ENUMERACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES Y ESCHERICHIA COLI EN EN PRODUCTOS CÁRNICOS William Andrés Olalla Chiai!a La"#ra$#ri# d% Mir#"i#l#&'a d% l#s Alim%n$#s II( Fa)l$ad d% Ci%nia % In&%ni%r'a %n Alim%n$#s( Uni*%rsidad Ténia d% Am"a$#
I+
R%s)m%n
Median Mediante te el uso de produc productos tos cárnic cárnicos: os: carne de res y pollo, pollo, se observ observó ó la presen presencia cia de coliformes totales y fecales ( E. coli). El medio de cultivo a emplearse fue caldo bilis-verde brillante (Difco, Francia), la utiliación de !ste medio para el aislamiento de coliformes en las muestras dio como resultado utiliando el m!todo de "M# por triplicado la presencia de $%&'' bacterias por ramo para la carne de res y %' bacterias por ramo de pollo. En conclusión el caldo de cultivo bilis-verde bilis-verde brillante brillante (Difco, (Difco, Francia), puede ser utiliado para el aislamiento selecti sele ctivo vo de col colifo iforme rmess tot totales ales y fec fecale ales, s, los cua cuales les son ind indica icador dores es de con contam taminac inación ión e inocuidad alimentaria.
II+
In$r#d)i,n
os *oliformes Fecales son un subrupo de los *oliformes totales, capaces de fermentar la lactosa a &&+ * en ve de +* como lo acen los totales. /pro0imadamente el 123 del rupo de lo loss *o *oli lifo form rmes es pr pres esen ente tess en e ece cess es está tán n fo form rmad ados os po porr Escherichia coli. 4a 5u 5uee lo loss *oliformes Fecales se encuentran casi e0clusivamente en las eces de los animales de sanre caliente, se considera 5ue refle6an me6or la presencia de contaminación fecal, (7alv8n, %''). 9en ;ibes (%''%), la presencia de E. coli (o bien de coliformes termotolerantes) es un indicio de contaminación fecal reciente, por lo 5ue tras su detección deber8a considerarse la toma de medidas adicionales, como la realiación de muestreos adicionales y la investiación de las posibles fuentes de contaminación, como un tratamiento inadecuado o alteraciones de la interidad del sistema de distribución. a capacidad de los *oliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales omeot!rmicos es favorecida por la e0istencia de condiciones adecuadas de materia oránica, p<, umedad, (/larcón, %''=). El caldo bilis-verde bilis-verde brilla brillante nte es el medio está recomendado para el recuento de coliformes totales y fecales, utiliando la t!cnica del nmero más probable. En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los aentes selectivos 5ue iniben el desarrollo de bacterias 7ram positivas y 7ram neativas a e0cepción de coliformes, y la lactosa es el idrato de carbono fermentable. Es una propiedad del rupo coliforme, la fermentación de la lactosa con producción de ácido y as.
El ob6etivo de la práctica fue aislar utiliando utiliando caldo bilis-verde bilis-verde brillante brillante (Difco, Francia), a colonias pertenecientes al rupo al rupo coliforme >otales y E. *oli aplicando el m!todo del nmero más probable ("M#) a partir de la t!cnica de tubos mltiples. Mientras mayor sea el nmero
de coliformes en la muestra de carne, mayor será la probabilidad de estar frente a una contaminación fecal reciente.
III+
Ma$%rial - Mé$#d#s
#ara la e0perimentación se preparó caldo bilis-verde brillante (Difco>M, Francia). a esteriliación de los materiales se lo realió en el autoclave (/ll /merican, ?9/), lueo de este proceso en la cámara de flu6o laminar (9treamline, ?9/) se realiaron diluciones seriadas de las muestras utiliando %2 . de muestra y aua peptonada, obteniendo concentraciones de =' = ,='-% ,='-, se inoculó '.= ml de cada dilución por triplicado en el caldo lactosado verde bilis brillante. 9e debe tener en cuenta un tobo testio. a muestra fue llevada a proceso de incubación en estufa (Memmert, /lemania) a '@* por %& oras. Finaliado este proceso se procedió a la interpretación de resultados, el crecimiento se evidencia por la presencia de turbide en el caldo de cultivo, puede e0istir vira6e del color del medio de cultivo al color amarronado o amarillo, mientras 5ue los resultados neativos se presentan por ausencia de turbide yAo as. os resultados positivos son comparados con la >abla %. "mero más probable ("M#) de bacterias coliforme y Escericia coli, cuando la muestra a sido realiada por triplicado, por o por cm, para realiar los cálculos posteriores.
Ta"la .+ R%%$a /ara %l Cald# la$#sad# *%rd% "rillan$% "ilis 01
>abla %. "mero más probable ("M#) de bacterias coliformes y Escericia coli, cuando la muestra a sido realiada por triplicado, por ó por cm
I2+ R%s)l$ad#s C3l)l# d% NMP /#r &( %n m%di# d% )l$i*# B4LB 01 E+ .
NMP=
NMP del ensayo 100
∗ Factor de dilusiónintemedio
NMP5 N6m%r# M3s Pr#"a"l% /#r &ram# d% m)%s$ra d% arn% d% r%s NMP=
2400 100
2
∗10
NMP=2400 Coliformes / g
Ta"la .5 N6m%r# d% T)"#s /#si$i*#s %n m)%s$ras d% /#ll# - arn% d% r%s
.78. Pr)%"as /#si$i*as
9
.78. Pr)%"as /#si$i*as
M)%s$ras d% arn% d% r%s Dil)i#n%s .780 9 M)%s$ras d% arn% d% /#ll# Dil)i#n%s .780
0
.
.789 9
.789 .
NMP :0;77 NMP 07
Ela"#rad# /#r5 Olalla( A+( FCIAL+UTA+07.;+ F)%n$%5 La"#ra$#ri# d% Mir#"i#l#&'a I+ De las muestras obtenidas de los productos cárnicos pollo y carne de res, se realió el cálculo del "M#, en cada uno de ellos, en la Ta"la . se muestran los resultados de tubos positivos y neativos, sen el m!todo empleado de "M# se pudo determinar el rado de contaminación de los productos, los valores de la cantidad de bacterias fueron elevados, esto no sinifica 5ue sean alarmantes ya 5ue al ser productos crudos su consumo no se realia en ese estado, por lo 5ue son sometidos a cocción, con esto se eliminan los coliformes, el problema radicar8a si estos valores se presentan en productos 5ue ya fueron sometidos a aln tratamiento t!rmico. De iual forma en la Fi&)ra . se muestra la contaminación en los tubos con respecto al tubo de control, el cual no presento turbide ni cambios de color, tampoco el desprendimiento de ases en la *ampana Duram.
Fi&)ra .+8 Muestras, la del centro no presento variación de color. F)%n$%5 aboratorio de Microbiolo8a BB. 2+
Dis)si,n
De acuerdo al análisis microbiolóico de los productos cárnicos pollo y carne de res, presentó contaminación microbiana superior a los l8mites 5ue establece la ">E B"E" = C:%'=' *arne y productos cárnicos crudos ( =''' bacterias por ramo) los microoranismos indicadores predominantes fueron *oliformes >otales y *oliformes fecales con valores $%&'' bacterias por ramo de carne de res utiliando la t!cnica "#M. 9en /larcón (%''=), la enumeración de coliformes contina siendo la t!cnica de referencia para indicar si un alimento o el proceso de su elaboración parcial o total poseen caracter8sticas sanitarias satisfactorias. En esta práctica se demostró 5ue los productos cárnicos e0aminados presentaron un nmero de coliformes 5ue sobrepasaron los l8mites establecidos, lo cual permite inferir 5ue están siendo e0cesivamente manipulados desde el momento en 5ue salen del matadero asta su comercialiación. 7alv8n, (%'') indica 5ue los oranismos coliformes se analian solo como sealiadores de la eficacia del tratamiento y la interidad del sistema de distribución no como indicadores de la presencia de patóenos, mientras 5ue los oranismos coliformes termotolerantes, en este caso los E. coli se analian como indicadores de contaminación fecal. El valor del recuento de Escherichia coli indicar8a prácticas de iiene deficientes en la elaboración o conservación inadecuada del producto, se sui!rela revisión de las Guenas #rácticas de Manufactura, (ópe, =1C&). En mucos productos crudos de orien animal, altos recuentos de E. coli pueden ser esperados dada la asociación cercana de estos alimentos con el ambiente animal y por la probabilidad de contaminación de pieles, reses, etc. con materia fecal animal durante la faena. E. coli se
puede eliminar fácilmente mediante procesos t!rmicos, por consiuiente, la presencia de la misma en un alimento sometido a temperaturas elevadas sinifica un proceso deficiente o, lo 5ue es más comn, una contaminación posterior al proceso atribuible al e5uipo, manipuladores o contaminación cruada. 9in embaro, si el ob6etivo del análisis es controlar la contaminación post tratamiento t!rmico, los oranismos seleccionados deber8an ser las bacterias coliformes en luar de E. coli, (;ibes, %''%). #ascual (=111), dice 5ue las bacterias de este !nero se encuentran principalmente en el intestino de los umanos y de los animales de sanre caliente, es decir, omeotermos, pero tambi!n ampliamente distribuidas en la naturalea, especialmente en suelos, semillas y veetales, os coliformes se introducen en ran nmero al medio ambiente por las eces de umanos y animales. #or tal motivo suele deducirse la mayor8a de los coliformes 5ue se encuentran en el ambiente son de orien fecal. 9in embaro, an e0isten mucos coliformes de vida libre.
2I+
C)%s$i#nari# a< D%sri"a 9 /r)%"as "i#=)'mias /ara #n>irmar la /r%s%nia d% #li>#rm%s+ =. #roducción de indol (B) H Bnocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a 2@* por %& I % . H /dicionar entre '.% y '. m de reactivo de Jovacs.
H a presencia de una coloración ro6a en la superficie del tubo se considera una prueba positiva. %. #roducción de ácidos mi0tos (;o6o de metilo, ;M) H Bnocular un tubo adicional con caldo ;M-K# e incubar a 2@* por &C I % . H /dicionar 2 otas de solución de ro6o de metilo. H 9e considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color ro6o. ?n color amarillo es una prueba neativa. . #roducción de metabolitos neutros (Koes-#rosLauer K#) H Bnocular un tubo con caldo ;M-K# e incubar a 2@* por &C I % . H /dicionar '. m de solución K#= y '.% m de solución K#% y aitar. H De6ar reposar durante =' minutos sin aitar el tubo se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie, ópe, N. *. (=1C&).
"<
En)m%r% las ara$%r's$ias d%l &r)/# #li>#rm%
El rupo contempla a todas las bacterias ent!ricas 5ue se caracterian por tener las siuientes propiedades bio5u8micas: ser aerobias o anaerobias facultativas ser bacilos 7ram neativos no ser esporóenas (9i es 7ram neativo "O esporula), ;ibes, M. E. (%''%).
<
Esri"a 9 &én%r#s - %s/%i%s d%l &r)/# #li>#rm% - #li>#rm% >%al+
*oliforme 7!nero Escericia Jlebsiella Enterobacter
*oliforme fecal 7!nero Enterococcus 9treptococcus. Escericia
Especies E. albertii E. blattae J. oaenae J. pneumoniae E. cloacae E. saLaaLii
Especies E. faecium E. columbae 9. bovis 9. e5uinu E. coli, *ase, *. . (%'').
d< La d%$%rminai,n d%l NMP #ns$a d% $r%s %$a/as5 /r%s)n$i*a( #n>irma$ia( #m/l%m%n$aria+ D%sri"ir ada )na d% >#rma r%s)mida+ En la fase presuntiva el medio de cultivo 5ue se utilia es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperación de los microoranismos daados 5ue se encuentren presentes en la muestra y 5ue sean capaces de utiliar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se e mplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de a5uellos microoranismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. a determinación del nmero más probable de microoranismos coliformes fecales se realia a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir as cuando son incubados a una temperatura de &&.2 I '.=@* por un periodo de %& a &C . a bs5ueda de Escericia coli se realia a partir de los tubos positivos de caldo E*, los cuales se siembran por aotamiento en medios selectivos y diferenciales (/ar Mac *onLey,
/ar eosina aul de metileno) y posteriormente realiando las pruebas bio5u8micas básicas (BMKi*) a las colonias t8picas.
2II+
C#nl)si#n%s 9e determinó 5ue Escherichia coli indica el 8ndice de contaminación fecal más adecuado, en la mayor8a de las circunstancias, las poblaciones de coliformes termotolerantes se componen predominantemente de E. coli por lo 5ue es el microoranismo de elección para los proramas de monitoreo para la verificación, incluidos los de viilancia sanitaria en el consumo de alimentos. 9e obtuvo 5ue la determinación de microoranismos coliformes totales por el m!todo del "mero más #robable ("M#), se fundamenta en la capacidad de este rupo microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y as al incubarlos a 2@* durante %& ., utiliando un medio de cultivo 5ue contena sales biliares. 9e analió 5ue el aislamiento de la bacteria E. coli en alimentos da alto rado de certea de contaminación de orien fecal, alrededor del 11 3. 9in embaro, el aislamiento de este microoranismo no permite distinuir si la contaminación proviene de e0cretas umanas o animales, lo cual puede ser importante, puesto 5ue la contaminación 5ue se desea abitualmente controlar es la de orien umano, 9u presencia se interpreta como una indicación de 5ue los oranismos patóenos pueden estar presentes y su ausencia indica 5ue el aua o el alimento estudiado se allan e0entos de oranismos productores de enfermedades. Estos microoranismos tambi!n se utilian como indicadores de desinfección, pero los análisis son muco más lentos y menos fiables 5ue la medición directa de la concentración residual de desinfectante. /demás, E. coli es muco más sensible a la desinfección 5ue los protooos y virus ent!ricos, #ascual, K. *. y. (=111).
2III+
Bi"li#&ra>'a
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