Bioquímica I – Biomolècules, estructura i funció Tema 1: Composició elemental dels éssers vius. Bioquímica: definició i objectius. Elements químics que composen els éssers vius. La composició material dels organismes vius es basa en 28 elements, que es caracteritzen per ser els de pes atòmic més baix i per tant també els més estables. Aquests elements els podem dividir en tres grans tipus: Els que composen principalment les biomolècules, i representen el 99% dels elements i són C, H, O i N. També es troben en gran mesura encara que de forma no tant abundant el P i el S. Aquests elements es caracteritzen especialment per formar enllaços covalents molt forts, enllaços doble estables i un número atòmic baix. Els que es troben en forma de ions, els més abundants són Na+, K+, Cl-, Mg2+ i Ca2+. Els oligoelements es troben en molt baixa proporció però són indispensables pel bon funcionament de enzims i proteïnes, com són Fe, Zn, Mn, Co i Cu. (Altres menys abundants són B, I, Se, Al, Ni, Cr, As ...) Pel que fa a la composició en molècules cal destacar que l’aigua representa entre el 90% en Cnidaris i el 60% en plantes. En el cas de les persones representa un 70%. Els ions representen un 1%. Les biomolècules representen el 30% i es divideixen en glúcids, lípids, àcids nucleics i proteïnes. Aquestes biomolècules són molècules orgàniques, formades per la unió covalent entre àtoms de carboni. La unió entre aquests pot ser de tipus sp3, amb un angle de 109,5º i permetent la rotació; o bé en forma de sp2, formant enllaços dobles en un mateix pla formant un angle de 120º i sense permetre la rotació. Pel que fa als sp dels triples enllaços, mai es troben en la natura. El carboni per si sol és un element poc reactiu i per tant cal que s’hi uneixin grups funcionals. (R-OH, R-CHO, R-CO-R’. R-COO-R’, R-NH3+, R-CONH2, -C-O-C-, -SH, -COO-C-) Les biomolècules poden adoptar diferents conformacions i configuracions. Una conformació és la disposició a l’espai que pot adoptar una molècula unida per enllaços senzills a causa de la rotació d’aquests. Però a la natura no hi ha tantes conformacions; ja que hi ha certes restriccions, principalment per les interaccions no covalents entre diferents elements d’una molècula, i en menor mesura per l’impediment al·lostèric que provoca el volum de certs àtoms. Una configuració és la disposició dels elements d’una molècula que no és derivada de la rotació dels enllaços simples; com és el cas de l’àcid fumàric i l’àcid màlic que es diferencien per ser les configuracions cis i trans de l’àcid butendiòic. Els isòmers òptics en la natura tendeixen a fer-se servir tan sols un dels isòmers per tal d’assegurar l’especificitat. Per aquest motiu els aminoàcids sempre són L i els monosacàrids D.
1
Les macromolècules estan formades per la unió d’unitats més senzilles: els sucres monosacàrids, els àcids nuclèics de nucleòtids, les proteïnes d’aminoàcids i els lípids no estan formats de cap monòmer perquè són molècules força simples. L’aigua es caracteritza pel que fa la seva relació amb la vida per tenir una temperatura de fusió i ebullició més alta que la resta d’hidrurs del grup 16 de la taula periòdica, un alt calor específic, el calor que s’ha de subministrar a un gram d’aigua perquè augmenti la seva temperatura en 1 grau, fa que s’absorbeixin els canvis de temperatura. L’aigua és una molècula molt cohesionada (té una tensió superficial força alta) com a conseqüència de la seva estructura. L’oxigen de l’aigua és més electronegatiu que els altres dos hidrògens, tot i que la càrrega global de la molècula és neutra, sobre l’oxigen hi trobem una densitat de càrrega negativa dos vegades superior a la que hi ha en els hidrògens. L’oxigen en la molècula d’aigua adopta una configuració electrònica de sp3 però amb la particularitat que com a conseqüència de la densitat de càrrega negativa que hi ha sobre l’oxigen es crea una repulsió entre els orbitals que fa que l’angle format entre els àtoms d’hidrogen i oxigen en comptes de ser de 109º sigui de 104’5º. Aquesta diferència de densitat de càrrega permet formar el que s’anomenen enllaços o ponts hidrogen. Aquest enllaços no covalents resulten especials pel fet que les distàncies d’enllaç són superiors a les dels enllaços covalents però alhora són inferiors a els establerts per les forces electromagnètiques dels enllaços de Van Der Waals, també es caracteritzen pel fet que el donador i l’acceptor han d’estar alineats per tal que l’enllaç sigui eficient a diferència de les forces electroestàtiques que depenen únicament de la distància, també es caracteritzen per tenir una distància d’enllaç constant al igual com l’enllaç covalent i a diferència dels enllaços electroestàtics on la distància pot ser variant. El donador és un element que pot formar un enllaç covalent amb l’oxigen mentre que l’acceptor és l’element electronegatiu capaç de tenir una càrrega parcialment negativa. Una particularitat de l’aigua és que al estar en forma sòlida de gel forma quatre ponts d’hidrogen formant una estructura cristal·lina, mentre que l’aigua líquida en té per terme mig 3’4, però el que realment té un efecte clarament diferencial és que aquests ponts d’hidrogen duren per terme mig 10-9s. Per aquest motiu en el gel es manté una distància entre les molècules superior a l’aigua líquida a causa de la seva estructura que manté les molècules més separades i per tant té una densitat inferior. En les biomolècules també es formen ponts d’hidrogen. Els grups hidroxil i amino actuen com a donadors mentre que àtoms de nitrogen o oxigen de grups carboxil actuen com acceptors. Les propietats dissolvents de l’aigua i les interaccions no covalents. Les substàncies es poden definir en dos tipus segons la seva afinitat per dissoldre’s amb l’aigua. Les hidrofíliques s’hi dissolen molt bé, les hidrofòbiques no es dissolen en absolut amb l’aigua mentre que a les anfipàtiques una part de la molècula és de cada tipus. Substàncies hidrofíliques: Els compostos iònics són aquells en que l’aigua hidrata o 2
apantalla la càrrega dels seus ions. La força amb que estan cohesionats aquests compostos a q .q part de dependre del quadrat de la distància depèn de la constant dielèctrica del F = K . 12 2 medi que en el cas de l’aigua fa que sigui 80 vegades més petita que en l’aire o r .D en el buit. També és aplicable aquesta explicació per les biomolècules en grups funcionals com el carboxil o l’amino (-COO-, H3N+-). Les interaccions iòniques que s’estableixen entre l’aigua i els compostos iònics sovint també s’anomenen pont salí i estan formades per una càrrega i un dipol. Les substàncies polars són molècules que tenen elements amb electronegativitats molt diferents i formen càrregues parcials dins aquesta molècula. Els grups polars poden fer ponts d’hidrogen amb l’aigua i per tant, són solubles. Les substàncies hidrofòbiques tenen elements amb electronegativitats més o menys iguals. Aquestes quan es barregen amb l’aigua fan que les molècules que estan prop a d’elles no puguin establir els ponts d’hidrogen que formen per mitjana amb elles i es vegin forçades a organitzar-se d’una manera més estructurada, reduint així l’entropia o desordre del sistema, aquest procés d’ordenament és energèticament desfavorable. Per tal de minimitzar aquesta energia i augmentar de nou l’entropia del sistema, les molècules apolars són ajuntades per una força hidrofòbica. En les substàncies amfipàtiques la part polar no té cap problema i forma interaccions amb l’aigua, mentre que la part apolar fa que les molècules d’aigua s’ordenin i per evitar que l’entropia del sistema disminueixi fa que les parts apolars s’agrupin. Aquesta agrupació de les parts apolars de les molècules amfipàtiques poden agrupar-se de diferents maneres: poden formar esferes on totes les parts apolars quedin a l’interior i les polars a l’exterior en contacte amb l’aigua formant una estructura que s’anomena micel·la. Poden formar també monocapes on les parts apolars es troben en contacte amb un medi apolar com pot ser l’aire (està compost principalment de molècules apolars). També es poden formar bicapes que estan formades per dos monocapes que es complementen per amagar els extrems apolars. Aquestes molècules es diu que es troben disperses ja que no es pot dir que estiguin del tot en estat insoluble ni dissolt, ja que l’aigua les aguanta en certa manera. Interaccions de Van der Waals: es donen entre àtoms no carregats que es troben molt propers l’un de l’altre. Consisteix en que un dels àtoms que té càrrega neutre, en un moment determinat, els electrons del seu núvol electrònic es troben en major proporció en un dels punts, creant així una zona amb una certa densitat de càrrega, llavors tenim el que s’anomena un dipol transitori o instantani. Aquest és capaç de provocar en l’àtom contigu una repulsió dels electrons del núvol electrònic d’aquest àtom que es troben propers en la zona amb densitat de càrrega negativa del primer àtom. S’indueix així una densitat de càrrega en el segon àtom, anomenant-se aquest dipol induït que es caracteritza per la preexistència del dipol instantani o transitori i també per estabilitzar aquest. Per tant, dos àtoms molt propers tendeixen a crear una atracció electrostàtica pel fet de sincronitzar i estabilitzar les seves densitats de càrrega. Aquesta atracció té un límit que s’anomena distància de Van der Waals, aquesta és deguda a que en l’atracció entre dels dos dipols no es poden sobreposar els núvols electrònics ja que es crea una major repulsió.
3
Aquest tipus d’interaccions són molt importants en bioquímica ja que en una macromolècula se’n hi poden arribar a trobar moltes d’aquestes atraccions i resulten de gran importància per la conformació de la molècula.
Amortidors. Un àcid feble és una molècula que es capaç de donar un protó però que es troba parcialment dissociada. És molt important en bioquímica perquè les molècules com els enzims són molt sensibles al canvi de pH i per tant, si hi ha una amortidora fa que s’hagi d’afegir molts equivalents de base o àcid per canviar molt poc el pH.
AH ↔ A− + H +
Ka ⇒ pKa = − log Ka
[ ] [HA])
pH (amortidora ) = pKa + log( A −
Amortidor intracel·lular: amortidor fosfat. H 2 PO4− ↔ HPO42− + H +
pKa = 6,86
Amortidor sanguini: amortidor bicarbonat. H + + HCO3− ↔ H 2 CO3 ↔ H 2 O + CO2 ( passa.a.gas )
4
Tema 2: Els glúcids. Característiques estructurals i propietats generals dels glúcids. Oligosacàrids. Polisacàrids de reserva i estructurals. Els glúcids són molècules formades per la unió covalent d’unitats bàsiques anomenades monosacàrids de polihidroxialdehids i polihidroxicetones. Es caracteritzen per tenir grups hidroxi a tots els carbonis menys en el que hi ha la funció aldehid o cetona respectivament. Les funcions dels glúcids : Reserva com és el cas dels tubercles que acumulen glúcids en forma de midó. Estructurals com és la paret cel·lular dels vegetals. Formar part d’altres molècules. Els nucleòtids estan format d’una base nitrogenada, un glúcid i un resta fosfat. Informativa. Els grups sanguinis (A, B, O) indiquen el glúcid de la paret cel·lular dels glòbuls vermells de la sang.
Dins els glúcids podem distingir aquells que tenen un nombre reduït i definit de monosacàrids que s’anomenen oligosacàrids. Els glúcids formats per la unió de un nombre indefinit de sacàrids s’anomenen polisacàrids. Els monosacàrids es poden classificar segons el grup carbonil que tenen (aldoses tenen el grup aldehid i les cetoses tenen el grup cetona). En general tenen entre 3 i 6 carbonis distingint així entre trioses, tetroses, pentoses i hexoses. La combinació d’ambdós classificacions dóna lloc a noms com cetopentosa o aldohexosa.
5
Propietats dels glúcids: Tenen molta afinitat per l’aigua ja que tenen molts grups d’hidroxils que els fan solubles. 2+ Les aldoses tenen propietats reductores. R-COH + Cu + OH R-COOH + Cu2O + 3 H2O A la natura es troben en forma d’heterocicles, és a dir cicles amb una cadena que conté un element diferent del C. Si tenim una dissolució α-D-glucopiranosa +113º (evoluciona)+52,5º perquè estan en equilibri en l’enllaç hemiacetàlic que pot donar de nou les formes α i β, s’anomena mutarrotació, és a dir, un canvi en la rotació específica d’un sucre o glucòsid de piranosa o furanosa que acompanya el equilibri de les seves formes anomèriques α i β. Si cal reduir l’equilibri passa de la forma heterocíclica a la lineal.
Derivats dels glúcids: Desoximonosacàrids: un grup hidroxil s’ha convertit en un hidrogen. Exemple la desoxiribosa. R-OH R-H Acids urònics: un grup hidroxil s’ha convertit en un àcid. Exemple àcid glucoronid que és un derivat de la glucosa.
Aminosucres: un grup hidroxil s’ha convertit en un grup amino. Exemple β-Dglucosamina.
6
Disacàrids. Els disacàrids són la unió de dos monosacàrids mitjançant un enllaç glucosídic. Aquest es caracteritza per ser un enllaç estable, és a dir que no està sotmès a cap equilibri, que uneix covalentment les unitats de monosacàrids. Hemiacetal + R − OH → Acetal Hemicetal + R − OH → Cetal ( si.l ' alcohol.és.orgànic ⇒ Glicòsid
Els distingim pels monosacàrids que els formen i per quins carbonis estan enllaçats, i per la configuració de l’anòmer (α,β) enllaçant. Polisacàrids. Els polisacàrids són el resultat de la unió d’un nombre indefinit de monosacàrids. Els podem distingir segons la composició (homopolisacàrids i heteropolisacàrids) segons tinguin un únic tipus de monosacàrid o més d’un. Segons els carbonis enllaçants, segons la configuració de l’enòmer enllaçant i segons si presenten ramificació. La funció estructural pot ser per exemple: La quitina que forma l’exoesquelet dels artròpodes que està formada N-acetil βD-glucosamina β (1 4) amina La cel·lulosa que és un homopolisacàrid lineal de β-D-glucopiranosa β(14), 4 5 formada per entre 10 i 10 unitats de glucosa sense que importi el nombre de molècules, s’estableixen ponts d’hidrogen de manera que es forma una estructura completament recta, formant una xarxa de ponts d’hidrogen que fan que sigui rígida i insoluble Els muropolisacàrids (pepticglicants) constituïts per un derivat de l’àcid urònic anomenat àcid glucurònic i N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina Els pèptidglicans en la paret cel·lular dels bacteris La funció de reserva pot ser per exemple: El midó de les plantes, especialment en les llavors i els tubercles En el citoplasma cel·lular hi han grans agregats de polisacàrids en forma d’inclusions en concret: - L’amilosa està formada per una estructura en forma de bucle de α-Dglucopiranosa α(14) i cada volta està formada per 6 residus - L’amilopectina està formada també de α-D-glucopiranosa α(14) amb ramificacions (1 6) cada 24-30 restes i tenen una longitud aquestes ramificacions de 20 restes que li donen una estructura més laxa que l’amilosa. En els animals es troba en forma de glicògen, α-D-glucopiranosa α(14), amb ramificacions (16) cada 8-12 residus i tenen una llargada d’entre 8 i 10 residus. - Si no es formessin aquests polímers augmentaria molt la pressió osmòtica de la cèl·lula i augmentaria també la dificultat per fer entrar glucosa en contra de gradient, els polímers en estar semidissolts no participen en aquests processos. Tot i que formar aquests grans agregats de polisacàrids és costós per la cèl·lula resulta beneficiós en global per les conseqüències ja descrites. - Les ramificacions serveixen per obtenir molècules de glucosa molt més ràpidament de cada extrem i de les ramificacions, evitant també tenir que fragmentar l’estructura. Tal i com es veu els polisacàrids de reserva dels animals estan molt més ramificats que no pas els dels vegetals degut al major consum energètic.
7
Tema 3: Els nucleòtids. Estructura general i funcions dels nucleòtids i els seus derivats. Les funcions dels nucleòtids: Donen lloc als àcids nuclèics per unió covalent entre aquestes unitats. Són la “moneda” energètica de la cèl·lula ja que l’energia i el treball no es donen en el mateix lloc ni en el mateix moment, per tant cal una molècula que capturi l’energia i la porti allà on es fa el treball. La moneda energètica és l’ATP. Missatger secundari: molècula que es genera dins la cèl·lula en resposta a la unió d’una proteïna receptora de membrana amb una hormona (molècula que viatja per la sang fins a trobar una altra cèl·lula diana a la que li provoca una reacció). L’hormona s’uneix a la proteïna receptora de la membrana de forma no covalent canviant-li l’estructura. Exemple: cèl·lula 1 adrenalina cèl·lula 2 (ATPAMP-C) activa enzim que genera glucosa. Participa en el metabolisme captant i cedint electrons. Composició dels nucleòtids: Monosacàrid, en concret 1 aldopentosa, en configuració furanosa (forma cíclica de 5 costats). L’anòmer es troba en configuració β. Els sucres que hi participen són la ribosa (RNA) i la 2-desoxiribosa (DNA) es troben en perpendicular a la base nitrogenada. Grup fosfat, està unit al carboni 5 de la pentosa per un enllaç éster de fosfat. Base nitrogenada, compost aromàtic, heterocíclic (C i N) amb un cert caràcter cíclic. Està unida al C1 de la pentosa per un enllaç N-glucosídic per un àtom de nitrogen (se’n diu així per analogia amb l’enllaç glucosídic). Existeixen dos tipus de bases nitrogenades: les bases púriques derivades de la purina estan formades per dos cicles de 5 i de 6 costats respectivament. Dins aquest grup es troben la guanina i l’adenina, estan presents en el DNA i al RNA. Les bases pirimidiniques que deriven de la pirimidina tenen un únic anell de 6 costats. Dins aquest grup hi ha la citosina, la timina i uracil, estan presents en el DNA la citosina i la timina i en el RNA la citosina i l’uracil.
Tipus de nucleòtids: Ribonucleòtids (RNA) tenen la ribosa. Desoxiribonucleòtids (DNA) tenen la desoxiribosa. Nucleòsid consta de la base nitrogenada i de la pentosa. Nucleòtid consta de la base nitrogenada, la pentosa i el grup fosfat. Nomenclatura: a partir del seu nucleòsid, la posició, el nombre de fosfats i segons la pentosa i la base nitrogenada (Adenina, Guanina, Citosina, Timina i Uracil).
Nucleòtids modificats: Nucleòtids metilats. Les metilacions de les bases nitrogenades es troben sobretot al DNA dels procariotes ja que són un mecanisme de defensa contra els virus bacteriòfags (fags) que infecten el seu DNA. Les procariotes tenen enzims que degraden el DNA i per tal que no degradin el seu propi tenen una combinació de metilacions específica. Nucleòsids difosfats o trifosfats. Nucleòsids en els que hi ha units 2 o 3 restes fosfats, com és el cas de l’ATP o ADP. Nucleòsids en grup fosfat en posicions diferents de 5. Per exemple l’AMPc (adenin monofosfat cíclic) que presenta el grup fosfat unit al carboni 2. Derivats de l’adenosina que la contenen a més d’altres components. (NAD, FAD, CoA).
8
Tema 4: Els lípids. Característiques generals dels lípids. Classificació. Estructura i propietat de cada tipus. Els lípids són molècules amb un marcat caràcter hidrofòbic, és a dir insolubles, que formen un grup molt divers. Classificació dels lípids: Àcids grassos Triacilglicèrids Lípids saponificables apolars Complexos o saponificables: es poden unir per formar Ceres molècules de varis àcids grassos. Fosfoglicèrids Lípids saponificables polars Esfingolípids Simples o no saponificables: molècules sense Esteroïds acomplexar amb cap d’altres. Terpens Àcids Grassos: Classificació dels àcids grassos: CH3-(CH2)n-COOH CH3-(CH2)n-COO Saturats Presenten tots els carbonis units per enllaços covalents simples. Insaturats Presenten algun dels carbonis units per un enllaç covalent doble i normalment es troba en configuració Cis, normalment també la insaturació es troba entre els carbonis 9 i 10 començant a partir del carboni carboxílic. Propietats dels àcids grassos: Els àcids grassos són substàncies amfipàtiques. Es disposen en forma d’estructures de monocapes. Poden ser saponificats en presència d’una base forta (NaOH, KOH) donant lloc a una sal d’àcid gras, és a dir, un sabó.
R − COOH + NaOH → R − COONa + H 2 O La diferència entre la sal d’àcid gras i l’àcid gras és que la primera es dispersa en forma de micel·les i el segon en monocapes, això explica la propietats del sabó d’arrossegar la matèria orgànica insoluble en aigua a l’interior de la micel·la. La conformació dels àcids grassos tendeix a la forma més estesa possible per poder formar més interaccions de Van der Waals amb les molècules adjacents donant una tendència a sòlid (mantega) però quan ens trobem amb àcids grassos amb dobles enllaços, al no poder formar l’estructura tant compacte com en els àcids grassos saturats pel fet que el doble enllaç té un cert angle en la cadena carbonada, l’estructura resultant que es forma amb les molècules adjacents no és tant compacte i té més fluïdesa amb una tendència líquida (oli), degut a que no es poden establir tantes interaccions de Van der Waals.
9
Lípids saponificables apolars: Els lípids saponificables apolars són substàncies molt hidrofòbiques i tenen la funció de constituir el material de reserva dels animals, en forma de triacilglicèrids, que és la molècula resultant de l’esterificació de tres residus d’àcid gras i una molècula de glicerol. Aquesta és molt apolar i per tant molt hidrofòbica. Les funcions dels lípids saponificables apolars: Principalment formar substàncies de reserva de tots els animals ja que presenta dos avantatges com són que no entra en dissolució el citoplasma i per tant no té efecte en la pressió osmòtica, i en segon lloc perquè són molècules encara més reduïdes que els glúcids que estan una mica oxidats, per tant se’n pot treure més energia a l’oxidar les perquè estan més reduïdes. Es formen a partir d’una esterificació que consisteix en la reacció d’un alcohol amb un àcid par donar un éster:
Àcid (àcid .gras ) + Alcohol ( glicerol.CH 2 OH − CHOH − CH 2 OH ) → Éster + Aigua R − COOH + R'−OH → R − CO − O − R'+ H 2 O - Triacilglicèrids: Poden ser simples o mixtes segons estiguin formats per tres àcids grassos iguals o diferents respectivament. Això fa que siguin més o menys fluids, segons les interaccions. En les plantes hi ha moltes insaturacions que fa que els seu triglicèrids siguin líquids, és a dir olis, mentre que en el dels animals hi ha poques insaturacions i per tant són sòlids, és a dir greixos sòlids com les mantegues. - Funcions dels triacilglicèrids: Principalment formen part de les substàncies de reserva de tots els animals perquè tenen dos gras avantatges: - No estan en solució en el citoplasma i per tant no tenen efecte en la pressió osmòtica. - Són molècules encara més reduïdes que els glúcids que estan una mica més oxidats, i per tant se’n pot treure més energia al poder-los oxidar més ja que estan més reduïts. Entre en 22 i el 26% de la massa del nostre cos és grassa i permet que puguem viure durant 60 dies sense menjar mentre que el glucogen del fetge dura com a molt un dia sense menjar. El NaOH hidrolitza l’enllaç éster i formem una sal d’àcid gras, és a dir, un sabó. - Ceres: Molècules resultants de la esterificació d’una molècula d’àcid gras amb un alcohol de cadena llarga. - Funcions de les ceres: Substància de reserva del plàncton. Impermeabilització d’estructures com fruits, plomes, etc. Lípids saponificables polars: Molècules molt amfipàtiques. Constituents de les membranes plasmàtiques de les cèl·lules. - Fosfoglicèrids: Molècula resultant de la esterificació d’una molècula de glicerol amb dos àcids grassos en els C1 i C2, mentre que en el C3 hi ha unit per un enllaç fosfoéster una molècula de fosfat que mitjançant un altre enllaç fosfoéster uneix una altra molècula provinent d’un alcohol (molècula carregada).
10
- Esfingolípids: Molècules que provenen de la esfingosina, que donen lloc a: Ceramides: per la unió al C2 de l’esfingosina per un enllaç amida un àcid gras. Esfingomielines: són el principal component de la mielina de les neurones. És una molècula de ceramida a la qual al C1 presenta unit un grup fosfat que presenta unit un cert alcohol per un enllaç fosfoéster. Cal destacar que tenen una estructura molt semblant a la d’un fosfolípid. Glucolípids: es troben a la part externa de la membrana Cerebròsid: sucre monosacàrid, com la galactosa (teixit cel·lular. Es caracteritza per una estructura formada a partir nerviós) i glucosa (teixit no nerviós). de ceramida amb un sucre en el C1. Segons el sucre: Gangliòsids: sucre oligosacàrid, aminosucres, àcids urònics o derivats d’aquests. Els glucolípids tenen una funció particular que és la de marcar les cèl·lules per permetre la coordinació cel·lular. Té la seva aplicació en els grups sanguinis, que venen determinats per la seqüència de sucres: A O N.A.GAL- GAL-N.A.GAL-GAL-GLUC GAL FRUC B
11
Terpens: Lípids constituïts per unitats d’isopropè acabades amb un motiu químic diferent. Lípids molt apolars. Funcions dels terpens: (Són molt diverses) Aromes de les plantes, Geraniol, Fitol (constituent de la clorofil·la). Pigments fotosintètics de les plantes, β-carotè. Constitueixen hormones vegetals, Giberel·lines. Transportadors electrònics, molècules capaces de reduir-se i oxidar-se i ser transportades llavors, Ubiquinona.
Vitamines A (retinol, visió), K (tocofenol, evita que els greixos s’oxidin ) i K (filoquinona, coagulació), són molècules que necessitem i que hem d’obtenir de l’ambient i llavors modificar-les per poder usar-les.
Esteroïds: Molècules derivades del ciclopentaperhidrefenantrè. - Esterols: tenen un grup hidroxil en el C3 i una cadena al·lifàtica en el C17, això fa que siguin components de la bicapa lipidica de les membranes cel·lulars, regulant la fluïdesa d’aquesta, en els animals és el colesterol en les plantes estigmasterol i el ergosterol.
- Àcids biliars: tenen un grup hidroxil en el C3 i en el C5 una cadena amb molts grups àcids, que dóna lloc a molècules amb una estructura molt amfipàtica que forma micel·les. Això permet emulsionar les grasses i que al separar-les permeten una major actuació de les lipases. - Hormones esteroidals: distingim entre dos grans grups Hormones sexuals Andrògens: determinen els caràcters sexuals masculins (testosterona). Estrògens: determinen els caràcters sexuals femenins (β-estradiol). Progestagens: regulen funcions de l’aparell reproductor femení (progesterona). Hormones de la càpsula suprarenal Neuronalcorticoids. Glucocorticoids. - Vitamina D: no necessiten precursor sinó que necessiten la llum ultraviolada per acabar de sintetitzar-les, aquesta vitamina permet capturar el calci. La malaltia per falta de vitamina D és el raquitisme.
12
Tema 5: Els aminoàcids i les proteïnes. Aminoàcids: classificació. L’enllaç peptídic. Característiques i propietats dels pèptids. Estructura secundària, terciària i quaternària. Proteïnes globulars i fibroses. Proteïnes integrals de membrana. Relació estructura i funció: mioglobina i hemoglobina. Els aminoàcids es diferencien per la cadena lateral Els diferents carbonis de l’aminoàcid es comencen a contar a partir del carboni carboxílic amb les següents lletres: α (1), β (2), γ (3), δ (4). A les proteïnes hi ha 20 aminoàcids diferents. Classificació: en f(x) de la polaritat de la R que determina la seva posició interior o exterior en la proteïna. R No polar: - R Alifàtica Alanina (ALA – A) té una cadena lateral constituïda per un grup metil. Valina (VAL – V) té una cadena lateral constituïda per un grup iso-propil. Leucina (LEU – L) té una cadena lateral constituïda per un grup iso-butil. Isoleucina (ILE – I) té una cadena lateral constituïda per un grup sec-butil. - R Aromàtica Fenilalanina (PHE – F) té en el carboni β de la alanina un anell aromàtic. Triptòfan (TRP – W) es caracteritza per ser el mes apolar del grup. - α-iminoàcid alifàtic Prolina (PRO – P) té una cadena lateral alifàtica que enllaça amb l’extrem N de l’aminoàcid. - Sense R Glicina (GLY – G) no té cadena lateral, hi ha un H. R Polar: - R Polar no carregada -OH Tirosina (TIR – Y) té R constituïda per un anell aromàtic però amb un hidroxil que li dóna polaritat. Serina (SER – S) Treonina (THR – T) -CONH2 Asparagina (ASN – N) Glutamina (GLN – Q) S Metionina (MET – M) té 1 éster tiol. Cisteïna (CYS – C) té 1 grup tiol i per oxidació poden donar un enllaç dipolar. Pot formar la cistina per unió de dos carbonis α a través d’un enllaç disulfur. Cα-CH2-S-S-CH2-Cα
- R Polar carregada - Tindran caràcter àcid en cedir el protó. Àcid aspàrtic (ASP – D) Àcid glutàmic (GLU – E) + Tindran caràcter bàsic al captar el protó. Lisina (LIS – K) Arginina (ARG – R). Té un grup guaminino. Histidina (HIS – H)
13
Propietats generals dels aminoàcids Son substàncies amfòteres, és a dir, tenen un caràcter àcid i bàsic + – alhora. En condicions fisiològiques trobem els grups COO i NH3 , en aquestes condicions se’ls anomena zwiterió que ve de l’alemany i vol dir que hi ha dos ions, el + i el -. El punt isoelèctric és aquell pH en que l’aminoàcid té una càrrega neutra de 0. Tots tenen un carboni α asimètric excepte la glicina. Per tant tenen isomeria òptica (D i L), en les proteïnes tots els aminoàcids són L. Els aminoàcids aromàtics absorbeixen la llum a 280 nm. L’enllaç peptídic És un enllaç amida substituït, és a dir, 1 amida enllaçada amb 1 carboni per la unió covalent pel grup amino d’un aminoàcid amb un grup carboxil d’un segon aminoàcid. És una estructura ressonant ja que va canviant. Aquesta propietat explica una mica el fet que hi hagi una distància d’enllaç amb l’oxigen inferior a la normal, una distància d’enllaç amb el nitrogen superior i angles propers als 120º. El tipus d’enllaç doble que s’hi dóna no permet la rotació i fa que tots els elements estiguin en un mateix pla. Aquestes propietats són molt importants en l’estructura de les proteïnes. Predomina la forma TRANS ja que les cadenes laterals podrien fer un impediment al·lostèric. Cada proteïna té una estructura tridimensional diferent. Aquesta és única per una proteïna en condicions fisiològiques, s’anomena estructura o conformació nativa, i és la que li permet fer la seva funció. L’estructura d’una proteïna ve determinada per la seqüència d’aminoàcids que la composen.
14
Nivells d’estructura proteica Primària: seqüència d’aminoàcids que composen una proteïna. Secundària: un segment d’aquesta seqüència que els seus residus han estat posats d’una manera regular i repetitiva. Supersecundària: diferents elements d’una estructura secundària es pleguen amb els altres. Domini estructural: quan una part de la proteïna es plegui independentment de la resta de proteïna. Terciària: tota la molècula d’aminoàcids units, és a dir, la proteïna. Quaternària: quan una proteïna està formada per diferents molècules.
- Primària Està formada per pèptids que són la unió d’aminoàcids. Un dipèptid, dos, un oligopèptid 15-20 i una cadena oligopeptídica per més de 20. cada aminoàcid que compon un pèptid s’anomena residu. En una proteïna hi ha una o varies cadenes polipeptídiques que tenen una funció determinada. Una cadena polipeptídica és el mateix que una proteïna, però si està formada per varies cadenes polipeptídiques cadascuna d’elles individualment no és una proteïna. Es forma un esquelet polipeptídic que és una estructura lineal amb un extrem aminoterminal (N-terminal) i un extrem carboxiterminal (C-terminal). És important la seqüència ja que AKE ≠ EKA tot i tenir la mateixa composició. - Secundària Està estabilitzada per ponts d’hidrogen que donen lloc als angles d’enllaç ψ i Ф constant en tots els carbonis. Tipus d’estructures: - Hèlix α: pren una configuració helicoidal normalment fent una volta dextrògira. A la part interior hi ha l’esquelet polipeptídic. De vegades són amfipàtiques i queden les parts polars a cada costat. Cada volta té 3,6 residus i una distància de 5,4 Å.
- Full plegat β o β laminar: té forma de zigazaga. Els ponts d’hidrogen no estan entre el mateix segment sinó que es troben entre ells. N’hi ha dos tipus les paral·leles en que els segments avancen en el mateix sentit i les antiparal·leles avancen en sentits contraris. S’estableixen ponts d’hidrogen intercalats entre els diferents segments i al estar més alineats s’estableixen més forts.
15
- Girs γ: 3 residus giren 180º. Els ponts d’hidrogen que s’estableixen sempre són entre el primer i el últim dels residus. - Girs β: 4 residus que giren 180º. Els ponts d’hidrogen que s’estableixen sempre són entre el primer i el últim dels residus. Hi ha dos tipus (I i II) que depenen de la disposició dels àtoms en el gir. R2 sol ser prolina en els de tipus I i R3 glicina en els de tipus II. Aquests girs β s’utilitzen per unir els segments de 2 fulls β antiparal·lels. És molt comú trobar residus de prolina fent enllaços X-PRO en configuració CIS.
- Plegament de l’estructura secundària (estructura supersecundària): Cadenes polipeptídiques irregulars: hi ha elements sense estructura secundària. α-rectes: elements de la cadena polipeptídica que contenen l’estructura secundària en forma de llaços. β-corbatura Patrons de plegament: - Bacterioferritina: feix hèlix α - α – hemolisina: barril β, usada pels bacteris per obrir un porus en la membrana dels eritròcits. - Plastocianina: cadira β - Piruvat quinasa barril αβ
- Terciària Aquesta estructura està estabilitzada per qualsevol tipus d’interacció no covalent com és el pont salí, pont
16
d’hidrogen, dipols, forces hidrofòbiques o de Van Der Waals. També s’hi troben enllaços disulfurs amb la cisteïna amb enllaços tiol oxidat. - Proteïnes fibroses: són exclusives dels animals i per tant no les trobem en bacteris ni en vegetals. Es disposen en forma de fibra i en comú tenen una estructura de la cadena polipeptídica molt regular. Tenen una funció estructural en les cèl·lules o en els teixits ja que són insolubles en aigua. Són resistents a l’alteració de la seva estructura (col·lagena, sedoïnes, α-queratines). L’α-queratina constitueix la capa externa de la pell, banyes, pèl, plomes i ungles. Té una estructura d’hèlix α menys en els extrems que no adopta cap forma definida. No té estructura quaternària. Està interaccionant amb 2 cadenes, formant una estructura helicoidal, una superhèlix levògira. Aquesta s’uneix a una altra superhèlix per formar un protofilament, l’estructura a partir de la qual es pot formar un filament. Quan s’ajunten molts formen una microfibrilla. Les interaccions principals són les de Van Der Waals, que es donen en grans quantitats perquè els residus de la queratina són hidrofòbics i per tant insolubles. Entre les diferents superhèlix també són importants els enllaços disulfur que depenen de la resistència que hagi de tenir la queratina segons la seva funció. - Proteïnes globulars: Fan moltes funcions, són molt solubles en aigua i tenen una forma arrodonida i compacte. L’interior i l’exterior de la proteïna són completament diferents ja que a l’exterior hi ha els residus polars i sobretot si tenen càrrega; mentre que a l’interior hi ha els residus apolars o poc polars. Les proteïnes més grans de 200 aminoàcids tenen dominis estructurals que són parts de la proteïna que es pleguen de manera independent de la esta de la proteïna. Cada domini té una funció . Un exemple molt clar de proteïnes amb dominis estructurals són les proteïnes de membrana (no són solubles). Que tenen dos parts o regions, les extramembranals que tenen totes les propietats de les proteïnes globulars, la regió intermembranal es troba en un entorn apolar i per tant els extrems apolars es troben cap a l’exterior són apolars. Tenen un esquelet polipeptídic regular, no tenen una estructura compacte ja que formen un porus intern per al pas de molècules, per tant quan tenim l’interior de la proteïna buit allí s’hi troben també tots els residus polars recobrint-lo. - Cuaternària: Està formada per més d’una cadena polipeptídica anomenada oligòmers, cada cadena està formada per protòmers o subunitats formant tetràmers, pentàmers... segons el nombre d’unitats que la composin. Estabilitza l’estructura per enllaços no covalents i enllaços disulfur, són molt importants les forces inter i intra moleculars entre les subunitats. Els oligòmers poden tenir diferents simetries, la més usual és la circular, amb un eix de simetria al mateix pla. Helicoidal, al voltant d’un eix vertical. Icosahèdrica, formant pentàgons i hexàgons com en una pilota.
Dímer Les avantatges entre els dímers i els dominis específics, és que si es degrada una part del dímer només cal canviar la part malmesa mentre que en els dominis específics cal tornar a sintetitzar tota la proteïna. També tenen l’avantatge que permeten regular l’activitat de la proteïna. Exemple de la Mioglobina: La mioglobina (Mg) és una proteïna de reserva d’oxigen de la cèl·lula. És especialment abundant a les cèl·lules musculars. Està totalment formada per hèlix α. Té una proteïna conjugada, que li permet unir per un enllaç covalent una molècula orgànica, anomenada grup prostètic, en aquest és el grup Hemo. Aquest grup Hemo és un derivat d’un anell tetrapirròlic, aquesta és una estructura molt plena de dobles enllaços, en el centre dels quals 2+ hi ha un àtom de Fe que li permet fer un anell de coordinació, és a dir quatre enllaços amb l’anell, un amb la mioglobina per una aminoàcid de histidina i un amb un àtom d’oxigen. Al oxidar-se a 3+ Fe no agafa oxigen i per tant l’interior de la proteïna es troba en un entorn hidrofòbic.
17
MgO 2 ↔ Mg + O 2
[Mg ][. O 2 ] ⇒ [MgO ] = [Mg ].PO 2 2 Kd [MgO 2 ] [MgO 2 ] = llocs .unió.ocupats = [MgO 2 ] + [Mg ] llocs .unió.totals
Kd = Y
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− PO 2 PO 2 [Mg ].PO 2 PO 2 Kd Kd = Kd = = Y = [Mg ].PO 2 + [Mg ] PO 2 + 1 PO 2 + Kd PO 2 + Kd Kd Kd Kd Kd Exemple de la Hemoglobina: La hemoglobina (He) és una proteïna globular, que es troba en els glòbuls vermells i transporta l’oxigen des dels pulmons fins als teixits. És una proteïna tetràmera, és a dir poligomèrica. Esta constituïda per dos unitats α i dos β disposades en diagonal. Té una estructura molt semblant a la de la mioglobina. Podem trobarla en dos formes: la T (tensa) en la que té molt baixa afinitat per l’oxigen, i es troba amb el grup Hemo desoxigenat. L’altra forma és la forma R (relaxada) en la que té una alta afinitat per l’oxigen. En la forma T no hi ha les mateixes interaccions no covalents que en R i per tant les conformacions són diferents. Quan la forma T s’oxigena fa que hi hagi canvis en la resta de cadenes polipeptídiques que fan que augmentin la seva afinitat per l’oxigen fent que també s’oxigenin. Aquest és un factor d’al·losterisme ja que aquest consisteix en el fenomen pel qual la unió d’una molècula (factor al·lostèric) a una proteïna, modula l’activitat d’aquesta. Canvi conformacional He al uniu-se a l’O2
Kd (constant de dissociació de l’oxigen de la mioglobina), Y (fracció de dissociació, la fracció de mioglobina que està ocupada sobre en total de mioglobina). Aquest desenvolupament permet veure com al disminuir la pressió parcial d’oxigen al múscul a causa d’un esforç físic, la mioglobina perd afinitat per l’oxigen de manera logarítmica, permetent que sigui utilitzat per la cèl·lula. Mentre que quan la pressió parcial d’oxigen torna a recuperar valors alts, propis de l’estat de repòs; la mioglobina torna a estar totalment associada amb l’oxigen. Comparació estructura Mg amb un monòmer de He
2,3 - bifosfoglicerat
Altres efectors al·lostèrics de la hemoglobina: - El pH (Efecte Bohr), canvia les interaccions no covalents la conformació. pH baix estabilitza la forma de ↓ afinitat per l’O2 (T); i pH alt estabilitza la d’ ↑ afinitat per l’O2 (R). - L’hemoglobina també transporta diòxid de carboni. Quan l’extrem N-terminal reacciona amb el diòxid de carboni formant un enllaç amida per una reacció de carbaminació, que suposa un canvi conformacional. Aquest canvi de conformació suposa un augment d’afinitat per l’oxigen de la forma R i una pèrdua d’afinitat per l’oxigen de la forma T. R − NH
+ 3
+ CO
2
↔ R − NH − COO
−
+ 2H
+
- El 2,3-bifosfoglicerat es produeix en els glòbuls vermells i es posa en la cavitat de la He estabilitzant la forma de ↓ afinitat (T). S’aconsegueix que s’alliberi més oxigen als teixits tot i no agafar-ne tant als pulmons. L’hemoglobina fetal té 2α i 2γ, que no s’uneixen al BPG i per tant pot captar millor l’oxigen de la mare
18
- Plegament proteic: El plegament proteic es el que a partir d’una seqüència d’aminoàcids fa que hi hagi una certa funció. Seqüència Estructura Funció La força hidrofòbica dirigeix el plegament d’una cadena desplegada a plegada. La cadena d’aminoàcids té parts hidrofòbiques i parts hidròfiles, aquestes per un procés de nucleació es disposen de tal manera que els residus hidrofòbics quedin amagats de l’aigua, en aquest moments doncs ja s’ha reduït bastant el nombre de les possibles conformacions. Aquest pas és de vital importància ja que una proteïna de 110 residus que per aquest procés tarda 110 un minut a formar-se, altrament s’haurien de provar les 3 possibles conformacions de cada residu, un total de 3 -13 39 combinacions, si tenim es provessin a una cada 10 segons, tardaria 3.10 anys!! El següent pas, és llavors, el de formar les interaccions internes. - Desnaturalització Si alterem l’estructura suficientment, aquesta perd la seva funció, llavors diem que ha estat desnaturalitzada. En aquesta s’alteren les interaccions no covalents, no el enllaços peptídics de la seqüència d’aminoàcids. Calor: fa vibrar la molècula i que llavors es perdin les interaccions. pH: pot canviar completament l’estructura. Agents desnaturalitzants: Agents químics: com alcohols orgànics, urea i detergents. Pressió Classificació dels tipus de Reversible: quan traiem l’agent desnaturalitzant podem recuperar l’estructura. desnaturalització: Irreversible: quan traiem l’agent desnaturalitzant no podem recuperar l’estructura. Estructural: les α-queratines. Reserva: la mioglobina (reserva d’oxigen) o l’albúmina. Transport: la hemoglobina (oxigen entre teixits), proteïnes integrals de membrana (dins les cèl·lules). Funcions que poden fer Moviment: actina i miosina (múscul, flagels). les proteïnes: Defensa: moltes toxines de les plantes són proteïnes, al igual com els anticossos que es mengen els cossos foranis. (immunoglobulines, γ-globulines). Regulació: hormones (no totes són proteïnes), com la insulina (pèptid). Catalítica: els enzims.
19
Tema 6: Enzims i cinètica enzimàtica Enzims, naturalesa i funció. Classificació i nomenclatura dels enzims. Cinètica enzimàtica. Equació de Michaelis-Menten i les seves transformacions matemàtiques. Cofactors i vitamines. Els enzims són biomolècules que fa la funció de catalitzador ( molècula que augmenta la velocitat de reacció sense alterar-ne l’equilibri). Els enzims són proteïnes globulars, encara que un petit grup estan constituïts per RNA, els Ribozims. Si estan units covalentment, s’anomena grup prostètic. Poden estar constituïts per altres elements no proteics: Si no està unit covalentment, s’anomena cofactor. Ions metàl·lics (redox hidròlisi) solen ser oligoelements. Aquests elements no proteics poden ser: Coenzims (redox del metabolisme, reaccions de transferència de grups) molts són vitamines hidrosolubles. Els enzims que no tenen grup prostètic ni cofactor s’anomenen, Apoenzims. Els enzims que tenen grup prostètic i cofactors s’anomenen, Holoenzims. De vegades després de la reacció cal canviar el cofactor o grup prostètic. Co.Usat / Co. per .Usar Apoenzim ← → Holoenzim
Els enzims es classifiquen segons la funció que catalitzen: Família de les oxidoreductases Catalitzen reaccions de tipus redox. Família de les transferases Catalitzen reaccions de transferència de grups funcionals. Família de les hidrolases Catalitzen reaccions d’hidròlisi. Catalitzen reaccions d’addició de grups a una molècula units per dobles enllaços. Família de les liases
R − CH = CH − R '+ X Liasa → R − CH 2 − CHX − R '
Família de les isomerases Catalitzen reaccions d’isomerització. Família de les lligases Catalitzen reaccions d’unió de molècules. En general tot són funcions de transferència de grups funcionals, molècules, electrons ... Per tal que un enzim pugui catalitzar una reacció cal que s’uneixi físicament al seu substrat. La unió es dóna per una certa zona de l’enzim, que sol ser una cavitat que s’anomena Centre Actiu. Els grups funcionals que estan implicats en la fixació del substrat a l’enzim per interaccions no covalents, s’anomenen centre de fixació del substrat. Els grups funcionals implicats en la catàlisi, s’anomenen centre catalític. La base de l’especificitat es perquè el substrat es pugui unir a l’enzim. Ha de ser capaç d’encaixar a la cavitat del centre actiu, complementarietat geomètrica; i també ha de tenir els grups funcionals necessaris per establir els enllaços no covalents per fixar-s’hi, complementarietat electrònica. Hi ha hagut diversos models de fixació, el model de “Clau-Pany” (E. Fisher) que proposa que la complementarietat havia de ser absoluta per tal de encaixar-s’hi. El posterior model de “L’encaix induït” de Koshland proposa que un cop s’han unit aquests es deformen per ajuntar al màxim possible les seves interaccions no covalents.
El mecanisme per augmentar la velocitat de reacció que fan servir els enzims: ∆Gº’ és la constant en bioquímica. L’estat de transició té molta més energia lliure. L’energia lliure que cal per arribar a l’estat de transició s’anomena energia ++ d’activació (∆G ), a aquest estat s’hi pot arribar subministrant energia. Els enzims el que fan es reduir l’energia d’activació i per tant faciliten la reacció.
20
[P] = [S ] = 1M T = 298º K P = 1atm
∆G (0) = ∆G º '+ R.T . ln
∆G º ' = − R.T . ln
[H 2O] = 55'5M
[H ] ⇒ pH = 7 +
[P] [S ]
Les biomolècules són molècules metaestables ja que es caracteritzen per ser termodinàmicament inestables ja que són molt reduïdes i cinèticament estables ja que tenen una velocitat de reacció molt lenta ( ∆G ++ molt alta). Com es redueix l’energia d’activació? 1.- La deformació de l’enzim sobre el substrat és molt semblant a la forma del substrat en l’estat de transició. 2.- Grups funcionals de l’enzim intervenen directament en la reacció facilitant que aquesta tingui lloc per mitja de la + donació i l’acceptació de H , o la captació o cessió de e per part d’un metall i que es recuperen al final de la reacció. Cinètica enzimàtica: estudi de la velocitat de reacció d’una catàlisi. En enzimologia es mesura la velocitat en els primers moments de la reacció, d [P ] − d [S ] V = S ↔ P = és la velocitat inicial (Vo). Això es pot considerar ja que al principi no es dt dt dóna la reacció inversa, també perquè hi ha tant poques molècules de V = K .[S ]( ordre 1) substrat que han passat a producte que es pot considerar que la K 1 / K −1 K2 E + S ← E+P → ES → concentració de substrat s’ha mantingut constant. Si en un experiment posem diferents concentracions de substrat durant el mateix temps a un Vo = K 2 .[ES ] concentració d’enzim determinada, podrem observar com en la gràfica de però .si .[S ] >>> [ES ] = [ET ] formació de producte per unitat de temps, el pendent de la corba (Vo), Vo = V max = K 2 .[ET ] augmenta en funció de l’augment de concentració de substrat. La velocitat − − − − − − − − − − − − − − − − − − − màxima de la reacció és aquella que hi hauria si disposéssim d’infinit substrat, i l’asímptota del gràfic respon a la saturació de l’enzim. La reacció K2 V max = K 2 .[Eo ] ES → E+P del pas del complex enzim-substrat a enzim i producte considerem que en K 2 + K −1 K −1 els primers moments de la reacció no es dóna i per tant no té una K-2 KM = ≈ = Kd K1 K1 associada. Cal destacar també que K2 és sempre la constant més petita i per tant dóna la velocitat més petita que determina la global del procés. La [E ][. S ] Kd = constant de dissociació (Kd), si aquesta és grans ens indica que l’enzim té [ES ] poca afinitat pel substrat, mentre que si és petit en té molta. La KM és la 1 V max .[S ] concertació de substrat inicial que hi ha d’haver perquè Vo sigui la meitat de Si Vo = .V max = 2 K M + [S ] Vmax. Les constants catalítiques són KM i Vmax que ve determinada per una quantitat d’enzim constant. Els enzims que segueixen aquest patró [S ] + K M = 2[S ] ⇒ K M = [S ] s’anomenen Michaelians. Transformacions de l’equació de Michaelis – Menten: Linealització de Lineweaver – Burk:
Vo =
1 V max .[S ] KM [S ] ⇒ = + K M + [S ] Vo V max .[S ] V max .[S ]
1 KM 1 1 = + . Vo V max [S ] V max y = B.x + A Linealització de Eadie – Hofstee:
Vo.[S ] + Vo.K M = V max .[S ]
Vo.K M = (V max − Vo).[S ] Vo = V max − Vo [S ] Vo Vo = − K M + V max [S ] y = − B.x + A KM .
21
22
Cinética de Michaelis - Menten. Las reacciones enzimáticas se caracterizan porque aunque se aumente la concentración de sustrato la velocidad no aumenta linealmente, aparece un efecto de saturación. La saturación se debe a que todos los centros activos están ocupados. La velocidad depende de la cantidad de enzima con sustrato suficiente. Consideraremos sólo la velocidad inicial de las reacciones para cada concentración de sustrato cuando se construya una gráfica, evitando el error introducido por el deterioro del enzima. Como en el primer momento no hay producto no consideraremos la reacción contraria. La velocidad depende de una constante de velocidad K y de su inversa: K1 K2 E + S ↔ ES ↔ E + P K-1 K-2 El paso limitante en la velocidad es K2, por lo tanto la expresión de la velocidad será: v = K2.[S] Donde K2 también recibe el nombre de K CAT. La concentración de enzima será mucho menor que la de sustrato porque no se consume. Los enzimas que siguen esta cinética se dice que siguen la cinética de Michaelis - Menten. Al aumentar la concentración de enzima la gráfica es igual pero por arriba. Ecuación de velocidad de Michaelis - Menten. La concentración de sustrato libre será prácticamente la concentración inicial porque la cantidad de enzima es muy pequeña. Haremos las siguientes consideraciones: - S0 = [S] + [SE] donde [SE] puede despreciarse. - ET = [E] + [ES] - [E] ≠ ET - La velocidad de transformación de sustrato en producto está limitada por K2 v0 = K CAT*[ES] - Hipótesis del estado estacionario: como la concentración de enzima es muy pequeña y la concentración de sustrato muy grande en el primer momento se llega a una concentración de complejo enzima - sustrato que es constante para toda la reacción. - El enzima siempre tiene moléculas de sustrato en su centro activo de manera que la concentración de enzima - sustrato será prácticamente constante por lo que : velocidad de formación = velocidad de descomposición K1.[E].[ES] = K-1.[ES] + K CAT.[ES] [ES.(K + K CAT)]
A la relación entre constantes se le denomina constante de Michaelis - Menten:
En lugar de ponerlo en función de enzima libre lo ponemos en función de complejo enzima - sustrato:
KM.[ES] = [E] - [S] - [ES].[S] ⇒ [ES](KM + [S]) = [E] + [S]
Esto es válido para cuando todo el enzima esté formando complejo enzima - sustrato y si el enzima sigue la cinética de Michaelis - Menten.
- Si la concentración de sustrato es muy pequeña podemos despreciarla en el denominador.
23
La velocidad crece proporcionalmente a la concentración de sustrato , es de orden 1 respecto a el sustrato. - Si la concentración de sustrato es grande, Km es despreciable: V = v0 La velocidad es independiente respecto a la concentración de sustrato. Es lo que ocurre en el tramo final de la gráfica que tiende asintóticamente a V. Es la ecuación de una hipérbola. El enzima presenta saturación de velocidad respecto a la concentración de sustrato. El enzima no seguirá la cinética de Michaelis - Menten si tiene cooperatividad en la unión del sustrato por lo que la curva será sigmoidea. La V será igual y la saturación dependerá e la concentración de enzima. La saturación se alcanza para determinada concentración de enzima, si la concentración de enzima es el doble la velocidad será el doble. La velocidad y ν son dos formas de expresar la actividad de una proteína. Significado de los parámetros. Km: Relación entre las constantes cinéticas. Caracteriza la interacción del enzima con su sustrato, aunque no -1 -7 depende de sus concentraciones. El valor fisiológico de Km va desde 10 hasta 10 M. Tiene unidades de concentración. Se puede calcular gráficamente su valor:
Km tiene el mismo valor que la concentración de sustrato. Se suele relacionar con otras constantes: - Si Kcat es mucho más pequeña que K-1, Kcat es despreciable en el numerador:
Por lo tanto Km es una medida inversa de la afinidad del enzima por el sustrato. Al aumentar K m, K afinidad baja. K cat: constante catalítica. Es la capacidad del enzima para llevar a cabo la transformación. Recibe también el nombre de número de recambios, cantidad máxima de moléculas transformadas por unidad de tiempo (sustrato, producto) por molécula de enzima o por número de sitios activos. Siempre en condiciones de saturación de manera -1 que la cantidad de sustrato no sea limitante. Se mide en s . El número de recambios se calcula fácilmente:
K CAT / KM : establecer eficacia catalítica del enzima. En las células para enzimas de Michaelis - Menten la concentración de sustrato es mucho más pequeña que Km, como mucho son iguales. Si la concentración de sustrato es mucho menor la velocidad cambia mucho para intervalos de concentración de sustrato pequeños. Podemos despreciar en el denominador:
donde K CAT / KM es la constante de un proceso que depende de las concentraciones de enzima y sustrato (es como si fuera su constante de velocidad). Tiene un límite superior en K1. Ello significa que la reacción más rápida depende de K1 y ésta de la unión de enzima y sustrato. Los enzimas con cinética más rápida son los de difusión de enzima - sustrato más alta, que es la rapidez con la que el sustrato llega al sitio activo. Cada vez que un sustrato llega a un sitio se transforma, por lo que la velocidad depende de lo rápido que llega el sustrato al sitio.
Por ello K CAT = ∞. Para el enzima más rápido la velocidad depende sólo de K1. Los enzimas con más rápidos posible y se dice que han alcanzado la perfección cinética.
24
Kcat
/Km = K1 son los
Kcat
Kcat
/Km es el criterio de especificidad (grado de discriminación) que no depende de Km sino de /Km que permite distinguir entre dos sustratos con los que puede actuar. E + A ⌠EA ◊ P VA E + B ⌠ EB ◊ p VB VA Si el enzima es más específico por A entonces VA >VB, /VB > 1 prefiere A.. Si se ponen en concentraciones iguales siendo la concentración de enzima constante:
Cálculo gráfico.
Transformamos la ecuación en la de los dobles inversos con lo que sale la ecuación de una recta, calculando sólo algunos puntos se puede obtener:
Inhibición. El efecto de un inhibidor es disminuir o bloquear la velocidad de una reacción catalizada uniéndose al enzima. La mayor parte de los enzimas están afectados. Son específicos, cualquier sustancia no sirve para unir cualquier enzima. Se alteran grupos importantes para la función catalítica o se altera ligeramente la conformación (con lo que la proteína ya no es activa) sin llegar a desnaturalizarlo. Los inhibidores sirven para distinguir los grupos esenciales. Inhibición permanente: unión del inhibidor irreversible por medio de enlaces covalentes provocando una modificación química de los grupos catalíticos. Una vez modificado el enzima está siempre inhibido. Para distinguirlo de los reversible se someten a diálisis y si no se separan enzima e inhibidor es permanente. Ejemplo: el iodoacetato reconoce grupos SH y OH y envenena la cisteína.
Inhibición reversible: la unión del inhibidor y el enzima es reversible. Al quitar el inhibidor del medio se recupera la actividad. Hay varios tipos: - Competitiva: inhibidor y sustrato compiten por unirse al enzima en el mismo sitio de manera que no se unen a la vez.
25
Para eliminar el inhibidor (y aumentar la velocidad) aumentamos la concentración de sustrato y lo desplazamos. La V no se verá afectada porque V = K CAT [ET] aunque necesitaremos concentración de sustrato más alta que en ausencia de inhibidor. Cinéticamente se puede distinguir el tipo de inhibidor. Km determina la afinidad del enzima por el sustrato (concentración de enzima y velocidad constantes). Un inhibidor competitivo es como si bajara la afinidad 2 y Km será mayor. La Km con inhibidor será Km x () donde () depende de: - Concentración de inhibidor: influye positivamente (+inhibidor, +Km). - KI: gobierna la unión de inhibidor y enzima. Como está escrita en el sentido de la disociación cuanto más aumente KI menor será Km.
Haciendo la gráfica de doble inverso se averigua si el inhibidor es competitivo:
La recta tendrá la misma V pero la pendiente será más grande porque Km es mayor, cortará en el mismo punto de ordenadas. Al aumentar la concentración de inhibidor la Km sube y se origina una familia de rectas que cortan a las ordenadas en el mismo punto y tienen la pendiente más grande. Un inhibidor competitivo ha de cumplir un requisito: ser parecido al sustrato estructuralmente porque se acopla al mismo sitio activo. El succinato deshidrogenasa cataliza la reacción redox del succinato:
Dos inhibidores competitivos del succinato deshidrogenasa: - Oxalacetato: COO - CO - CH3 - COO - Malonato: COO - CH2 - COO - Inhibición acompetitiva: el inhibidor sólo se une al complejo enzima - sustrato, que ya no formará producto, por lo que la velocidad bajará. El inhibidor no se une al centro activo sino a cualquier otro sitio, lo que hace que cambie la conformación y el enzima ya no es tan efectivo.
I
No se puede superar la inhibición aumentando la concentración de sustrato. La V con inhibidor (V ) será más pequeña.
La Km será más pequeña, como si tuviera más afinidad: El resultado es una recta nueva que corta en un valor más grande de ordenadas y con pendiente igual. Si aumentamos la concentración de inhibidor obtenemos una familia de rectas con pendiente igual y corte en ordenadas más grande.
26
Inhibición mixta: intermedia entre acompetitiva y competitiva. El inhibidor (que no tiene porqué parecerse al sustrato) no se une al centro activo aunque tiene efecto de competitivo. La unión de uno y otro no son excluyentes. El resultado final depende de cual de los dos prevalezca.
Competitiva.
Km sube
Acompetitiva. V no afectada
Km baja
Competitiva + Acompetitiva.
El valor del punto de corte en ordenadas depende del efecto que prevalezca. I - Inhibición no competitiva: si KI = K’I el inhibidor se une por igual al enzima que al complejo enzima - sustrato y K m = K m. El punto de corte en abcisas es igual con inhibidor que sin él. En ordenadas es más grande por lo que V baja. Si K m se mantiene igual y V baja la pendiente aumenta. E+S⇔
ES ⇔
E+P
↓KI
↓K II
EI ⇔
ESI
I
V
I
K
m
Km ↔
27
El punto de corte con las abcisas da prueba de la importancia de relativa del efecto competitivo o acompetitivo para que lo corte por encima o por debajo. - Inhibición no competitiva: cuando KI = K’I. En este caso da igual unirse al enzima que al complejo enzima sustrato, aunque no se transformará igual de bien porque V es diferente. Cuanto más se parezca el inhibidor al estado de transición del sustrato más eficaz será el inhibidor. Son inhibidores muy potentes de la actividad catalítica del enzima.
Efecto del pH y de la temperatura sobre la actividad enzimática. Efecto del pH: afecta al estado de disociación de los grupos, aunque todas las proteínas no se ven afectadas de igual forma porque algunas no tienen grupos disociables. La mayor parte de los enzimas tienen un pH óptimo. Si hay pequeños cambios de pH no se desnaturaliza el enzima. El pH puede afectar de dos maneras: - La unión del sustrato es mejor o peor que antes. - Que afecte a la velocidad catalítica de la reacción. M mol La velocidad enzimática se mide en /t y la actividad enzimática en /t, y la unidad internacional µmol/min, cantidad de enzima que transforma un micromol de sustrato en producto en un minuto en condiciones óptimas. Otra unidad es mol la cantidad enzimática que se requiere para transformar 1 /s y se la llama katal. - Efecto de la temperatura: cuando la temperatura sube la velocidad de reacción aumenta. Existe una temperatura máxima a la cual la proteína se desnaturaliza dejando de ser funcional. La mayor parte de los enzimas se desnaturalizan a unos 50ºC. La ribonucleasa se desnaturaliza a temperaturas superiores a los 70ºC.
28
Tema 7: Regulació de l'activitat enzimàtica Efectors bàsics, pH i temperatura. Tipus d'inhibició enzimàtica i la seva anàlisi gràfica. Mecanismes de regulació de l'activitat enzimàtica. Sistema de regulació dels enzims: - El pH determina la funció d‘una proteïna a dos nivells. Un és aquell en que el pH fa que l’enzim es desnaturalitzi; i l’altre es que provoqui alguns canvis lleus en el centre actiu que tant poden ser alteracions en el centre de fixació com el centre catalític que fan que l’enzim deixi de ser actiu. El pH de màxima activitat s’anomena pH òptim. - La temperatura actua com a catalitzador fent vibrar la molècula i ajudant-la a assolir l’estat de transició a 55-60 ºC, però quan hi ha la presència d’enzims aquests es desnaturalitzen en perdre l’estructura pròpia. - Els inhibidors són molècules que quan s’uneixen als enzims, els inactiven fent-los perdre la seva activitat catalítica. Aquests inhibidors poden ser de dos tipus segons com s’uneixin als enzims: + Irreversibles: mitjançant la unió covalent que modifica covalentment a l’enzim modificant-li en centre actiu. Per exemple: el gas sarin modifica l’acetilcolinesterasa o la penicil·lina inhibeix la formació dels proteoglicans. + Reversibles: són aquells que mitjançant una unió no covalent s’uneixen a l’enzim donant lloc a un complex inactiu. Alguns s’uneixen al complex enzim substrat. En ambdós casos els inactiva. La constant KI és la mesura de l’afinitat de l’inhibidor per l’enzim. Hi ha dos tipus d’inhibició competitiva i no competitiva. La inhibició competitiva es aquella en que l’inhibidor s’uneix al centre actiu d’un enzim. Hi ha competència entre l’inhibidor i el substrat per associar-se amb l’enzim. L’inhibidor només es pot unir a l’enzim primari.
Vo =
V max .[S ] [S ] + K M aparent
[Eo] = [E ] + [EI ] + [ES ] [Eo] = [E ] + [ES ] + [E ][. I ]
Ki [Eo] = [ES ] + [E ].1 + [I ] Ki
[I ] K M .ap = K M .1 + Ki V max .[S ] Vo = [S ] + K M .1 + [I ] Ki
La inhibició no competitiva es aquella en que l’inhibidor s’uniex a l’enzim per un lloc diferent al centre actiu, i per tant no afecta la unió de l’enzim al substrat. Afecta la catalisi. Ki és igual tant si l’enzim esta unit al substrat com si no, ja que no es veu afectada la seva unió. No afecta a Km perquè no afecta la afinitat de l’enzim pel substrat al no tapar el centre actiu. Només afecta a la velocitat màxima
Vo =
V max aparent.[S ] [S ] + K M
[Eo] = [E ] + [ES ] + [EI ] + [EIS ] [E ][. I ] Ki = [EI ] [Eo] = [E ] + [ES ] + [E ][. I ] + [ES ][. I ] Ki
Ki [Eo] = [E ].1 + [I ] + ES .1 + [I ] Ki Ki ] [E ] = [Eo 1 + [I ] Ki V max [S ]. [I ] 1+ Ki Vo = [S ] + K M
29
Alguns inhibidors afecten a la velocitat màxima i la afinitat de l’enzim pel substrat, es tracta d’inhibició mixta. Sistema de control del enzims: Per la quantitat d’enzim present. Serveix per controlar l’enzim a llarg termini. Això es pot aconseguir de dos maneres diferents com són el control de la síntesi d’aquests enzims (DNARNAProt(Enz)), fent que el gen que codifica per l’enzim no es transcrigui, la forma més econòmica; o bé transcrivint el gen però sense traduir-lo. Aquest es el cas de la β-galactosidasa que només es sintetitza quan cal degradar galactosa. Aquests mecanismes només serveixen per aquells enzim que s’utilitzen rarament a diferència dels usats freqüentment (“House Keeping”). L’altre mecanisme de control de la quantitat d’enzim present a la cèl·lula consisteix en regular la degradació. Quan més clau és un enzim, té una vida mitja més curta, fent que un procés clau s’aturi quan cal. Per la activitat de l’enzim present. - Els isozims (isoenzims) són enzims que catalitzen una mateixa reacció però que tenen constants catalítiques diferents (Km, Vmax); i es sintetitzen en teixits diferents. Aquest és el cas de la reacció de fosforilació de la glucosa a glucosa 6-fosfat, que en el múscul es fa servir un enzim anomenat hexoquinasa (Km=0,1mM) i serveix per obtenir energia, mentre que en el fetge trobem la glucoquinasa (Km=10nM) que serveix per regular la concentració de glucosa a través de la reserva de glicògen. Això fa que en situació normal la glucosa la capti principalment el múscul, però si la concentració de glucosa en sang augmenta després de menjar llavors el fetge la capta molt més per regular la concentració en sang. En canvi quan fem esport la concentració en sang baixa afavorint que la que hi ha l’agafi principalment el múscul. - La disponibilitat de substrat. * Fent que les cèl·lules mantinguin la concentració de substrat al voltant de Km, aconseguint així que les petites variacions de concentració no afectin la activitat de l’enzim. * També per la compartimentació de la cèl·lula hi ha la possibilitat de posar en contacte o no l’enzim amb el substrat. *Els complexes multienzimàtics que són agrupacions d’enzims que realitzen reaccions encadenades o acoblades on el producte de l’activitat catalítica d’un enzim és el substrat del següent. Aquest sistema permet que hi hagi una elevada concentració de cadascun dels substrats. *Els enzims al·lostèrics són enzims que canvien la seva activitat quan a ells s’uneix una molècula. Tenen estructura quaternària i per tant el que passa a una unitat li afecta a la resta. Hi ha dos tipus d’enzims al·lostèrics, aquells que l’efector al·lostèric és el propi substrat, anomenats homotròpics; aquells que l’efector al·lostèric és diferent del substrat, s’anomenen hetetròpics. * La modificació és la unió covalent al centre actiu augmentant (positius +) o disminuint (negatius -) l’activitat de l’enzim. La majoria també són homotròpics. - Hi ha mecanismes reversibles de regulació dels enzims com són les fosforilacions:
quinases / fosfatases R − OH + HPO42 − ← → R − O − PO32 −
Aquestes fosforilacions fan que s’afegeixin càrregues negatives que fan que canviïn les interaccions no covalents de l’enzim fent que li canviï l’estructura activant-lo o desactivant-lo. La adenilació i la metialció són també altres mecanismes que al igual que la fosforilació regulen l’activitat de l’enzim de manera reversible. - Hi ha mecanismes irreversibles que regulen l’activitat de l’enzim a partir del trencament de la cadena polipeptídica. L’enzim es pot trobar en forma de proenzim que és inactiu i que té una part de la cadena polipetídica que sobra que li tapa el centre actiu impedint la unió amb el substrat. Per això quan hi ha el trencament l’enzim s’activa. Aquest és el cas de factors de coagulació o proteasses digestives. Efecte del pH sobre l’activitat enzimàtica: Efecte de la temperatura sobre l’activitat enzimàtica:
30
