Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Química. Bioquímica Experimental. Depto. de Bioquímica Titulares: Dra. Gutiérrez Venegas Gloria / Dr. Martínez Castilla Patricio
2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA LACTATO DESHIDROGENASA DE MÚSCULO ESQUELÉTICO DE POLLO Y MONITOREO DEL PROCESO DE PURIFICACIÓN PURIFICACIÓN POR ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA-SDS. Por: Abarca Merlín Daniela Melissa / Bojorquez Cortés Ángel Alexis / Medina López Jaqueline Michael / Vega Aguilar Itzel Karina.
Resumen Para poder estudiar una enzima tanto cinéticamente como para conocer su importancia biológica se necesita purificarla, existen diversos métodos de purificación que incluyen métodos físicos y químicos como lo son el calentamiento, la precipitación por salado, cromatografía de intercambio iónico o de afinidad, etc. La enzima lactato deshidrogenasa (LDH) es una proteína tetramérica que cataliza la conversión reversible de piruvato a lactato usando NAD+ /NADH como cofactor. Durante este proceso de purificación basado en las características fisicoquímicas de solubilidad, pH, punto isoeléctrico, etc; se logró purificar la enzima de interés, obteniendo distintas cantidades en todas las fracciones de este proceso y confirmando su presencia y pureza a través de una electroforesis SDS-PAGE
Introducción La mayor parte de las investigaciones bioquímicas requieren la purificación, al menos parcial, de las sustancias objeto de estudio. Esto requiere generalmente un gran esfuerzo ya que una célula contiene miles de sustancias diferentes, la molécula que buscamos puede ser extremadamente inestable o encontrarse a concentraciones muy bajas. Por esta razón es indispensable separarlas aprovechando diversas propiedades y
características de las proteína globulares, por ejemplo: 1) tamaño molecular, 2) solubilidad, 3) carga eléctrica, 4) diferencias en sus características de adsorción, 5) afinidad biológica por otras moléculas. Se pretende purificar la enzima Lactato Deshidrogenasa (LDH) presente en músculo de pollo (Gallus gallus). Esta enzima es una “válvula de seguridad” en nuestra vía de producción de energía denominada glicolisis, la cual requiere grandes cantidades de oxígeno, y cuando el flujo de éste no es suficiente, la vía se detendría, no habría
producción de ATP ni de NAD+ disponible para continuar la vía glucolitica de no ser por la presencia de LDH.
Fig.1. Reacción catalizada por LDH La lactato deshidrogenasa (LDH) es una enzima NAD dependiente que se encuentra ampliamente distribuida en tejidos animales, vegetales y en microorganismos. Su peso molecular es aproximadamente 135 kDa y su estructura es la de un tetrámero, en el que las subunidades van unidas por enlaces hidrófobos, puentes de hidrógeno y fuerzas electrostáticas. Existen 2 tipos distintos de subunidades, M y H, cuyas combinaciones posibles dan lugar a cinco formas moleculares, con actividad lactato deshidrogéica y con características cinéticas y fisicoquímicas diferentes, que se han denominado isoenzimas. A si mismo es importante mencionar que el punto isoeléctrico de la enzima es de 7.75 Es una enzima citoplasmática que se encuentra en forma soluble o ligada a membrana. Las diferentes isoenzimas se encuentran en distintas proporciones en cada tejido, lo cual puede dar idea de la funcionalidad de cada isoenzima, atendiendo a las funciones metabólicas en que intervienen.
Hipótesis Si se realizan adecuadamente los pasos de purificación de la LDH en base a sus propiedades fisicoquímicas como carga, punto isoeléctrico, masa molecular y afinidad, tendrá como resultado la extracción de una enzima pura en baja cantidad debido a las pérdidas normales de cada uno de los procesos.
Objetivos Conocer las propiedades fisicoquímicas de las proteínas: carga, punto isoeléctrico,masa molecular y afinidad. Conocer las diferentes estrategias utilizadas para aislar proteínas a partir de diferentesfuentes celulares. Relacionar las propiedades fisicoquímicas de las proteínas con el fundamento de lastécnicas utilizadas en la purificación de proteínas: Centrifugación diferencial,precipitación por salado, cromatografía de filtración en gel, cromatografía deintercambio iónico y cromatografía de afinidad. Aplicar las técnicas de centrifugación y precipitación por salado como técnicas inicialesde purificación de una proteína.
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Materiales y Métodos La parte experimental de esta práctica se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del manual de Bioquímica Experimental Edición 2013 de la Facultad de Química, UNAM. 1
Resultados La purificación de la enzima Lactato deshidrogenasa (LDH) de músculo de pollo se llevó a cabo desde la extracción de está en pechuga de pollo hasta la purificación final con el uso de cromatografía de afinidad para finalmente monitorear la separación de la enzima mediante electroforesis SDS- PAGE. Para el primer método de monitoreo fue necesario realizar una curva de calibración para poder determinar posteriormente las concentraciones de LDH presentes en cada una de las fracciones obtenidas. La curva de calibración fue realizada con albumina de suero bovino (BSA) +%0 +%1 / .+%$ ' , - +%2 , + & ) +% ( ' & " % +%( $ # "+%' !
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Figura 2. Curva de calibración de BSA según el método de Bradford. La determinación de proteínas por el método de Bradford es ampliamente utilizado ya que es simple, rápido, barato y sensible. El método esta basado en la unión especifica del colorante de Coomassie G250 a los residuos de Arg, Trp, Tyr, Hist y Phe de las proteínas
Figura 3.. Cursos temporales de la actividad enzimática de la LDH de músculo de pollo. Se construyó midiendo la reacción LDH - NADH a 340 nm en un medio de reacción con piruvato. !
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Tabla 1. Tabla de purificación de la LDH de músculo esquelético de pollo.
El monitoreo de la purificación también se efectuó con la separación de las proteínas en gel de poliacrilamida-SDS, este método permite separar y comparar mezclas compejas de proteínas, evaluar su pureza e incluso conocer algunos valores aproximados de las caracteristicas fisicoquimicas de las proteinas a separar.
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Una vez separadas las proteínas en el gel de poliacrilamida es necesario medir las distancias que cada una recorrio y mediante el peso molecular de los estandar (MW), se gráfica el log de los pesos moleculares de las proteínas en función de los RF, de esta manera se puede extrapolar conociendo el peso molecular de la LDH, la distancia que debió recorrer en el gel.
Figura 4: Log PM vs Rf con respecto a cada proteína y su recorrido en el gel de poliacrilamida
Discusión Daniela Abarca:Se extrajo la enzima
del citoplasma de las células licuando suavemente pedazos de pollo con buffer frío (4ºC) pH 8.6 con PMSF que actúa como inhibidor de proteasas para evitar la desnaturalización de la LDH. Esa temperatura de trabajo evita la desnaturalización y disminuye la actividad de las proteasas. La filtración de esta mezcla permite la separación de contaminantes de gran tamaño. Con esta separación se obtiene una solución concentrada de
la LDH acompañada otras proteínas y biomoléculas Posteriormente a través de la técnica salting in y saltingout con la sal (NH4)2SO4 la cual posee una densidad que no interfiere con la precipitación de proteínas y una solubilidad menor que el cloruro de sodio que se mantiene casi constante a pesar del efecto de la temperatura. Se usan porcentajes de saturación de 55% y 75% lo cual es de gran utilidad porque sirve para eliminar contaminantes y favorecer el proceso
de purificación. En este paso posiblemente se perdió LDH por la saturación de amonio. La cromatografía de afinidad no asegura que sólo se obtuviera LDH pues en el músculo de pollo podría haber otras enzimas que tuvieran el mismo sustrato (NADH) por lo que se recomendaría realizar una técnica más de separación, pero aun así es un método efectivo de purificación. La cromatografía de intercambio iónico depende específicamente del punto isoeléctrico de la proteína, por lo que se usan amortiguadores con un pH por arriba o por debajo del p.I dependiendo del tipo de columna, que puede ser aniónicao catiónica. En este caso se usó una columna de intercambio catiónico Macro-prep High S de BIORAD a pH 6.5. La LDH por debajo de su punto isoeléctrico tiene carga positiva y es retenida por la columna que tiene grupos sulfonicos (SO3-), luego se hicieron lavados con un buffer a pH 6.5 que contenía sales que modificaron la fuerza iónica y finalmente hizo eluir la LDH. Se evaluó la pureza de las fracciones por la técnica de electroforesis, en la cual se observó que el método de purificación fue eficaz. Pues las bandas coinciden con el peso molecular correspondiente de 36.5 kDa aprox.
Bojorquez Cortés A. Alexis Para la primera parte de la purificación se llevó a cabo la extracción utilizando un método de ruptura de membranas con ayuda de una licuadora. Para evitar que la enzima sea dañada por factores previamente mencionados como pH, temperatura, proteasas, entre otros, que favorecen su desnaturalización o hidrólisis enzimática se llevó a cabo el procedimiento a bajas temperaturas. Trabajar a 4ºC evita la desnaturalización e inhibe la actividad de las proteasas presentes en el medio. Así mismo, la adición de amortiguador A nos ayudad a asegurar que la enzima no sufra daño, entre los componentes de este buffer se enceutra PMSF que es un inhibidor de proteasas, Bmercaptoetanol que rompe puentes disulfuro, así como Tris pH=8.6, éste es un amortiguador de la zona de pH del medio donde normalmente se encuentra la enzima. La LDH es una enzima muy sensible a proteólisis. La posterior filtración (F0) y centrifugación (F1) nos ayuda a tener la enzima en un sobrenadante, elimiando así contamiantes de gran tamaño. En estas primeras fracciones obtenidas se esperaría obtener la mayor cantidad de LDH, pero acompañada de muchas otras enzimas, proteínas y biomoleculas en general. Para el método de pp por salado se utilizo sulfato de amonio el cual tiene
como ventaja poseer una densidad que no interfiere con la sedimentación de la mayor parte de las proteínas precipitadas por centrifugación, así como una relación estequiometrica de 2 amonios por 1 sulfato. El uso de este método se llevó por etapas, es decir, se llevaron 2 precipitaciones variando el porcentaje de saturacion de la sal. Esto nos sirvió para eliminar desde fragmentos de membrana, proteínas ya desnaturalizadas e incluso ribosomas mediante el uso de bajos porcentajes de saturación (55 % saturación); o proteínas “contaminantes” (no desnaturalizadas) utilizando concentraciones altas (75%). A pesar de los 2 procedimientos realizados no podemos asegurar que ninguna unidad de enzima no haya pp al utilizar un 55% de saturacion, siendo este método un primer paso donde posiblemente se haya perdido enzima. Por lo mismo, de ambas precipitaciones se tomaron fracciones Posteriormente, mediante el uso de una columna de exclusión molecular Sephadex G25, se llevó a cabo el proceso de desalado.Esta técnica nos permite separar proteínas de otras moléculas, donde la matriz de la columna de exclusión contiene poros, en los cuales, si una molécula entre en ellos, se moverá por la columa más lentamente recorriendo un camino más largo que una molécula de gran tamaño que no entre a los poros. De esta manera, al haber una
gran diferencia entre la LDH y las moléculas de sal se logra un mayor grado de purificación. LDH sale en un menor tiempo que las sales de sulfato de amonio, ya que al ser moleculas pequeñas se quedan atrapadas en los poros. En este proceso no podemos considerar que haya ocurrido alguna pérdida de enzima, debido a que el tamaño de la proteínas impediría su rentención en el poro. Tras la cromatografía de exclusión molecular se procedió a una cromatografía de afinidad. La utilización de una cromatografía de afinidad nos ayuda a purificar mñas a la enzima de los demas posibles contaminantes.El uso de esta cromatografía es un método de separación altamente especifico basado en una interacción de unión especifica entre un ligando inmovilizado y la mólecula a separar. La calidad de la purificación dependera de la especificidad de la interacción. Ya unidad, en este caso, la enzima, los contaminantes pueden ser “enjuagados”, y posteriormente, la enzima unida a la columa puede ser eluida con una fase móvil que contenga el sustrato de mayor afinidad por la enzima. En esta caso se utilizó una columna DEAE affi gel blu gel, la cual posee como grupo funcional Cibacron Blue F3GA y DEAE. El azul de Cibacron es una molécula muy similar a la de NAD+, la cual es un sustrato natural de la
enzima, por lo que la interacción enzima-azul de Cibacron es altamente especifica, favoreciendo la purificación. Para romper la unión de nuestra enzima con su ustrato se utilizo un buffer que contenía el ustrato NADH, por lo que la afinidad de la LDH fue mucho mayor por NADH que por Cibacron. Hasta este punto se obtuvo la enzima LDH purifica. Para confirmar si nuestra enzima se encontraba pura se realizó una electroforesis en gel de poliarilamida-SDS y un seguimiento de activdad enzimatica. La actividad enzimatica especifica aumentó conforme la proteína se iba purificando En la electroforesis se observa la presencia de la proteína a la par del marcador de peso molecular, lo cual indica una purifiación exitosa. Se calcularon los Rf correspondientes y se graficaron. La purificación de cromatografia de afinidad se comparo con la cromatografia de intercambio iónico y se observó que en la segunda aún se presentaban otras moleculas ajenas a LDH (electroforesis).
Jaqueline Medina. Al momento de
realizar una purificación de cualquier proteína es necesario realizar varios procedimientos para lograr una buena obtención de la proteína de interés, en esta práctica realizamos homogenización triturando la
pechuga de pollo y colocándola en un buffer que evita su desnaturalización, a continuación se realizó el proceso de salting in y out en el cual se separó la LDH de acuerdo a su solubilidad en sales, finalmente de las fracciones obtenidas en estos procedimientos (F0,F2,F2,F3) se tomó la F3 y se le realizo cromatografía por exclusión molecular en la cual se desalo la fracción ye se obtuvo en tres partes a las cuales se les determino la actividad enzimática para ver en cual se encontraba la mayor cantidad de proteína, en la cual se obtuvo que la F3B tenía mayor actividad y a esa se le realizo cromatografía por afinidad. Una vez obtenidas las fracciones finales se les realizo a todas actividad enzimática, en la cual se observó que la actividad enzimática específica aumentaba conforme se iba purificando la proteína lo cual indica que efectivamente si se purifico la proteína. Para observar mejor esto se realizó una electroforesis a las fracciones, en la cual se observó que efectivamente con forme iban pasando los pasos de purificación se iba extrayendo la LDH más pura ya que los pesos moleculares eran similares a los de la proteína de referencia, al mismo modo se comparó con la cromatografía de intercambio iónico en la cual se obtuvo la proteína pero aun venían otras proteínas con esta, lo cual nos indica que la cromatografía por afinidad es mucho más específica y
mejor para la realización de la purificación de LDH. Karina Vega. En una extracción de
proteína se llevan a cabo varios pasos para tenerla de manera lo más pura posible, en nuestro caso usamos un homogenizado mecánico, centrifugado, precipito por salado, cromatografía de exclusión molecular, se utilizaron dos tipos de cromatografía, de intercambio iónico con una columna de intercambio catiónico (cargado negativamente), y de afinidad donde se usó Cibacron blue 3GA, que es parecido al NAD+ al cual la LDH es afín. Para comprobar que lo que habíamos obtenido era la LDH se hizo una electroforesis. En todo este proceso era necesario un monitoreo de la purificación de nuestra proteína, determinando la actividad enzimática total y específica, como se observa en la tabla 1, las actividades totales disminuyen y en el caso de la específica estas aumentan, ya que conforme avanza el proceso de purificación, tenemos menos proteínas que no son de nuestros interés y más LDH. La tendencia no es muy notoria, puesto que el NADH se descomponía muy fácilmente y al momento de leer absorbancias, nuestro tiempo cero daba con valores bajos (0.300 a 0.500) cuando debían dar de 1.100 a 0.800. En la electroforesis, se puede apreciar bien en el carril 6 las bandas de un tamaño de 36KDa, y es lo que
esperamos ya que la LDH tiene un peso de 140KDa, pero como estaba desnaturalizada, sus subunidades pesan aproximadamente 35KDa, las bandas que se ven más oscuras (carriles 2 y 5) son porque tienen sal, ya que se cometió un error y se depositó en el pozo una fracción que no estaba desalada.
Conclusiones Se logró purificar a la LDH de manera adecuada y manteniendo su actividad enzimática, de igual modo se vio que la purificación con cromatografía de afinidad es mejor que con intercambio iónico por la especificidad del ligando. En cuanto a la electroforesis se observó que efectivamente se logró obtener la LDH.
Bibliografía [1] Sánchez, s. et al. 2013. Manual de prácticas de Bioquímica experimental. México, Facultad de Química. UNAM. Págs. 7-32 (2). Janson, Jan-Christer. “Protein Purification: Principles, High Resolution Methos, ans Application”. 3ºº Edición. Vol. 54. Editorial Wiley. EUA. 2011. Pág. 4-10 [3] Harris Daniel. Análisis químico cuantitativo. 2da edición. Editorial Reverté. 2001. p97 (4) “Introduction to Affinity Chromatography” Obtenido el 11 de marzo del 2017 en el sitio web de Laboratorios Bio-Rad en: http://www.biorad.com/es-mx/applications
Cuestionarios Cuestionario 1. Parte I. Extracción y precipitación por salado 1. Menciona cuatro usos que se les puede dar a las proteínas purificadas -
Conocer secuencias de aminoácidos Investigación sobre estructura-función Aplicaciones terapéuticas o biotecnológicas Establecer relaciones evolutivas
2. Dentro de la guía para purificar a una proteína se plantea que es importante establecer cuál va a ser el uso final de la proteína purificada. Explica por qué. De acuerdo al uso final de una proteína purificada, se establece el grado de pureza a la cual se necesita esa proteína. Pureza Muy alta >99% Alta > 95-99% Moderada < 95%
Usos Terapéutico Estudios estructurales Secuenciación de aminoácidos
3. ¿Qué propiedades del lactato deshidrogenasa se aprovecharán en cada paso de su purificación? (Ejemplos: carga, peso, solubilidad y unión a ligandos) -
Solubilidad (salting in y salting out, cromatografía de filtración en gel) Peso molecular (Electroforésis) Carga (Cromatografía de intercambio catiónico) Unión a ligante (Cromatografía de afinidad) Punto isoeléctrico (Electroforesis e intercambio catiónico)
4. ¿Por qué es importante mantener la mezcla de proteínas a 4ºC? Para que no se desnaturalicen con el calor del ambiente 5. De acuerdo con la reacción que cataliza y su función en el organismo, ¿por qué crees que se seleccionó el músculo esquelético de pollo para aislar la lactato deshidrogenasa? Está presente en grandes cantidades debido al efecto Pasteur sobre la producción de energía en un medio anaerobio. (Ciclo de Cori)
6. ¿Qué tipo de columna y eluyente recomiendas para su purificación y por qué? -
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Sephadex-G25 para desalar la LDH después del salting in y saltingout. Los iones de la sal de amonio se unen a los poros de la columna, permitiendo que la LDH sea la primera en eluir. Como eluyente se usa un buffer que mantenga estable a la proteína. DEAE affi-gel blue gel para cromatografía de afinidad. La columna contiene un colorante que tiene similitud con el sustrato de la proteína (Cibacron Blue F3GA) de tal forma que la retiene en el gel hasta que se hace pasar un buffer como eluyente que contiene NADH, el verdadero sustrato de la enzima. Por lo tanto, hace eluir a la enzima por la saturación de su sitio activo. La afinidad por su sustrato, es mucho mayor que la afinidad con el gel. Macro-prep High S de BIORAD para cromatografía de intercambio iónico. Es una columna de intercambio catiónico que permite la unión de la enzima por acción de cargas. La proteína tiene que estar por debajo de su punto isoeléctrico (con carga positiva) para que se lleve a cabo el intercambio. Como eluyente se usa un buffer a pH< 7.5 (p.I de la LDH)
7. Existen varios métodos en la literatura para purificar a la lactato deshidrogenasa, ¿por qué existe esa variedad si todos purifican a la misma proteína? Cada método es para conseguir un grado de pureza mayor o menor y utilizan diferentes propiedades fisicoquímicas de la LDH. 8. Menciona al menos dos proteínas que tienen actualmente un uso farmacéutico o médico y cuál es la fuente biológica de la que se obtienen. La compañía japonesa Tanabe-Seiyakuhacce producción industrial de Laminoácidos mediante el uso de un reactor enzimático con L-aminoacilasa inmovilizada. Bayer AG (Alemania) y Beecham Pharmaceuticals (Inglaterra) reportan el uso de la enzima penicilino G acilasa inmovilizada para la producción de precursores de penicilinas semisintéticas (POULSEN, 2003).
Cuestionario 2. Parte II. Purificación por cromatografía de intercambio iónico y de afinidad. 1. ¿Por qué es necesario llevar a cabo el proceso de desalado de la o las fracciones con alto contenido de sal en protocolo experimental antes de someterla a cromatografía de afinidad o de intercambio iónico? Porque se deben eliminar residuos que no son de interés en la purificación, y para que la concentración de sal no intervenga en las diferentes cromatografías así como en la electroforesis. 2. ¿Cuáles otros usos tiene la cromatografía de exclusión molecular que no sea la de ayudar a desalar una suspensión de proteínas? Se puede usar también como una técnica más de separación de proteínas de diferentes tamaños. 3. ¿Qué intervalo de fraccionamiento de moléculas tiene el Sephadex-G25 y que aplicaciones tiene? De 1.000-5.000 Dalton, puede usarse para eliminar moléculas de peso molecular menores a 5000 Da. La muestra se coloca en la columna, y al añadir el amortiguador de elución, las moléculas de menor tamaño se meten entre los poros de la matriz de Sefadex y se retienen allí, mientras que las grandes no se retienen y salen más rápidamente de la columna. Posteriormente eluyen o salen las de peso molecular menor. 4. ¿Qué es el volumen vacío en una columna de filtración en gel? Es el volumen que se toma cuando hay gel y fase líquida, es decir, el volumen de la fase móvil. 5. ¿A qué se refiere el término volumen muerto en una columna cromatográfica? Es el volumen de fase móvil que se requiere para eluir una especie no retenida 6. Investiga la composición de la matriz de intercambio iónico que se usó para purificar a la LDH. Se usó Macro-Prep High S Resin que es una resina de intercambio catiónico fuerte que contiene grupos funcionales sulfonatos (SO3-). 7. De acuerdo con pI de la LDH, si contaras con una columna de intercambio aniónico como DEAE-celulosa, ¿a qué pH mantendrías a tu proteína y a qué pH
mantendrías el amortiguador para eluir a la proteína de la columna? Fundamenta tu respuesta. -La proteína deberá tener un pH por encima de su pI para tener una carga parcial (-),y podrá eluir en la columna. El amortiguador debe ser ligeramente alcalino. 8. ¿Qué propiedad de la proteína se utiliza para purificar a la proteína mediante una columna de intercambio catiónico? Su punto isoeléctrico, mediante la unión a la matriz según su carga. 9. ¿Qué debe contener el eluyente para la purificación de la LDH en la cromatografía de intercambio iónico que se propone en este protocolo y por qué? Deberá tener la característica de ser un eluyente iónico que contenga alguna sal, para que se establezca una diferencia de cargas y de esta forma la enzima con base a su p.i, pueda eluir. 10. ¿Qué propiedad de la proteína estás utilizando para purificarla por cromatografía de afinidad y cuál es el componente clave para la purificación de la LDH en esta columna? Si la proteína tiene una afinidad específica por un ligando como un cofactor, un anticuerpo o un ion metálico, en el caso de la LDH se usa al cofactor de la enzima, el NAD+ o bien un compuesto que presente alguna similitud a éste como el Cibacron blue 3GA, Cuando la muestra atraviesa la columna de afinidad, la proteína de interés se unirá al ligando, mientras que el resto saldrá de la columna. Referencias. Dra. Sánchez Nieto Sobeida. Material de apoyo para los estudiantes del curso Bioquímica experimental (0141). Facultad de química, departamento de bioquímica. Pp 12-17. Recuperado de http://depa.fquim.unam.mx [consultado 11/03/17] http://www.bio-rad.com/es-mx/product/macro-prep-high-s-resin [consultado 11/03/17]
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Cuestionario 3. Parte III monitoreo del proceso de purificación. A. determinación de la concentración de proteínas 1. Compara ambos métodos de cuantificación de proteínas utilizados en la práctica y enlista sus diferencias. Considera tanto el fundamento de las técnicas como la metodología para llevarlas a cabo. Método de absorción a 280 (UV) •
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Se realiza a 205nm o 280nm con una sensibilidad 50µg/ml a 2mg/ml Se basa en la absorción del enlace peptídico y de tirosinas y triptófano La sensibilidad depende del número de aminoácidos aromáticos que posea la proteína No es destructivo Su costo es bajo
Método de Bradford •
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Se realiza a 595nm con una sensibilidad de 1µg/ml a 1.5mg/ml Su mecanismo se basa en la reacción con aminoácidos específicos y estructuras terciarias de la proteína (el colorante cambia de café a azul) Es un ensayo rápido y reproducible Gran variación proteína a proteína No compatible con detergentes
2. Compara los resultados de concentración que obtuviste con los dos métodos empleados en la práctica. Solo se realizó el método de Bradford 3. ¿Qué desventajas tiene determinar la concentración de proteína por Abs 280 con respecto al método de Bradford en muestras que tienen una cantidad variable de proteínas, como en nuestras fracciones de la purificación de la lactato deshidrogenasa? Que la concentración de la proteína teóricamente va disminuyendo por lo tanto se disminuyen la cantidad de aminoácidos aromáticos en la muestra, lo cual dificulta la correcta medición de esta en el método de 280 Y en el método de Bradford es más fácil la medición de esta ya que reaccionan aminoácidos más específicos
4. ¿Puedes usar otra proteína que no sea BSA como estándar? Si es así ¿cuál y por qué? No ya que la proteína BSA es la más usada en estos procedimientos 5. ¿Qué sustancias pueden interferir en cada uno de los métodos empleados y si se puede, cómo evitas su interferencia? Las sales; se puede evitar diluyendo la fracción Buffers altamente alcalinos; se evita corriendo blancos adecuados Detergentes: preparando buffer adecuados para contrarrestarlo 6. Investiga el intervalo de concentración de proteínas que detecta cada uno de los métodos. Absorción a 280: 50µg/ml a 2mg/ml Bradford: 1µg/ml a 1.5mg/ml 7. ¿Por qué es necesario construir una curva de calibración en la determinación colorimétrica de proteínas por el método de Bradford? Por qué la respuesta de la proteína puede variar al momento de realizar el método, y es necesario una referencia al momento de realizarlo 8. Investiga qué otro método existe para cuantificar proteínas y explica su fundamento. •
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Ensayo nano Orange: se realiza en el rango de 485-590nm con una sensibilidad de 10ng/ml a 10 µg/ml su mecanismo de acción se basa en la unión a detergentes en la superficie de las proteínas y a regiones hidrofóbicas de las proteínas; el colorante no reaccionante no presenta fluorescencia; es un ensayo rápido y con alta sensibilidad Método BCA: se realiza a 562nm con una sensibilidad de 0.5 µg/ml a 1.2 mg/ml, su mecanismo es la reducción del Cu2+a Cu+ en presencia de proteínas a un pH elevado, el ácido bicinconinico quela a iones de Cu+ formando complejos de color purpura: las muestras deben de leerse en un intervalo de 10min Ensayo de Lowry: se realiza a 750nm con una sensibilidad de 1µg/ml a 1.5mg/ml, su mecanismo es la reducción del Cu2+a Cu+ en presencia de proteínas a un pH elevado, el reactivo de Biuret quela a los iones Cu+ y el reactivo de folin-ciocalteu potencia el color azul; proceso lento
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Ensayo cuantitativo: se realiza de 450-550 con una sensibilidad de 10ng/ml a 150 µg/ml, su mecanismo se basa en la reacción con grupos amino primarios en presencia de cianuro o tioles; su sensibilidad depende del número de aminas presentes
Referencias http://www.smbb.com.mx/revista/Revista_1998_2/bitacora.pdf 12/03/17]
[consultado
Cuestionario 4. Parte III monitoreo del proceso de purificación. B separación de las proteínas en gel de policramida-SDS
1. ¿En cuál de los pasos de la purificación se obtuvo una mayor cantidad de LDH? Durante la purificación por cromatografía de afinidad, ya que en ese paso la proteína ya se encontraba desalada. Para despegar a la LDH de la columna se adicionaron 3 mL de amortiguador de elución A ( el cual contiene NADH, molécula por la cual la LDH es afín) y se recolectan tres fracciones.
2. ¿Cuál de los dos métodos de purificación cromatográfica produce una mayor cantidad de LDH, la cromatografía de afinidad o la de intercambio iónico? La cromatografía de afinidad, ya que al no variar el intervalo de pH, puedes mantener las condiciones óptimas de la enzima y evitar desnaturalizarla. La resina ocupada para el intercambio iónica es un fuerte intercambiador catiónico, por lo que la LDH la debes mantener a pH debajo de su pI para que se encuentre cargada positivamente. Usualmente, en una purificación se utilizan la cromatografía de intercambio iónico y la de afinidad como pasos secuenciales, una después de otra, pero por costos hemos utilizado sólo una de ellas. Con los resultados que obtuvo tu equipo y los otros equipos, predice cuál sería el resultado si primero se realizara la cromatografía de intercambio catiónico y luego la cromatografía de afinidad. Se obtendría una mayor purificación de LDH, en este caso cabria considerar el objetivo de la práctica, ya que al ser meramente educativo no es necesario que contemos con una proteína con una pureza tan alta.
3. ¿Cuántos contaminantes se tienen en la mezcla de proteínas obtenida en el proceso cromatográfico final? Se esperaría que ya no tuviera sales procedentes del salt-in/out, aunque posiblemente podría tener isoenzimas parecidas en estructura y sustrato a la LDH y en mucho menor medida trazas de las soluciones buffer. 4. Elabora un esquema de purificación para la proteína malato sintasa, utilizando semillas de girasol. Para ello busca: A) Cuál es la función de la proteína: Enzima importante en el ciclo del ácido glicoxílico que cataliza de manera reversible la síntesis de L-malato a partir de acetil-CoA y glioxilato. B) En qué material biológico se encuentra: semillas como la del girasol. Células vegetales, algunos hongos y protozoos.
C) En qué compartimento subcelular se encuentra: En los glioxisomas.
D) Busca la información estructural y/o fisicoquímica de la proteína. -pH óptimo: 6.8 -T óptima: 79.5ºC -MM: 20600 -Subunidades: Homodimero. Clasificación: EC 4.1.3.2
E) Realiza un diagrama de flujo del protocolo de purificación propuesto, fundamentando el porqué de cada paso de purificación, indicando en cada paso en dónde está la proteína. Recuerda que tiene características muy distintas a la lactato deshidrogenasa por lo que no necesariamente se tienen que usar los pasos de purificación usados en este protocolo experimental. Recuerda que para cada tipo de proteína el protocolo de purificación puede variar.
Bibliografía •
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