en casi todos los tipos de células eucariotas observadas. Las especies vegétales y animales evolutivamente elevadas poseen algunos genes que codifican actina que en conjunto forman una familia de polipéptidos estrechamente relacionados cuyos miembros se especializan en diferentes tipos de motilidad.

La estructura de la actina se ha conservado notablemente en todo el curso de la evolución, por ejemplo la presencia de aminoácidos de las moléculas de actina de células de levadura y del músculo esquelético de conejo son 88% idénticas. En realidad los filamentos de actina de diversas fuentes pueden copolimentarse para formar filamentos híbridos. 115



La identificación de filamentos de actina en determinada célula se puede lograr utilizando una prueba citoquímica basada en que los filamentos actina, cualquiera que sea su origen, interactúan de manera muy específica con la proteína miosina. Para facilitar la interacción se fragmenta miosina purificada con una enzima proteolítica en dos o tres partes una de las cuales ( fragmento de meromiosina pesada (MMP) o su subfragmento S1 más pequeño ) se enlaza a las moléculas de actina a todo lo largo del microfilamento. Además de identificar los filamentos que contienen actina, la MMP o los fragmentos S1 se enlazan de modo que revelan la polaridad del filamento. El extremo de microfilamento al cual se fijan los fragmentos de miosina tiene aspecto puntiagudo, y el otro externo presenta púas. Ensamblado y desensamblado de microfilamentos Los monómeros de actina deben enlazarse en un nucleótido de adenosina por lo regular ATP, antes de polimerizarse. El papel de ATP en el ensamblado de la actina es similar al del GTP en el ensamblado de microtúbulos. El ATP relacionado con monómeros de actina se hidroliza a ADP en algún momento luego de su incorporación al filamento de actina en crecimiento. Por consiguiente, cuando las células están ensamblando filamentos de actina a gran velocidad, el extremo del filamento contiene un casquete de subunidades actina- ATP que impide el desensamblado del filamento y favorece su ensamblado continuo. En el tubo de ensayo es fácil lograr la polimerización y despolimerización de filamentos de actina, por lo que las condiciones que favorecen el ensamblado y desensamblado de microfilamentos es un proceso bien comprendido.

Miosina: molécula motora de los filamentos de actina Anteriormente se examinó la estructura y acciones de dos motores moleculares: cinesina y dineina, que operan sobre vías en los microtúbulos. Hasta ahora todos los motores conocidos que operan junto con los filamentos de actina son miembros de la superfamilia miosina. Inversamente, la única función conocida de la miosina es actuar como sistema generador de fuerza en presencia de actina. Todas las miosinas estudiadas se mueven hacia el extremo más de los microfilamentos. Falta por determinar si las células contienen o no motores moleculares que se muevan hacia el extremo menos del microfilamento.

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La miosina se aisló por primera vez del tejido muscular esquelético de mamíferos y posteriormente de gran variedad de células eucariotas, incluyendo protozoarios vegetales evolutivamente elevados, células no musculares de animales y tejido muscular cardiaco y liso de vertebrados. Las miosinas por lo general se dividen en dos clases: la miosina convencional (tipo II) y la no convencional (tipo I), ambos tipos de miosina se presentan juntas en muchas células eucariotas. Las moléculas de tipo II son las mejores conocidas de los dos tipos. Miosinas II Las proteínas de tipo miosina II generan fuerzas en diferentes tipos de tejido muscular y también en varias actividades no musculares incluyendo división de una célula en dos mediante citocinesis. Cada molécula de miosina II consta de seis cadenas de polipéptido (un par de cadenas pesadas y dos pares de cadenas ligeras) organizadas para producir una proteína altamente asimétrica. Cada molécula contiene una larga cola en forma de varilla fija a un extremo de dos cabezas bulbosas globulares. La cola está formada por el entrelazamiento de secciones alfa-helicoidales de las dos cadenas pesadas para formar una espiral alfa-helicoidal enrollada. La disección de la molécula de miosina mediante procedimientos leves de digestión proteolítica produce varios fragmentos. Los dos sitios susceptibles a proteasas en la cola son porciones no helicoidales de la cadena pesada que se cree actúan como “bisagras” flexibles que ayudan en las funciones motoras en la molécula.

Miosina I En 1973, Thomas Pollard y Edward Korn, de los Nacional Institutes of Health (NIH), de Estados Unidos, describieron una proteína similar a miosina extraída del protozoario Acanthamoeba . A diferencia de las miosinas convencionales esta miosina más pequeña sólo tiene una cabeza y es incapaz de formar filamentos por polimerización in vitro . Desde entonces se aislaron en varios tipos de células otras miosinas de una sola cabeza y dominios de cola muy variables que se agruparon para formar la miosina clase I. Las proteínas de la miosina I consta de una sola cadena pesada y una o más cadenas ligeras. Igual que las miosinas II la miosina I puede generar in vitro un movimiento dependiente de ATP a lo largo de filamentos de actina. El mejor conocimiento de la función de las miosinas clase I proviene de estudios efectuados en células manipuladas por ingeniería genética del moho del fango Dictyostelium , cuyo único gen misiona II se pude borrar o suprimir funcionalmente. Las células tratadas de esta manera solo expresa miosina I, pero tienen capacidad de locomoción y fagocitosis normales, sin embargo, estas células no pueden dividirse, puesto que la separación del citoplasma en dos partes (citocinesis) depende de manera estricta de miosina II. Los anticuerpos fluorescentes contra miosina I tienden a localizarse cerca de la membrana plasmática, lo que apoya la hipótesis de que estas moléculas de miosina de una sola cabeza generan fuerzas a nivel de la superficie de la célula. La miosina I también se encuentra asociada a orgánelos membranosos y se cree que es la proteína motora que desplaza vesículas citoplásmicas a lo largo de vías constituidas por microfilamentos. ORGANELOS CELULARES

RIBOSOMAS El proceso de síntesis de proteínas, conocido también como traducción de la información genética, se lleva a cabo en las células de los organismos en una maquinaria biológica universal muy compleja, llamada 117



en su conjunto aparato traductor. Este proceso involucra una serie de reacciones que permiten la decodificación de la información genética contenida en las moléculas de los transcritos o ARN mensajero (ARNm), correspondientes a cada proteína que va a ser sintetizada. Participan en este proceso enzimas, cofactores proteicos y no proteicos, moléculas de ARN de transferencia, los transcritos y los RIBOSOMAS estos últimos constituyen la parte central del aparato traductor. Los mecanismos necesarios para ordenar a los ARN de transferencia (ARNt) a lo largo del ARNm son algo complicados. Requieren de los ribosomas, cuya primera tarea es localizar el codón de iniciación en el extremo 5’ del ARNm y acomodarlo de modo tal que el encuadre para la lectura de los siguientes tripletes sea el adecuado. Luego el ribosoma se desliza hacia el extremo 3’ del ARNm, traduciendo esos

tripletes en aminoácidos, los cuales uno por vez son traídos por los respectivos ARNt. Las reacciones que ligan a los aminoácidos entre sí (uniones peptídicas) tienen lugar también en el ribosoma. Cuando el ribosoma arriba al codón de terminación (en el extremo 3’ del ARNm) cesa la sínte sis proteica y la proteína es liberada. Como puede apreciarse, en las células los ribosomas constituyen las “fábricas” de las proteínas.

Biogénesis de los componentes del ribosoma. Una célula típica contiene millones de ribosomas en su citoplasma. En un eucarionte, las subunidades ribosómicas se forman en el nucléolo dentro del núcleo por la asociación de ARN ribosómico (ARNr) recién transcriptos con las proteínas ribosómicas, que han sido transportadas hacia el núcleo después de su síntesis en el citoplasma. Una observación importante confirmo la relación del nucléolo con la síntesis de ribosomas. Por consiguiente, el nucléolo más que un orgánulo puede considerarse una estructura temporal, expresión morfológica de la transcripción del ARNr. Su presencia y actividad van estrechamente unidas a la necesidad de ribosomas en la célula y por tanto, a la fabricación de proteínas. Los genomas procarióticos o eucarióticos contienen copias múltiples de genes de ARNr. La combinación de un gran número de copias y promotores fuertes para los genes de ARNr es lo que le permite a las células mantener niveles elevados de ribosomas. En los eucariontes, estos genes están en el nucléolo formando racimos, y es ahí en donde se efectúa el procesamiento del ARNr y el ensamblaje de las proteínas ribosomales para generar a las subunidades ribosómicas las cuales son luego exportadas al citoplasma para tomar parte en la síntesis de proteínas. La formación de los ARNr maduros se produce por procesamiento de los transcritos primarios de elevado peso molecular. Los genes que codifican para los ARNr son colinealmente transcritos dando lugar a moléculas de pre-ARNr las cuales son procesadas para dar origen a las distintas moléculas maduras de ARNr. A diferencia de los genes para los ARNr los que codifican para las proteínas ribosomales se encuentran en unas muy pocas copias en el genoma. Por tanto, los mecanismos que regulan su expresión son también diferentes. La coordinación de la síntesis de las moléculas de proteínas ribosomales entre si se logra a través de regulación tanto a nivel transcripcional como postranscripcional. En eucariontes la síntesis de las proteínas ribosomales también se regula a nivel traduccional. Los ARNm que codifican para las proteínas ribosomales (pre ARNm) de eucariontes contienen una secuencia peculiar de nucleótidos ricos en pirimidinas en la zona 5’ no traducible de sus mensaje s. 118



Estructura de los ribosomas Cada ribosoma está compuesto por dos subunidades identificadas con las siglas 40S y 60S. Estos números hacen referencia a sus coeficientes de sedimentación, es decir, a las velocidades con que las subunidades sedimentan al ser ultracentrifugadas (la subunidad 60S, por la acción de la fuerza centrífuga, migra más rápidamente hacía el fondo del tubo). Las subunidades 40S y 6OS, juntan formas la unidad 80S, es decir un ribosoma completo. Cada subunidad ribosómica se halla integrada por una o más moléculas de ARNr, más un determinado número de proteínas. Así, la subunidad 40S contiene el ARNr 18S más 33 proteínas, mientras que la subunidad 60 S se integran con los ARNr 28S, 5,8S y 5S más 50 proteínas. Dado que las 83 proteínas ribosómicas son construidas a partir de sus respectivos ARNm, puede decirse que en la formación del ribosoma intervienen 85 genes (83 corresponden a las proteínas, uno al ARNr 45S y otro al ARNr 5S)

El ensamblaje de las proteínas ribosómicas con los ARNr tiene lugar en el nucléolo, de modo que estas proteínas sintetizadas en los ribosomas citosólicos deben primero ingresar en el núcleo y luego, como integrantes de las subunidades ribosómicas, volver al citoplasma. Las proteínas de la subunidad menor se denominan S1, S2,… S33 (S por small) y las de la subunidad mayor L1, L2..., L50 (L por large).

Cada ARNr exhibe varias asas a lo largo de su molécula debido al aparcamiento de determinadas secuencias complementarias de nucleótidos existentes en la propia molécula. Por consiguiente en algunos tramos de los ARNr se forman dobles hélices semejantes a los del ADN. Estos apareamientos tienen por función establecer la configuración tridimensional de los ARNr, al permitir que sus partes puedan combinarse adecuadamente con las proteínas ribosómicas.

En la subunidad 40S la disposición de algunas proteínas da lugar a la formación de dos áreas especiales, una al lado de la otra, denominadas sitio P (por peptidil) y sitio A por (aminoacil). Además en la subunidad mayor se da la formación de un túnel por el cual saldría la cadena polipeptídica a medida que se sintetiza. Las unidades ribosómicas se reparten el trabajo llevado a cabo por los ribosomas. Así, la subunidad menor coloca a dos ARNt consecutivos cerca del ARNm para su mutua ligazón, mientras que la subunidad mayor cataliza las uniones peptídicas y asiste a los factores que actúan en los distintos pasos de la síntesis proteica. Es posible que la función catalítica de la subunidad mayor esté en manos de algunos de sus ARNr y no de sus proteínas. Cada ARNm suele traducirse no por uno sino por varios ribosomas a la vez, los cuales se deslizan por su molécula siguiendo la dirección 5’ – 3’, en fila india, separados unos de otros por una distancia de

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alrededor de 30 codones. Tales asociaciones que son claramente detectables en las imágenes ultra microscópicas, se denomina polirribosomas. Los ribosomas pueden encontrarse libres en el citosol o asociados a las membranas del retículo endoplasmático. En el primer caso elaboran proteínas destinadas al núcleo (por ejemplo, histonas, proteínas ribosómicas, factores de transcripción, etc.), a las mitocondrias, a los peroxisomas o al propio citosol. En el segundo caso, las proteínas son volcadas en el interior del retículo endoplasmático o retenidas en su membrana y pueden permanecer en este orgánelos o ser transportadas por medio de vesículas de transporte al complejo de Golgi, desde donde pasaran a los lisosomas; a la membrana plasmática o bien serán secretadas al exterior.

BIOSÍNTESIS DE PROTEINAS. La expresión de la información genética es el proceso de interpretación de la información genética contenida en el ADN, cuya expresión se manifiesta en forma de polipéptidos a través de una serie de mecanismos complejos a nivel intracelular. Desde el punto de vista bioquímico, es un proceso anabólico en el que a partir de aminoácidos se construyen grandes macromoléculas llamadas proteínas. La síntesis de proteínas, etapa final de la expresión génica, es un proceso importante porque estas son moléculas indispensables para la vida. Las proteínas se encuentran constituyendo el coloide celular, el citoesqueleto, los orgánelos citoplasmáticos, las membranas celulares y la sustancia intercelular. Existen proteínas conocidas como enzimas que son importantes como aceleradores de las reacciones químicas a nivel celular, cualquier alteración en su síntesis involucra problemas fisiológicos que conllevan a la muerte celular, o alguna insuficiencia en el ser vivo. La síntesis de las proteínas puede dividirse en tres etapas, llamadas de iniciación, de elongación y de terminación. La etapa de iniciación es regulada por la presencia de ciertas proteínas denominadas factores de iniciación (IF), que dan lugar a dos hechos separados pero concurrentes, uno en el extremo 5’ del ARNm

y otro a nivel de la subunidad menor del ribosoma. El primero involucra al cap y a una secuencia de nucleótidos aledaña, localizada entre el cap y el codón de iniciación. Estas estructuras son reconocidas por el factor IF4, con el cual se ligan. En el segundo, el metionil-ARNt, junto a un GTP, se une a la subunidad menor del ribosoma, participando en esta reacción el factor IF2. Logrados ambos acondicionamientos, interviene el factor IF3, que adosa el extremo 5’ del ARNm a una

de las caras de la subunidad menor del ribosoma. Esta subunidad, tras deslizarse por el ARNm unos cuantos nucleótidos, ayuda al anticodón UAC del metionil-ARNt a localizar el codón AUG de iniciación. El metionil ARNt se detiene luego de producirse un correcto encuadre entre los tripletes complementarios del codón y el anticodón.

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Como consecuencia, el codón de iniciación queda acomodado en el sitio P de la subunidad menor y el segundo codón del ARNm queda invariablemente ubicado en el sitio A de dicha subunidad , al lado del sitio P. La etapa de iniciación culmina al combinarse la subunidad mayor del ribosoma con la menor para formar un ribosoma completo. Entre las citadas subunidades quedan encerrados los dos primeros codones del ARNm, el AUG de iniciación unido al metionil-ARNt en el sitio P y el segundo codón en el sitio A. La etapa de elongación comienza al acercarse otro aminoacil-ARNt éste compatible con el segundo codón del ARNm, con el cual se une al sitio A. Al quedar ambos aminoacil-ARNt cerca, el aminoácido situado en el sitio P (una metíonina), al tiempo que se desacopla del metionil-ARNt, se liga mediante una unión peptídica al aminoácido ubicado en el sitio A. Se forma de este modo un dipeptidil-ARNt, que permanece ubicado en el sitio A. Su permanencia en ese sitio es breve, entre tanto, fuera del ribosoma, esperando para ingresar, se encuentra el tercer codón del ARNm, al que se le ligará el correspondiente aminoacil ARNt. Esta reacción es mediada por un factor de elongación llamado EFl y consume energía, que es aportada por una molécula de GTP. De inmediato el ARNm se desplaza en dirección de su extremo 5’, por un proceso l lamado translocación. Lo hace mediante el factor de elongación EF2, que consume la energía aportada por otro GTP . El corrimiento del ARNm hace que el codón de iniciación sea desalojado del sitio P y por consiguiente del ribosoma, el segundo codón se mude del sitio A al sitio P y el tercer codón ingrese al sitio A vacante. Lógicamente, el corrimiento de los codones desplaza también a los respectivos ARNt, por lo que el ARNt sale del ribosoma no tarda en desprenderse del codón de iniciación, el dipeptidil-ARNt pasa al sitio P y el tercer aminoacil ARNt se acomoda en el sitio A.

El paso siguiente comprende la formación de una nueva unión peptídica, esta vez entre el dipéptido previo desacoplamiento del dipeptidil ARNt y el aminoácido del tercer aminoacil ARNt. Tal unión da 121



lugar a un tripeptidil-ARNt, que permanece en el sitio P hasta la próxima translocación de ARNm . Los procesos arriba citados se repiten en forma consecutiva codón tras codón, formándose en el cuarto paso un tetrapeptídil-ARNt y luego peptidil-ARNt cada vez más largos, que se translocan del sitio A al P conforme se suceden las uniones peptídicas. Se calcula que en promedio se agregan a la cadena peptídica unos 5 aminoácidos por segundo. Debido a que con cada translocación se corren tres nucleó tidos del ARNm, el extremo 5’ de éste se aleja progresivamente del ribosoma y su extremo 3’ se acerca a él en igual medida. Cuando el extremo 5’ del ARNm se ha alejado unos 90 nucleótidos del ribosoma, en torno del codón de iniciación se

establece un nuevo ribosoma, y con él se da el inicio de la síntesis de una nueva cadena proteica . Esto se repite una y otra vez, de modo tal que cuando el primer ribosoma formado se halla en las cercanías del extremo 3’ del ARNm, toda la molécula del ARNm, cada 90 nucleótidos (30 codones), se encuentra asociada con ribosomas. Este complejo cuyo largo depende de la longitud del ARNm, recibe como vimos el nombre de poliribosoma. La síntesis de la proteína culmina cuando el ribosoma es alcanzado por el codón de terminación del ARNm (UAA, UGA UAG, indistintamente), lo cual deja al sitio A vacío, sin el esperado aminoacil-ARNt, aunque pronto es ocupado por un factor de terminación (TF) . Ante la ausencia del aminoacil-ARNt el polipéptido del peptidil-ARNt, situado en el sitio P se despliega del ARNt y se une, para formar su carboxilo libre, a una molécula del H 2O. Ello hace que el polipéptido, la proteína se independice del ARNm y entonces se libere del ribosoma. Las subunidades 40S y 60S de éste se separan y pasan al citosol, donde integran un fondo común que abastece de subunidades ribosómicas al sistema para continuar formando ribosomas y con ello nuevas cadenas proteicas, en el extremo 5’ del mismo ARNm o

de otro que se esté traduciendo.

Como vemos, el número de ribosomas en el poliribosoma, es decir, el número de lugares en los que tiene lugar la síntesis proteica, se mantiene relativamente constante, ya que a medida que unos ribosomas se retiran del extremo 3’ del ARNm, otros se ensamblan en su extremo 5’. Esta síntesis con tinuada de una proteína a partir de un mismo ARNm, por el trabajo simultáneo de varios ribosomas es interrumpida, en el momento que corresponde, por la acción de factores reguladores. Varias veces hemos dicho que la traducción del ARNm se produce en direcc ión 5’ - 3’ y que el aminoácido determinado por el codón de iniciación, en el extremo 5’ del ARNm, es una metionina,

portadora, como es lógico, del grupo amino libre de la cadena proteica en formación. Esta metionina usualmente es removida, por lo que el segundo aminoácido pasa a la primera posición. En el extremo opuesto de la proteína se encuentra el aminoácido que lleva el grupo carboxílico libre de la cadena proteica, determinado por el triplete previo al codón de terminación, en el extremo 3’ del ARNm. Surge de estos datos que en las uniones peptídicas que tienen lugar en el ribosoma, el grupo carboxílo es seguido por la cadena peptídica en crecimiento (ubicada en el sitio P) y el grupo amino por el aminoácido del aminoacil-ARNt (ingresado al sitio A) Las uniones peptídicas, así como las restantes reacciones químicas producidas durante las tres etapas de la síntesis proteica, son catalizadas por la actividad enzimática de algunos componentes de la 122



subunidad ribosómica mayor, estimándose que son los propios ARNr, y no proteínas ribosómica; los que ejercen esa actividad.

Teóricamente, una célula posee los recursos necesarios para sintetizar unas 10.000 proteínas distintas. Emanadas de los ribosomas, tales proteínas pueden permanecer en el citosol o tener como destino el núcleo, las mitocondrias, los peroxisomas o el retículo endoplasmático. Por ejemplo, las histonas y otras proteínas nucleares deben cruzar los poros nucleares para ingresar en el núcleo; Las enzimas del ciclo de Krebs deben atravesar las dos membranas de la mitocondria para llegar a la matriz mitocondrial; la catalasa debe pasar a través de la membrana del peroxisomas para arribar a su matriz etc. Respecto de las proteínas destinadas al retículo endoplasmatico, para que puedan ser colocadas en la membrana o en el interior del organoide los ribosomas deben establecer una íntima relación con él, lo que da lugar al retículo endoplasmático rugoso. Un tráfico tan selectivo obliga a las proteínas surgidas de los ribosomas excepto las que permanecerán en el citosol a portar alguna señal que las conduzca a los organoides adecuados y estos deben poseer un receptor específico que reconozca esa señal. La señal de la proteína consiste en una secuencia de unos pocos aminoácidos, denominada péptido señal. De acuerdo con el organelo al cual se dirige y la clase de proteína, ésta puede tener un solo péptido señal, unas veces situado en el extremo de su molécula y otras en medio de ella, o varios de esos pépticos distribuidos a lo largo de la proteína. Como es obvio la presencia de los pépticos señalan derivan de la existencia en los genes y por ende en los ARNm de secuencias de nucleótidos diseñadas para tal fin. Apenas las proteínas emergen de los ribosomas, sus átomos tienden a establecer las combinaciones químicas que dan lugar a la formación de las estructuras secundarias y terciarias que las caracterizan. Este proceso se ve facilitado o es impedido por ciertas proteínas citosólicas llamadas chaperonas, de las cuales existen varias familias, por ejemplo la hsp60, la hsp70 y la hsp90 por heat shock protein (proteínas de choque térmico). Un tema médico vinculado con la actividad de los ribosomas

El conocimiento del proceso de síntesis de proteínas permite en la actualidad, entre otras cosas, combatir las infecciones bacterianas, se han descubierto muchos antibióticos que bloquean la síntesis de proteínas en las bacterias ocasionando su muerte. También permite entender la expresión de enfermedades hereditarias. Al ser invadidas por bacterias, las células eucariotas de ciertos organismos inferiores elaboran sustancias llamadas antibióticos para defenderse de la infección. Comúnmente los antibióticos logran sus objetivos interfiriendo la síntesis proteica en los ribosomas de las bacterias, lo que provoca su muerte. Por ejemplo, afecta el inicio de la traducción y distorsiona la fidelidad de ésta conforme la cadena proteica se alarga. La eritromicina impide la translocación del ARNm. La tetraciclina no permite que los aminoacil- ARNt se coloquen en el sitio A, la puromicina usurpa el sitio A del ribosoma, de modo que la cadena peptídica se liga al antibiótico en lugar de hacerlo con el correspondiente aminoacil ARNt, y ello interrumpe su crecimiento. El cloranfenicol directamente impide que se produzcan las uniones peptídicas . La medicina ha trasladado estos efectos a otros escenarios biológicos, particularmente el organismo humano. Así, cuando determinadas bacterias lo infectan, éstas pueden ser destruidas mediante la administración adecuada de antibióticos.

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Debe advertirse que la puromisina afecta también a los ribosomas de las células eucariotas de manera que su uso farmacológico es muy restringido. Por su parte, eritromicina, la tetraciclina y el cloranfenicol, si bien interfieren levemente la síntesis proteica en los ribosomas eucariotas citosólicos, afectan más a los ribosomas de las mitocondrias, lo cual refleja el origen procariótico de estos orgánelos. MITOCONDRIAS Las mitocondrias son organelos a los que podemos definir como estructuras granulares filamentosas que se encuentran en el citoplasma de células eucarióticas. Estos organelos tienen una alta organización estructural, una composición química muy compleja y un gran acumulo de enzimas o coenzimas responsables de la transformación de la materia, transformación que produce la energía necesaria para las múltiples funciones celulares. Desde el punto de vista funcional, las mitocondrias son organelos transductores de energía porque es a nivel de ellas donde se va a transformar al conjunto de metabolitos celulares que provienen de glúcidos, lípidos y proteínas para poder extraer la energía almacenada en sus enlaces de Carbono e Hidrogeno y cederla al ADP para sintetizar gran cantidad de moléculas de ATP. En 1,894 ALTMANN las describió por primera vez dándoles el nombre de B I O B L A S T O S , en 1,897 BENDA les dio el nombre de MITOCONDRIAS, en 1,900 MICHAELIS usa por primera vez el Verde de Janus, un colorante vital para colorear estos organelos. En 1,934 BENSLEY y HOERR consiguen aislar por primera vez mitocondrias hepáticas, lo cual hizo posible el estudio directo por métodos bioquímicos para poder interpretar las funciones que cumplen estos organelos en la célula. En 1,948 HOGEBOOM con el auxilio de técnicas como la centrifugación diferencial y el conocimiento de la cinética enzimática establece que estos organelos son los responsables de la RESPIRACION CELULAR. En años recientes, con el auxilio de la microscopia electrónica es posible conocer en detalle su ultraestructura y se tiene la certeza que las mitocondrias constituyen el mayor ejemplo de integración estructural y funcional de toda la célula. Esta alta organización entre estructura y función se debe a la capacidad que tiene de transformar la materia en energía , propiedad que tal vez no esté presente en otros organelos. Presenta un ADN específico (similar en estructura al ADN bacteriano) propio de estos organelos, igualmente se han aislado ribosomas específicos de 50 S, de menor densidad en comparación a los ribosomas del citoplasma que son de 80 S. Se he encontrado ARN y se ha demostrado que el ADN tiene a capacidad de sintetizar ARN ribosómico y ARN de transferencia; por lo tanto, las mitocondrias se comportarían como organelos semiautónomos, con capacidad de sintetizar gran parte de sus propias proteínas. Estos organelos pueden ser observados en células cultivadas in Vitro, sobre todo si son observadas en un campo oscuro, con el uso de la microscopia de contraste de fases. El examén vital se facilita mediante la coloración con solución diluida de Verde De Janus, con la cual, las mitocondrias toman el color azul verdoso. Esta coloración se debe a enzimas propias de la mitocondria llamadas OXIDASAS que mantienen al colorante vital en su forma oxidada (coloreada), mientras que el resto del citoplasma celular, que se encuentra en forma reducida, reduce al colorante y lo transforma en su leucobase que es 124



incolora. Las mitocondrias pueden ser separadas del resto de las estructuras celulares por medio de incolora. Las centrifugación diferencial ya que debido a su gran densidad se van hasta el fondo del tubo, si se hace un análisis de ellas, se observa que mantienen su forma y estructura.

Al definir a estos organelos hemos dicho que pueden ser granulares o filamentosos; pero existe una gran variedad de formas que dependen del estado funcional y tipo de célula que se estudie. La forma también va a depender del tipo de colorante, del pH de los fijadores que se empleen y de la presión osmótica del medio. Esto quiere decir que la morfología mitocondrial está sujeta a la influencia de muchas variables, sin embargo podemos aducir que generalmente son de forma granular, circular o filamentosa y que además las hay en forma de Y, coma, L, arriñonada, etc.

El tamaño también varía de acuerdo a la célula que se estudie. Lo que varía mas es la longitud, pues el diámetro es casi constante. Como promedio, promedio, podemos decir que el diámetro varía de 0.5 a 1 micra y la longitud l ongitud de 3 a 7 micras. Si quisiér quisiéramos amos seña señalar lar los dos rangos extremo extremos, s, podrí podríamos amos decir que las más pequeñas llegan a medir 3 micras de longitud y las más grandes 40. En general el número varía de acuerdo al tipo celular y al estado funcional. Existen algunas levaduras donde la mitocondria es única pero extremadamente grande y muy ramificada dando la apariencia de ser más de una. En un hígado normal se pueden encontrar de 1,000 a 1,600 mitocondrias por hepatocito. En algunos ovocitos pueden encontrarse hasta 300,000 mitocondrias, y en una Ameba hasta 50,000. El número de mitocondrias está en relación al grado de actividad oxidativa de la célula, esto quiere decir que, en células que cumplen gran función metabólica existe una gran gr an cantidad de mitocondrias, no así en células que van a transformar poca cantidad de materia. En los tejidos vegetales hay poca cantidad de mitocondrias, porque son organismos autótrofos, y los cloroplastos son quienes están encargados de la transformación de la materia. Es un hecho constante que en tejidos cancerosos el número de mitocondrias por célula disminuye, esto puede ser consecuencia del aumento de la glucólisis anaeróbica (vía glicolítica) y la disminución de la respiración celular que se lleva a cabo en las mitocondrias. En el músculo, después de la administración repetida de hormona tiroidea (tiroxina), hay un aumento en el número de mitocondrias. Lo mismo sucede en el hipertiroidismo humano. La distribución es irregular, las mitocondrias se acumulan preferentemente alrededor del núcleo en el citoplasma periférico. Por regla general, se van a disponer en el lugar de la célula donde se requiere mayor energía. Además, la distribución depende de los movimientos citoplasmáticos y de la estructura macromolecular del retículo endoplasmático y del sistema vacuolar. Durante la mitosis, las 125



mitocondrias se agrupan cerca del huso y otorgan la cantidad suficiente de energía para que se realicen los movimientos anafasicos de los cromosomas, desde la zona central hasta los polos. Al dividirse la célula, las mitocondrias se distribuyen en cantidad aproximadamente igual entre las células hijas. ESTRUCTURA Y ULTRAESTRUCTURA. Dentro de la mitocondria podemos establecer claramente claramente dos tipos de compartimientos: a. Compartimiento interno: Está limitado por la membrana interna y ocupado por la matriz mitocondrial. Es llamado lado M de la mitocondria. b. Compartimiento externo: Es el espacio comprendid compr endidoo o encerrado entre la membran me mbranaa externa y la membrana membrana interna. interna. MATRIZ MITOCONDRIAL. La matriz es un gel denso con alta concentración de proteínas solubles y pequeñas moléculas, dentro de la matriz mitocondrial hay pequeños ribosomas y un ADN circular . A veces pueden observarse algunos gránulos densos que pueden ser de origen lipídico o pueden ser gránulos de vitelo de naturaleza proteica. Otras veces se encuentran proteínas asociadas a Fe que originan la llamada FERRITINA y grandes cantidades de un complejo de fosfato de calcio, conocido con el nombre de HIDROXIAPATITA. MEMBRANAS EXTERNA E INTERNA. INTERNA . Son de estructura trilaminar y de naturaleza química lipoproteíca, lipoproteíca , semejante a la unidad de membrana, sin embargo, entre ellas se pueden establecer diferencias en cuanto a estructura, composición química y función. La diferencia más saltante es que la membrana externa es más rica en lípidos y es lisa, mientras que la interna es más rica en proteínas y en su superficie interna presenta las partículas fundamentales. PARTÍCULAS FUNDAMENTALES. También llamadas partículas F1, están presentes en la membrana interna de la mitocondria. Se calcula que puede haber de 10 4 a 10 5 partículas por mitocondria, cada una de las cuales presenta una ATPasa especial que es la responsable del acoplamiento de la Cadena Respiratoria con la síntesis de ATP. CRESTAS MITOCONDRIALES. Son invaginaciones de la membrana interna a manera de dedos de guante. Su forma, número y disposición varía según el tipo celular y al estado funcional de la célula . Las crestas mitocondriales llenan casi todo el espacio de la matriz, aunque pueden existir zonas de la mitocondria que carezcan de estas estructuras. Generalmente estas crestas se encuentran orientadas transversalmente, aunque puedan estar en forma longitudinal, circular y hasta tubular, como es el caso de las crestas mitocondriales de los paramec parameciums iums .

COMPOSICION QUÍMICA. 126



Si queremos representar la concentración porcentual de los distintos componentes químicos presentes en la mitocondria, podemos decir que en ella se va a encontrar: Agua 66 % Proteínas 22 % Lípidos 11 % Iones metálicos y nucleótidos 1 % Proteínas. Entre estas se van a encontrar proteínas estructurales y proteínas solubles, que serían enzimas solubles que generalmente se localizan en la matriz mitocondrial. Luego tenemos un conjunto de proteínas insolubles que corresponden a la cadena respiratoria, además de los citocromos, que son proteínas ricas en Fe y a veces en Cu. Lípidos. Dentro de los lípidos vamos a tener a los fosfolípidos y dentro de estos a las lecitinas y cefálicas. En algunos casos, se ha encontrado también colesterol , que es un lípido esteroideo. Nucleótidos. De preferencia ADP, ATP, FAD y NAD. NAD . Iones metálicos. Como sodio, potasio, calcio, magnesio y algunas veces fósforo conjugado con macromoléculas . Gracias a la distribución específica de las proteínas en las distintas membranas de la mitocondria es que pueden transformar la materia en energía. Para poder averiguar la compartimen compartimentalizac talización ión de las proteínas es necesario separar ambas membranas mitocondriales y los compartimientos que ellas limitan, mediante la centrifugación en gradiente de densidad. La membrana externa puede separarse produciendo una hinchazón que primero rompe y luego contrae la membrana interna y la matriz. En uno de los procedimientos empleados con mayor frecuencia, se utiliza dos detergentes, la digitonina y el Lubrol WX. Al separar la membrana externa mediante el uso de digitonina se obtienen intactos intactos los denominados MITOPLASTOS, que son unidades cons tituidas por la membrana interna envolviendo a la matriz y su contenido. Luego, este mitoplasto es tratado con Lubrol WX, utilizando un mayor gradiente de densidad para separar la membrana interna de la matriz. Separadas la membrana externa, la membrana interna y la matriz mitocondrial, ya es posible hacer un análisis más detallado de los componentes químicos de cada una de las membranas y los compartimientos que estas limitan. Hay ciertas enzimas que son indicadores específicos y exclusivos de cada una de las partes de la mitocondria . REPRODUCCION DE LAS MITOCONDRIAS Hay hechos que permiten afirmar que las mitocondrias se reproducen: ya sea para sustituir a mitocondrias viejas que terminan siendo degradadas en citolisosomas, ya sea para responder al aumento de las necesidades metabólicas de la célula, o bien bie n previamente a la mitosis. La prueba más evidente de que las nuevas mitocondrias se forman a partir de otras mitocondrias la proporcionó el experimento de Lucke en 1963. Tras suministrar colina radiactiva al hongo Neurospora durante un cierto tiempo, observó que sus mitocondrias quedaban marcadas. Después de suprimir la colina radiactiva y suministrar otra sin marcar, apreció que, en las siguientes generaciones celulares, la radiactividad se repartía entre las mitocondrias de forma que la cantidad de radiactividad encontrada en cada mitocondria era aproximadamente la mitad que en la división precedente. Si no hubiera habido una reproducción de las mitocondrias, toda la colina marcada hubiera permanecido en las primeras mitocondrias y no aparecería en las mitocondrias formadas tras retirar la colina marcada. La división de las mitocondrias, según las imágenes observadas al microscopio electrónico pueden ser realizadas por tres mecanismos. Bipartición. Si se somete a una rata durante 6 semanas a una dieta con carencia de riboflavina  Bipartición. (vitamina B6) se forman mitocondrias gigantes. Al dar de nuevo riboflavina se dividen por bipartición.  Estrangulación. Estrangulación. Si se somete a una rata durante 9 días a carencia de cobre, se producen mitocondrias gigantes. Al dar de nuevo cobre se dividen por estrangulamiento. 127





Gemación. Se forman pequeñas yemas mitocondriales que se separan posteriormente. Esta teoría es difícil de probar, pues el contorno a veces muy irregular de las mitocondrias hace que parezcan yemas lo que, en realidad, es parte de la forma normal de la mitocondria.

Se ha sugerido que, en su inicio, las mitocondrias eran organismos procariotas que formaron simbiosis con organismos eucariotas anaerobios y que luego continuaron reproduciéndose conjuntamente, convirtiéndose en un componente más de la célula. Esta teoría se apoya en los siguientes hechos:  El ADN mitocondrial es semejante al de las bacterias.  Los ribosomas mitocondriales son similares a los ribosomas de células procariotas .  El cloranfenicol inhibe la síntesis de proteínas bacterianas y también la de proteínas mitocondriales por los ribosomas de la mitocondria, pero no la del resto de las proteínas del citoplasma de las células eucariotas.  Tanto las bacterias aerobias como las mitocondrias contienen en sus membranas enzimas de la fosforilación oxidativa: hay también unidades proyectantes en el mesosoma bacteriano, que de este modo guarda cierto parecido con las crestas mitocondriales.  Las mitocondrias de células eucariotas muy diferentes (como hongos y mamíferos) contienen en su membrana proteínas con características inmunológicas comunes.  En su composición, la membrana mitocondrial externa es más parecida al retículo endoplasmático, mientras que la interna es más parecida a la membrana plasmática de células procariotas. FUNCION MITOCONDRIAL Oxidación mitocondrial Sin las mitocondrias, las células dependerían de la glucólisis anaerobia, que degrada glucosa a piruvato, para obtener todo su ATP (en los vegetales se obtiene también ATP en los cloroplastos). Pero en la glucólisis se libera sólo una pequeña fracción de la energía liberada por la oxidación total de los azúcares (dos moléculas de ATP por cada molécula de glucosa). En la mitocondria, el metabolismo de los azúcares y ácidos grasos se completa mediante su oxidación total a CO 2 y H2O liberándose 36 moléculas de ATP por cada una de glucosa. La oxidación de los ácidos grasos constituye el ciclo de la ß-oxidación . Los ácidos grasos penetran en la matriz mitocondrial, donde forman moléculas de acetil-coenzima A, y pasan y dan tantas vueltas en el ciclo como pares de carbono contienen. En cada vuelta se libera una molécula de acetil-CoA, con dos carbonos menos, el cual puede sufrir entonces una nueva ß-oxidación. De este modo se repite sucesivamente el ciclo oxidativo hasta que los ácidos grasos de número par de carbonos se convierten así por completo en moléculas de acetato activado. El acetil-CoA producido, así como los NADH y FADH originados en la oxidación, son utilizados en el ciclo de Krebs. La oxidación de los glúcidos se realiza en el ciclo de Krebs. El piruvato, procedente de la glucólisis anaerobia de la glucosa y otros azúcares relacionados (proceso que tiene lugar en el citosol), es transportado dentro de la mitocondria, donde el complejo enzimático piruvato deshidrogenasa lo transforma en acetil-coenzima A, el cual entra en el ciclo de Krebs de la matriz mitocondrial, oxidándose a CO 2 y generando NADH + + H+ y FADH para la cadena respiratoria.

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Tanto el NADH como el FADH ceden los electrones, que son conducidos por la cadena transportadora de electrones, separándose de los protones, hasta que se reúnen de nuevo con éstos y el O 2 para formar agua. Esta cadena comprende numerosos componentes que cada día van siendo mejor identificados: una flavoproteína Fe-S, ubiquinona y la cadena de citocromos. Los citocromos b - c forman un complejo (280 kDa) en forma de dímero que contienen al menos ocho polipéptidos diferentes. Cada monómero tiene dos grupos hierro (Con Fe) y una proteína Fe-S, acepta electrones de la ubiquinona y los transfiere al citocromo c. Este transporta los electrones al complejo de la citocromo oxidasa, que forma un complejo (200 kDa), también dimérico, que contiene los citocromos a y a 3 con dos grupos hemo y un grupo con los protones y con el O 2 para formar H 2O consumiéndose alrededor del 90% del O2 utilizado por la célula. Existen agentes inhibidores de este transporte: la unión de los electrones a la flavoproteína Fe-S es inhibida por la rotenona; el funcionamiento del complejo de citocromos b-c es inhibido por la antimicina A y el complejo de la citocromo-oxidasa es bloqueado por el cianuro y por la azida.

La transferencia de electrones por la cadena respiratoria está acoplada a la síntesis de ATP a partir de ADP + Pi este proceso de fosforilación dependiente del transporte electrónico se le denomina fosforilación oxidativa. Se han formulado varias teorías para explicar este acoplamiento (formación de un intermediario químico activado, acoplamiento por cambio en la configuración. etc.), pero la teoría que lo explica mejor es la hipótesis quimiosmotica de Mitchell (1961). La transferencia de electrones bombearía protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana, produciendo un gradiente de concentración (una unidad de pH) y eléctrico (0,16 V), debido a la impermeabilidad de la membrana mitocondrial interna a los protones. La energía obtenida en los procesos oxidativos se almacena así en forma de un gradiente electroquímico de protones, que será utilizado en la fosforilación y en otros 129



procesos que requieren energía (transporte de material a través de la membrana). La fosforilación se lleva a cabo por la ATP sintetasa mitocondrial, que opera de modo inverso a las bombas estudiadas en la membrana plasmática. A través de la ATP sintetasa fluyen protones hacia la matriz mitocondrial a favor de gradiente electroquímico, y ese paso activa la reacción ADP + Pi ATP + H2O. →

Esta hipótesis explica cómo la fosforilación depende del gradiente: agentes como el 2,4-dinitrofenol, que disipan el gradiente, desacoplan el transporte electrónico de la síntesis de ATP. Este desacoplamiento entre la cadena y la fosforilación ocurre de una manera natural en las mitocondrias de grasa parda durante el despertar de la hibernación. La membrana interna de estas mitocondrias contiene una proteína de transporte de 32 kDa, llamada termogenina, que permite el flujo de H + hacia el interior, a favor de la gradiente electroquímica, sin activar la ATP sintetasa. Por ello, estas células pueden oxidar sus reservas de grasa a gran velocidad, produciendo más calor que ATP y actuando así como calefactores que reaniman a los animales hibernantes, o protegen del frío al recién nacido . El rendimiento en ATP sintetizado varía según la procedencia de los electrones utilizados por la cadena respiratoria. Se consigue formar 2.5 moles de ATP por cada mol de NADH y 1.5 moles de ATP por cada mol de FADH. La intensidad de funcionamiento de la cadena transportadora de electrones depende de varios factores; entre ellos el nivel de ADP. A más ADP, más rápido es el transporte de electrones. Si una célula consume mucho ATP, como resultado sube el nivel de ADP y, por tanto, se acelera el transporte de electrones con el consiguiente consumo de oxígeno y la producción de ATP. Algunos agentes como la oligomicina desacoplan la fosforilación de la cadena (no se produce ATP). Por centrifugación diferencial pueden obtenerse las mitocondrias, romperse sus membranas por tumefacción y separar éstas de la matriz y entre sí (la externa de la interna). El análisis de las tres fracciones obtenidas permite conocer la localización de los diversos componentes mitocondriales que intervienen en las funciones anteriormente expuestas. En la membrana externa está la enzima monoamino oxidasa, en la matriz los componentes del ciclo de Krebs, y en la membrana interna los componentes de la cadena transportadora de electrones y de la fosforilación oxidativa, y diversas permeasas. Al separarse las unidades proyectantes de las membranas internas mediante tratamiento por rotura con perlas de vidrio y centrifugación posterior, se observó que las unidades proyectantes realizan la función ATPasa (aunque ya no sean sensibles a la oligomicina), pero no el transporte de electrones. Por el contrario, las membranas sin unidades proyectantes realizan el transporte de electrones pero no la fosforilación oxidativa. Si se unen de nuevo unidades proyectantes y membranas, reaparece la fosforilación, el transporte y la inhibición por la oligomicina. Esto quiere decir que las unidades proyectantes contienen la ATP sintetasa y que las membranas contienen la cadena . La inhibición por la oligomicina depende de un factor de acoplamiento, fácilmente, reconstituible. Es el tallo de las unidades proyectantes (F0) que se separa de las esferas durante su extracción. Cada unidad de fosforilación ocupa unos 20 x 20 nm de la membrana interna, mitocondrial. Dichas unidades se disponen en forma de mosaico (irregularmente distribuidas por la membrana interna) tanto en dirección transversal como 130



lateral. En una mitocondria de hígado hay unas 15 000 unidades de fosforilación en el músculo volador de insecto, unas 100 000.

MITOCONDRIAS ESPECIALES Los protozoos contienen mitocondrias ordinarias y otras especializadas, los cinetoplastos, propios de algunos flagelados, se trata de mitocondrias similares, con crestas y tamaño variable, que se sitúan junto al corpúsculo basal del flagelo. Presentan pocas crestas, muchas fibrillas de ADN y prolongaciones mitocondriales. En Leishmania donovani , cuando se encuentra en la forma parásita, el cinetoplasto es pequeño y con pocos crestas la matriz incluye un material fibrilar (posiblemente ADN). En su forma no parásita, el cinetoplasto tiene muchas crestas y es grande . Si a flagelados del género Trypanosoma se les quita el cinetoplasmo mientras están presentes en la sangre de vertebrados, estos protozoos pueden reproducirse; pero no se pueden traspasar a los insectos. En la parte intermedia de los espermatozoides de gasterópodos, la mitocondrias tiene una estructura aberrante, en la que se observan tres compartimientos: glucogénico, matricial y cristalino. El tercero es el más grande y la estructura cristalina resulta de la transformación de las crestas. La glucólisis se realiza en los dos primeros compartimentos, mientras que la fosforilación oxidativa tiene lugar en la porción cristalina. RETICULO ENDOPLASMATICO El retículo endoplasmático (RE) es un sistema de membranas que ocupa gran parte del espacio citoplasmático y se extiende desde el borde interno de la membrana plasmática hasta la envoltura nuclear, a través de él puede haber comunicación entre el entorno celular y el núcleo. El RE se puede dilatar y cuando eso sucede sirve para acumular sustancias . Esta red de membranas no es pasiva, ya que además de cumplir un rol estructural va a tener un rol fisiológico fundamental. La existencia de este sistema ya se vislumbraba en el siglo pasado, pero en esa época no se contaba con suficientes técnicas para poder probar este hecho. En 1889, Platner utilizando colorantes básicos para colorear células de páncreas, observa unas regiones filamentosas que se coloreaban fuertemente, al cabo de cierto tiempo, ya no encontraban esos filamentos teñidos, pasaba otro rato y volvían a aparecer. De acuerdo a esto, Platner dedujo que en el citoplasma debía de haber una región muy importante donde hay una gran actividad, ya que se tiñen en un momento, desaparece y así sucesivamente. El aseguraba que en esta estructura se estaba elaborando algo que después se transformaba, a esta estructura le dio el nombre de Ergastoplasma (Ergasto = elaborar, transformar ). Esta es la primera referencia en cuanto a la existencia de este sistema endomembranoso. En 1945, Porter con ayuda del microscopio electrónico demuestra que efectivamente existían filamentos dispuestos a manera de red que van desde la envoltura nuclear hasta el límite con la membrana plasmática, a esta red le da el nombre de Retículo Endoplasmático. Este sistema de endomembranas separa compartimientos porque tiene un espacio luminal que debe tener una composición diferente a la composición del citoplasma.

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MORFOLOGIA DEL RETICULO ENDOPLASMATICO. El R.E. puede adoptar tres formas: 1. Cisterna: De 50 nm de fondo, a manera de bolsas. Esta forma generalmente se encuentra asociada a ribosomas que se ubican en la superficie externa de su membrana. 2. Vesículas: De 50 a 500 nm de diámetro. Algunas presentan ribosomas y otras no . Las vesiculas no tienen comunicación entre ellas y sirven pare llevar en su interior algunas sustancias. 3. Túbulos: De 50 a 100 nm de diámetro. Estos túbulos se anastomosan, es decir, se unen entre dos de ellos. Generalmente se encuentran asociados a ribosomas. Estas tres formas las podemos encontrar en una misma célula, o a veces, por la especialización de la célula, vamos a encontrar que predomina solamente una o dos formas del RE. CLASES DE RETICULO ENDOPLASMATICO. Topográficamente, podemos dividir al retículo en dos tipos: 1. Retículo Endoplasmático Rugoso (RER) 2. Retículo Endoplasmático Liso (REL) Esto está referido exclusivamente a la presencia o ausencia de ribosomas en la superficie externa de la membrana. El RE tiene 3.80 m/cm 3, de los que 2.41 corresponden a R.E.R. y 1.39 a R.E.L. lo que se quiere demostrar con esto es que, en relación a otros organelos, la mayor cantidad de membrana corresponde al retículo endoplasmático. El predominio de RER o REL en la célula depende de la función que esta cumple. RETICULO ENDOPLASMATICO RUGOSO (RER) Este es el retículo que tiene RIBOSOMAS adheridos a su superficie y es el que Platner vio en sus experimentos, pues lo que se estaba tiñendo era el ácido ribonucleico (ARN), que es parte de los ribosomas. Como este retículo tiene ribosomas adheridos a su superficie, cumple la función de ser el soporte físico para la síntesis de proteínas. Además, en su interior se van a acumular las proteínas sintetizadas. Dentro de la célula hay proteínas que se forman para el bien interno de ella y proteínas que tienen que salir fuera de ella, estas últimas son las PROTEINAS DE EXPORTACION, a cuya síntesis está ligado al RER.

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Teoría de la Señal. Esta hipótesis explica como las proteínas que son sintetizadas por los ribosomas en la membrana del RE son introducidos al lumen de este. La hipótesis de señal fue formulada en el año de 1976 más o menos. Recordemos que la membrana biológica es un mosaico fluido constituido por una bicapa de fosfolípidos, con proteínas incluidas en ella, estas proteínas fluyen en la membrana y pueden juntarse o separarse de acuerdo al estado fisiológico de la célula. En la membrana del retículo existen proteínas llamadas RECEPTORAS DEL RIBOSOMA a RIBOFORINAS. Cuando llega una señal para que empiece la síntesis de proteínas, los ribosomas que están libres, fuera del RE, comienzan a ordenarse, de tal manera que el ARN mensajero se pueda unir a ellas . El ARN mensajero es una secuencia de bases nitrogenadas que contiene la información para la síntesis de proteínas, en forma de codones. Está demostrado que la cadena polipeptídica crece a través de un surco o túnel de la subunidad mayor del ribosoma. Al inicio del ARN mensajero (ARNm) hay codones con información para que se comience a formar el péptido de señal, este péptido ubica a las riboforinas y hace que se aproximen unas a otras, formando una especie de túnel entre ellas. En estas riboforinas se asienta la subunidad mayor del ribosoma, cuyo surco o túnel se comunica directamente con el túnel formado por las riboforinas. Al unirse el ribosoma al retículo, el péptido de señal penetra hacia el lumen reticular por el túnel, luego es separado de la cadena por la acción de una peptidasa de señal, que es una enzima ubicada en la membrana de mosaico fluido del RE. Por otro lado, el polipéptido sigue creciendo hasta encontrar en el ARN mensajero un codón que le indique la terminación de la síntesis, esta señal también indica a las riboforinas que se desplacen en sentido contrario, alejándose entre sí. El ribosoma se despega y el péptido formado queda en el lumen del RE. RETICULO ENDOPLASMATICO LISO (REL)

FUNCIONES: 133



Aparte de participar en procesos de transportes y almacenamiento de algunas sustancias, el REL tiene otras funciones. GLUCOGENOLISIS. Proceso que consiste en degradar glucógeno hasta transformarlo en glucosa. El glucógeno está asociado a la superficie externa del R.E.L. Cuando se pone en ayunas a un animal, estos gránulos comienzan a disminuir. Lo que indica que han sido utilizados por los organismos. El R.E.L. puede cumplir esta función porque posee una enzima que quita el fósforo a la glucosa-6-fosfato, dejándola como glucosa libre, para que pase al torrente sanguíneo. SINTESIS DE LÍPIDOS. En el R.E.L. encontramos toda la estructura capaz de unir ácidos grasos a glicerol y formar lípidos. Las gotas de grasa se asocian al R.E.L. para sintetizar lípidos, los lípidos se sintetizan a este nivel y caen al interior del retículo. SINTESIS DE ESTEROIDES Y SUS HORMONAS. En el R.E.L. se sintetizan esteroides como el COLESTEROL, a partir del cual se forman los estrógenos hormonas de tipo esteroideo formadas también en este retículo. Las células de Leydig (que encontramos en testículos de mamíferos) están repletas de R.E.L., porque allí se sintetiza la testosterona, que es una hormona esteroidea. En las células de la cápsula suprarrenal encontramos abundante R.E.L., porque estas también sintetizan hormonas de tipo esteroideo. A nivel de las células del ovario también encontramos abundante R.E.L. DETOXIFICACION. La gran mayoría de sustancias químicas, muchos fármacos y hormonas de tipo esteroide, a veces compuestos aromáticos se descomponen a nivel hepático en el R.E.L. por ejemplo en el caso del colantreno (sustancia que aparece en los sitios negreados de la carne asada en parrilla), hasta hace algunos años estaba catalogado como cancerígeno, cuando se profundizó más en el asunto se descubrió que este no es el verdadero cancerígeno sino que cuando se ingiere en cantidades elevadas el R.E.L. lo transforma en un compuesto que se llama 5,6 epóxido, que es el verdadero cancerígeno. La función que cumple el R.E.L., de quitar la toxicidad a lo que él considera toxico se llama DETOXIFICACION. En la membrana del R.E.L. existen unas proteínas Llamadas CITOCROMOS, cuya función es transportar electrones (oxidación y reducción), hay un citocromo llamado B5 que parece estar íntimamente relacionada a la síntesis de lípidos y hormonas esteroideas. El citocromo P450 interviene en la detoxificación, su nombre de Pigmento 450 se debe a que estas proteínas coloreadas absorben una cantidad de luz de una longitud de onda determinada, haciéndose visibles, en este caso a 4,500 A° o 450 nanómetros. GLUCOSILACION. El R.E.R. tiene ribosomas a cuyo nivel se sintetizan proteínas que caen al interior del retículo, así también existe R.E. asociado a la síntesis de lípidos, por lo que en su interior vamos a encontrar lípidos. Existe un mecanismo por el cual a estas proteínas y lípidos se les adicionan otras moléculas, principalmente carbohidratos, para obtener glicoproteínas o glucolípidos respectivamente. Este mecanismo se llama GLICOSILACION. Parece ser que la glucosilación empieza a nivel del R.E. porque se ha demostrado la presencia de Glucosiltransferasa enzima encargada de transferir moléculas de carbohidratos a lípidos o proteínas. Pareciera ser que en algunos casos las proteínas se están formando y simultáneamente se están glicosilando, esto parece que empieza en el R.E. pero es otra la molécula encargada de completar este proceso. MODIFICACIONES DEL RETICULO ENDOPLASMATICO El R.E. es capaz de modificarse y formar una estructura definida, entre las modificaciones que sufre tenemos: ENVOLTURA NUCLEAR. Es una estructura compleja que se basa en una vesícula de retículo endoplasmático extendida alrededor del material hereditario nuclear (cromatina). Como tal vesícula, la envoltura aparece conformada por dos membranas: la membrana nuclear externa y la membrana nuclear interna , es una doble unidad de membrana porosa que delimita al núcleo propio de las células eucariotas. La membrana en contacto con el citosol es la que se continua con la membrana del retículo endoplasmático rugoso (RER), que al igual que este está asociada con ribosomas. 134



RETICULO SARCOPLASMATICO. Protegiendo a los microfilamentos, existe un R.E. que abarca todo el espacio del sarcómero formando canales que desembocan en un túbulo mayor. Esto también es R.E.L., pero como es característico y exclusivo de las células musculares toma el nombre de RETICULO SARCOPLASMATICO. Este R.E. a través de la línea Z del sarcómero forma una gran tubería que contacta con la membrana plasmática de la célula en donde está asociado a una neurona, de tal manera que la señal de contracción la recibe este R.E.L. ante esta señal, el Retículo sarcoplasmático libera calcio y cuando cesa la señal, el calcio vuelve al retículo sarcoplasmático y el músculo se relaja.

CUERPO MIELOIDE. Es una modificación del R.E.L que se encuentra en la retina de los ojos de muchos vertebrados. Pareciera que la manera como se disponen las porciones del R.E.L., formando un doble cono, sirve de alguna forma para tratar de controlar y distribuir los pigmentos que dan color a los ojos. APARATO DE GOLGI Este orgánulo fue descubierto en 1898 por Camilo Golgi, patólogo de la Universidad de Pavía, quien lo describió como un aparato reticular interno mediante la aplicación de técnicas de impregnación con dicromato de osmio y de rubidio para teñir neuronas de purkinje del cerebelo de la lechuza. Su existencia fue confirmada posteriormente por Cajal, tanto en neuronas teñidas con métodos de impregnación argéntica, como en células mucosecretoras de la lámina epitelial del intestino. La confirmación definitiva la proporcionaron los estudios al microscopio electrónico realizados en 1950 por Sióstrand, Dahon y Félix, estos estudios demostraron que este sistema es un organelo membranoso de la célula, al que se denominó aparato o complejo de Golgi. La localización del aparato de Golgi en las células secretoras es entre el núcleo y el ápice por el que se vierte la secreción. En las células musculares, el complejo de Golgi aparece en ambos polos del núcleo, que es alargado, lo mismo ocurre en condroblastos. En las células plasmáticas que son muy basófilas y con el núcleo excéntrico, todo el citoplasma aparece teñido por los colorantes básicos (hematoxilina, pironina) a excepción de una zona situada junto al núcleo, que corresponde al aparato de Golgi. Como esta zona aparece sin teñir, se denominó zona Golgi negativa. En las células vegetales meristemáticas el complejo de Golgi muestra un notable desarrollo ocupando extensas áreas del citoplasma, algo semejante ocurre en diversos tipos celulares de muchos invertebrados con un complejo de Golgi muy desarrollado. El aparato de Golgi consta de varias unidades, probablemente conectadas entre sí, denominadas dictiosomas, estos son un conjunto de sáculos apilados, separados entre sí entre 20 y 30 nm, en cuya periferia hay vesículas de diversos tamaños. La cara más próxima al núcleo celular, o cara proximal, se denomina cara externa o cara Cis o también cara de formación, es de forma convexa y presenta muchas fenestraciones, su periferie se resuelve en túbulos y vesículas, los túbulos conectan con otros dictiosomas. Las vesículas provienen del retículo endoplasmático, principalmente del rugoso, les transfiere su contenido; por eso se llaman vesículas de transición. Es posible que esas vesículas correspondan también a túbulos seccionados que conecten el retículo endoplasmático rugoso y el complejo de Golgi, así se deduce de las imágenes observadas con el microscopio de alta resolución y de la reconstrucción de estudios realizados en cortes seriados. Las restantes cisternas son cada vez 135



menos fenestradas y contienen menos túbulos y vesículas. La cara más próxima a la membrana plasmática, o cara distal, se denomina cara interna o cara Trans, o también cara de maduración. La luz de las cisternas es más amplia que en las de la cara Cis (va aumentando progresivamente), y de su superficie emigran grandes vesículas denominadas vacuolas de condensación, gránulos de secreción o de cimógeno. La estructura de la membrana del complejo de Golgi es trilaminar, de menor espesor que la plasmática, y similar a la estructura de la mayoría de las membranas citoplasmáticas. En algunos casos, se ha descrito que el espesor de las membranas del aparato de Golgi va aumentando desde la cara Cis a la Trans; de modo que las vesículas de secreción que abandonan el complejo de Golgi para unirse a la membrana plasmática tienen ya el mismo espesor que esta.

COMPOSICION DEL APARATO DE GOLGI Si se hace la centrifugación habitual del homogeneizado celular, todo el retículo endoplasmático (liso y rugoso) y el complejo de Golgi aparecen como vesículas. Si se hace centrifugación diferencial a continuación, se pueden separar las vesículas lisas de las rugosas. Esto sirve para estudiar el complejo de Golgi en células con escaso retículo endoplasmático liso, pues, en estas células, la mayoría de las vesículas que se encuentren corresponden al complejo de Golgi. En células con abundante retículo endoplasmático liso se puede hacer una homogeneización suave, con lo que los dictiosomas se conservan enteros y se pueden aislar por centrifugación diferencial. El estudio bioquímico de los dictiosomas muestra que la composición de su membrana es intermedia entre la de la membrana plasmática y la del retículo endoplasmático rugoso, pues hay un 65% de proteínas y un 35% de lípidos. La composición de los lípidos del complejo de Golgi es intermedia entre la que se observa en la membrana plasmática y la encontrada en el retículo endoplasmático rugo. Así, en el complejo de Golgi hay más esfingomielina y colesterol que en el retículo endoplasmático rugoso y menos que en la membrana plasmática. Como en las otras membranas, también hay asimetría en la distribución de los fosfolípidos en ambas hemimembranas del complejo de Golgi. La lamela exoplasmática (E o luminal) es más rica en fosfatidicolina y esfingomielina. La lámela protoplasmática (P o exterior a la luz) es más rica en fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina. Esta asimetría coincide con la del retículo endoplasmático rugoso, pero en proporciones diferentes. En las membranas del complejo de Golgi hay hidrolasas y peroxidasas que no son específicas. Las enzimas más destacables son varios tipos de glicosil - transferasas (intervienen en la glicosilación o unión de oligosacáridos a proteínas) y sulfo - transferasas (que transfieren grupos sulfato a las proteínas hidrocarbonadas). FUNCIONES DEL APARATO DE GOLGI. Participación del Aparato de Golgi en la secreción proteica. 136



Desde el descubrimiento del aparato de Golgi, las observaciones morfológicas hacían pensar que estaba implicado en la secreción proteica. Ya en 1914 Cajal vio gotitas de moco sobre la región del aparato de Golgi de las células caliciformes del intestino y sugirió que este orgánulo podría ser la fabrica intracelular que lo sintetizará. Si se observa al microscopio electrónico el aparato de Golgi de la célula caliciforme, se aprecia que los sáculos de la cara Cis están aplastados casi vacíos, mientras que los de la cara Trans están hinchados y llenos de moco, de esta cara se desprenden grandes vesículas llenas de moco que llegan hasta la membrana plasmática apical y se liberan. Algo semejante ocurre en otras células que segregan proteínas. La participación del aparato de Golgi en la secreción proteica se investigó mediante radio autografía, marcando con tritio el aminoácido leucina. En 1961, Leblond realizó estos experimentos con páncreas y encontró que las proteínas sintetizadas se localizaban en el retículo endoplasmático rugoso a los 3 minutos, a los 20 minutos en el aparato de Golgi, a los 90 minutos en los gránulos de secreción y a los 120 minutos se liberaban de la célula. A partir de entonces se fue comprobando que el mismo camino se sigue en muchos otros tipos de células secretoras de proteínas glicosiladas.

Modificaciones en los carbohidratos unidos a proteínas En las células, las glucoproteínas y proteoglicanos pueden teñirse con un color magenta mediante la técnica del PAS. Así se ve que en las células caliciformes se tiñe no, sólo el moco, sino también el complejo de Golgi. Si se utilizan algunos compuestos de plata en lugar del PAS, se forman depósitos de plata que se observan en negro (tinciones de Golgi y Cajal) y que también pueden verse al microscopio electrónico. Estas observaciones indican la presencia de abundantes carbohidratos en el complejo de Golgi. La incorporación de carbohidratos en el complejo de Golgi se estudió también utilizando radiografía, marcando radiactivamente los diferentes azucares o sus derivados. Aunque en los primeros estudios autográficos, Neutra y Leblond (1966) encontraron que la glucosa tritiada se incorporaba directamente en el complejo de Golgi, nuevas pruebas radiográficas modificaron esta hipótesis. Actualmente se utilizan también lectinas como marcadores de los azúcares. La manosa se incorpora exclusivamente en el retículo endoplasmático rugoso. La N-acetil-glucosamina, se incorpora tanto en el retículo endoplasmático rugoso como en el complejo de Golgi. La galactosa y el ácido siálico (N-acetilneuraminico) se incorporan exclusivamente en el complejo de Golgi, de modo que, aunque el primer paso de la glicosilación tiene lugar en el retículo endoplasmático rugoso, las diferencias entre las estructuras de los oligosacáridos en las proteínas maduras se deben a modificaciones posteriores producidas durante su paso a través del complejo de Golgi. De una parte se producen modificaciones en los oligosacáridos unidos a N, dando lugar a tres tipos diferentes (ricos en manosa, complejos e híbridos) y a las enzimas lisosómicas. Además, a las proteínas se añaden oligosacáridos de otro tipo (oligosacáridos 137



unidos a O). Algunas células, como las que sintetizan la matriz de los tejidos conectivos (conjuntivo, cartílago, hueso), forman proteínas, denominadas proteoglicanos, que van unidas a numerosas y largas cadenas de carbohidratos. Estas cadenas de carbohidratos (glicosaminoglicanos) son también añadidas en el complejo de Golgi. Maduración de las proteínas Las proteínas del complejo de Golgi que llegan a la cara Trans deben sufrir un proceso de maduración, que se inicia en esta cara pero que prosigue durante la emigración de las vesículas hasta la membrana plasmática. La maduración de las proteínas requiere: Hidrólisis. Generalmente ocurre en los pares de aminoácidos Lys-Arg, Lys-Lys, Arg-Arg y Arg-Lys. Algunos polipéptidos, como hormonas y neurotransmisores, son sintetizados en su forma inactiva, como precursores. Después en la cara Trans del complejo de Golgi, son procesados mediante enzimas hidroliticas que eliminan partes del polipéptido incluyendo péptidos señal, conduciendo a la liberación de la forma madura o activa. Además, algunos polipéptidos que van a ser segregados son tan cortos que no han podido ser sintetizados eficientemente, sino como moléculas más largas y que luego han sido cortadas por hidrólisis, es el caso de las encefalinas, que constan de tan sólo cinco aminoácidos. Condensación. Las proteínas llegan a la cara trans como soluciones diluidas. Con el tiempo estas soluciones se concentran (algunas hasta 200 veces), dando lugar a las vesículas con contenido más denso (gránulos de cimógeno), también denominados vesículas de condensación. La condensación tiene lugar por la acidificación de la luz de las vesículas mediante una bomba de H + dependiente de ATP. COMPARTIMENTACION DEL COMPLEJO DE GOLGI Desde los estudios de Rothman (1981) se ha establecido que el complejo de Golgi consta de tres compartimientos superpuestos, los cuales se pueden separar por centrifugación diferencial, pudiéndose medir su actividad enzimática. Cada compartimiento comprende más de una cisterna y son los siguientes:  Compartimiento Cis. En él ocurre la fijación de los grupos fosfato a las manosas en las enzimas lisosómicas. Este marcador evita que estas enzimas sufran nuevos cambios al pasar por los otros compartimientos en su camino al exterior del complejo de Golgi.  Compartimiento intermedio. En él se rompen las manosas (por manosidasas I y II) y se añade Nacetil-glucosamina (por las N-acetil-glucosamina transferasas I y II)  Compartimiento Trans. En él ocurre la adición de galactosa y ácido siálico por las transferasas correspondientes. La liberación de cualquier tipo de vesículas (como enzimas lisosomicas, oligosacáridos ricos en manosa, complejos unidos a oxígeno, etc.) ocurre siempre desde este compartimiento. Algunos autores distinguen dos zonas más: la red Cis que corresponde a las vesículas de transición entre el retículo endoplasmático rugoso y el complejo de Golgi: y la red Trans, que corresponde a las vesículas que se desprenden de la cara Trans del complejo de Golgi. En esta red Trans se clasifican las proteínas para su destino: por ejemplo, hacia lisosomas o hacía la membrana plasmática.

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Al principio se pensó que las cisternas del complejo de Golgi se iban desplazando desde el compartimiento Cis al Trans, alejándose del núcleo. Sin embargo, hoy día se hace difícil pensar que los tres compartimentos puedan estar transformándose uno en otro, ya que no se puede admitir que una cisterna Cis acabe en Trans, pues los procesos biológicos y las enzimas correspondientes difieren de un compartimiento a otro. Lo que probablemente ocurre es el paso de la proteína de un compartimiento a otro por vesiculación: vesículas no recubiertas por clatrina que geman en un compartimiento y saltan a fusionarte al siguiente, sin posibilidad de retroceso, de esta manera se renueva de paso la membrana. Existe también un retorno de membrana desde el compartimiento Cis del complejo de Golgi hacia el retículo endoplasmático rugoso. La administración de la droga brefeldina A bloquea la fusión de las vesículas que pasan desde el retículo endoplasmático al compartimiento Cis del complejo de Golgi. Tras un tratamiento largo con esta droga, el complejo de Golgi se disgrega y las proteínas que estaban almacenadas en él retornan hacia el retículo endoplasmático. Este retorno puede ser bloqueado por agentes inhibidores de microtúbulos, los cuales no bloquean la fusión de las vesículas que pasan desde el retículo endoplasmático al compartimiento Cis del complejo de Golgi, o las que pasan de éste al compartimiento intermedio o de éste al Trans. Así, parece que sólo el retorno de membrana requiere microtúbulos. ALGUNAS FUNCIONES ESPECÍFICAS DEL APARATO DE GOLGI La secreción celular de proteoglicanos y glucoproteínas y la formación de lisosomas no incluyen todas las funciones del complejo de Golgi. Probablemente, el complejo de Golgi sea el principal director del transporte macromolecular en el interior de la célula. Muchos tipos de moléculas diferentes pasan a través de alguna porción del complejo de Golgi en algún momento de su maduración. Entre estas moléculas, como hemos visto, se encuentran las proteínas, glicoproteínas y proteoglicanos segregados por la célula. Además están las glucoproteínas y glucolípidos de la membrana plasmática, de modo que el complejo de Golgi no solo interviene en la renovación de la membrana plasmática mediante el proceso de exocitosis (aportando la membrana de las vesículas de secreción), sino que también participa en la formación de glicocaliz y de la pared celular vegetal. Un caso particular de estructuras formadas por el complejo de Golgi son el acrosoma de los espermatozoides y el nematocisto de los cnidoblastos de los cnidarios, ambas estructuras contienen componentes del tipo glicoproteínas. Aunque no hay pruebas evidentes, se ha sugerido que el complejo de Golgi interviene también en relación con compuestos lipídicos y derivados. Así parece que las lipoproteínas y hasta la bilis en hepatocitos pasan por el complejo de Golgi. Lo mismo ocurre con los quilomícrones del intestino (producidos en los enterocitos), con la síntesis lipídica en glándulas sebáceas y sudoríparas, y con la esteroidogénesis en las células de Leydig. Lo que se ignora aún es si, en estos casos, el complejo de 139



Golgi sirve únicamente de embalaje para el transporte, o si realiza algún papel químico importante en la liberación de esas sustancias. La extrusión fuera de la célula de los lípidos unidos a proteínas ocurre con vesículas procedentes del complejo de Golgi, sin embargo, la liberación de las hormonas esteroideas a la sangre no se realiza a través de vesículas de exocitosis procedentes del complejo de Golgi. LISOSOMAS En 1951, Cristian De Duve se dedicaba a estudiar mitocondrias y buscaba obtenerlas juntas para demostrar la existencia de una enzima mitocondrial, que era la citocromo oxidasa, pero cuando separaba la fracción de mitocondrias por centrifugación diferencial, encontraba que allí aparecía un contaminante, una enzima que es la Fosfatasa ácida y esta no tenía nada que ver con las mitocondrias. Pone nuevamente la fracción mitocondrial a la centrífuga y encuentra una fracción de mitocondrias donde no había actividad de fosfatasa ácida, la que se había concentrado en la otra fracción. Cuando lleva esta segunda porción al microscopio electrónico observa que la fosfatasa ácida solo estaba en el interior de vesículas. Cambia entonces el rumbo de sus investigaciones, deja a las mitocondrias y empieza a estudiar esta fracción que contenía fosfatasa ácida. Además de fosfatasa ácida, De Duve encuentra que allí había otras enzimas, Como proteasas, nucleasas, fosfatasas, glucosidasas, etc. Como en este organelo se encontraban enzimas que hidrolizaban los 4 componentes orgánicos de mayor importancia en la vida, De Duve le acuña el nombre de LISOSOMA = cuerpo que descompone algo.

La función del lisosoma está relacionada con la digestión celular, las enzimas que contiene este lisosoma son llamadas también HIDROLASAS ACIDAS debido a que trabajan con PH de 5. Desde 1951 en que De Duve describe a estas organelos, se han descrito más de 50 enzimas hidroliticas asociadas a vesículas lisosomales, lo que no quiere decir que todas las vesículas tengan las 50 enzimas, pero la enzima que nunca falta en un lisosoma, y por lo cual se le reconoce como tal, es la Fosfatasa ácida. Un lisosoma es como una bomba nuclear en la célula pues tiene todo lo que hidroliza, si algo desestabiliza su membrana, todo su contenido sale al exterior y la célula se termina en un instante. Por tanto, la envoltura que rodea a los lisosomas tiene propiedades fundamentales: Es una membrana que no se altera con un PH 7. Es una membrana estabilizada, si se desestabiliza y se rompe, capaz de provocar la muerte de la célula. Además las enzimas que contienen están en forma paracristalina lo que hace que permanezcan inactivas hasta que algo induzca a alguna a trabajar . DIVERSIDAD FUNCIONAL DE LOS LISOSOMAS. Normalmente se denominan lisosomas primarios aquellos que contienen sólo enzimas y que aún no han participado en procesos digestivos generalmente son muy pequeños (unos 0.5 nm de diámetro) y corresponden a las vesículas que contienen hidrolasas ácidas emanadas de la cara Trans del complejo de Golgi, muestran un contenido homogéneo denso. Por el contrario, aquellos que contienen materiales en 140



digestión en su interior (todos los restantes) se incluyen en la expresión lisosomas secundarios, muestran un contenido heterogéneo. La mayoría de las células animales superiores se nutren por difusión a través de la membrana y transporte activo. Sin embargo, algunos materiales que deben penetrar en ciertos protozoos (amebas) o células animales (leucocitos) son demasiado voluminosos para poder atravesar la membrana plasmática y son introducidos por endocitosis (fagocitosis o pinocitosis). En vertebrados superiores, esto ocurre en los enterocitos, túbulos proximales renales, epidídimo, leucocitos y macrófagos . En protozoos, y en el intestino de muchos invertebrados y de algunos vertebrados (como los ciprínidos, que no segregan pepsina), la tripsina pancreática no es suficiente para hidrolizar completamente las proteínas y éstas son ingeridas por endocitosis. En mamíferos esto sólo ocurre en recién nacidos así se captan los anticuerpos de la leche materna, que pasarán luego a la sangre. En estos casos actúan los lisosomas, que intervienen en la degradación de estas proteínas. El proceso se inicia con la formación de una vesícula de endocitosis. Si se trata de sustancias no visibles al microscopio, es una vesícula de pinocitosis, también denominada endosoma que, al adentrarse en el citoplasma, entra a formar parte de una red de túbulos y vesículas, conocida como compartimiento endosomal periférico, externo o temprano. A medida que este compartimiento se adentra aún más en la célula, disminuye el pH en su interior, y pasa a denominarse compartimiento endosomal perinuclear interno o tardío. Algunos investigadores piensan que se trata de dos compartimentos diferentes; es decir, que no están en continuidad, y que el tránsito del temprano a tardío se realiza mediante tráfico de vesículas, como ocurre en el paso de un compartimiento a otro del complejo de Golgi. Más en profundidad, el compartimiento endosomal tardío se transforma en el compartimiento endolisosomal, que es ya verdaderamente un compartimiento lisosómico (contiene hidrolasas ácidas), pues en él vierten sus enzimas los lisosomas primarios, emanados del complejo de Golgi, para proceder a la degradación de las sustancias incorporadas por endocitosis sin que las enzimas digestivas salgan al hialoplasma. Lo mismo ocurre en la fagocitosis de bacterias u otros microorganismos por los leucocitos polimorfonucleares y macrófagos. Las vacuolas de endocitosis (denominadas fagosomas en este caso) se unen a lisosomas procedentes del compartimiento endolisosomal, formándose un fagolisosoma (lisosoma secundario).

En ambos casos, completada la digestión, las moléculas resultantes difunden al hialoplasma. Quedan los residuos que, o bien son exositados por unión de la membrana del lisosoma a la plasmática y liberación del contenido al exterior o bien se acumulan en el lisosoma y permanecen allí por el resto de la vida de la célula, formando los denominados cuerpos residuales o telolisosomas. Los gránulos de lipofuscina que se observan en células con larga vida, como las del hígado, miocardio y neuronas, por ejemplo, son una muestra de esta segunda posibilidad. Es posible que estas vacuolas participen varias veces en el proceso de digestión. Así se ha demostrado suministrando a una célula ferritina y varias horas después oro coloidal y viendo que se acumulan los dos materiales en el mismo cuerpo residual. Los leucocitos polimorfonucleares están provistos de numerosos lisosomas, que son visibles incluso al microscopio de luz como granulaciones denominadas gránulos azurófilos. Estos lisosomas se unen a la vacuola que encierra las bacterias fagocitadas y las digieren. Ante una infección considerable, los 141



fagolisosomas formados pueden acumular tal cantidad de bacterias en su interior que su membrana se rompe liberando las enzimas, que terminan con el leucocito, originando así el pus. Se ha visto que de un lisosoma pueden formarse varios menores o fusionarse unos con otros, como ocurre en los macrófagos. En este proceso intervienen microfilamentos, pero la membrana lisosómica siempre se mantiene inalterada, de modo que se evite la salida de enzimas al hialoplasma. Parece que, en algunos casos, los lisosomas pueden verter sus enzimas al exterior y destruir sustancias externas a la célula. Tal es el caso del tracto digestivo de moluscos, en el que los lisosomas liberan sus enzimas a la superficie epitelial para digerir externamente las partículas. Algo semejante ocurre con el acrosoma, un lisosoma especializado que se encuentra en el extremo de la cabeza del espermatozoide. Cuando éste entra en contacto con las cubiertas del óvulo, del acrosoma se liberan enzimas hidrolíticas, como proteasas, hialuronidasa, glucosidasas, fosfatasas, acilsulfatasas y fosfolipasas, que destruyen las cubiertas del óvulo para que la membrana del acrosoma se fusione con la membrana plasmática del óvulo.

Es probable que la destrucción de la matriz ósea efectuada por los osteoclastos sea causada por enzimas lisosómicas liberadas al exterior, destrucción que es seguida de endocitosis para la degradación final de algunas de las sustancias liberadas de la matriz. Lo mismo ocurre en la digestión de la matriz cartilaginosa por los condroblastos. Los lisosomas no sólo degradan sustancias procedentes del exterior de la célula (heterolisosomas) también pueden englobar y digerir organelos (mitocondrias, membranas citoplasmáticas, etc.) y porciones de citoplasma de la propia célula en grandes vacuolas digestivas denominadas vacuolas de autofagia, autolisosomas o citolisosomas para explicar la formación de una vacuola de gran tamaño, algunos piensan que no basta con suponer la fusión de muchos lisosomas y que el retículo endoplasmático liso proporcionaría esa membrana envolviendo los orgánulos sobrantes. Estas vacuolas digestivas se forman, por ejemplo, en condiciones de ayuno, en las que la célula debe nutrirse a sus expensas, pero también en circunstancias fisiológicas normales, como son los procesos de destrucción de organelos sobrantes. Además de organelos hay proteínas citosólicas que deben entrar en los lisosomas para su destrucción. Estas proteínas están marcadas por ciertas secuencias de aminoácidos como la secuencia Lys-Phe-Glu-Arg-Gln denominada secuencia KFERQ si se utiliza el código de una letra con el que pueden designarse más abreviadamente los nombres de los aminoácidos. Es posible que, mediante estas secuencias, esas proteínas citosólicas se unan a los organelos viejos que van a ser lisados. También es posible que esas proteínas citosólicas entren directamente en los lisosomas porque las secuencias que las marcan sean reconocidas por receptores de la membrana del lisosoma y se incorporen a éste atravesando su membrana por la acción de mecanismos de bombeo especiales. El contenido de estos lisosomas puede aparecer en la forma de figuras de mielina, que reflejan el alto contenido lipídico de los materiales en degradación. Esta destrucción de organelos es controlada, pero los lisosomas podrían destruir la célula entera si se rompen sus membranas, como hemos visto que ocurre en los leucocitos ante una grave infección. Roturas de este tipo tienen lugar tras la muerte (degeneración post morten). Antes se pensaba que los citolisosomas eran responsables de la eliminación de aquellas células que deben tener una vida corta y dejar paso a otras. Tal es el caso de las células sanguíneas, epiteliales. etc. Hoy en día se acepta que este proceso forma parte de la denominada muerte celular programada (apoptosis). Los citolisosomas o Autofagosoma (vacuolas autofágicas) también intervienen en el mecanismo de regulación de la secreción englobando gránulos de secreción, antes de que sea segregados, y digiriéndolos. 142



En muchas células de diferentes organismos se han encontrado con el microscopio electrónico estructuras constituidas por una membrana y que en su interior contienen numerosas vesículas, por lo que se les denomina cuerpos, multivesiculares. Se ven con frecuencia en células endoteliales, pero también se han observado en células sanguíneas, enterocitos, ovocitos, miocardio, etc . Aunque hubo ciertas dudas en el pasado sobre su naturaleza, tras ponerse de manifiesto que posee actividad fosfatasa ácida, se les consideró inequívocamente como lisosomas. Se han dado tres interpretaciones acerca del origen y significado de los cuerpos multivesiculares.  Se trata de vesículas de pinocitosis que penetran en un lisosoma primario, en cuyo caso habría que suponer que las vesículas de pinocitosis se unirían primero a la superficie del lisosoma y posteriormente se invaginarían.  Pueden ser varios lisosomas primarios, cada uno delimitado por su propia membrana, pero el conjunto quedaría rodeado por una membrana común.  Una tercera interpretación es que un lisosoma primario incorpora moléculas pequeñas del citoplasma a su interior (microautofagia) por un proceso semejante a la pinocitosis. DIGESTION INTRACELULAR. Puede ser heterofagica o autofagica: DIGESTION HETEROFAGICA: Esta función es realizada por un tipo de población celular de los organismos pluricelulares, denominados en forma genérica MACROFAGOS. Están agrupados dentro del llamado Sistema Endotelial, veamos algunos casos de digestión heterofagica: 1. Defensa del organismo. Todo cuerpo extraño, como bacterias y virus, que ingresan al organismo son englobados por los macrófagos por endocitosis para ser destruidos a nivel de los lisosomas. Sin embargo, existen algunas bacterias, como los de la TBC, de la difteria o la brucella, que están envuel tas en una pared tan rígida que las enzimas lisosomales son incapaces de destruirlas, y entonces ese fagoli sosoma se convierte un caldo de cultivo ideal para que la bacteria comience a reproducirse y en un vehículo que esparce la bacteria y/o sus toxinas por toda la economía debido a que los macrófagos viajan por todo el organismo. 2.- Inmunidad pasiva. En mamíferos como cerdos y caballos existe un tipo especial de macrófagos, llamados enterocitos que engloban la lactosa contenida en la leche, pasan así de la madre a las crías, con lo que estas adquieren cierto tipo de inmunidad. En el hombre, las sustancias inmunológicas son pasadas a través de la placenta de tal manera que en el feto, desde muy pequeño, ya hay una actividad heterofagica de los enterocitos y por lo tanto un tipo de inmunidad pasiva. 3. Reabsorción de proteínas. Por ejemplo, las proteínas circulantes en los glóbulos rojos, los que son destruidos al cumplir su vida media, quedando sus proteínas libres en el plasma sanguíneo. Estas proteínas son englobadas por macrófagos que luego las degradan. Otro tipo de reabsorción de proteínas sucede a nivel renal, el riñón está formado por una serie de túbulos constituidos por epitelio con gran capacidad de reabsorción, pero algunas proteínas pequeñas se escapan de la filtración y absorción y viajan por el interior de dichos túbulos, los macrófagos que allí existen son los que se encargan de coger y degradar esas proteínas que se escaparon. 4. Producción de hormonas. La tiroglobulina que se había formado en el Aparato de Golgi se almacena en la matriz del folículo tiroideo. El coloide se llena por un proceso de secreción celular, que es un tipo de exocitosis. Para que la tiroxina se cargue de yodo tiene que participar la tiroglobulina. Cuando se elevan los niveles de TSH (hormona estimulante de la tiroides), se comienza a formar una vesícula pinocitica, ingresando con ella a la célula un poco de tiroglobulina del coloide tiroideo. Después se observa que los lisosomas acuden y comienzan a degradar la tiroglobulina, que se transforma en T3 y T4, estas formas activas de la hormona tiroidea llegan al otro polo de la célula y por exocitosis salen al exterior, cayendo al torrente sanguíneo. 5. Crinofagia. Ocurre por ejemplo en las células que producen Prolactina, hormona hipofisiaria que estimula la secreción de leche materna. La prolactina se activa a nivel de los lisosomas, de donde sale para llegar 143



hasta las glándulas mamarias, dando la señal para que secreten leche. Se han hecho experimentos en los cuales se retira la cría de ratas que recién las han tenido y que presentan niveles de prolactina bastante elevados, en estas ratas se observa que las vesículas cargadas de prolactina no salen de las células que la han producida, por lo que no se secretan, a los 4 días se observa que las vesículas conteniendo prolactina se han fusionado a lisosomas, encontrándose la hormona en proceso de degradación. Este proceso heterofágico se denomina Crinofagia.

DIGESTION AUTOFAGICA. Es el fenómeno referido a la digestión del propio contenido celular. Ocurre en forma normal en el caso de células sometidas a una serie de factores adversos. Por ejemplo, en un corte citológico de cualquier tejido de una rata que haya estado en ayunas se observa porciones de citoplasma o mitocondrias en el R.E., lo que indica que la célula responde al ayuno tra tando de mantener su integridad aun a costa de digerir pedazos de su propia estructura. La autofagia también se produce como un proceso de remodelación fisiológica. Por ejemplo, durante el desarrollo embrionario existen células que tienen una determinada posición, luego otra y finalmente desaparecen al haber cumplido su rol fisiológico, su desaparición se produce gracias a que lisosomas nacidos del R.E. las digieren, es decir, hay una autodigestión de carácter programado. De manera similar, existen células que tienen que morir antes que el individuo adquiera la posición bípeda, lo cual se realiza también por autofagia. También hay autofagia como respuesta patológica, por ejemplo en los casos de tratamiento periódico con rayos X, lo que permite observar una multiplicación de vacuolas autofagicas en los tejidos irradiados. DIGESTION EXTRACELULAR. En los huesos existen dos tipos de células: los osteoblastos y los osteoclastos, estos últimos derivados de los primeros. A medida que se crece, los osteoblastos van siendo remodelados, los lisosomas primarios de los osteoclastos se fusionan a su membrana plasmática y vierten su contenido, estas enzimas destruyen al hueso para darle forma. INTERVENCION EN PROCESOS PATOLOGICOS Los lisosomas tienen también gran importancia en los procesos patológicos. Las células que se ven forzadas a englobar grandes cantidades de sustancias extrañas tenderán a acumular estos materiales en sus lisosomas con el consiguiente detrimento de su vitalidad. Los sustitutivos del plasma, como dextrano o polixinilo, producen este resultado. En la silicosis ocurre lo mismo con la sílice. En el caso de anomalías genéticas, como la deficiencia de enzimas degradantes del glucógeno, éste se acumula en los lisosomas (que carecen de estas enzimas por el defecto mencionado) llegando a producir la muerte ( glucogénesis de Pompe ). Otra enfermedad congénita lisosómica es la enfermedad de Fabry , debida a la ausencia de la enzima lisosómica galactosidasa alfa, requerida para el catabolismo de esfingolípidos. Hay productos químicos que actúan sobre la membrana de los lisosomas, algunos existen ordinariamente en el organismo y es muy posible que regulen procesos de autofagia. La vitamina A y algunas hormonas son agentes labilizantes de la membrana de los lisosomas y actúan sobre todo en las células del tejido conjuntivo, provocando que la membrana del lisosoma se rompa fácilmente y libere las hidrolasas. Por el 144



contrario, la cortisona e hidrocortisona son estabilizantes de la membrana lisosómica , a esto parece deberse su conocido efecto antiinflamatorio. En la enfermedad conocida como gota se producen cristales de urato en el líquido sinovial de las articulaciones. Los leucocitos neutrófilos (polimorfonucleares) fagocitan estos cristales que rompen la membrana del lisosoma. Así se digieren los neutrófilos y se vierten hidrolasas a los tejidos (líquido sinovial) provocando una reacción inflamatoria. El síndrome de Hurler se produce por la falta de fucosidasa, acompañándose de retardo mental marcado, el síndrome de Tay Sachs se debe a la falta de exosaminidasa, se acompaña de retardo mental y malformaciones corporales. Se presentan de 14 a 15 síndromes asociados a la falta de enzimas lisosomales.

ORIGEN DE LOS LISOSOMAS. Las enzimas lisosómicas son glucoproteínas con oligosacáridos unidos a N que muestran el rasgo poco habitual, pero común a todas ellas, de poseer un residuo de manosa fosforilada. Estas enzimas se sintetizan en el retículo endoplasmático rugoso y pasan al compartimiento Cis del complejo de Golgi, donde pierden alguno de los residuos de manosa incorporados en el retículo endoplasmático rugoso, y las dos manosas terminales incorporan un radical fosfato que sirve de marcador. La superficie luminal de la cara Trans del complejo de Golgi posee receptores para esta manosa fosforilada, con lo que las enzimas lisosómicas quedan fijadas a esta membrana. Desde esta cara Trans del complejo de Golgi, las enzimas lisosómicas se emiten en vesículas con cubierta de clatrina constituyendo los lisosomas primarios. Estas vesículas pierden pronto la cubierta de clatrina y pueden fusionarse con otros lisosomas primarios ya existentes o incorporarse al compartimiento endolisosomal, fusionándose con los lisosomas secundarios que actúan en ese compartimiento. Para que las vesículas con enzimas lisosómicas alcancen el compartimiento endolisosomal, no basta con el marcador manosa-fosfato de estas enzimas y el receptor de la membrana del Golgi para este marcador, hace falta también que las membranas del compartimiento endolisosomal presenten en su superficie receptores para las vesículas que transportan las enzimas lisosómicas. Al producirse la fusión, las hidrolasas pierden el marcador de manosa-fosfato, lo que puede ayudar a retener estas enzimas en el lisosoma, evitando que sean cogidas de nuevo por membranas con receptores durante el reciclaje de membranas.

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Para estudiar las interrelaciones entre los marcadores manosa-fosfato, sus receptores en las membranas de la cara Trans del complejo de Golgi, y los receptores de las membranas del compartimiento endolisosomal para las vesículas que son transportadas hacia él, se ha experimentado añadiendo enzimas lisosómicas con su marcador manosa-fosfato al medio de cultivo. Las células normales, que también tienen receptor para este marcador en la membrana plasmática, incorporan por endocitosis estas enzimas, las cuales, ya en el citoplasma, se dirigen al compartimiento endolisosomal, con el que se fusionan gracias a los receptores de este compartimiento para las vesículas lisosómicas. Es decir, la membrana plasmática se comporta como la de la cara Trans del complejo de Golgi, de la cual proviene. Sin embargo, en células cuyas enzimas lisosómicas carecen del marcador manosa-fosfato por una enfermedad congénita, las enzimas sintetizadas por el complejo de Golgi son segregadas directamente al espacio extracelular en vez de alcanzar el compartimiento endolisosomal. Esto ocurre porque el complejo de Golgi, aunque posee los receptores adecuados, no reconoce estas enzimas como lisosómicas al carecer de marcador y las dirige por defecto hacia la superficie celular. Las enzimas lisosómicas carentes de marcador y suministradas en el medio no penetran en estas células. En aquellas células cuyas enzimas lisosómicas poseen el marcador manosa-fosfato pero el complejo de Golgi no posee los receptores para este marcador, las enzimas lisosómicas sintetizadas por la propia célula son también liberadas directamente al exterior porque el complejo de Golgi, que carece de los receptores adecuados, no empaqueta las enzimas con destino al compartimiento endolisosomal y, por defecto, también eligen la ruta de la secreción constitutiva. Del mismo modo, las enzimas lisosómicas con marcador vertidas en el medio no entran en la célula, pues su membrana plasmática carece de receptores para estas enzimas. Finalmente, en las células que, aun teniendo receptores para el marcador lisosómico en la membrana plasmática y en el complejo de Golgi, no tienen receptores para las vesículas lisosómicas en las membranas del compartimiento endolisosomal, se observa que las enzimas vertidas en el medio entran en la célula, pero no permanecen en ella y vuelven a salir. También abandonan la célula las enzimas lisosómicas sintetizadas por el complejo de Golgi. PEROXISOMAS Los peroxisomas, junto con las mitocondrias, son organelos celulares que desempeñan un papel primordial en la utilización del oxígeno. Morfológicamente son parecidos a los lisosomas, es decir son partículas esféricas, limitadas por una membrana, de un diámetro variable entre 0.3 y 1.5 µm y con un contenido enzimático especifico. Sin embargo, difieren mucho funcionalmente de los lisosomas, pues las enzimas que contienen no son hídrolasas acidas, sino enzimas que intervienen en el metabolismo del H2O2 y colaboran con las mitocondrias y cloroplastos en algunas funciones. Los peroxisomas se observaron por primera vez en el riñón y el hígado de roedores, hacia 1950, cuando comenzaron los estudios de la célula con el microscopio electrónico, y se les denominó microcuerpos . En el hígado se distribuyen irregularmente, a diferencia de los lisosomas, que ocupan una posición pericanalicular. Posteriormente, los peroxisomas se fueron localizando en muchos tipos celulares de vertebrados, protozoos, levaduras y en algunos tipos celulares de vegetales superiores, como en tejidos verdes que realizan la fotorrespiración y en el endosperma, que contiene abundante grasa y constituye 146



una reserva alimenticia para el desarrollo del embrión tras la germinación de la semilla. Con el tiempo se han observado en casi todos los tipos celulares (excepto eritrocitos), hasta el punto que se consideran un organelo habitual de las células; si bien no siempre se pueden identificar por su aspecto morfológico, siendo además necesarias técnicas especiales para ponerlos de manifiesto. Así, en enterocitos son muy abundantes, pero pasan desapercibidos por su pequeño tamaño ( alrededor de 0.2 µm) y la ausencia de cristales. Vistos con el microscopio electrónico los peroxisomas presentan un contenido granular fino y pueden ser identificados por técnicas citoquímicas específicas. Una de las más empleadas es la adición de diaminobenzidina y H 2O2, que reaccionan con la intervención de una de las enzimas del peroxisoma, la catalasa. Como resultado de la oxidación de la diaminobenzidina, se produce un precipitado en los peroxisomas que es visible incluso al microscopio óptico. En el interior de algunos peroxisomas pueden observarse estructuras cristalinas que generalmente corresponden a la enzima oxidasa de urato. La estructura de estos nucleoides cristalinos varía según el tipo celular; en general, los nucleoides aparecen formados por estructuras en forma de túbulos, unos de 10 y otros de 4.5 nm de diámetro, formando distintos tipos de redes. Los peroxisomas se aíslan inicialmente en la misma fracción celular que los lisosomas pero, como son más pesados que éstos, al volver a centrifugar en gradiente de sacarosa, los peroxisomas quedan más al fondo que los lisosomas, pudiendo ser así separados de éstos.

FUNCIÓN Actividad enzimática Los peroxisomas se denominan así porque contienen enzimas que utilizan el oxígeno molecular para eliminar átomos de hidrógeno de sustratos específicos, a través de una reacción oxidativa que produce H2O2. La reacción global sería: RH 2 + O2 => R + H 2O2, siendo RH2 el sustrato oxidable (aminoácidos, cetoácidos alfa, ácido úrico, alantoína, acil-CoA, enoil-CoA, ácido glicólico, ácido glioxílico, etc.). Las enzimas que catalizan esta reacción son: la oxidasa de aminoácidos, la oxidasa de hidroxiácidos alfa y la oxidasa de urato, denominadas de acuerdo con el sustrato. El H 2O2 resultado de la reacción es un producto altamente tóxico que es eliminado por otra enzima del peroxisoma, la catalasa, bien directamente, según la reacción: 2 H 2O2=> 2H2O + O2, o utilizando este H2O2 para oxidar diversas sustancias, como alcoholes, fenoles, ácido fórmico, formaldehído y acetaldehído, según la reacción: H 2O2 + R'H2 => R' + 2H 2O, siendo R'H2 una de las sustancias mencionadas. En los peroxisomas del riñon e hígado se han localizado estas cuatro enzimas. La más abundante es la catalasa, que constituye el 40 % de la proteína total de los peroxisomas del hígado . No obstante, estas cuatro enzimas no aparecen siempre en los peroxisomas de todos los tejidos, pero al menos la catalasa y oxidasa de hidroxiácidos alfa están siempre presentes. A diferencia de las oxidaciones respiratorias mitocondriales, que consumen también oxígeno, las que se desarrollan en los peroxisomas no están acopladas a la fosforilación del ADP en ATP. Mediante su dotación enzimática, variable de unos tejidos a otros, los peroxisomas pueden intervenir en diversas vías metabólicas, que difieren según los organismos y el tipo de tejido. Las funciones específicas mejor conocidas son: el catabolismo de las purinas, el metabolismo de los lípidos y el metabolismo del ácido glicólico. 147



Catabolismo de las purinas Los ácidos nucleídos viejos son degradados en sus constituyentes por nucleasas específicas: primero en nucleótidos y, después, en bases púricas y pirimidínicas. Estas bases, o bien son reutilizadas para la síntesis de nuevos ácidos nucleicos, o bien son degradadas. En la degradación de las bases púricas (adenina y guanina) intervienen diversas enzimas peroxisómicas. El H 2O2 que se libera con estas oxidaciones es descompuesto por la catalasa. En muchas aves y algunos mamíferos, incluidos los primates y el hombre, el producto final de la degradación es el ácido úrico. En otros mamíferos, tortugas y moluscos, el ácido úrico es degradado a alantoína que, en algunos peces teleósteos, continúa su degradación hasta ácido alantoico. En muchos peces, anfibios e invertebrados marinos el ácido alantoico es degradado a ácido glioxílico y urea. Esta última puede ser finalmente degradada a amoníaco.

Metabolismo de los lípidos En hígado de rata, en el protozoo Tetrahymena y en las semillas de ricino, se ha comprobado que los peroxisomas intervienen en el metabolismo de los lípidos mediante los siguientes procesos, aunque no todos ellos ocurren en todos los organismos. oxidación de los ácidos grasos Se piensa que aproximadamente un 25 % de los ácidos grasos se degradan en peroxisomas y el resto en mitocondrias. En ambos orgánulos este proceso de degradación se denomina  oxidación y conduce a la formación de acetil-CoA. La diferencia reside en que, mientras que en las mitocondrias la primera reacción oxidativa es catalizada por una deshidrogenasa, en los peroxisomas esta oxidación la realiza una oxidasa flavinica. La oxidación del acil-CoA por el oxígeno molecular forma H 2O2, que es descompuesta por la catalasa. Los acetil-CoA formados pasarán a diferentes rutas (biosíntesis de azúcares, ciclo de Krebs). Conversión de grasa en carbohidratos: ciclo del glioxilato El acetil-CoA producido en la degradación de ácidos grasos puede seguir una ruta melabólica importante en algunos órganos vegetales. Esta vía metabólica se ha estudiado con profundidad en la semilla de ricino, en la cual, en el momento de la germinación, la grasa de endosperma se convierte en glúcidos. Las moléculas de acetil-CoA producidas en la degradación de los ácidos grasos en el peroxisoma se utilizan para producir ácido succínico, en el proceso conocido como ciclo del glioxilato. De ahí el nombre de glioxisomas dado a los peroxisomas de estas semillas que contienen las enzimas que intervienen en ese ciclo y que son sintetizadas en el momento de la germinación o poco antes. El ácido succínico producido en este ciclo abandona los peroxisomas y penetra en las mitocondrias, en cuya matriz es oxidado por las enzimas del ciclo de Krebs a ácido oxalacetico, que abandona las mitocondrias y se convierte en glucosa en el hialoplasma. Peroxisomas que realizan una función similar se han demostrado no sólo en vegetales, sino también en algunos flagelados, como Englena, que utilizan los ácidos grasos de cadena corta como fuente de carbohidratos.

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Metabolismo del ácido glicólico En órganos verdes de vegetales, en los que se verifica el proceso de fotorrespiración, en abundancia de luz y oxígeno y baja tensión de CO 2 se produce ácido glicólico, que es un subproducto metabólico de los cloroplastos producido por fijación de O 2 en la ribulosa-1-5-difosfato. El ácido glicólico entra en los peroxisomas y es oxidado a ácido glioxílico, que se convierte en glicina, que pasa de los peroxisomas a las mitocondrias donde se transforma en serina y CO 2.

Otras funciones Las reacciones oxidativas de los peroxisomas son muy importantes en el hígado y riñon, cuyos peroxisomas detoxifican gran cantidad de moléculas tóxicas que entran en la circulación, como, por ejemplo, el etanol. Casi la mitad del etanol ingerido por el organismo es oxidado a acetaldehído en los peroxisomas del hígado. ORIGEN Se ha observado una relación entre los peroxisomas y el retículo endoplasmático rugoso. Es muy frecuente que los peroxisomas aparezcan en la proximidad del retículo endoplasmático rugoso; incluso se han publicado imágenes de microscopía electrónica que muestran inequívocamente conexiones entre las membranas del retículo endoplasmático rugoso y las de vesículas que contienen la estructura cristalina característica de algunos peroxisomas. De ahí que se piense que los peroxisomas pueden originarse como una gemación del retículo endoplasmático rugoso desprovista de ribosomas y en la que se almacenarían las enzimas peroxisómicas. Sin embargo, está suficientemente demostrado que las enzimas peroxisómicas no se sintetizan en el retículo endoplasmático rugoso, sino en los ribosomas libres. Estas proteínas están provistas de un peptido señal aminoterminal, de al menos tres aminoácidos, que es reconocido por receptores específicos de la membrana del peroxisoma. Estos receptores se 149



sintetizarían por el retículo endoplasmático rugoso, al originar la membrana del peroxisoma, quedarían alojados en el lado citosólico de dicha membrana y reconocerían las enzimas peroxisómicas permitiéndolas entrar. Como las mitocondrias y cloroplastos, los peroxisomas pueden realizar fisión previo crecimiento. Según estudios radioautográficos, la vida media del peroxisoma es de 4.5 días, y se destruyen por autofagia. VACUOLA VEGETAL En las células vegetales meristemáticas existen numerosas vesículas y vacuolas de pequeño tamaño (provacuolas), que sólo se aprecian bien con el microscopio electrónico. Al crecer estas células, las provacuolas adquieren mayor tamaño y se fusionan hasta formar una gran vacuola central, que en algunas células, como las parenquimáticas, llega a ocupar más del 90 % del volumen celular. La vacuola se halla limitada por una membrana citoplasmática, que se denomina tonoplasto, con estructura trilaminar, de menor espesor que la membrana plasmática; es decir, como las membranas citoplasmáticas, aunque en algunos casos se ha descrito que su espesor es igual al de la membrana plasmática. Mediante criofractura se observa una imagen similar a la de la membrana plasmática, el examen de cortes al microscopio electrónico muestra que la hemimembrana interna es más gruesa que la externa, al igual que ocurre en la membrana plasmática. En la vacuola hay un jugo vacuolar de apariencia amorfa incluso con microscopía electrónica; pero a veces también pueden observarse estructuras de mayor tamaño, cristalinas o no, según los productos que almacene la vacuola, y que guardan relación con su función.

Funciones La vacuola lleva a cabo funciones fisiológicas importantes, que podemos resumir en las siguientes: Facilitar el intercambio con el medio externo Como el intercambio de sustancias del interior de la célula con el medio externo sólo puede realizarse a través de la membrana plasmática, cuando las células animales desean aumentar dicho intercambio, cambian de forma aumentando la relación superficie/volumen, como ocurre, por ejemplo en las microvellosidades. En las células vegetales, la gruesa pared celular no permite esa modificación, y el problema se resuelve gracias a la vacuola. Si ésta no existiera, la célula tendría todo el citoplasma y organelos ocupando el mismo volumen que ahora tiene, pero con una superficie de dimensiones mucho más reducidas. Al aparecer la vacuola, el volumen del citoplasma no aumenta, pero se extiende ocupando una fina capa entre la pared celular y la vacuola. De esta manera, la célula vegetal se hace grande y desarrolla una gran superficie de membrana plasmática en relación con el pequeño volumen que ocupa el citoplasma, si no incluimos en este volumen el que ocupa la vacuola. Esa misma disposición aumenta la eficacia de los cloroplastos, evitando en gran medida que se hagan sombra unos a otros. Turgencia celular La vacuola se encuentra a una gran presión osmótica debido a la alta concentración de azúcares y sales que contiene. Su membrana presenta particularidades especiales de permeabilidad y transporte. Esto hace que la célula se mantenga turgente, pues el agua tiende a penetrar en la vacuola para equilibrar la presión osmótica. El citoplasma queda así apretado contra la pared celular. 150



La presión de turgencia de una vacuola puede sufrir cambios controlados como respuesta a fluctuaciones ambientales. La presión se incrementa al aumentar la concentración de solutos, bien en el hialoplasma (mediante la importación de solutos desde el espacio extracelular a través de la membrana plasmática), o bien directamente en la propia vacuola (mediante la síntesis de estos solutos por hidrólisis de sustancias almacenadas). Cuando estos mecanismos actúan en sentido inverso causan la disminución de la presión. El control de la presión de turgencia está regulado por receptores de la membrana plasmática que responden a los cambios de presión induciendo un bombeo de K + hacia el citoplasma (para contrarrestar la disminución de la presión) o la difusión de K + hacia el exterior a favor de gradiente (para contrarrestar el aumento de presión). La presión de turgencia varía ampliamente de unas plantas a otras: desde 0,5 hasta 50 atmósferas. En plantas de hábitat salino se requiere una alta concentración de solutos para aumentar la turgencia. Un mecanismo rápido para aumentar la presión sería la incorporación de K +; sin embargo, altas concentraciones de este ion no serían viables y, por eso, estas plantas acumulan solutos orgánicos en las vacuolas que pueden alcanzar concentraciones de hasta 0.5 M sin dañar el metabolismo. Entre estos solutos están los polifosfatos, compuestos polihidroxílicos como el glicerol y el manitol, aminoácidos como la prolina, o derivados N-metilados de aminoácidos como la glicinbetana. La vacuola regula también las concentraciones de determinados iones y el pH del hialoplasma, que alcanzan valores diferentes a los encontrados en la vacuola . La concentración de Na + dentro de la vacuola es entre 4 y 5 veces mayor que en el hialoplasma, debido a una bomba de Na + presente en el tonoplasto. Cuando desciende el pH del medio, la vacuola bombea iones H + hacia su interior para ejercer un efecto tampón. Los cambios en la turgencia pueden generar alteraciones en la forma celular si la pared es plástica, como ocurre en los estomas. Durante el día los estomas están abiertos y la luz activa bombas de K + de la membrana plasmática para mantener alta la presión de turgencia. Por la noche se invierte el proceso y se cierran los estomas. Cambios similares son los responsables de movimientos de la hoja de Mimosa pudica , del cierre de las trampas en las hojas de ciertas plantas carnívoras y de los movimientos de partes florales en la polinización de algunas plantas. Digestión celular En el interior de la vacuola hay enzimas lisosómicas. De este modo, la vacuola se comporta como fagosoma y citolisosoma. Acumulación de sustancias de reserva y subproductos del metabolismo En la vacuola hay agua y determinadas sustancias que pueden estar disueltas, floculentes o cristalinas. Entre estas sustancias están:  Aniones y cationes, como: Cl -, SO2-4 PO3-4, Na+, K+, Ca++ y Mg++.  Hidratos de carbono: - Monosacáridos: Los más abundantes son las hexosas, como la glucosa (en uvas), fructosa (en melocotones), galactosa, manosa y sorbosa. - Disacáridos: Como sacarosa y maltosa (que se forma por el desdoblamiento de polisacáridos, especialmente del almidón). - Polisacáridos: No cuentan ni el almidón (que está en los plastidios), ni la celulosa (que está en la pared celular). El más abundante es la inulina, que por hidrólisis da fructosa. El glucógeno sólo es frecuente en hifas de hongos y algunos líquenes.  Aminoácidos: Son eslabones en la elaboración de materias proteicas que también se almacenan en las vacuolas. El más difundido es la asparagina. En menor cantidad existen leucina, tirosina y ácido glutámico.  Polipéptidos y proteínas: Incluyen: - Enzimas: Como la amilasa (que degrada el almidón en dextrina y luego en maltosa), y diversas lipasas y proteasas. Muchos vegetales contienen en las vacuolas proteínas que inhiben las enzimas que digieren proteínas en animales herbívoros (como el factor inhihidor 1), constituyendo una defensa contra su voracidad. Son muy abundantes en las hojas de solanáceas. Pueden observarse con el microscopio electrónico en cortes como partículas floculentas. - Granos de aleurona: Son reservas proteicas que llenan las vacuolas y son visibles incluso al microscopio óptico. Forman granos regulares (cristaloides proteicos) o irregulares. En el ricino, sobre el cristaloide hay gránulos irregulares que forman el globoide. Se encuentran en gran 151


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proporción en el endosperma de semillas y pueden estar en las vacuolas de estas células durante años hasta que, al germinar la semilla, se hidrolizan las proteínas sirviendo de alimento al embrión. Alcaloides y glucósidos: Se consideran productos de degradación de la actividad metabólica del citoplasma celular y se almacenan en la vacuola. Pigmentos antociánicos: De naturaleza glucosídica. Dan color rojo a corolas, hojas, algunos órganos caulinares y subterráneos. Pigmentos flavónicos: Parecidos a los anteriores. Se encuentran en pétalos y dan color amarillo combinados con xantofila. Taninos: Dan precipitados azules o negros en presencia de sales férricas. Con dicromato potásico dan precipitados pardos. Se encuentran unidos a materias proteicas a las que vuelven insolubles e imputrescibles; de ahí su utilidad para teñir pieles. Se encuentran en el parénquima, al que dan un color pardo. Derivan del ácido gálico o elágico en combinación con glucósidos. Se consideran un producto de excreción de la planta. Ácidos orgánicos y sus sales: Presentes en el parénquima de la hoja, fruto y rizomas. Los más frecuentes son los ácidos cítrico, málico, tartárico y oxálico . Son muy abundantes en las plantas suculentas. El ácido oxálico forma cristales en presencia de Ca ++ (oxalato cálcico). Si cristaliza con una molécula de agua, los cristales son monoclínicos. Se observan como agujas muy finas, se encuentran en bulbos de liliáceas y en las hojas de Aloe sp., y se denominan rafidios. Pero si cristalizan con tres moléculas de agua, los cristales son del sistema rómbico. Frecuentemente estos cristales forman bipirámides sobre cuyas caras se depositan pirámides. El conjunto forma una drusa o macla, frecuente en todas las partes de la planta. Algunos de estos compuestos tienen una función claramente metabólica. Las plantas suculentas abren sus estomas por la noche, cuando la concentración de CO 2 ambiental es menor que durante el día, y el CO 2 es incorporado en ácido málico que se almacena en las vacuolas. Durante el día, cuando hay energía luminosa, el ácido málico es transformado en azúcares mientras se mantienen los estomas cerrados.

La mayoría de las vacuolas se forman por la fusión de múltiples vesículas membranosas. El organelo no posee una forma definida, su estructura varía según las necesidades de la célula. Desde hace mucho tiempo se ha considerado que las vacuolas se forman del retículo endoplasmático. Cuando se evidenció que eran muy parecidas a los lisosomas de las células animales se llegó a la conclusión de que las vacuolas de por lo menos algunas células vegetales tenían un origen similar al de los lisosomas animales. La formación de los lisosomas está asociado a una región del citoplasma muy especializada llamada GERL, formado por el complejo de Golgi, el retículo endoplasmático y los lisosomas. Esta asociación de membranas se ha encontrado también en algunas células vegetales, por lo que el origen de las vacuolas podría ser el mismo que el de los lisosomas animales. PLASTOS O PLASTIDIOS Son organelos exclusivos de células vegetales y están relacionados con procesos metabólicos primordiales, pues son capaces de sintetizar y almacenar sustancias. Se encuentran en la mayoría de las células vegetales superiores e inferiores, en el curso de la evolución, tanto en las plantas superiores como en los vegetales terrestres, se ha impuesto la forma lenticular en los plastos, con un diámetro que oscila de 4 a 8 micras. Hay diversos tipos de plastidios, pero todos tienen en común la existencia de una doble membrana. Pueden clasificarse según su aspecto y función en:  Indiferenciados , que pueden ser: 152



- Proplastos: se cree que son el origen de todos los demás. - Etioplastos: provienen de proplastos que, en vez de diferenciarse en presencia de la luz para dar cloroplastos, se diferencian en la oscuridad dando lugar a etioplastos.  Diferenciados , se clasifican en: - Cromatoforos fotosintéticamente activos, que son los de los cloroplastos verdes, los feoplastos (pardos) y los rodoplastos (rojos). - Cromatóforos fotosintéticamente inactivos, conocidos como cromoplastos y son generalmente rojos y amarillos. - Leucoplastos: son incoloros y fotosintéticamente inactivos; están especializados en el almacenaje de sustancias y existen varios subtipos, según cuál sea la sustancia almacenada: — Amiloplastos (almidón). — Oleoplastos (aceites). — Proteinoplastos (proteínas). Los plastidios no sólo realizan fotosíntesis y almacenamiento; también se utilizan para el metabolismo intermedio, pues producen la mayor parte de la energía y poder reductor, en forma de ATP y NADPH, necesarios para las reacciones biosinteticas de la planta. La síntesis de bases púricas y pirimidinicas, así como de muchos aminoácidos y de todos los ácidos grasos de la planta, tiene lugar en los plastidios. Los plastos se encuentran limitadas del resto del citoplasma por dos membranas estructuralmente distintas. A menudo están coloreadas por pigmentos de carácter liposoluble. Todos los plastidios en su fase juvenil, denominados en esa fase protoplastidios, contienen hasta un 3% de su peso en seco de ADN, en estado adulto tienen un 1%. Los plastos se multiplican por bipartición. El ADN de los plastidios se presenta como una molécula gigante circular, que tiene de 120.000 a 200.000 pares de bases, los protoplastos crecen junto con las células meristemáticas. Los protoplastos se desarrollan en el interior, mediante la formación de repliegues en su membrana interior, adquiriendo gran superficie, en esta superficie interna, los pigmentos fotosintetizadores se sitúan de forma ordenada. En la oscuridad los protoplastos de los vegetales se pueden transformar en estruturas cristalinas llamadas etioplastos, que por el efecto de la luz, pueden a su vez transformarse en cloroplastos. Los plastos que están dañados o que son seniles presentan a menudo en su interior gotas de lípidos, conocidas con el nombre de plastoglóbulos. En la reproducción sexual de los organismos, los plastidios se transmiten mediante los gametos, en muchos casos a través del gameto femenino. El ADN de los plastos es específico y se denomina ADNplastidial, difiere del ADN-nuclear por la relación entre las bases y grosor, es un filamento doble que se replica por una ADN-plastidial-polimerasa específica, y también existe una ARN-plastidial-polimerasa específica para la transcripción. Una parte de las proteinas del plasto se sintetiza a partir del ADNplastidial de 40 nm de longitud, y otra parte del ADN-nuclear. Los genes de los plastos forman el plastoma, mientras que el conjunto de plastos de una célula se llama plastidoma . Los ribosomas de los plastos son más pequeños que los del citoplasma, con una velocidad de sedimentación de 70 s. Estos ribosomas plastidiales son parecidos a los de los procariontes, y sensibles como ellos a determinados antibióticos, como el cloroanfenicol o la limcomicina. CLOROPLASTOS Los cloroplastos son los organelos que realizan la fotosíntesis mediante el pigmento clorofila que poseen en gran cantidad, en algunos casos la clorofila puede quedar acompañada de otros pigmentos, como por ejemplo en las algas pardas (feoficeas), existen feoplastos donde la clorofila está enmascarada por carotenoides pardos, como la fucoxantina, en las algas rojas (rodoficeas), hay rodoplastos donde la clorofila está enmascarada por carotenoides de color rojizo, como la ficoeritrina-roja y la ficocianinaazul. Son muy abundantes en las células vegetales superiores diferenciadas, en las que se observan situados en la periferia, alrededor de la gran vacuola central, su número es muy variado de unos lugares a otros de la planta, y también depende del tejido o tipo celular en el que se encuentran. En el parénquima clorofílico o asimilador son muy abundantes, contándose hasta 30 a 40 cloroplastos por célula, y su posición varía dentro de ésta en relación con la luz . Con luz tenue, los cloroplastos se disponen paralelamente a la cara de la célula donde incide la luz, buscando la máxima absorción de luz. Por el contrario, con luz intensa, los cloroplastos emigran disponiéndose junto a las paredes celulares y orientadas paralelamente a la luz incidente. 153



En los vegetales inferiores los cloroplastos muestran formas muy variables: adquieren forma espiral en Spirogyra, estrellada en Zygnema, en herradura en Chlamydomonas. y semicilíndrica en Ulothrix. Estructura de los cloroplastos. Los cloroplastos poseen una estructura con forma de disco, el diámetro oscila entre 1 a 3 micras, y un espesor de 1 a 2 micras. Cada cloroplasto se encuentra separado del hialoplasma por 2 membranas concéntricas de 60 Å de espesor, la membrana interna y la externa del cloroplasto. En el interior de esta envuelta se encuentra el estroma, y en el estroma se disponen un conjunto de estructuras aplanadas y alargadas llamadas tilacoides o lamelas. La pared de los tilacoides se forma por una membrana de 70 Å de espesor, y así se puede distinguir una zona intermembranosa entre las dos envueltas del cloroplasto y el interior del tilacoide, espacio intralamelar o lóculo. Las membranas de los tilacoides se asientan según el eje principal del plasto, dando dos tipos de estructuras, una formada por discos aplastados de 0.3 a 0.6 micras de diámetro, que se apilan unas sobre otras, originando los grana , entonces se dice que están formadas por los tilacoides de los grana; y el otro conjunto de estructuras, están limitando cavidades que se encuentran en el estroma de forma variable, y se conocen como los tilacoides del estroma. Los grana se distinguen en las células vivas como zonas más verdes dentro del cloroplasto al verlo al microscopio.

En una célula, en cada cloroplasto suele haber de 40 a 60 granas, cada uno de los cuales está formado aproximadamente por 10 tilacoides, la zona donde se unen los tilacoides y los grana se denomina zona de transición. La zona de los cloroplastos representa una superficie de 500 veces la de la membrana externa de la envoltura. Los espacios intermembranosos y los intratilacoidales poseen un contenido más claro que el estroma, en el estroma hay una sustancia fundamental finamente granular, además de plastoglóbulos que tienen un diámetro de 500 a 3000 Å, granos de almidón, fibrillas de ADN-plastidial, que se agrupan en nucleoides de 30 a 40 Å de tamaño, y plastorribosomas que tienen 170 Å de diámetro. Estructura de la envuelta Las membranas de la envuelta de los plastos contienen un 60% de lípidos y un 40% de proteinas. Los lípidos son talactolípidos, fosfolípidos y sulfolípidos en proporción decreciente , también pueden contener una pequeña proporción de pigmentos carotenoides, pero no clorofila. Las cadenas polipeptídicas son diferentes de las de los tilacoides, entre estas proteinas están la galactosiltransferasa, que son enzimas que catalizan la síntesis de los glucoplípidos de las membranas, además de ser transportadores que controlan el paso de moléculas entre el estroma y el hialoplasma. Membranas de los tilacoides Los microtúbulos de los tilacoides se componen de un 38% de lípidos, un 12% de pigmentos y un 50% de proteinas. Los lípidos son semejantes a los de la membrana de la envuelta, pero en proporciones distintas. Los pigmentos son la clorofila, con un 10%, y los carotenoides, con un 2% de la masa total de 154



las membranas. Ambas son solubles en los solventes de los lípidos . Las clorofilas son complejos porfirina-magnesio, estas moléculas poseen un polo hidrófobo, que corresponde a un alcohol, el fitol, y un polo hidrófilo que corresponde al núcleo tetrapirrólico. En los vegetales superiores, en las membranas de los tilacoides existen dos tipos de clorofila, que difieren por el grupo situado en el núcleo de la porfirina, en la clorofila 'a', hay un grupo metilo y en la clorofila 'b', un grupo formilo . Existen también carotenoides, que son sobre todo carotenos y xantofilas. Los carotenos son largas moléculas hidrófobas, formadas por unidades de isopreno, cuyos extremos constituyen anillos de cromatidios. Las xantofilas son derivados oxigenados de los carotenos. Las proteinas son de tres tipos: las asociadas a las clorofilas, forman complejos proteina-clorofila; las constituyentes de la cadena fotosintética de transporte de electrones; y ATP-asas responsables de la fosforilación. Función de los cloroplastos. La función principal del cloroplasto es realizar la fotosíntesis. Ésta es un proceso anabólico y autotrófico primordial, del que depende la vida sobre la Tierra. Consiste en la conversión por los organismos fotosintéticos de la energía luminosa procedente del Sol en energía eléctrica y después en energía química. Esta energía será utilizada para formar materia orgánica propia o biomasa (glúcidos) a partir de moléculas inorgánicas, como agua, CO 2 y sales minerales. El O 2 molecular, resultante de la ruptura de moléculas de agua que intervienen en el proceso, se desprende como producto de desecho. La materia orgánica y el oxígeno que fabrican las plantas, son elementos que utilizan los otros seres vivos como fuente de energía y materia. La fotosíntesis se puede representar mediante una ecuación global:

En esta ecuación el compuesto resultante (CH 2O) representa a un monosacárido, por ejemplo, la glucosa. La reacción o ecuación global de la fotosíntesis en realidad, se lleva a cabo en dos etapas o fases distintas: Fase luminosa : tiene lugar en presencia de luz. Durante esta fase tienen lugar dos procesos muy importantes: la fotólisis del agua por la que se obtiene poder reductor en forma de coenzimas reducidas (NADPH), y la fotosfosforilación que produce ATP. El producto de desecho de esta fase es el oxígeno molecular. Fase oscura : no requiere la presencia de luz. Se produce la reducción de la materia inorgánica a materia orgánica gracias al poder reductor y al ATP obtenidos en la fase anterior. Para comprender los acontecimientos que tiene lugar durante la fotosíntesis es necesario conocer la localización de los diferentes procesos en los cloroplastos. La ubicación de los complejos moleculares implicados en la fase luminosa es a nivel de la membrana tilacoidal y éstos son: los fotosistemas, la cadena de transporte de electrones y la ATP sintetasa. En el estroma tiene lugar la fase oscura de la fotosíntesis, es decir, se desarrolla el ciclo de Calvin.

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Fase Luminosa. Las reacciones de la fase luminosa de la fotosíntesis se desarrollan de la siguiente manera: Absorción o captación de la luz solar: es llevada a cabo por los pigmentos fotosintéticos. Éstos son las clorofilas y los carotenoides. Estos pigmentos junto a proteínas específicas se encuentran agrupados formando los llamados fotosistemas , que aparecen ubicados en las membranas tilacoidales de los cloroplastos. La clorofila constituye el centro de reacción del fotosistema y los demás pigmentos y proteínas el complejo denominada antena. Transporte o flujo electrónico fotosintético : Al chocar los fotones con el fotosistema son arrancados electrones de la molécula. Estos electrones arrancados del centro de reacción cargados con la energía del fotón, son transportados por un conjunto de proteínas transportadoras, situadas en la membrana tilacoidal, hasta la coenzima NADP +, que se reduce a NADPH. En la cadena de transporte de electrones funcionan intercalados dos fotosistemas: - Fotositema I (FSI): Capaz de absorber luz de longitud <700 nm. Su centro de reacción se denomina P700 porque su máximo de absorción se encuentra a 700 nm - Fotosistema II (FSII): Capaz de absorber luz de longitud <680 nm. Su centro de reacción se denomina P680 porque su máximo de absorción se encuentra a 680 nm. Fotofosforilación: es la formación de ATP debida a la luz. Para que tenga lugar la fase oscura de la fotosíntesis se necesita NADPH y ATP. Según la “hipótesis quimiosmótica ” de Mitchell, la energía liberada en el transporte de electrones se utiliza para bombear protones, en contra de un gradiente, desde el estroma al espacio intratilacoidal. Estos protones regresan al estroma a favor de la gradiente a través del complejo enzimático denominado ATP-asa, que utilizará la energía liberada en el transporte para fosforilar el ADP y transformarlo en ATP.

Fase Oscura. La fase oscura de la fotosíntesis o ruta de asimilación del CO 2 tiene lugar en la matriz o estroma de los cloroplastos, tanto la energía en forma de ATP como el NADPH que se obtuvo en la fase fotoquímica se usa para sintetizar materia orgánica por medio de sustancias inorgánicas. La fuente de carbono empleada es el dióxido de carbono, mientras que como fuente de nitrógeno se utilizan los nitratos y nitritos, y como fuente de azufre, los sulfatos. Esta fase se llama oscura, ya que suele ser realizada en la oscuridad de la noche.

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Síntesis de compuestos de carbono: descubierta por el bioquímico norteamericano Melvin Calvin en los años 50, utilizando la técnica de marcaje con isótopos radiactivos, por lo que también se conoce con la denominación de Ciclo de Calvin, se produce mediante un proceso de carácter cíclico en el que se pueden distinguir varios pasos o fases. En primer lugar se produce la fijación del dióxido de carbono o fase carboxilativa . En el estroma del cloroplasto, el dióxido de carbono atmosférico se une a la pentosa ribulosa-1,5-bisfosfato, gracias a la enzima RuBisCO (ribulosa 1,5 difosfato carboxilasa/oxidasa), y origina un compuesto inestable de seis carbonos, que se descompone en dos moléculas de ácido-3-fosfoglicérico. Se trata de moléculas constituidas por tres átomos de carbono, por lo que las plantas que siguen esta vía metabólica se llaman C3. Si bien, muchas especies vegetales tropicales que crecen en zonas desérticas, modifican el ciclo de tal manera que el primer producto fotosintético no es una molécula de tres átomos de carbono, sino de cuatro (un ácido dicarboxílico), constituyéndose un método alternativo denominado vía de la C4, al igual que este tipo de plantas. Con posterioridad se produce la reducción del dióxido de carbono fijado o fase reductiva . Por medio del consumo de ATP y del NADPH obtenidos en la fase luminosa, el ácido 3-fosfoglicérico se reduce a gliceraldehído 3-fosfato. Éste puede seguir dos vías, consistiendo la primera de ellas en regenerar la ribulosa 1-5-difosfato (la mayor parte del producto se invierte en esto) o bien, servir para realizar otro tipo de biosíntesis: el que se queda en el estroma del cloroplasto comienza la síntesis de aminoácidos, ácidos grasos y almidón. El que pasa al citosol origina la glucosa y la fructosa, que al combinarse generan la sacarosa (azúcar característico de la savia) mediante un proceso parecido a la glucólisis en sentido inverso. La regeneración de la ribulosa-1,5-difosfato o fase regenerativa/sintetica , se lleva a cabo a partir del gliceraldehído 3-fosfato, por medio de un proceso complejo donde se suceden compuestos de cuatro, cinco y siete carbonos, semejante a ciclo de las pentosas fosfato en sentido inverso (en el ciclo de Calvin, por cada molécula de dióxido de carbono que se incorpora se requieren dos de NADPH y tres de ATP). UNIDAD ACADEMICA N° 04: NÚCLEO CELULAR: ESTRUCTURA Y FUNCIONAMIENTO NUCLEO INTERFASICO La presencia del núcleo es una de las características que distingue a las células eucariotas. El núcleo ocupa alrededor del 10% del volumen total de la célula y en él se halla confinado el ADN. Está delimitado por la envoltura nuclear, compuesta por dos membranas concéntricas una interna y otra externa que se continúan con el sistema de membranas del retículo endoplasmático. Ambas membranas aparecen perforadas por poros, a través de los cuales el interior del núcleo se comunica con el citosol. La envoltura nuclear se halla reforzada por dos armazones de filamentos intermedios, uno adosado a su superficie interna la lámina interior y otro situado sobre la cara citosólica de la membrana externa . En el compartimiento nuclear se localizan: 1. Cuarenta y seis cromosomas, cada uno formado por una larga molécula de ADN combinada con varías proteínas, particularmente con las proteínas básicas llamadas histonas. 2. Los distintos tipos de ARN (ARNm, ARNt, ARNr), que se sintetizan en el núcleo al ser transcriptos los secretos del ADN correspondientes a sus genes. Las moléculas de ARN salen hacia el citosol por los poros de la envoltura nuclear. Debe señalarse que antes de abandonar el núcleo los ARN experimentan una serie de cambios por ejemplo, cortes y empalmes en sus moléculas conocidos como procesamientos del ARN. Respecto de los ARNr, se transcriben en sectores particulares de ciertos cromosomas. El ADN de estos sectores y el ARNr recién sintetizado componen una estructura nuclear visible con el microscopio óptico, llamada nucléolo. 3. Diversas proteínas, entre otras la ADN polimerasa, las ARN polimerasas, la proteínas ribosómicas, las que regulan la actividad de los genes, las que participan en el procesamiento del ARN, etc. Todas estas proteínas incluidas las histonas de los cromosomas son fabricadas en el citosol e ingresan en el núcleo a través de los poros de la envoltura nuclear . 4. Los elementos mencionados en los puntos anteriores se hallan dispersos en la matriz nuclear (nucleoplasma), cuya composición es prácticamente desconocida. Los motivos por los cuales las moléculas de ADN han sido confinadas en un compartimiento citoplasmáticos, serían: 1) proteger al 157



ADN de posibles colisiones generadas durante los desplazamientos de las proteínas motoras asociadas a los microtúbulos y a los filamentos de actina, esenciales para transportar a los elementos citoplasmáticos; 2) poder completar el procesamiento de los ARNm antes que se inicie la síntesis proteica, ya que ésta debe producirse a partir de ARNm plenamente formados.

ENVOLTURA NUCLEAR Hemos dicho que la envoltura nuclear está compuesta por dos membranas concéntricas. Estas, se unen a un nivel de los poros, los cuales se hallan distribuidos más o menos regularmente por toda la superficie de la envoltura. La membrana externa de la envoltura nuclear se continúa con la membrana del retículo endoplasmático. Más aún, comúnmente su cara citosólica aparece asociada a un gran número de ribosomas, y el espacio entre la membrana externa y la membrana interna conocido con el nombre de espacio perinuclear se continúa con la luz del retículo endoplasmático. Así como muchas proteínas elaboradas en los ribosoma asociados al retículo endoplasmático se vuelcan en el interior de este último, las elaboradas en los ribosomas de la envoltura nuclear se vuelcan en el espacio perinuclear.

La membrana nuclear interna se halla sostenida por la lámina nuclear, que es un delgado enrejado de filamentos intermedios dispuestos en las más variadas direcciones . La lámina nuclear, cuyo espesor es variable pero normalmente de 10 a 20 nm, se halla interrumpida sólo a la altura de los poros. Sus filamentos intermedios, compuestos por proteínas llamadas láminas, al ensamblarse forman una estructura bidimensional, a diferencia de los filamentos intermedios de queratina, desmina, vimentina, etc., que en el citosol dan lugar a estructuras tridimensionales. Algunas proteínas transmembranosas presentes en la bicapa lipídica de la membrana nuclear interna sirven como puntos de anclaje para los filamentos laminares. La lámina nuclear establece la forma generalmente esférica de la envoltura nuclear, y le otorga cierta rigidez. Como ocurre con la envoltura nuclear, la lámina nuclear se desarma al comenzar la mitosis y se vuelve a armar en las dos células hijas cuando ésta concluye, con la consiguiente reparación de la envoltura. 158



POROS NUCLEARES. Los 3.000 a 4.000 poros presentes en la envoltura celulares son mucho más que simples perforaciones en las que la membrana interna se continúa con la membrana externa. En efecto, en ellos un conjunto de proteínas forma una estructura llamada complejo del poro, que está integrada por los siguientes componentes: 1. La pared del complejo, con forma de cilindro hueco abierto en sus dos extremos, está compuesta por ocho columnas proteicas que atraviesan la envoltura nuclear de lado a lado. En conjunto, los extremos citosólicos de dichas columnas componen un anillo a nivel de la membrana externa. Un anillo similar se forma en el lado del poro que da al interior del núcleo, a nivel de la membrana interna. Debe señalarse que los filamentos intermedios de la lámina nuclear se hallan ligados al complejo del poro por medio del anillo interno y le confieren rigidez. 2.Proteínas transmembranosas amarran las columnas proteicas a la bicapa lipídica de la envoltura nuclear. Así, por uno de sus extremos cada una de esas proteínas se adhiere a la columna, su dominio central atraviesa la bicapa y el extremo opuesto queda libre en la luz del espacio perinuclear. 3.El complejo muestra además una serie de rayos que nacen en la cara interior de las columnas y se proyectan hacia el centro del poro, por lo que reducen su diámetro real. 4.Finalmente, de los anillos externo e interno nacen fibrillas que se proyectan hacia el citosol y el interior del núcleo, respectivamente. Las fibrillas que dan hacia el núcleo se unen por sus extremos, lo cual genera una estructura con aspecto de jaula.

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El diámetro total del complejo del poro es de unos 100 nm y su espesor de alrededor de 30 nm. Sin embargo, sus distintos componentes convierten al poro en un canal cilíndrico de apenas 9 nm de diámetro, ubicado en el centro del complejo. A través de él pasan iones y moléculas de pequeño y gran tamaño, ya sea desde el núcleo hacia el citosol o en dirección opuesta. Los iones y las moléculas pequeñas son transferidos en forma pasiva, sin gasto de energía. En cambio, las macromoléculas por ejemplo las proteínas para poder pasar deben antes inducir la dilatación del poro. La energía requerida para que tenga lugar este singular transporte activo es tomado del ATP. Como vemos, el complejo del poro se comporta como un diafragma, que se abre o cierra de acuerdo con las dimensiones de las moléculas que deben atravesarlo. Paso de macromoléculas a través del poro nuclear. La entrada de proteínas al núcleo se realiza por un mecanismo que autoriza el pasaje sólo de las adecuadas. En efecto, las proteínas destinadas al núcleo producidas en ribosomas que se hallan libres en el citosol emanan de éstos con un péptido señal una secuencia específica de unos pocos aminoácidos que es reconocido por algún componente en el lado citosólico del complejo del poro, probablemente las fibrillas nacidas en su anillo externo. El péptido señal conduce a las proteínas hacia el centro del complejo, al que atraviesan previo agrandamiento del poro, que de 9 nm pasa a tener 25 nm de diámetro. Así es el péptido señal el que define la apertura del diafragma, lo cual, como vimos, es un proceso que requiere energía. A diferencia de las proteínas que ingresan en las mitocondrias y los peroxisomas, las destinadas al núcleo se pliegan apenas surgen de los ribosomas y en ese estado atraviesan los poros de la envoltura nuclear. Más aún, ya plegadas, estas proteínas deben ligarse a otros residentes en el citosol, llamadas nucleoporinas o importinas , que las conducen a la superficie de la envoltura nuclear y las ayudan a atravesar el poro.

Algunas proteínas por ejemplo, las reguladoras de la actividad de los genes, debido a que tienen que ser producidas con cierta antelación, una vez emanadas de los ribosomas son retenidas en el citosol hasta la llegada de las señales que les ordenen ingresar al núcleo. La retención tiene lugar al unírseles proteínas chaperonas de la familia HSP90 (Proteínas de choque térmico). Precisamente, dichas señales provocan la separación de las chaperonas, tras lo cual las proteínas pueden ingresar al núcleo. Así como las proteínas elaboradas en el citosol dependen de su péptido señal para ingresar en el núcleo, las que deben regresar, lo mismo que las moléculas de ARN sintetizadas en el núcleo, también dependen de señales específicas para atravesar los poros de la envoltura nuclear y salir hacia el citosol. Por ejemplo, los ARNm pueden abandonar el núcleo si han completado su procesamiento, mientras que los ARNr pueden hacerlo luego de ensamblarse con determinadas proteínas. ARQUITECTURA NUCLEAR En las células en interfase, existe una capa de proteínas, la lamina nuclear, que reviste la superficie interna de la membrana nuclear formando una capa variable de 10 – 100 nm de grosor (normalmente de 10 – 20 nm), que conecta la membrana interna con la cromatina después de extraer las proteínas de la membrana y la cromatina con detergentes iónicos, la lamina parece una red de grupos octogonales de 160



filamentos de 10 nm de diámetro. Las laminas purificadas estan compuestas por 3 proteínas extrínsecas de membrana, las láminas A, B y C, que en conjunto forman una red fibrosa. Las laminas A y C son idénticas, excepto por la presencia de 133 aminoácidos adicionales en el extremo carboxílico de la lamina A. Las laminas son muy homologas en secuencia y estructura a las proteínas de los filamentos intermedios. Las láminas aisladas tienen colas con aspecto de varilla de 52 nm de longitud y cabezas globulares , la formación de los largos filamentos de láminas como de las proteínas de los filamentos intermedios, esta mediada por interacciones entre las cabezas globulares, no se conoce la estructura exacta de estos filamentos. La lamina B parece tener un papel especializado en la unión a la membrana, solo la lamina B se une con gran afinidad a membranas nucleares de las que se han eliminado las laminas. Las membranas nucleares internas contienen un receptor para la lamina B de PM 58000, que se une específicamente a la lamina B, las laminas A y C se unen a la lamina B y hacen de mediadoras de las interacciones entre la lamina y la cromatina. En células en interfase, las tres laminas estan localizadas en la superficie interna de la membrana nuclear.

MONTAJE Y DESMONTAJE DE LA MEMBRANA NUCLEAR En el estadio de profase de la mitosis en eucariotas superiores, las observaciones al microscopio óptico, sugieren que la membrana nuclear desaparece a medida que la cromatina se condensa en cromosomas mitóticos. En el microscopio electrónico sin embargo, muestra como la membrana nuclear se fragmenta en pequeñas vesículas. La lamina B permanece asociada a estas vesículas, las laminas A y C son despolimerizadas en pequeños oligomeros y difundidas por toda la célula. El desmontaje de la lamina se correlaciona con la fosforilación de las laminas, efectivamente la mayor parte de investigadores creen que la fosforilación de las laminas por la enzima quinasa acciona el desmontaje.

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El primer proceso observado en la mitosis es la fosforilación y despolimerizacion de las láminas que es seguido por la desintegración de la membrana nuclear en pequeñas vesículas y la condensación de los cromosomas. Durante la mitosis en células animales en cultivo, el trafico vesicular de la membrana nuclear se funden alrededor de la cromatina dispersa, simultáneamente, las laminas se repolimerizan sobre la membrana nuclear interna y aparentemente forman un puente entre la cromatina y la membrana. En la profase de la mitosis, el factor promotor de la mitosis desencadena la despolimerización de las láminas por una fosforilación transitoria de grupos -NH 2 de serinas específicas en estos polipéptidos. Este desembalaje causa la disgregación y desaparición de la envoltura nuclear, que se fragmenta en vesículas, a las que quedan asociados los fragmentos de lámina B durante la mitosis. Las láminas A y C son solubles y se distribuyen por el citoplasma. Al final de la mitosis (anafase-telofase), la desfosforilación de las láminas provoca su repolimerización en la superficie de los cromosomas, permitiendo que la envoltura nuclear se forme de nuevo. Uniéndose las vesículas de la ex-envoltura nuclear a la lámina y fusionarse estas entre sí para formar una envoltura alrededor de cada cromosoma o grupo de cromosomas. Las envolturas se fusionan para formar la envoltura nuclear definitiva. En embriones de ranas y algunas células, la reconstrucción de la estructura nuclear tienen dos fases inicialmente se forman membranas nucleares alrededor de los cromosomas individuales y luego se fusionan conjuntamente para formar un único núcleo interfásico.

CROMATINA - CROMOSOMAS Cada cromosoma está constituido por una larguísima molécula de ADN, asociada a diversas proteínas. Según de qué cromosoma se trate, tal molécula puede contener entre 50 y 250 millones de pares de bases. Las proteínas asociadas al ADN se clasifican en dos grandes categorías. Unas se conocen con el nombre de histonas. Las otras, que integran un grupo heterogéneo formado por diversas clases de polipéptidos, se denominan no histónicas. El complejo formado por ADN, histonas y proteínas no histonicas se llama cromatina . La cromatina, entonces, es el material de que están compuestos los cromosomas.

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La organización de la cromatina no es uniforme a lo largo de la estructura del cromosoma. De hecho, se pueden distinguir una serie de elementos diferenciados: los centrómeros (o constricciones primarias), los telómeros (o extremos cromosómicos), las regiones organizadoras del nucléolo (NORs según la abreviatura en inglés) y los cromómeros, todos ellos caracterizados por contener secuencias específicas de ADN. Centrómeros Es la constricción primaria que, utilizando tinciones tradicionales, aparece menos teñida que el resto del cromosoma. Es la zona por la que el cromosoma interacciona con las fibras del huso acromático desde profase hasta anafase, tanto en mitosis como en meiosis, y es responsable de realizar y regular los movimientos cromosómicos que tienen lugar durante estas fases. Las estructuras centroméricas que interaccionan con las fibras del huso se denominan cinetocoros. Además, el centrómero contribuye a la nucleación de la cohesión de las cromátidas hermanas. En la estructura del centrómero intervienen tanto el ADN centromérico, que consta fundamentalmente de heterocromatina constitutiva, como proteínas centroméricas. Telómeros La palabra telómero procede del griego telos , "final" y meros , "parte". Los telómeros son los extremos de los cromosomas. Son regiones de ADN no codificante, altamente repetitivas, cuya función principal es la estabilidad estructural de los cromosomas en las células eucariotas, la división celular y el tiempo de vida de las estirpes celulares. Además están involucradas en enfermedades tan importantes como el cáncer. Los telómeros fueron descubiertos por Hermann Joseph Muller durante la década de los años 30. Desde entonces, se ha avanzado mucho en el conocimiento de los telómeros, gracias a las técnicas de la genética molecular. Regiones organizadoras del nucléolo Además de las constricciones primarias, en algunos cromosomas se puede distinguir otro tipo de "adelgazamiento" denominada constricción secundaria , las que se hallan relacionadas normalmente con la presencia de las secuencias de ADN ribosómico. Tales regiones se denominan "regiones organizadoras del nucléolo" (o, sencillamente, "NORs" por el acrónimo en inglés para nucleolus organizer regions ). Las secuencias de ADN ribosómico quedan englobadas dentro del nucléolo, que permanece adosado a las NORs durante buena parte del ciclo celular. Los cromosomas con NOR en muchos casos presentan un segmento que une a esta región con el telómero, el cual se denomina satélite o trabante . 163



Cromómeros Los cromómeros son "engrosamientos" o regiones más compactadas de la eucromatina, que se distribuyen de manera más o menos uniforme a lo largo de los cromosomas y se pueden visualizar durante las fases de la mitosis o de la meiosis de menor condensación de la cromatina (profase). Su naturaleza molecular sigue siendo controvertida, pero podrían ser consecuencia de un cierto grado de compartimentalización en la distribución de las secuencias de ADN y en la organización de los cromosomas. Desde hace varios años, el grupo de Giorgio Bernardi en Italia, sostiene que hay una distribución compartimentalizada de secuencias relativamente grandes de ADN (llamadas "isócoras") en el genoma de los vertebrados de sangre caliente, de modo tal que cada isócora tiene un contenido en bases (porcentaje de C+G) relativamente homogéneo pero diferente al de las demás. Después de publicado el primer borrador del "Proyecto Genoma Humano", parece confirmarse la existencia de cinco isócoras en el genoma de los humanos, dos de ellas ricas en A y T, y tres ricas en G y C. La distribución alternante de ambos tipos de isócoras podría ser la explicación molecular de la existencia de cromómeros.

La enorme longitud de los cromosomas exige que la replicación se inicie en muchísimos puntos del ADN a la vez, a fin de que su síntesis se logre en un tiempo adecuado. Cada uno de esos puntos se denomina origen de replicación, y en ellos el ADN exhibe secuencias de nucleótidos especiales. Más aún, todos los orígenes de replicación tienen en común secuencias conservadas de alrededor de una docena de pares de nucleótidos llamadas ARS (por autonomous replication sequence). Por otro lado, la capacidad o incapacidad funcional del ADN, es decir, su aptitud o incompetencia para generar moléculas de ARN, depende de la secuencia de sus nucleótidos. Así en algunos sectores el ADN exhibe secuencias de nucleótidos funcionalmente aptas para transcribir (genes), mientras en otros presenta secuencias aparentemente prescindibles. En las moléculas de ADN se halla depositada la información genética de la célula. Dado que todas las células poseen conjuntos virtualmente idénticos de tales moléculas, puede decirse que en ellas se encuentran la información genética que rige el destino de todo organismo, desde la que modula los acontecimientos biológicos que tienen que ver con su desarrollo embriológico hasta la que gobierna su crecimiento, diferenciación y funciones, incluida su predisposición o inmunidad a determinadas enfermedades. La totalidad de la información genética depositada en las moléculas de ADN lleva el nombre de genoma. El 75% del ADN se halla representado por secuencias singulares (copias únicas) de nucleótidos y secuencias que se hallan una o pocas veces repetidas. En este sector del ADN se encuentran la secuencias de nucleótidos funcionalmente activas, es decir, los genes. Estos representan una pequeña parte del ADN alrededor del 13% de ese 75%, lo que equivale al 10% de todo el genoma . Precisamente, uno de los mayores desafíos para los biólogos moleculares es descifrar las funciones del ADN ajeno a los genes. El 25% restante del ADN se halla representado por secuencias de nucleótidos altamente repetidas . Sus funciones se desconocen, aunque no se descarta que desempeñen algún papel en el mantenimiento de la estructura de los cromosomas. Las células humanas somáticas poseen 46 cromosomas . Es decir, 46 moléculas de ADN, divididos en 22 pares de autosomas más un par de cromosomas sexuales. Los dos miembros del par sexual son idénticos entre sí en la mujer, pero distintos en el varón. En forma preliminar, puede decirse que en cada célula existen dos juegos virtualmente idénticos de 23 164



cromosomas, uno aportado por el espermatozoide y otro por el ovocito en el momento de la fecundación. De allí que se define a las células somáticas como diploides, y a los espermatozoides y ovocitos como células haploides. Los ADN de los 46 cromosomas contienen en conjunto unos 6 x 10 9 pares de nucleótidos. Por lo tanto, en promedio, una molécula de ADN de un cromosoma humano, si estuviera completamente extendida, mediría unos 4 cm de largo. Lógicamente, largo. Lógicamente, 46 moléculas de tamaña longitud, de hallarse extendidas, no podrían estar contenidas en el núcleo celular, no sólo por el espacio que demandarían sino por los enredos que se producirían, lo que afectaría su normal funcionamiento y hasta su propia integridad. La célula ha resuelto el problema de espacio haciendo que la molécula de ADN se enrolle sobre sí misma, debe advertirse que el grado de enrollamiento varía de acuerdo con el momento del ciclo en que se halla la célula, ya que es mínimo durante la interfase (cuando la síntesis de ARN es alta) y máximo cuando la célula se apresta a dividirse. Así; en las células vivas los cromosomas se muestran como estructuras altamente variables. TIPOS DE CROMATINA. En algunos sectores la cromatina experimenta un grado de enrollamiento aún mayor. Durante la interfase, la cromatina así compactada recibe el nombre de heterocromatina , y se reserva el de eucromatina para para la menos condensada. Existe una relación directa entre el grado de enrollamiento y la actividad transcripcional del ADN. Así, la cromatina menos compactada es la que posee el ADN transcripcionalmente activo, es decir, el ADN en el que están sintetizando moléculas de ARN . En el conjunto de células este ADN abarca alrededor del 10% del genoma. En cambio, el ADN correspondiente a la cromatina más condensada es inactivo desde el punto de vista transcripcional. A esta categoría pertenece toda la heterocromatina y un vasto sector de la eucromatina, aquel cuyo nivel de enrollamiento enrollamiento se halla en un punto intermedio entre la eucromatina transcripcionalmente activa y la heterocromatina. Las regiones eucromáticas eucr omáticas experimentan ciclos de contracción y extensión. La heterocromatina puede ser constitutiva o facultativa. Durante la interfase, recibe el nombre de heterocromatica constitutiva altamente condensada que se halla de manera constante en todos los tipos de organismos, es decir, como un componente estable del genoma, no convertible en eucromatina. A esta categoría pertenece la mayor parte de la cromatina que forma los brazos cortos de los cromosomas acrocéntricos y la cromatina de los sectores cromosómicos que poseen ADN satélite (como la de los centrómeros, la de una parte del brazo largo del cromosoma Y, etc.). En cambio, se le da el nombre de heterocromatina facultativa a a la que se detecta en los cromosomas en localizaciones que varían de acuerdo con el tipo celular, de manera tal que sectores de cromatina que aparecen como heterocromatina en un tipo celular, en otros se presentan como eucromatina. También el cuerpo de Barr (es decir, el cromosoma X compactado en las células de la mujer) corresponde a esta clase de heterocromatina.

CICLO CELULAR Las células van modificando su estructura a medida que se van diferenciando y especializando y para referirnos a una determinada célula debemos saber entre otras cosas: el tipo de tejido que constituye, el nivel metabólico y el estadío citológico de desarrollo en el que se encuentra. Por ejemplo, si una célula pertenece a un tejido proliferativo, que es aquel tejido constituido por células en continua división, cada una de sus células se encontrará dividiéndose en dos, por lo tanto el contenido 165



de materiales celulares también se reparte. Si consideramos que las células hijas también se dividen inmediatamente, el contenido de material celular declinaría, pero esto no sucede así ya que las células, entre dos divisiones secuenciales, pasan por una FASE DE INTERFASE, la antiguamente llamada Fase de Reposo, período en el cual los materiales celulares se duplican, especialmente el ADN que es el material de la herencia. Al conjunto del período de interfase y Período de División Celular secuenciales en una célula se le llama CICLO CELULAR. CELULAR . Las células se reproducen para hacer posible el crecimiento corporal y para reemplazar a las células que desaparecen por envejecimiento o por muerte programada, también lo hacen durante ciertas situaciones patológicas, como la reparación de heridas. Para poder reproducirse la célula duplica primero el contenido de su núcleo y de su citoplasma y luego se divide en dos. La multiplicación celular aparece a penas se inicia la vida embrionaria, con la segmentación de la célula huevo. Dado el enorme volumen del citoplasma de esta célula en relación con el tamaño del núcleo, durante las rápidas divisiones de segmentación solo se duplican sus materiales nucleares, en tanto que los citoplasmáticos se reparten entre las sucesivas células hijas hasta lograrse el reestablecimiento en el blastocisto de la relación núcleo citoplasmática característica de las l as células somáticas. En el período de división celular el componente que principalmente se divide es ADN, pues la célula necesita dividir el material genético entre sus células hijas, por lo tanto el Período de Interfase hay un período de tiempo en el cual se recupera el contenido normal del ADN. Realizando experimentos con Timidina Tritiada, para ver cómo este compuesto se incorporaba al núcleo, ya que su incorporación incorpor ación indicaría síntesis y replicación de ADN, se observo que qu e la Timidina Tritiada se incorporaba al núcleo solo en una fracción intermedia del Período de Interfase; concluyéndose que ése era el período de síntesis y replicación de ADN por lo cual se llamo PERIODO DE SINTESIS o PERIODO S. La determinación del Período S, nos marca dos períodos de tiempos adicionales: Uno que se extiende desde la finalización de la división celular hasta el inicio de la síntesis y  replicación del ADN o Período S al cual se le llama PERIODO G 1 (GAP1). Otro lapso de tiempo que va desde la finalización del Período S hasta el inicio de otra división  celular el cual se llama Período G 2 (GAP2). Existen células que escapan a este ciclo celular, células que en un primer momento permanecen en período de tiempo más o menos grande en G1, en cuyo caso se dicen que se encuentran en el llamado PERIODO G0. A partir de este estadío especial es que en una célula pueden desarrollarse los procesos de DIFERENCIACION CELULAR. Por CELULAR. Por ejemplo, de esta manera puede formarse una Neurona, en cuyo caso ya es imposible volver al ciclo celular. Tenemos otros casos de tipos celulares que aún conservan la capacidad de volver al ciclo celular, estas son las células de tejidos capaces de regenerarse como el tejido adiposo, tejido óseo, etc., pero como requisito indispensable estas células deben de sufrir un proceso previo de desdiferenciación.

El comportamiento del material genético dentro del ciclo celular, está regido por señales específicas. Existen un FACTOR INDUCTOR o INICIADOR, que daría la señal a la célula para que el ADN inicie su replicación en un determinado momento del ciclo celular. Asimismo al inicio de una división existe, el 166



llamado FACTOR DE CONDENSACION, que induce a la condensación de la Cromatina para construir los Cromosomas. Se han realizado experimentos utilizando fusión de células, por ejemplo, si una de ellas se encuentra normalmente en Prometafase o Profase con su cromatina condensada, el Factor inductor es capaz de incidir sobre el otro núcleo, de tal manera que a pesar de que ese otro núcleo, puede o no haber replicado el material genético, sufre un proceso de Condensación de su Cromatina. El contenido de ADN dentro de la célula y de la síntesis de proteínas y ARN varía de acuerdo al período del ciclo en que se encuentra ésta. Veamos ahora cuál es la secuencia de d e estos cambios. El contenido de ADN de una célula, es generalmente medido en Picogramos, siendo el promedio de dos picogramos por núcleo celular. Nosotros lo vamos a representar, para generalizar en términos de ADN como 1C, 2C, 3C, 4C, donde C es el contenido de ADN por núcleo celular. Partamos de un núcleo que tiene 2C de ADN que se encuentra en el período G 1, lo que significa  que es un núcleo que viene de una división celular, por lo tanto el contenido de ADN está disminuido a la mitad. Durante el período S se duplica el material genético, ya sabemos que la duplicación del ADN  trae como consecuencia que ese núcleo a medida que transcurre el Período S, recupera el contenido celular de 4C, es decir el doble d oble del contenido de la célula célul a proveniente de la Mitosis. Por lo tanto, aquellas células que se encuentran en G 1, tienen la mitad del contenido del ADN de las que estan en G2. Así podemos fácilmente reconocer en un tejido, cuales células están en G 2 y cuales en G1 con sólo analizar el contenido de ADN de cada célula.

Por otro lado veamos lo que ocurre con el ARN y las proteínas durante el ciclo celular. celul ar. En el caso de la síntesis del ARN, la curva de síntesis tiene un ligero incremento en el período G 1,  llega a su pico más alto durante el período S y declina en el G 2 para caer casi hasta cero durante la Mitosis, al final de la cual vuelve a los valores de d e G 1 para reiniciarse una curva similar. En cuanto a la síntesis de proteínas, tiene una curva casi paralela a la del ARN con un ligero  desplazamiento hacia la derecha, porque para que haya síntesis de proteínas debe haber previamente síntesis de ARN. En el período G 2 existe un aumento se debe a la síntesis de proteínas necesarias para la reproducción celular. En el período de Mitosis decae la cantidad de proteínas. El aumento de ARN y proteínas a lo largo de los períodos G 1 y S, se debe a que una célula que parte de G1 es una célula de volumen reducido porque proviene de una división celular, pero a medida que van transcurriendo estas fases el volumen citoplasmático y nuclear va aumentando hasta que llega a la Fase de división celular donde nuevamente se reparten los materiales celulares. Estos cambios que se operan en el núcleo no son sólo citológicos, como la aparición de los cromosomas por condensación y luego un período más o menos largo de interfase en donde aparentemente no ocurre nada, son también cambios Bioquímicos, pues en la interfase ocurre la mayor actividad metabólica y es el núcleo el que la dirige, este metabolismo comienza a disminuir a medida que la célula se acerca a la división celular. Así pues durante la división celular, la célula se concentra; se dedica casi exclusivamente a este proceso de división celular y disminuye todo el resto del metabolismo, tanto de la síntesis de ARN como de 167



proteínas en general. Esto tiene su origen en el cambio de conformación que se opera en el interior de la estructura del material de la herencia, es decir de la estructura de la cromatina, ya que los cromosomas condensados no sintetizan ARN. Para que haya síntesis de ARN, por lo tanto para que se inicie la síntesis de proteínas, los cromosoma tiene que estar más o menos extendidos; las zonas cromatínicas que se encuentran más o menos condensadas serán aquellas zonas que no están transcribiendo por lo tanto sus genes no se expresan ni dirigen la síntesis de ninguna proteína. Los grados de condensación de la cromatina nos indican cuales porciones de molécula de ADN estan trabajando y cuales no. CONTROL DEL CICLO CELULAR Las células poseen mecanismos especiales tanto para coordinar los procesos de síntesis en el núcleo y en el citoplasma como para marcar el comienzo y la conclusión de las distintas fases del ciclo celular. La regulación del ciclo celular ocurre de diferentes formas, algunas se dividen rápidamente, otras como las células nerviosas pierden la capacidad de dividirse una vez que llegan a la madurez. Algunas, como las células hepáticas, conservan, aunque no la utilizan, su capacidad de división. Las células del hígado se dividen si se remueve parte del hígado y su división continua hasta que el hígado retorna a su tamaño normal. Factores ambientales tales como cambios en la temperatura y el pH, disminución de los niveles de nutrientes llevan a la disminución de la velocidad de división celular. Reloj molecular Todas las células eucariotas tienen un “reloj molecular” que determina cuando debe di vidirse. Basados en las investigaciones realizadas en huevos de anfibios los investigadores imaginaron la existencia de un “reloj central bioquímico” u oscilador que “instruye” a los núcleos acerca de las funciones a cumplir para

controlar las fases de la división.

El “reloj”, formado por un conjunto de proteínas nucleares que

interaccionan entre si, integra los mensajes provenientes de las cascadas estimuladoras e inhibidoras y, si prevalece la cascada estimuladora, pone en marcha el programa de división celular. Poco antes de finalizar la fase G1 cuya duración varía bastante entre los distintos tipos celulares existe un momento de trancision en el que la célula debe tomar (o no) la decisión de dividirse, este punto se denomina punto R o restricción. En el control de la división celular intervienen dos tipos de moléculas. CICLINAS.- Las ciclinas cuyo nombre se debe que en el curso de cada ciclo celular alternan un periodo de síntesis creciente seguido por otro de rápida degradación. Existen varias clases de ciclinas que se diferencian entre si porque sus concentraciones suben y bajan en diferentes momentos del ciclo celular. Las principales corresponden a dos grandes grupos:  Ciclinas G1  Ciclinas Mitóticas QUINASAS.- (CDK) Dependientes de las ciclinas: actúan cuando son activadas por las ciclinas fosforilando moléculas cruciales para la división celular. En los seres superiores se identificaron dos principales:  Cdc2 (cell división cicle)  Cdk2 ( quinasa dependiente de la ciclina) No obstante la existencia en el genoma de una numerosa familia de genes relacionadas con estas quinasas sugiere que junto a la Cdk2 y a la Cdc2, podría intervenir varias mas en la regulación de los distintos pasos del ciclo celular. En los vertebrados el franqueo del punto R esta regulado por los factores de crecimiento que se unen a los receptores de la superficie celular. Esto produce una “cascada” de reacciones destinadas a activar quinasas mitogénicas que migran al núcleo y fosforilan las proteínas. Estas últimas, que controlan los genes de proteínas (valga la redundancia), implicadas en la división celular (ciclinas) desencadenándola en la mitosis. Esquema de los sucesos a nivel del punto R La “llave” del punto R de la fase G1 (momento en el cual la célula decide si debe o no avanza r en la prosecución del ciclo) es un conmutador molecular que pasa de “apagado” a “encendido”. A medida que sube el nivel de las ciclinas, las mismas se combinan con quinasas dependientes de ciclinas (es decir enzimas fosforilantes cuya actividad depende de los niveles de ciclinas). Las quinasas activas transfieren fosfatos del ATP a la proteína pRB (el “freno” del ciclo celular) . Si la pRB no esta 168



fosforilada “secuestra” (es decir permanece unida) otras proteínas claves para la prosecución del ciclo:

los factores de transcripción que actúan sobre los genes . Los genes estimulados producen proteínas necesarias para que avance el ciclo celular. Estimulos externos Las células normales se reproducen en respuesta a una “cascada” de señales que les envían los fac tores de crecimiento externo y detienen su división en respuesta a factores inhibidores que obviamente actúan también por medio de una cascada de señales. ACTIVACION DE LA DIVISION CELULAR Tomada la decisión de dividirse, la célula deja atrás la fase G1 e ingresa en fase S, es decir, comienza a replicar su ADN. Ello se debe a que una ciclina G1 activa la quinasa Cdk2, la cual inicia una cadena de fosforilaciones en sucesivas proteínas intermediarias, que culminan con la activación de alguna de las moléculas responsables de la replicación del ADN, por ejemplo las ADN polimerasas. La ciclina G1 aumenta su concentración a partir del punto R, la Cdk2 se activa solo cuando la ciclina G1 alcanza determinado umbral de concentración y este es un requisito indispensable para que las dos proteínas puedan unirse. Mas aun a partir de ese momento ambas moléculas unidas componen un complejo proteico denominado factor promotor de replicación (FPR). Dado que en un punto de la fase S la concentración de ciclina comienza a declinar, cuando regresa al umbral anteriormente citado se separa de la Cdk2, por lo cual el FPR desaparece. Debe subrayarse que de las dos moléculas la ciclina es la única cuya concentración varia, ya que comienza a sintetizarse a partir del control G1, sigue haciéndolo en concentraciones cada vez mas elevadas durante gran parte de la fase S hasta que en un punto de esta ultima inicia su declinación para desaparecer por completo en el curso de la fase G2. En cambio los niveles de la Cdk2 se mantienen constantes a lo largo de todo el ciclo celular. En una fase S normal, el ADN se replica solamente una vez, ya que si así no lo hiciese las células hijas tendrían un numero anormal de cromosomas. En consecuencia deben existir mecanismos para impedir la aparición de nuevas duplicaciones a partir del ADN ya replicado. Superada la fase G2 se activa el inicio de la mitosis. Al final de la G2 aumenta la concentración de ciclina mitótica y al alcanzar una determinada concentración se une a la Cdc2 componiendo el factor promotor de maduracion o factor promotor de mitosis (FPM) que se encarga de fosforilar proteínas con funciones esenciales durante la mitosis. Cuando todos los cinetocoros sean ligados a las fibras del uso se desactiva este complejo. La pausa impuesta por la G2 le provee a la célula un lapso durante el cual actúan determinados mecanismos de seguridad para controlar antes que la célula se divida si las moléculas de ADN han completado su replicación y, en los casos que corresponda, si fueran separadas. Además; en la fase G2 debe completarse la duplicación de los componentes citoplasmáticos.

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FRENOS DE LA DIVISION CELULAR Un importante regulador del ciclo celular lo constituye una proteína denominada p53, la cual por un lado ejerce un control de tipo negativo frenando la división a nivel de G1, antes de punto R. Esta proteína es sintetizada por la propia célula en respuesta a la aparición de alteraciones del ADN, se origina en el gen p53 perteneciente a la categoría de genes supresores de tumores. La p53 hace que se exprese otros genes de proteínas reguladoras como los p21 y p16 que bloquean la actividad de la Cdk2. Las células al no replicar su ADN se estabilizan en la fase G1. Si el ADN replicado tiene un daño peligroso para las células hijas, la proteína p53 se encarga de la muerte celular o apoptosis (muerte celular programada). Resulta interesante señalar que aquellos fármacos anticancerígenos que actúan alterando, de alguna manera, la replicación correcta del ADN requiere para su completa efectividad una p53 funcionante. Pueden si esto se cumple desencadenar la apoptosis de las células cancerosas alteradas por el fármaco. Existe otras importantes proteínas reguladoras de la proliferación celular una de ellas es la Rb (por el tumor de retina denominado retinoblastoma) deriva del gen Rb, que también es otro inhibidor de Cdk, la proteína p21 actúa a lo largo de todo el ciclo celular. La p21 esta bajo el control de la denominada: proteína supresora de tumores, la hoy famosa p53, que entre sus múltiples efectos pueden mencionarse:  Control de la integridad del ADN.  Detención del crecimiento celular (duplicación celular) o senescencia.  Puesta en marcha del suicidio celular o apoptosis cuando existe daño en el ADN o los sistemas de control se desregulan.  Supresor de tumores. Por otra parte diversas proteínas reprimen el ciclo al actuar como inhibidores. Ciertas proteínas p15 y p16 bloquean la actividad del complejo Cdk ciclina recuerde que esta quinasa en su forma activa a la pRB, e impiden que el ciclo progrese de G1 a S.

LA FASE M SE PRODUCE CUANDO LA CICLINA MITOTICA ACTIVA A LA CDC2 Superados tales controles, comienza la fase M el mecanismo que desencadena la mitosis es similar al que inicia la fase S, aunque con distintos protagonistas. Ahora intervienen la cdc2 y una ciclina mitótica que comienza a sintetizar a partir de la fase G2 (antes que desaparezca la ciclina G1). Cuando la ciclina alcanza un determinado umbral de concentración, se une a la cdc2 fosforila directamente o a través de moléculas intermediarias a diversas proteínas que cumplen funciones esenciales en la consumación de la mitosis, por ejemplo, algunas proteínas asociadas a los filamentos de actina, y a los microtubulos del citoesqueleto, las laminas de la lamina nuclear, la histona H1, etc. Veamos las consecuencias de la fosforilación de estas proteínas:  Se desintegra el armazón de filamentos de actina, de modo que la célula pierde contacto con sus vecinas (o con la matriz extra celular) y se vuelve esférica. Mas tarde, otros filamentos de actina participan en la citocinesis. Se desarman los microtubulos interfasicos, pero otros se nuclean para dar lugar a las fibras del  huso mitótico. Se desintegra la lamina nuclear y con ella la envoltura del núcleo.  Se modifica la forma como la histona H1 se asocia al ADN, lo que lleva al enrollamiento y  compactación de los cromosomas. 170



MITOSIS La mitosis (del griego mitos , hebra) es un proceso que ocurre en el núcleo de las células eucarióticas, consistente en el reparto equitativo del material hereditario (ADN) característico. Normalmente concluye con la formación de dos núcleos separados (cariocinesis), seguido de la partición del citoplasma (citocinesis), para formar dos células hijas. La mitosis completa, que produce células genéticamente idénticas, es el fundamento del crecimiento, de la reparación tisular y de la reproducción asexual. La mitosis es el tipo de división del núcleo celular por el cual se conservan los organelos y la información genética contenida en sus cromosomas, que pasa de esta manera a las células hijas resultantes de la mitosis. La mitosis es igualmente un verdadero proceso de multiplicación celular que participa en el desarrollo, el crecimiento y la regeneración del organismo . Este proceso tiene lugar por medio de una serie de operaciones sucesivas que se desarrollan de una manera continua.

El resultado esencial de la mitosis es la continuidad de la información hereditaria de la célula madre en cada una de las dos células hijas. El genoma se compone de una determinada cantidad de genes organizados en cromosomas, hebras de ADN muy enrolladas que contienen la información genética vital para la célula y el organismo. Dado que cada célula debe contener completa la información genética propia de su especie, la célula madre debe hacer una copia de cada cromosoma antes de la mitosis, de forma que las dos células hijas reciban completa la información. Esto ocurre durante la fase S de la interfase, el período que alterna con la mitosis en el ciclo celular y en el que la célula entre otras cosas se prepara para dividirse. Tras la duplicación del ADN, cada cromosoma consistirá en dos copias idénticas de la misma hebra de ADN, llamadas cromátidas hermanas , unidas entre sí por una región del cromosoma llamada centrómero. Cada cromátida hermana no se considera en esa situación un cromosoma en sí mismo, sino parte de un cromosoma que provisionalmente consta de dos cromátidas . En animales y plantas, pero no siempre en hongos o protistas, la envoltura nuclear que separa el ADN del citoplasma se desintegra, desapareciendo la frontera que separaba el contenido nuclear del citoplasma. Los cromosomas se ordenan en el plano ecuatorial de la célula, perpendicular a un eje definido por un huso acromático. Éste es una estructura citoesquelética compleja, de forma ahusada, constituido por fibras que son filamentos de microtúbulos. Las fibras del huso dirigen el reparto de las cromátidas hermanas, una vez producida su separación, hacia los extremos del huso. Por convenio científico, a partir de este momento cada cromátida hermana sí se considera un cromosoma completo , y empezamos a hablar de cromosomas hermanos para referirnos a las estructuras idénticas que hasta ese momento llamábamos cromátidas. Como la célula se alarga, las fibras del huso “tiran” por el centrómero a los

cromosomas hermanos dirigiéndolos cada uno a uno de los polos de la célula. En las mitosis más comunes, llamadas abiertas, la envoltura nuclear se deshace al principio de la mitosis y se forman dos envolturas nuevas sobre los dos grupos cromosómicos al acabar. En las mitosis cerradas, que ocurren por ejemplo en levaduras, todo el reparto ocurre dentro del núcleo, que finalmente se estrangula para formar dos núcleos separados. Se llama cariocinesis a la formación de los dos núcleos con que concluye habitualmente la mitosis. Es posible, y ocurre en ciertos casos, que el reparto mitótico se produzca sin cariocinesis (endomitosis) dando lugar a un núcleo con el material hereditario duplicado (doble número de cromosomas). La mitosis se completa casi siempre con la llamada citocinesis o división del citoplasma. En las células animales la citocinesis se realiza por estrangulación: la célula se va estrechando por el centro hasta que al final se separa en dos. En las células de las plantas se realiza por tabicación, es decir, las células hijas “construyen” un a nueva región de pared celular que dividirá la una de la otra dejando puentes de citoplasma (plasmodesmos). Al final, la célula madre se parte por la mitad, dando lugar a dos células hijas, cada una con una copia equivalente y completa del genoma original. 171



FASES DE LA MITOSIS La división de las células eucarióticas es parte de un ciclo vital continuo, el ciclo celular, la mitosis es una fase relativamente corta de este ciclo en comparación con la duración de la interfase.

PROFASE Es la fase más larga de la mitosis. Se produce en ella la condensación del material genético (ADN, que en interfase existe en forma de cromatina), para formar unas estructuras altamente organizadas, los cromosomas. Como el material genético se ha duplicado previamente durante la fase S, los cromosomas replicados están formados por dos cromátidas, unidas a través del centrómero por moléculas de cohesinas. Uno de los hechos más tempranos de la profase en las células animales es la duplicación del centrosoma; los dos centrosomas hijos (cada uno con dos centriolos) migran entonces hacia extremos opuestos de la célula. Los centrosomas actúan como centros organizadores de microtúbulos, controlando la formación de unas estructuras fibrosas, los microtúbulos, mediante la polimerización de tubulina soluble. De esta forma, el huso de una célula mitótica tiene dos polos que emanan microtúbulos. En la profase tardía desaparece el nucléolo y se desorganiza la envoltura nuclear. PROMETAFASE La membrana nuclear se divide o fragmenta y los microtúbulos invaden el espacio nuclear. Esto se denomina mitosis abierta, y ocurre en una pequeña parte de los organismos multicelulares. Los hongos y algunos protistas, como las algas o las tricomonas, realizan una variación denominada mitosis cerrada, en la que el huso se forma dentro del núcleo o sus microtúbulos pueden penetrar a través de la membrana nuclear intacta. Cada cromosoma ensambla dos cinetocoros hermanos sobre el centrómero, uno en cada cromátida. Un cinetocoro es una estructura proteica compleja a la que se anclan los microtúbulos. Aunque la estructura y la función del cinetocoro no se conocen completamente, contiene varios motores moleculares, entre otros componentes. Cuando un microtúbulo se ancla a un cinetocoro, los motores se activan, utilizando energía de la hidrólisis del ATP para "ascender" por el microtúbulo hacia el centrosoma de origen. Esta actividad motora, acoplada con la polimerización/despolimerización de los microtúbulos, proporciona la fuerza de empuje necesaria para separar más adelante las dos cromátidas de los cromosomas. Cuando el huso crece hasta una longitud suficiente, los microtúbulos asociados a cinetocoros empiezan a buscar cinetocoros a los que anclarse. Otros microtúbulos no se asocian a cinetocoros, sino a otros microtúbulos originados en el centrosoma opuesto para formar el huso mitótico. La prometafase se considera a veces como parte de la profase. METAFASE 172



A medida que los microtúbulos encuentran y se anclan a los cinetocoros durante la prometafase, los centrómeros de los cromosomas se congregan en la "placa metafásica" o "plano ecuatorial", una línea imaginaria que es equidistante de los dos centrosomas que se encuentran en los dos polos del huso. Este alineamiento equilibrado en la línea media del huso se debe a las fuerzas iguales y opuestas que se generan por los cinetocoros hermanos. El nombre "metafase" proviene del griego μετα que significa "después." Dado que una separación cromosómica correcta requiere que cada cinetocoro esté asociado a un conjunto de microtúbulos (que forman las fibras cinetocóricas), los cinetocoros que no están anclados generan una señal para evitar la progresión prematura hacia anafase antes de que todos los cromosomas estén correctamente anclados y alineados en la placa metafásica. Esta señal activa el checkpoint de mitosis . ANAFASE Cuando todos los cromosomas están correctamente anclados a los microtúbulos del huso y alineados en la placa metafásica, la célula procede a entrar en anafase (del griego ανα que significa "arriba", "contra", "atrás" o "re-"). Es la fase crucial de la mitosis, porque en ella se realiza la distribución de las dos copias de la información genética original. Entonces tienen lugar dos sucesos. Primero, las proteínas que mantenían unidas ambas cromatidas hermanas (las cohesinas), son cortadas, lo que permite la separación de las cromátidas. Estas cromátidas hermanas, que ahora son cromosomas hermanos diferentes, son separados por los microtúbulos anclados a sus cinetocoros al desensamblarse, dirigiéndose hacia los centrosomas respectivos. A continuación, los microtúbulos no asociados a cinetocoros se alargan, empujando a los centrosomas (y al conjunto de cromosomas que tienen asociados) hacia los extremos opuestos de la célula. Este movimento parece estar generado por el rápido ensamblaje de los microtúbulos. Estos dos estadios se denominan a veces anafase temprana y anafase tardía. La anafase temprana viene definida por la separación de cromátidas hermanas, mientras que la tardía por la elongación de los microtúbulos que produce la separación de los centrosomas. Al final de la anafase, la célula ha conseguido separar dos juegos idénticos de material genético en dos grupos definidos, cada uno alrededor de un centrosoma. TELOFASE La telofase (del griego τελος , que significa "finales") es la reversión de los procesos que tuvieron lugar durante la profase y prometafase. Durante la telofase, los microtúbulos no unidos a cinetocoros continúan alargándose, estirando aún más la célula. Los cromosomas hermanos se encuentran cada uno asociado a uno de los polos. La membrana nuclear se reforma alrededor de ambos grupos cromosómicos, utilizando fragmentos de la membrana nuclear de la célula original. Ambos juegos de cromosomas, ahora formando dos nuevos núcleos, se descondensan de nuevo en cromatina. La cariocinesis ha terminado, pero la división celular aún no está completa. Citocinesis La citocinesis es un proceso independiente, que se inicia simultáneamente a la telofase. Técnicamente no es parte de la mitosis, sino un proceso aparte, necesario para completar la división celular. En las células animales, se genera un surco de escisión ( cleavage furrow ) que contiene un anillo contráctil de actina en el lugar donde estuvo la placa metafásica, estrangulando el citoplasma y aislando así los dos nuevos núcleos en dos células hijas. Tanto en células animales como en plantas, la división celular está dirigida por vesículas derivadas del aparato de Golgi, que se mueven a lo largo de los microtúbulos hasta la zona ecuatorial de la célula. En plantas esta estructura coalesce en una placa celular en el centro del fragmoplasto y se desarrolla generando una pared celular que separa los dos núcleos. El fragmoplasto es una estructura de microtúbulos típica de plantas superiores, mientras que algunas algas utilizan un vector de microtúbulos denominado ficoplasto durante la citocinesis. Al final del proceso, cada célula hija tiene una copia completa del genoma de la célula original. El final de la citocinesis marca el final de la fase M. Consecuencias de la mitosis Mediante el proceso mitótico, el material genético se divide en dos núcleos idénticos, con lo que las dos células hijas que resultan si se produce la división del citoplasma serán genéticamente idénticas. Por tanto, la mitosis es un proceso de división conservativo, ya que el material genético se mantiene de una generación celular a la siguiente. La mayor parte de la expresión génica se detiene durante la mitosis, 173



pero mecanismos epigenéticos funcionan durante esta fase, para "recordar" los genes que estaban activos en mitosis y transmitirlos a las células hijas. Errores en la mitosis Aunque los errores en la mitosis son bastante poco frecuentes, este proceso puede fallar, especialmente durante las primeras divisiones celulares en el cigoto. Los errores mitóticos pueden ser especialmente peligrosos para el organismo, porque el descendiente futuro de la célula madre defectuosa mantendrá la misma anomalía. Un cromosoma puede no separarse durante la anafase. Este fenómeno se denomina "no-disyunción". Si esto ocurre, una célula hija recibirá dos cromosomas hermanos y la otra se quedará sin ninguno. Esto da lugar a que una célula tenga tres cromosomas que codifiquen la misma información genética (dos hermanos y un homólogo), una condición conocida como trisomía, y la otra célula, que solamente tiene un cromosoma (el cromosoma homólogo), tendrá monosomía. Estas células se consideran aneuploides, y la aneuploidía puede causar inestabilidad genética, un hecho frecuente en cáncer. La mitosis es un proceso traumático. La célula pasa por cambios drásticos en su estructura, algunos orgánulos se desintegran y se reconstruyen en cuestión de horas, y los microtúbulos tiran constantemente de los cromosomas. Por tanto, en ocasiones los cromosomas pueden dañarse. Un brazo del cromosoma se puede romper y perder un fragmento, causando deleción. El fragmento puede incorporarse incorrectamente a otro cromosoma no homólogo, causando translocación. Se puede integrar de nuevo al cromosoma original, pero en una orientación inversa, causando inversión. O se puede tratar erróneamente como un cromosoma separado, causando duplicación cromosómica. Una parte de estos errores pueden detectarse por alguno de los puntos de control existentes a través del ciclo celular, lo cual produce una parada en la progresión celular, dando tiempo a los mecanismos reparadores a corregir el error. Si esto no ocurre, el efecto de estas anormalidades genéticas dependerá de la naturaleza específica del error. Puede variar de una anomalía imperceptible, a carcinogénesis o a la muerte del organismo. Endomitosis La endomitosis es una variante de la mitosis sin división nuclear o celular, lo que da lugar a células con muchas copias del mismo cromosoma en el mismo núcleo. Este proceso también se denomina endoreduplicación, y las células resultantes endoploides. Un ejemplo de una célula que sufre endomitosis es el megacariocito. MUERTE CELULAR La homeostasis en organismos eucariotas se mantienen por la existencia de mecanismos que regulan la proliferación, diferenciación y muerte celular. Estos mecanismos parece que están bien determinados en los dos primeros procesos, pero no ocurre así con el tercero, en cuya comprensión se ha avanzado desde hace relativamente poco tiempo. Los dos tipos de muerte celular que se reconoce en el organismo son la necrosis y la apoptosis. La primera tiene un carácter patológico y se desencadena tras un daño celular extremo. Por el contrario, la apoptosis es un proceso fisiológico irreversible que ocurre de forma habitual en los organismos eucariotas pluricelulares, tanto en el desarrollo embrionario como en la etapa adulta.

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NECROSIS La necrosis es la muerte patológica de un conjunto de células o de cualquier tejido del organismo, provocada por un agente nocivo que causa una lesión tan grave que no se puede reparar o curar. Por ejemplo, el aporte insuficiente de sangre al tejido o isquemia, un traumatismo, la exposición a la radiación ionizante, la acción de sustancias químicas o tóxicos, una infección, o el desarrollo de una enfermedad autoinmune o de otro tipo. Una vez que se ha producido y desarrollado, la necrosis es irreversible. Desde el punto de vista morfológico, la necrosis se caracteriza por una dilatación del retículo endoplasmatico, una floculación de la cromatina nuclear y una entrada de agua que acaba por provocar la ruptura osmótica de la célula y la salida al exterior del contenido celular, es un proceso pasivo, que no requiere una activa participación de la célula, y que puede afectar a una zona mas o menos amplia de tejido. A diferencia de la apoptosis, la necrosis no requiere síntesis de nuevos ARNm o proteínas. De los datos recogidos de una gran variedad de estudios podría deducirse que el origen de todos los desordenes necroticos es un desequilibrio osmótico. La permeabilidad de la membrana plasmática se altera y se establece un flujo anormal de iones hacia el interior, principalmente de calcio que va acompañado de la entrada pasiva de agua. El volumen celular aumenta (tumefacción) y algunas rutas metabólicas se alteran por las nuevas concentraciones iónicas que se establecen. Así, la mayor concentración intracelular de calcio inhibe la producción de ATP, a la vez estimula la síntesis de algunas enzimas proteolíticas. La cromatina nuclear pierde su conformación original y constituye pequeños agregados. Algunos orgánulos membranosos, como el retículo endoplasmatico o la mitocondria, se dilatan por la entrada de agua, los ribosomas se desorganizan y los lisosomas se rompen. Como etapa final, los orgánelos estallan, la membrana plasmática y la envoltura nuclear se fragmentan y el contenido intracelular se vierte al exterior, promoviendo una respuesta inflamatoria. Las células fagocíticas que acuden al tejido ingieren y degradan estos restos. Esta salida del contenido celular será la responsable de la extensión del fenómeno necrótico, ya que las células adyacentes van a verse afectadas, bien directamente, o bien de modo indirecto por la reacción inflamatoria.

APOPTOSIS La apoptosis es una forma de muerte celular, que está regulada genéticamente, la muerte celular programada es parte integral del desarrollo de los tejidos tanto de plantas como de animales pluricelulares. La muerte celular durante el desarrollo normal de los animales fue descrita en 1951 por Glucksmann. Mas tarde, en 1971, Kerr y colaboradores descubrieron el proceso a nivel ultra estructural y le denominaron apoptosis. En la actualidad este término se usa como sinónimo de muerte celular programada. Cuando el medio no es apto para la célula, se ejecuta un programa de suicidio celular denominado apoptosis. Este programa produce la muerte de la célula de manera controlada, la unidad biológica no es capaz de sostener la homeostasis. Las células más viejas cuentan con mitocondrias más dañadas, por lo que la capacidad de aportar ATP se ve disminuida, y si a eso se le unen las condiciones del medio, el resultado es que las más viejas son las que menos se alimentan en un medio precario. A su vez, la ralentización de los ciclos metabólicos descompensa otras funciones celulares, y lo que antes tenía una cancelación de cargas favorable para la vida, ahora ha de recurrir a otras formas de cancelar la carga, produciendo la expresión de genes que desemboca en la apoptosis. 175



La ejecución en sí depende bien de factores externos a la célula (generalmente variaciones de concentración de factores de crecimiento, estímulos para la permanencia en el tejido o bien estímulos apoptóticos directos desde linfocitos) activando el ligando de FAS en la membrana celular, o bien de factores internos en los que la célula expresa metabólicamente su programa de muerte celular como consecuencia de un daño celular. En este contexto, daño implica desde oxidación por radicales libres que la célula evalúa como irreparable hasta el acortamiento de telómeros debido a sucesivos ciclos de división celular, lo cual, en última instancia, produciría daño genético por pérdida de información en caso de nuevas divisiones celulares, pasando esta definición de "daño" por todos los que generan apoptosis La apoptosis es un fenómeno biológico fundamental, permanente, dinámico e interactivo. Existen mecanismos pro- y anti-apoptóticos, regulados genéticamente, que actúan de forma activa y equilibrada. Esta muerta celular es necesaria para el buen funcionamiento de organismo, por que se eliminan células funcionalmente anormales y excedentes celulares normales. Así, en el sistema nervioso de vertebrados hasta un 50% de algunos tipos neuronales son inducidos muy tempranamente a morir por apoptosis. En embriones machos de mamíferos, las células del conducto de muller (que en la hembra darán lugar al útero y a las trompas uterinas) mueren por apoptosis en el momento de la diferenciación de lo órganos genitales. La regresión caudal en la metamorfosis de algunos vertebrados, la perdida de la región interdigital en amniotas, y la formación de la región del paladar o la retina son otros ejemplos de muerte celular programada. Pero la apoptosis también ocurre en células somáticas adultas. Así, en el recambio continuo de los tejidos, la renovación de los epitelios, la atrofia de la próstata tras la castración, la regresión de las glándulas mamarias después de la lactación o la atrasia del Folículo ovárico. La muerte celular programada en el sistema hematopoyetico es muy elevada: miles de millones de células mueren diariamente en la célula ósea y órganos linfoides durante la diferenciación y, fuera de estos órganos, miles de millones de leucositos neutrofilos inservibles mueren diariamente de esta manera en el hombre. Por eso, es en el sistema inmunitario donde mejor se ha estudiado este fenómeno, y se ha podido comprobar que desempeña un papel muy importante en la deleccion de población de linfocitos auto reactivos, habiéndose incluso identificado los genes y las proteínas que participan en esta muerte celular. Adema los linfocitos T citotóxicos y las células asesinas (NK) actúan induciendo apoptosis en sus células diana. Una deficiente regulación de este proceso puede dar lugar a múltiples desordenes. En el hombre se piensa que es esa deficiencia parte importante de la etiología de algunos tipos de cáncer, SIDA, enfermedades auto inmunitarias o trastornos del sistema nervioso central.

ASPECTOS MORFOLÓGICOS: En contraste con la necrosis, la apoptosis no es un proceso pasivo que se realice sin una activa participación de la célula, sino que se desencadena como un proceso individual en cada célula. Como una respuesta fisiológica a la influencia del entorno, mediada por una cáscada de transducción de señales desde la superficie celular hasta el núcleo, para poner en marcha un nuevo programa genético. La célula no sufre cambios osmóticos, sino que atraviesa estadios morfológicos distintos que pueden seguirse con la microscopia y el empleo de determinadas tinsiones. Pueden distinguirse 3 fases. 176



En una fase inicial, la célula individual embebida en el tejido, pierde el contacto con las células que la rodean, la cromatina nuclear se condensa y fragmenta, permaneciendo la envoltura nuclear. El volumen citoplasmático disminuye por perdida de agua y condensación de las proteínas, pero la mayoría de los orgánelos celulares permanecen intactos. La segunda etapa del proceso se caracteriza por la deformación de la membrana plasmática, que acaba fragmentándose, y la aparición de los llamados cuerpos apoptoticos, que consisten en material nuclear y citoplasmático englobado por esos fragmentos de membrana. Análisis bioquímicos de estos cuerpos ponen de manifiesto su alto contenido en proteínas, muy empaquetadas resistentes a acciones proteolíticas. En la fase final, las células circundantes y los macrófagos presentes en el tejido fagocitan estos cuerpos para su completa degradación, en la que participan proteasas dependientes de calcio que se encargan de dirigir proteínas integrantes del citoesqueleto. A diferencia de la necrosis, no hay ruptura de la célula que muere ni sus restos se vierten al exterior. El reconocimiento para la fagocitosis puede estar mediado por la interacción de glucoproteinas alteradas expuestas en la membrana plasmática que rodea los cuerpos apoptoticos y los receptores de membrana de tipo lecitina de las células fagocíticas. Otras veces las células fagocíticas segregan a la matriz extracelular proteínas denominadas trovospondina y vitronectina, que se unen a la membrana de los cuerpos apoptoticos. Como la superficie celular de las células fagocíticas presenta receptores del tipo integrina con afinidad por la trombospondina o por la vitronectina, estas actúan de puente de unión para la fagocitosis. Todo el proceso es bastante rápido, puede completarse en unas horas y ocurre sin perdida de material intracelular, daño secundario a las células adyacentes o reacción inflamatoria en el tejido. MECANISMO. La apoptosis puede iniciarse en el tercio final de G1 para impedir que una célula dañada ingrese a la fase de síntesis de manera que las mutaciones no se reproduzcan durante la replicación del ADN y en la fase G2 para impedir que las células que no hayan llegado a la madurez entren en mitosis. En el mecanismo molecular que controla la apoptosis actúan varios agentes, de los cuales uno de los más importantes y mejor estudiados es el complejo de cisteinil-aspartato proteasas (caspasas). Se han descrito 11 caspasas en células humanas que provocan una degradación proteica bien definida hasta llegar a la formación de cuerpos apoptóticos. Algunas caspasas son "iniciadoras" y otras "efectoras" del proceso catalítico, actuando sobre endonucleasas que son las responsables directas de la fragmentación del ADN. La cadena de degradación proteica tiene sucesivos clivajes dependientes de la ubicación del ácido aspártico que se repite en la estructura de la enzima. Se han descrito varios cientos de sustratos de caspasas. La activación de las caspasas, que existen en calidad de pro-caspasas inactivas, se produce por diversas vías en que participan varios complejos moleculares.

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NUCLEOLO En 1781 Fontana describió una formación dentro del núcleo que corresponde al nucléolo. En 1838 Schleiden y Schwann observaron esta formación en diversos tipos celulares, principalmente vegetales. En su interpretación, basados en la teoría celular, llegaron a la conclusión de que esta estructura originaba el núcleo, así como el núcleo originaría la célula y ésta los tejidos. Cajal, utilizando tinciones de plata, observó el nucléolo como un conjunto de esferas. Esta imagen, de zonas claras y oscuras, se corresponde con la que se observa al microscopio electrónico y que Stable y Sotelo (1950) interpretaron como un ovillo de filamentos (nucleolonema) entre los que quedan espacios claros (el nucleoloplasma). Con el perfeccionamiento técnico de la microscopia electrónica se interpretó la estructura del nucléolo como la de una esponja, con tabiques irregulares interconectados entre los cuales quedan espacios vacíos.

Se distinguieron los siguientes componentes: Parte amorfa . Corresponde a los espacios de escasa densidad a los electrones que forman cavidades intercomunicadas en la parte densa. Contiene gránulos de ADN y equivale al nucleoloplasma. Parte densa. Se corresponde con el nucleolonema. A su vez se distinguen en ella: Parte granular. Formada por agrupaciones de gránulos de unos 25 nm de diámetro, que contienen ribonucleoproteínas. Parte fibrilar. Más densa que la anterior, constituida por fibrillas de unos 8-10 nm, también formadas por ribonucleoproteínas. Centro fibrilar . Muy evidente en algunos nucléolos, donde puede haber varios centros fibrilares y de densidad inferior a la de las partes granular y fibrilar. Consiste en finas fibrillas de 7-9 nm. Contiene ADN y algo de ARN. Debido al contenido en ADN, se ha considerado que los centros fibrilares corresponden a organizadores nucleolares en fase activa o de transcripción. Algunos autores han discrepado de esta interpretación debido a que los centros fibrilares no se observan en muchos tipos celulares y no parecen indispensables para la correcta función del nucléolo, y han atribuido al centro fibrilar otras funciones, como la de almacén de reservas proteicas para la síntesis ribosómica. En muchos nucléolos se observa también una masa fibrilar densa que contiene exclusivamente ADN. Es la heterocromatina asociada al nucléolo y corresponde a la heterocromatina telomérica de los organizadores nucleolares. En los ovocitos y espermatocitos de muchas especies, durante la profase de la primera división meiótica, las partes fibrilar y granular forman estructuras separadas (segregación nucleolar). Además, los ovocitos de muchas especies suelen mostrar numerosos nucléolos de gran tamaño (hasta 12 micras de diámetro) y aparecen separados de los cromosomas. COMPOSICIÓN QUÍMICA La presencia de ácidos nucleicos en el nucléolo pudo demostrarse pronto al comprobarse que este componente nuclear absorbía la luz ultravioleta. El empleo de los test citoquímicos para el estudio de los ácidos nucleicos permitió establecer que el nucléolo se diferencia de la cromatina en que contiene básicamente ARN y no ADN: se tiñe con la pironina y no con el verde metilo, y da negativo el test de Feulgen (tinción selectiva para el ADN). La proporción de ARN en el nucléolo es muy variable y depende del tipo celular y del estado funcional. Se estima como valor medio un 10 %, aunque en algunas células alcanza el 30 %. El componente mayoritario son 178



las proteínas, que constituyen prácticamente el resto del nucléolo. Se trata de fosfoproteínas (ácidas) y otras proteínas muy diversas, algunas de las cuales son básicas. De la proporción de las diversas proteínas y ARN depende el carácter tintorial del nucléolo. A diferencia de la cromatina, que siempre es basófila, el nucléolo puede ser acidófilo. De ahí la distinción hecha en los primeros estudios de microscopía óptica entre basicromatina (cromatina en sentido estricto) y oxicromatina (cromatina ácida, correspondiente al nucléolo). Al estar constituido por ARN y proteínas ácidas del tipo fosfoproteínas, el nucléolo debería ser siempre basófilo; y así ocurre muchas veces. Sin embargo, posee también otras proteínas básicas que pueden disponerse enmascarando el ARN y las proteínas ácidas, y en este caso el nucléolo es acidófilo. Debido a este comportamiento tintorial variable, el nucléolo resulta ser un componente anfófilo . También es característica la tinción con plata del nucléolo, que se debe a una proteína específica, conocida como nucleolina , que sólo se une a transcritos de ARNr y es muy abundante. Entre las proteínas del nucléolo se encuentran las snRNP, que intervienen en la maduración del ARNr y ayudan a la construcción del ribosoma. En el análisis bioquímico de los nucléolos siempre se encuentra algo de ADN (1-3 %). Si se exceptúa cierta cantidad de ADN contaminante, ya que el nucléolo no tiene membrana, el ADN nucleolar puede corresponder al centro fibrillar y a la heterocromatina asociada al nucléolo. En el nucléolo se han detectado enzimas, principalmente las necesarias para la síntesis del ARN y su procesamiento.

CICLO NUCLEOLAR. Igual que ocurre con los cromosomas, el comportamiento del nucléolo es muy diferente según se consideren células interfásicas o mitóticas. En la interfase no se observan grandes cambios en el nucléolo: suele aumentar el volumen a lo largo de ella y hay cierta tendencia a la fusión de nucléolos, lo que ocurre cuando dos organizadores nucleolares se sitúan en posiciones muy próximas. Durante la división celular, el nucléolo muestra una serie de cambios que determinan un tipo de conducta nucleolar: el ciclo mitótico típico del nucléolo, el cual ocurre en la mayoría de las células. Este consiste fundamentalmente en tres procesos. Desorganización profásica. Es un proceso en el que el nucléolo presenta las siguientes características: a) disminuye de tamaño. b) su forma se hace irregular generalmente polilobulada o estrellada. c) su afinidad tintorial por muchos colorantes disminuye. d) aparecen pequeñas masas de material nucleolar libres entre los cromosomas profásicos que se están condensando. Transporte metaf ásico y anaf ásico. En esta etapa el nucléolo ha perdido su individualidad. Ya no se

observa como cuerpo, pero sus materiales constituyentes se han dispersado en el núcleo profásico y 179



terminan entroncándose o incorporándose (de una manera poco conocida) a los cromosomas metafásicos. Generalmente en esta fase el material nucleolar no se detecta morfológicamente. Sin embargo, después de marcar con uridina tritiada en la interfase previa, y de consultar por radioautografía que gran parte del marcaje corresponde al nucléolo, se puede observar que durante la metafase y anafase el marcador (presumiblemente ARN nucleolar o ribosomal) se encuentra sobre los cromosomas. También se ha comprobado que existe una proporción de ARN en los cromosomas metafásicos utilizando citoquímica. Reorganizacion telofásica. En la primera mitad de la telofase aparecen cuerpos laminares entre los cordones cromosómicos en vías de descondensación. Al mismo tiempo, se observan cuerpos más esféricos, resultado de la aglomeración y fusión de los más pequeños. El material de estos cuerpo, dispuestos también entre los cromosomas, presenta todas las reacciones citoquímicas propias del nucléolo interfásico. Su ultra estructura (cuerpos fundamentalmente formados por regiones fibrilares, rodeados por regiones granulares) es también semejante a la del nucléolo interfásico. Todas estas características, y además su particular conducta, hacen que se llame a éstos cuerpos prenucleolares , lo que denota su significación en el ciclo nucleolar. Avanzada la telofase, los cuerpos prenucleolares se hacen mayores y comienzan a formar un nucléolo interfásico. El proceso se produce por coalescencia y fusión de los cuerpos prenucleolares en torno a la región organizadora nucleolar. Cuando esto termina, se observan uno o más nucléolos maduros (en función del número de organizadores) habiendo prácticamente desaparecido los cuerpos prenucleolares.

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Biologia Celular LIBRO

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