Capítulo 4: Cultivo por Lotes, Continuo y Alimentado M.Sc. M.Sc . Cristhian Cristhian Carrasco Carrasco 2012 1
3.1 3. 1 In Intr trod oduc ucci ción ón.. Dentro de los aspectos básicos de biorreactores es necesario tener conocimiento de lo siguiente:
La Cinética de Reacción. Balance de Materia. Balance de Energía.
Propiedades de los Biocatalizadores = f (t, Propiedades (t, # fases, # componentes)
2
M.Sc. Cristhian Carrasco V. V. PRQ-216
2
3.1 3. 1 In Intr trod oduc ucci ción ón.. Dentro de los aspectos básicos de biorreactores es necesario tener conocimiento de lo siguiente:
La Cinética de Reacción. Balance de Materia. Balance de Energía.
Propiedades de los Biocatalizadores = f (t, Propiedades (t, # fases, # componentes)
2
M.Sc. Cristhian Carrasco V. V. PRQ-216
2
3.2 Aspectos Básicos de los Biorreactores
M.Sc. Cristhian Carrasco V. 2012
3
3.2.1 Balance Global de Materia. Balance de materia (biorreactor):
Acumulación
=
aplicado
Generación por Reacción Bioquímica
+
para
Flujo de Entrada de Materia
un
sistema
-
Flujo de Salida de Materia
Se aplica a un biorreactor: (Ci ×V)/dt = V × ri + (Qe × Cie - Qs × Cis) d (C Donde: V = Volume olumen n del de l Biorreactor [L] ri = Velocidad global de producción de un componente i [gL -1h-1] o Tasa Tasa Volu olumét métrica rica Qie y Qis = Caudal de circulación [L h-1] Cie y Cis = Concentración de un componente i [g L-1] M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
4
3.2.2 Balance Global de Energía. Balance de energía aplicado para un sistema (biorreactor):
Acumulación de Energía
=
Generación de Energía por Reacción Bioquímica
+
Diferencia de Entalpía de Entrada y Salida
+
Caudal del Calor (suministra do o retirado)
Se aplica a un biorreactor: (V×ρ×Cp×T)/dt = (-∆H)× V× ri + Q×ρ×Cp×(Te - Ts) + q d (V× Donde: V = Volume olumen n del d el Biorreactor [L] ri = Velocidad global de producción de un componente i [gL -1h-1] Q = Caudal de circulación [L h-1] Te y Ts = Tempera emperatura tura de un compon componente ente i [˚C] M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
5
3.3 Reactor Discontinuo de Tanque Agitado o Cultivo por Lotes (Reactor Batch)
M.Sc. Cristhian Carrasco V. 2012
6
3.3 Definición (Cultivo por Lotes). Los mas ampliamente aplicados a escala industrial son los biorreactores de cultivo por lotes siendo tanques agitados cilíndricos donde se pueden alcanzar y mantener condiciones asépticas y donde se emplean medios muy ricos en nutrientes. Opera a bajas densidades celulares (inicialmente) donde el medio de fermentación como el inóculo se introducen en el sistema al comienzo de la operación.
7
M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
7
3.3 Biorreactor. Esquema
v v
Operación: • Reactor Discontinuo de Tanque Agitado (DSTR) o Cultivo por Lotes. • Reactor Discontinuo Alimentado (Fedbatch) o Cultivo Alimentado • Reactor Continuo de Tanque Agitado (CSTR) o Cultivo Continuo
8
9
M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
9
3.3.1 Análisis cuantitativo del comportamiento del DSTR. Balance de materia aplicado a la biomasa:
Acumulación
=
Generación por Reacción Bioquímica
Se obtiene: rx + dQt ×(Xe – X) 0 / r V × rx = Vd (×V×X)/ t ==∫dX x Donde: V = Volumen del Biorreactor [L] rx = Velocidad global de producción de biomasa [gL-1h-1] X = Concentración de biomasa [g L-1] t = tiempo necesario para un incremento de biomasa [h] M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
10
3.3.2 Análisis cuantitativo del comportamiento del DSTR. Balance de materia aplicado al sustrato y producto:
Acumulación
=
Generación por Reacción Bioquímica
Se obtiene: V × rx + Q ×(Xe – X) = 0 t = - ∫dS /(r sx +r sp ) t = - ∫dP / r sp Donde: V = Volumen del Biorreactor [L] ri = Velocidad global del componente i [gL-1h-1] S y P = Concentración del sustrato y producto [g L-1] t = tiempo necesario para un incremento/consumo [h] M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
11
3.3.3 Análisis cuantitativo del comportamiento del DSTR. Considerando la definición de la ecuación de Monod, la tasa volumétrica rx = µ×X y el rendimiento de biomasa Ysx = - dX /dS se obtiene
[Xe+Ysx×(Se+Ks)]×ln[(Xe+Ysx×(Se-S))/Xe]- Ks×Ysx×ln(S/Se) = = µm×(Xe+(Ysx×Se))×t
M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
12
3.3.4 Limitaciones del DSRT Dependiendo de la condiciones de operación y del M.O. generalmente se observa: • • • •
Fenómeno de Inhibición (por substrato o por producto) Limitaciones cuando se opera a altas concentraciones de sustrato. Fermentación Incompleta (max. conc. de producto y mínima de sustrato). Mezclado Homogéneo (caso ideal).
M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
13
3.4 Reactor Alimentado Alimentado
Discontinuo o Cultivo
M.Sc. Cristhian Carrasco V. 2012
14
3.4 Definición (Cultivo por Lotes Alimentado). •
El substrato/nutrientes/biocatalizadores se alimenta en cargas sucesivas y no se retira producto alguno variando así el volumen del medio de reacción durante el proceso.
•
Su aplicación permite solucionar algunos problemas del cultivo batch teniendo en cuenta la velocidad de adición y/o la concentración de la alimentación.
15
M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
15
3.4.1 Análisis cuantitativo del comportamiento del Fed-Batch. Balance de materia aplicado a este proceso resulta:
Acumulación
=
Generación por Reacción Bioquímica
+
Flujo de Entrada de Materia
Se obtiene: ×(Xe – X) =0 x + Q Qe /V×(C Qe×Cie +V×ri V= ×d (rV×C ie-Ci)+ri = d C / i dt i)/ dt Donde: V = Volumen del Biorreactor [L] ri = Velocidad global de producción [gL-1h-1] Ci = Concentración de un componente [g L-1] t = tiempo necesario para un incremento de biomasa [h] M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
16
3.4.2 Análisis cuantitativo del comportamiento del Fed-Batch. Balance de materia aplicado al sustrato y biomasa:
Acumulación
=
Generación por Reacción Bioquímica
+
Flujo de Entrada de Materia
Se obtiene: V ×= rd x X+ µ×X - (Qe /V)×X / dQ t ×(Xe – X) = 0 (Qe /V)×(Se-S)-(µ×X)/Ysx =d S/ dt Donde: V = Volumen del Biorreactor [L] S y X = Concentración del sustrato y biomasa [g L -1] t = tiempo necesario para un incremento/consumo [h] M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
17
3.4.3 Limitaciones del Fed-Batch Dependiendo de la condiciones de operación y del M.O. generalmente se observa: • •
Su manipulación es riesgosa (contaminación) Control riguroso de diferentes variables (concentración de producto, o substrato, pH, el oxígeno disuelto, etc.).
M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
18
3.5 Reactor continuo de tanque agitado (CSTR) Teoría del Quimiostato
M.Sc. Cristhian Carrasco V. 2012
19
3.5 Definición (Cultivo Continuo). En la mayoría de los casos, los biorreactores de cultivo continuo son tanques agitados cilíndricos con un sistema de homogeneización, generalmente mecánico, garantizando la misma composición en cualquier punto (evitando los puntos muertos o zonas muertas) denominándose como quimiostatos. Siendo necesario detallar la clasificación de los sistemas de cultivo continuo:
20
M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
20
3.5 Clasificación. 3.5.1 Sistemas abiertos continuos (homogéneos)
Una sola etapa
Simple (Quimiostato, Turbidiostato)
Simple con parcial alimentación del cultivo
Cultivo Dializado (Ddializador)
21
M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
21
Multi-etapas I.
II.
1. Simple-conectados con una alimentación en la primera etapa
III.
II. Simple- conectados con una retroalimentación parcial del cultivo
IV.
III. Complejo-conectados con una alimentación en mas etapas
IV. Complejo-conectado con una alimentación en mas etapas (mismo intercambio de cultivo) 22
M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
22
3.5 Clasificación.
3.5.2 Sistemas abiertos continuos (heterogéneos) a.)
b.)
a.) Simple Tubular
c.)
(fluidos o sustratos sólidos);
b.) Tubular con parcial alimentación del cultivo
d.)
c.) Tubular continuamente inoculado desde el quimiostato; d.) Counter-current system (inóculo del quimiostato o con alimentación parcial del cultivo) 23
M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
23
3.5 Clasificación.
3.5.3 Sistemas cerrados continuos
a.)
b.)
a.) Vaso con paredes permeables; b.) Microorganismos crecen en la superficie (arriba o dentro); c.) Retro-alimentación con un separador; d.) Microorganismos crecen en una interface (gas-liq o sol-liq). c.)
d.)
24
M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
24
3.6 Teoría del Quimiostato. Es un biorreactor de tanque agitado en el que se asume básicamente:
El volumen de medio es constante El caudal de salida es igual al de entrada. La concentración de salida es igual a la concentración en el interior del reactor. Reducción de los costos de capital y operación. Mejor control del Proceso. 25
M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
25
26
M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
26
3.6.1 Análisis cuantitativo del comportamiento del Quimiostato. Balance de materia aplicado a la biomasa:
Acumulación
=
Generación por Reacción Bioquímica
+
Flujo de Entrada/Salida de Materia
Se obtiene: V × rx + Q ×(Xe – X) = 0
E.E.
Donde: V = Volumen del Biorreactor [L] rx = Velocidad global de producción de biomasa [gL-1h-1] Q = Caudal de circulación [L h-1] Xe y X = Concentración de biomasa [g L -1] M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
27
3.6.2 Análisis cuantitativo del comportamiento del Quimiostato. Considerando la definición de la velocidad de crecimiento, la velocidad específica de crecimiento (µ) y la tasa de dilución como D = Q/V y tiempo medio de residencia Θ = 1/D, se obtiene:
D × Xe = (D -µ) × X dado que Xe = 0 (esterilización) µ
=D
Análogamente para un producto (P) y un sustrato (S) se tiene. rp = D × P = Yxp × µ × X
-rs = - [rx/Ysx+rp/Ysp] = D × (S – Se) M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
28
3.6.3 Modelo de Monod para el Quimiostato. Obedeciendo la cinética de Monod en E.E.:
Biomasa (X): D × Xe + {[(µmax× S)/(KS + S)]- D} × X = 0
Sustrato (S): D × (Se – S)+ {[(µmax× S × X)/Yxs × (KS + S)]} – (X × rp/Ysp)= 0
Producto (P): D × (Pe –P)+ {Yxp ×{[(µmax× S)/(KS + S)]} × X = 0 M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
29
3.6.3 Modelo de Monod para el Quimiostato En este modelo se tiene: •
Variables = X, S y P
•
Variables manipulables = D, µ, Se, Pe, Xe (donde Pe, Xe = 0) Parámetros cinéticos y estequiométricos = µm, Ks, Ysx, Ysp, etc.
•
M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
30
3.6.3 Modelo de Monod para el Quimiostato. En condiciones estériles se tiene:
Sustrato (S):
S =
Ks D µ max − D
Biomasa (X):
X
=
Ysx So
−
Ks D µ max
−
D
Producto (P):
P = Pe
+
Yxp µ X D M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
31
S =
Ks D − D
µ max
X
=
Ysx So
−
Ks D µ max
−
D
Dependencia de X, S y D ×X frente a D para un RCTA (Quimiostato) empleando la ecuación de Monod con µ m = 1 h-1, Ks = 0.2 g L-1, Ysx = 0.5 y Se = 10 g L-1 M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
32
Constantes de saturación (K S) para diferentes sustratos y M.O.
Organismo Género
Sustrato
Escherichia Escherichia Escherichia Candida Candida Candida Saccharomyces Aspergillus Klebsiella Klebsiella
Glucosa Glucosa Manitol Glicerol Oxígeno Oxígeno Glucosa Glucosa Iones magnesio Iones potasio
KS mg/L 6.8 x 10- 2 4 2 4.5 4.5 x 10- 1 4.2 x 10- 2 25 5 5.6 x 10- 1 3.9 x 10- 1
10- 5 M 3.8 x 10- 2 2.2 1.1 4.9 1.4 1.3 x 10- 1 14 2.8 2.3 1.0
33
M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
33
34
34
Constantes de saturación (K S) para Bacterias
35
35
36
36
Tasas específica de crecimiento (µ m)
37
37
3.6.3 Modelo de Monod para el Quimiostato. Obedeciendo la cinética de Monod en régimen no estacionario:
Biomasa (X): D × Xe + {[(µmax× S)/(KS + S)]- D} × X = d X/d t
Sustrato (S): D × (Se – S)+ {[(µmax× S × X)/Yxs × (KS + S)]} – (X × rp/Ysp)= d S/d t
Producto (P): D × (Pe –P)+ {Yxp ×{[(µmax× S)/(KS + S)]} × X = d P/d t M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
38
3.6.3 Modelo de Monod para el Quimiostato. Otras consideraciones importantes son: Tasa de dilución máxima o de dilución crítica (wash-out)
La dilución máxima puede obtenerse cuando S = So e insertando este valor en la Ecuación de Monod:
D
= MÁX
µ
MÁX
1 −
Ks Ks + So
teniendo también la máxima productividad del producto, en el caso de metabolitos primarios, que se obtiene en esta zona.
M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
39
3.6.3 Modelo de Monod para el Quimiostato. Otras consideraciones importantes son: Productividad
En un quimiostato la producción de biomasa por unidad de volumen por unidad de tiempo de cultivo se denomina productividad, P: P=D×X Lo importante es encontrar el valor máximo de este producto, por lo tanto:
dP =0 dD x MÁX
=
Y sx So
+
Ks
−
Ks ( Ks
+
So )
M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
40
3.6.4 Limitaciones de la teoría del Quimiostato Suposiciones mencionadas: • •
Y = constante µ = µ (ecuación de Monod), Independencia química del sustrato.
En casos reales las desviaciones son tan pequeñas que se pueden considerar a estas suposiciones como si se cumplieran.
M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
41
3.6.5 Modelo de Monod para varias etapas.
D1 D2 K s D1 D2 K s µ − D2 K − S S s e 2+ µ − D 1 m µ m − D1
2
( µ m
D2 ) S
−
2 2 +
=
0
Quimiostato – dos etapas (en serie) M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
42
3.6.5 Modelo de Monod para varias etapas.
D1 D2 K s D1 D2 K s 2 − D2 ) S 2 + − D2 K s − µ S e S 2 + µ − D 1 m µ m − D1
2
( µ m
X 2
=
Y sx ( S e
−
dX i dt
=
0
S 2 ) =
k i X i
Método grafico para el calculo del numero de etapas necesarias para llevar a cabo un CSTR en serie.
Quimiostato – dos etapas (en serie) M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
43
"emulsification bioreactor"
Cultivo continuo de dos etapas para la degradación de petróleo crudo en agua de mar (Bertrand et al., 1983). M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
44
3.7.6 Modelo de Monod para otros reactores.
Biostato M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
45
3.7.7 Modelo de Monod para otros reactores.
Turbidiostato-cultivo continuo para bacteria fotosintéticas M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
46
3.7.8 Modelo de Monod para otros reactores.
Biorreactor de tanque Agitado Continuo M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
47
3.8 Ejemplo A partir de cultivos en discontinuo de un M.O., se han obtenido los parámetros de Monod que describe su crecimiento (µMAX = 0.2 h-1 y Ks = 0.35 gL-1). Se desea llevar el mismo proceso en un biorreactor continuo de tanque agitado a escala industrial. a.) Si la alimentación es estéril, ¿cuál será el volumen de fermentador necesario para tratar un caudal de 500 Lh-1 de una corriente de sustrato de 30 gL-1 si se desea alcanzar una conversión del 90%?¿Cuál será la velocidad de dilución que permite maximizar la productividad celular? Si se sabe que el rendimiento de substrato en biomasa es 0.09 g/g, ¿cuál será la productividad de biomasa? M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
48
3.8 Ejemplo a.) Dado que la conversión es del 90% (S = 3 gL-1), y conociendo los parámetros cinéticos, se puede calcular, fácilmente la velocidad de crecimiento (ec. Monod) en las condiciones de operación. µ =
3 S 1 = 0.2 × = 0.179[ h ] Ks + S 0.35 + 3 µ MAX
−
Como en condiciones E.E., la tasa de dilución coincide con la velocidad específica (µ).
V =
Q 500 = = 2793[ L ] D 0.179 M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
49
3.8 Ejemplo La tasa de dilución que permite productividad para este sistema es:
maximizar
la
0.35 0.5 Ks 1 = 0.21 − = 0 . 178 [ ] D MÁX = µ MÁX 1 − h Ks + So 0.35 + 3 −
Comparando este valor con el obtenido se deduce que el proceso se estaba llevando a cabo en condiciones próximas a la zona de inestabilidad.
M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
50
3.8 Ejemplo La productividad de biomasa en esa condiciones sería:
D × X = D × Y sx × (Se − S ) = 0.179× 0.09 × (30 − 3) D × X = 0.435 [ gL 1h 1 ] −
−
M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
51
3.8 Ejemplo b.) Se propone modificar el equipo incorporando un separador de biomasa en la corriente de salida. Se obtiene así una corriente de recirculación con una concentración celular cuatro veces mayor que la de salida del biorreactor. Si se desea obtener la misma conversión global de substrato y se aplica una relación de recirculación (caudal de recirculación/caudal de alimentación) de 0.30. ¿Qué caudal será factible en estas condiciones?
M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
52
3.8 Ejemplo Puesto que se desea mantener la conversión, la concentración de substrato en el reactor también será la misma que en el inciso a.); y por tanto la velocidad o tasa de crecimiento (µ) será, igualmente 0.179 h-1. Aplicando un balance de materia en el reactor, considerando que la alimentación es estéril y que opera en E.E. Q, X, S, P
Qo, Xo, So, Po
Qs, Xs, Ss, Ps
Qe, Xe, Se, Pe
Q, X
S, P
Qw, Xw, Sw, Pw
Qr, Xr, Sr, Pr M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
53
3.8 Ejemplo Biomasa (X):
(Qe×Xe + Qr×Xr) – (Qe+ Qr)×X + µ×X×V = V×dX / dt Por lo general, Qe×Xe ‹‹ Qr×Xr, por lo que sustituyendo Qr = R×Qe, en donde R es la denominada razón de circulación, y, si el equipo en E.E.
R×Qe×Xr – Qe×(1+R)×X + µ×X×V = 0 Si se divide esta ecuación por V donde D = Qe /V
D =
X r − 1 1 − R X
→
X =
RDX r D + DR − µ
M.Sc. Cristhian Carrasco V. PRQ-216
54
