BIOSINTESIS DE AMINOÁCIDOS EN ESCHERICHIA COLI
E.A.P. Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú
Resumen Se tiene conocimiento de que todos los aminoácidos provienen de intermediarios, del ciclo del acido cítrico o de la vía de las pentosas fosfato, sobre esta base se realizo el siguiente trabajo. Los distintos organismos presentan considerables diferencias en su capacidad para sintetizar los 20 aminoácidos estándar. Mientras que la mayor parte de bacterias y plantas pueden sintetizar los 20 aminoácidos, los mamíferos solo pueden sintetizar la mitad, generalmente aquellos cuyas vías metabólicas son sencillas, estos son los denominados aminoácidos no esenciales, que no son necesarios obtenerlos en la dieta, ya que el organismo con simples reacciones puede sintetizarlos. El resto, los aminoácidos esenciales, deben obtenerse de la dieta. Existen Palabras clave: Aminoácidos,
microorganismos como E. Coli que puede fabricarse sus propios aminoácidos a partir de amoniaco. En el presente informe se presentan las vías de la biosíntesis de aminoácidos, en un cultivo de E. Coli; a la cual se le añadió glucosa marcada con 14C y un sustrato carbonado o aminoácidos no radioactivos, en donde se demuestra la radioactividad de estos compuestos sobre los aminoácidos. Con este trabajo deducimos que los aminoácidos competidores son precursores de la biosíntesis de otros aminoácidos (los aminoácidos no esenciales), que por procesos de transaminación y aminación reductiva de los intermediarios del ciclo de Krebs y el piruvato. Así obtuvimos 3 familias: Familia del Ácido Aspártico, Familia de Ácido Glutámico y Familia de la Serina.
transaminación, intermediarios, radiactividad.
Abstract It is known that all amino acids come from intermediaries, citric acid cycle or the pentose phosphate pathway, on this basis took place the next job. Individual agencies have considerable differences in their ability to synthesize the 20 standard amino acids. While the majority of bacteria and plants can synthesize the 20 amino acids, mammals can synthesize only half, generally those whose metabolic pathways are simple, they are called non-essential amino acids, which are not required to obtain them in the diet, since the organism can synthesize simple reactions. The remainder, essential amino acids, be obtained from the diet. There are microorganisms such as E. Coli can be manufactured Keywords: Amino
their own amino acids from ammonia. This report presents the pathways of biosynthesis of amino acids in a culture of E. Coli, to which glucose was added 14C and a carbon substrate or nonradioactive amino acids, where it shows the radioactivity of these compounds on the amino acids. With this work we conclude that amino acids are precursors competitors for the biosynthesis of other amino acids (nonessential amino acids), which processes transamination and reductive amination of the Krebs cycle intermediates and pyruvate. So we got 3 families: Family of Aspartic Acid, Glutamic Acid Family and Family of Serine.
acids, transamination, brokers, radioactivity.
Introducción La síntesis de aminoácidos se desarrolla a un ritmo variable, dependiente de las necesidades que existan que existan en la célula respecto a cada aminoácido en particular. En los mamíferos existen rutas anabólicas para los aminoácidos considerados como esenciales (Alanina, Arginina, Asparragina, Aspartato, Cisteina, Glutamato, Glutamina, Glicina, Prolina, Serina, Tirosina)
Los 20 aminoácidos estándar(o proteinogénicos) se dividen en 5 familias en relación a su biosíntesis. Los miembros de cada familia derivan a partir de precursores comunes generados en el ciclo de Krebs, en la glicólisis o en la vía de las pentosas fosfato. Los aminoácidos glucogénicos son los que dan lugar a una producción neta de piruvato o intermediarios del Ciclo del TCA, tales como α-cetoglutarato u oxaloacetato, que son precursores de la
glucosa vía gluconeogénesis. Todos los aminoácidos excepto la lisina y la leucina son al menos en parte glucogénicos. La lisina y la leucina son los únicos aminoácidos que son solamente cetogénicos, dando lugar solamente a acetil-CoA o a acetoacetil-CoA, ninguno de los cuales puede traer la producción neta de la glucosa. Un grupo pequeño de aminoácidos comprendidos por isoleucina, fenilalanina,
treonina, triptófano, y tirosina dan lugar a precursores de la glucosa y de ácidos grasos y así son caracterizados como glucogénicos y cetogénicos. Finalmente, debe ser reconocido que los aminoácidos tienen un tercer posible destino. Durante etapas de hambruna los esqueletos de carbono reducidos se utilizan para la producción energética, con el resultado que se oxida a CO2 y H2O.
Materiales y Métodos En el experimento realizado para investigar las vías de la biosíntesis de aminoácidos, un cultivo de Escherichia coli que crecía exponencialmente en un medio de glucosa con sales fue dividido en dieciocho cultivos separados. Se añadió a cada cultivo, glucosa marcada con 14C y un sustrato carbonado (oxalacetato, α-cetoglutarato, piruvato, acetato y semialdehído glutámico) o un aminoácido (ác. aspártico, ác. glutámico, homoserina, serina, acetato, treonina, valina, arginina, isoleucina, glicina, leucina y prolina) no radioactivo. Después de crecer por una generación, los organismos fueron lisados, aislando luego fracciones de lípidos, ácidos nucleícos y proteínas residuales. Se usaron solo las fracciones proteicas las que fueron primero, hidrolizadas en medio básico y a altas temperaturas, para romper el enlace peptídico, obteniendo aminoácidos. Los
aminoácidos fueron separados por cromatografía bidimensional, en la cual se hizo una cromatografía ascendente vertical y otra horizontal (girando el papel 90º), usando solventes distintos. A los aminoácidos separados se los reconoció usando la ninhidrina (reacciona con todos los aminoácidos alfa cuyo pH se encuentra entre 4 y 8), dando una coloración que varía de azul a violeta intenso. Este producto colorido (llamado púrpura de Ruhemann) se estabiliza por resonancia, la coloración producida por la ninhidrina es independiente de la coloración original del aminoácido. La prolina da coloración amarilla. Por su sensibilidad esta reacción se emplea para valoración cuantitativa de aminoácidos por colorimetría. Los aminoácidos separados fueron eluídos individualmente, determinándose su concentración y midiéndose la radioactividad en una alícuota de la muestra por medio de un fotocolorímetro.
Resultados La actividad específica de cada aminoácido, se determino sabiendo la radioactividad de cada aminoácido. La actividad específica de los aminoácidos se encuentra en la Tabla I.
Tabla I. El
efecto de Competidores Sobre la Incorporación de C14 Glucosa en Aminoácidos.
Sustrato Carbonado
Actividad específica de los Aminoácidos
o Aminoacido no
(cpm/μmol)
Radiactivo
ala
arg
asp
cys
glu
gly
ile
leu
lys
met
pro
ser
thr
val
Control
1600
1300
820
220
2500
550
340
1500
800
510
1100
450
650
600
Acetato
1580
----
680
----
1510
----
----
----
----
----
660
----
540
----
Alanina
320
----
----
215
----
560
----
1520
----
----
----
455
----
590
Arginina
1610
60
840
----
2520
----
----
----
----
----
1090
----
----
----
Acido Aspartico
1590
----
205
----
1760
----
205
----
480
230
790
----
160
----
Acido Glutamico Semialdehido Glutamico Glicina
1570
150
375
----
200
550
----
----
----
----
85
----
325
----
1600
1290
810
----
2480
----
----
----
----
----
90
----
----
----
1620
1320
820
225
2520
275
----
1490
----
----
1100
450
----
610
Homoserina
1560
----
825
----
----
----
120
----
800
100
----
----
30
----
Isoleucina
1630
----
830
----
----
----
122
----
805
500
----
----
645
----
α-cetoglutarato
1610
----
570
----
1550
----
----
----
----
----
650
----
470
----
Leucina
1560
----
220
----
560
----
0
----
----
----
440
----
600
Oxalacetato
1220
1280
580
----
1620
----
----
----
----
----
715
----
455
----
Prolina
1600
----
820
----
2500
550
----
----
----
----
50
----
----
----
Piruvato
650
----
700
215
1850
555
----
615
----
----
790
450
540
270
Serina
960
----
----
10
----
270
----
1130
----
----
----
25
----
450
Treonina
1580
----
810
----
----
----
118
----
800
510
----
----
30
----
Valina
1590
----
----
220
----
550
----
600
----
----
----
450
----
5
La actividad específica de cada aminoácido debería calcularse como un porcentaje del valor control, encontrando de esta manera el porcentaje de inhibición de cada uno de los aminoácidos y sustratos carbonaos no radioactivos sobre la glucosa marcada. Tabla II. El
efecto en porcentaje de Competidores Sobre la Incorporación de C14 Glucosa en Aminoácidos.
Sustrato
Actividad específica de los Aminoácidos
Carbonado o
(cpm/μmol)%
Aminoacido no Radiactivo
ala
arg
asp
cys
glu
gly
ile
leu
lys
met
Pro
ser
thr
val
Control
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
Acetato
99
---
83
---
60
---
---
---
---
---
60
---
83
---
Alanina
20
---
---
98
---
100
---
100
---
---
---
100
---
98
Arginina
100
5
100
---
100
---
---
---
---
---
99
---
---
---
Ácido Aspártico
99
---
25
---
70
---
60
---
60
45
72
---
25
---
Ácido Glutámico
98
12
46
---
8
100
---
---
---
---
8
---
50
---
Semialdehído Glutámico
100
99
99
---
99
---
---
---
---
---
8
---
---
---
Glicina
100
100
100
100
100
50
---
99
---
---
100
100
---
100
Homoserina
98
---
100
---
---
---
35
---
100
20
---
---
5
---
Isoleucina
100
---
100
---
---
---
36
---
100
98
---
---
99
---
α-cetoglutarato
100
---
70
---
62
---
---
---
---
---
59
---
72
---
Leucina
98
---
---
100
---
100
---
0
---
---
---
98
---
100
Oxalacetato
76
---
71
---
65
---
---
---
---
---
65
---
70
---
Prolina
100
98
100
---
100
100
---
---
---
---
5
---
---
---
Piruvato
41
---
85
98
74
100
---
41
---
---
72
100
83
45
Serina
60
---
---
5
---
49
---
75
---
---
---
6
---
75
Treonina
99
---
99
---
---
---
35
---
100
100
---
---
5
---
Valina
99
---
---
100
---
100
---
40
---
---
---
100
---
1
1) Según los resultados la Tabla I y la Tabla II, vemos como los aminoácidos afectan la radioactividad del mismo aminoácido y no de otro más.
Alanina Arginina Glicina Isoleucina Leucina Prolina
2) En los resultados de las tablas también podemos observar que algunos aminoácidos aparte de afectar la radioactividad del mismo aminoácido, afectan a otros diferentes a él y que otros aminoácidos que no son parte de las proteínas también afectan la radioactividad de otros
aminoácidos que si forman parte de las proteínas. A estos aminoácidos los llamaremos competidores.
Grafico I.
Aminoácidos presentes en cadena proteica
Ácido Aspártico
Ácido Glutámico
Aspartato
Arginina
Alanina
Isoleucina
Leucina
Glutamato
Aspartato
Cisteina
Treonina
Valina
Isoleucina
Glutamato
Glicina
Lisina
Prolina
Leucina
Metionina
Treonina
Serina
Prolina
Serina
Treonina
Valina
Valina
Treonina
Grafico II. Aminoácidos no presentes en cadena proteica Homoserina
Isoleucina
Metionina
Treonina
Semialdehido Glutamico
Prolina
3) También trabajamos con alfa cetoácidos (α-cetoglutarato, oxalacetato, piruvato, acetato), observamos que estos compuestos también tienen efecto sobre la radioactividad de ciertos aminoácidos. Por conocimientos de la vía metabólica de ciclo del acido cítrico, sabemos que intermediarios de esta vía por reacciones química se convierten a ciertos aminoácidos. Grafico III. α-cetoacidos
que tienen efecto sobre la radioactividad de los aminoácidos. Acetato
αcetoglutarato
Oxalacetat o
Piruvato
Aspartato
Aspartato
Alanina
Alanina
Glutamato
Glutamato
Aspartato
Aspartato
Prolina
Prolina
Glutamato
Glutamato
Treonina
Treonina
Prolina
Leucina
Treonina
Prolina
Treonina
Valina
4) Revisando los resultados de la Tabla II y los Gráficos I, II y por último el III, nos dimos cuenta de que uno de los aminoácidos que más efecta o inhibe la síntesis de otros aminoácidos era el acido aspártico, lo relacionamos con un aminoácido, pudimos percatarnos que la mayoría de los aminoácidos que eran afectados por la Homoserina (Ile, Met,Thr) también eran afectados por el Ác. Aspártico, luego observamos que la Treonina afecta la radioactividad de un aminoácido (Ile), aparte del mismo afecta, con quien se acaba la síntesis ya que como se señaló en el primer punto, es una proteína de fi n de ciclo. Para ver mejor estos resultados, elaboramos la Tabla III, que nos mostrara la relación entre los aminoácidos. 5) Otro aminoácido que afecta a varios aminoácidos es el Ácido Glutámico (Arg, Asp, Glu, Pro, Thr), el único aminoácido que afecta la síntesis de aminoácidos coincidentes con el Ac. Glutámico es el Semialdehído Glutámico (Pro).
6) Y por último, observamos que la Serina también es otro aminoácido que afecta la síntesis de varios aminoácidos aparte del mismo (Ala, Cys,Gly, Ala,Leu, Val) y vemos que coincide con un aminoácidos que afecta la Valina (Leu ) aparte del mismo. A continuación la siguiente tabla nos mostrara mejor los resultados obtenidos.
Tabla III. El efecto de los Aminoácidos Competidores sobre la incorporación de C14 Proveniente de la glucosa Aminoácido Competidor
Ácido aspártico
Homoserina
Treonina
Acido Glutámico
Semialdehído Glutámico
Serina
Valina
Aminoácidos Afectados
Inhibici όn
Asp Thr Met Ile Lys (Glu)* (Pro)* Thr Met Ile Thr Ile
75 75 55 40 40 30 28 95 80 65 95 65
Glu Pro Arg (Asp)* (Thr)* Pro
92 92 88 54 50 92
Ser Cys Gly Ala Leu Val Val Leu
94 95 51 40 25 25 99 60
Otros aminoácidos significativos no afectados
Asp Lys Asp Met Lys
Arg Glu
()* No se están considerando estos aminoácidos pues probablemente provengan de un proceso de
transaminaciόn de algún intermediario del ciclo de Krebs.
Discusión Ahora discutiremos los resultados obtenidos para llegar a las conclusiones de nuestro trabajo: En el punto 1) observamos que habían aminoácidos que solo afectaban la síntesis de los mismo aminoácidos, como por ejemplo Alanina que inhibe a la misma en un 80%, y a ningún otro aminoácido mas. Así también la Glicina que inhibe a la misma en un 50%, no afecta a ningún otro aminoácido más. Entonces llegamos podemos decir que estos aminoácidos no son precursores de ningún otro, si no que son el producto final, son los que terminan la vía metabólica de la biosíntesis de aminoácidos. En el punto 2) observamos que había aminoácidos que aparte de inhibir la síntesis del mismo, afectaban a más aminoácidos, como por ejemplo el ác. aspártico que inhibe a la isoleucina y lisina en un 40%, asi como también inhibe a la Metionina en un 55% y a la treonina en un 75%, aunque en los resultados de la tabla también aparece que afecta al glutamato y a la prolina, no podemos asegurar esto, pues también tenemos conocimiento de que los aminoacidos se sintetizan a partir de los intermediarios del ciclo de Krebs, por una reacción química que será explicada más adelante. Entonces podemos deducir que estos aminoácidos participan en la síntesis de esos aminoácidos a los que inhiben, a estos aa los llamamos competidores. En el punto 3), observamos que los cetoácidos (α-cetoglutarato, oxalacetato, piruvato) utilizados en el trabajo inhibían también la síntesis de los aminoácidos. Y de esto tenemos conocimiento pues sabemos que los intermediarios del ciclo de Krebs pueden llegar a convertirse en aminoácidos. Basado en la vía catabólica en la que participen, los aminoácidos pueden tener un destino en el cual sus esqueletos de Carbono sean incorporados en intermediarios metabólicos que puedan posteriormente transformarse en glucosa, estos son los aminoácidos glucogénicos. Los aminoácidos también pueden ser cetogénicos, y en este caso sus esqueletos de C son en forma de acetoacetato, el mismo que se puede transformar posteriormente en acetil-CoA. Tenemos conocimiento de que algunos aminoácidos se forman gracias a intermediarios del Ciclo del Acido Cítrico o Ciclo de Krebs, por un proceso llamado Transaminaciόn. La reacción de aminotransferasa ocurre en dos pasos: 1.- el grupo amino de un aminoácido es transferido a la enzima, produciendo el correspondiente a-ceto ácido y la enzima aminada Aminoácido + enzima D → a-ceto ácido + E-NH2
2.- El grupo amino es transferido al α-ceto ácido aceptor (ej. α-cetoglutarato) formando el producto aminoácido (ej. Glutamato) y regenerando la enzima α-cetoglutarato + enzima-NH2 D → enzima + glutamato
Por ejemplo tenemos que el glutamato se sintetiza a partir de NH 4+ y α-cetoglutarato por medio de la glutamato deshidrogenasa. La reacción es la siguiente:
Otro ejemplo es el Aspartato y por este se explica porque no tomamos en cuenta al glutamato como un aminoácido que inhibe el ác. Aspártico:
Como vemos por el mismo proceso de transaminaciόn, el glutamato transfiere su grupo amino al oxalacetato para convertirlo en Aspartato. Por este motivo no tomamos en cuenta al glutamato.
Un último ejemplo es la Alanina, que se forma gracias a la adición de un grupo amino al piruvato, la reacción es la siguiente:
Aunque se ha demostrado que en ciertas especies la serina se puede convertir en piruvato mediante una reacción catalizada por la desaminación de serina/treonina deshidratasa, esta actividad de la enzima parece faltar en los seres humanos. Entonces ya después de esta discusión, por ultimo podemos establecer la familia de síntesis de aminoácidos:
Familia del Acido Aspártico
De los datos obtenidos vemos que el Acido Aspartico afecta síntesis de Treonina, Metionina, Isoleucina y Lisina. La Homoserina afecta a síntesis de Treonina, Metionina e Isoleucina. La Treonina participa en la síntesis de Isoleucina. *No se considera a la glutamato pues se sabe que es producto de las reacciones de los intermediarios del ciclo de Krebs, desde Oxalacetato que llega a ser α-cetoglutarato y por transaminaciόn se convierte a glutamato. *La prolina no se considero, pues no es totalmente seguro que el ácido aspártico participe en la síntesis de este aminoácido, pues su porcentaje de inhibición es demasiado bajo, mucho mas que la inhibición del propio Aspartato.
Relacionándolos:
Metionina Homoserina Treonina Acido Aspártico Lisina
Isoleucina
Familia del Ácido Glutámico
De los datos obtenidos en clase nos damos cuenta que el Acido Glutámico afecta la síntesis del mismo Acido Glutámico, de la Prolina, de la Arginina, del Acido Aspártico y de la Treonina. Continuamos con el α-Cetoglutarato que a su vez afecta al Acido Glutámico, a la Prolina, a la Treonina y al Acido Aspártico. Mientras que el Semialdehído Glutámico afecta prácticamente solo la síntesis de Prolina, es decir la Prolina. *No se consideró a la Treonina ni al Aspartato, pues por intermediarios de ciclo de Krebs y el proceso de transaminaciόn el Ácido Glutámico es solo un camino, mas no es su precursor. Relacionándolos:
Semialdehído Glutámico -Cetoglutarato
α
Treonina Ácido Aspártico
Ácido Glutámico Arginina
Prolina Glutamina
Familia de la Serina
Serina participa en la síntesis de Alanina, Cisteina, Glicina, Leucina, Valina. Valina afecta la síntesis de Leucina. Serina se convierte a Piruvato. Piruvato participa en la síntesis de Alanina, Valina. Relacionándolos:
Cisteína Alanina Serina
Piruvato Valina
Leucina
Glicina
Como nuestra base para el trabajo, fue el conocimiento previo de que los intermediarios del Ciclo del Ácido Cítrico eran precursores de la mayoría de aminoácidos. El siguiente gráfico nos permitirá entender la relación de esta vía metabólica con la síntesis de aminoácidos.
Conclusiones
Los aminoácidos que no inhiben la síntesis de otro aminoácido que no sea el mismo, son aminoácidos de fin de síntesis, son los que terminan la vía metabólica. Los aminoácidos que inhiben la síntesis de otros aminoácidos aparte de a ellos mismos se les denomina competidores, y participan en la síntesis de otros aminoácidos. Los aminoácidos también se sintetizan a partir de intermediarios del ciclo del ácido cítrico, por un proceso simple, la transaminaciόn. Los esqueletos carbonados de los aminoácidos provienen de intermediarios de la glicolisis (piruvato), de las vías de las pentosas fosfato o del ciclo del ácido cítrico (αcetoglutarato, oxalacetato, fumarato, succinato) Las reacciones de transaminaciόn intervienen en la síntesis de la mayoría de aminoácidos.
Bibliografía
Armstrong, F Bioquímica. Editorial Reverte, S.A. Barcelona España. 1982 Stryer, Lubert et al, Bioquímica, Quinta Edición, Editorial W.H. Freeman, EEUU. http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/interconversion%20aminoacidos.html
