Pedro C. Lara Jiménez (1) , Domingo Navarro Bosch (2) y Marta Lloret Sáez Bravo (1) (1)
Servicio de Oncología Radioterápica Hospital General de Gran Canaria “Dr. Negrín” (2)
Laboratorio de Fisiología Centro de Ciencias de la Salud Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Instituto Canario de Investigación del Cáncer (ICIC)
ÍNDICE: 1.
CINÉTICA CELULAR
Ciclo celular Apoptosis Cuantificación de la proliferación y de la apoptosis
2.
CINÉTICA TUMORAL Compartimentos celulares Parámetros de cinética Modelos de crecimiento
3.
CRECIMIENTO TUMORAL: Heterogeneidad tumoral y metastatización
4.
BIBLIOGRAFÍA
1.
CINÉTICA CELULAR 1.1 Ciclo celular Se denomina ciclo celular a la sucesión de eventos que tienen como resultado la
duplicación del material genético y la segregación en dos copias que dotarán a las dos células hijas. El ciclo celular se divide en cuatro fases: G1,S,G2 y M (Figura 1). La fase G1 ( "Gap" o intervalo) sigue a una división celu lar y es previo a la replicación del DNA. Su duración es de unas 6 horas. En esta fase se produce el crecimiento plástico de la célula, incrementando su tamaño, y desarrollando una u na situación de síntesis continua de sus estructuras. En este momento, las células toman su decisión de dividirse y por tanto de progresar a lo largo del ciclo celular o bien entrar en estados alternativos al ternativos como la diferenciación o la quiescencia celular (Fase G0). En est e -1-
Pedro Carlos Lara Jiménez et al.
punto denominado START o punto de restricción R, la célula debe salir de G1 y entrar en fase S, para iniciar la replicación del DNA. La decisión de continuar con el ciclo celular, depende de que las condiciones propias y ambientales sean adecuadas (nutrientes, factores de crecimiento, inhibidores, contacto célula a célula, etc). En la fase S (Síntesis) se duplica el DNA y tiene una duración de 6 a 8 horas. Así, cada cromosoma pasa a tener dos moléculas de DNA de cadena doble (cromátidas), la original y la copia. En la fase G2 las células se preparan para la división celular. Tiene una duración de 3-4 horas. Al final de la misma, se sitúa un segundo punto de decisión, previo al comienzo de la mitosis, el punto de control G2-M. Su función es asegurarse de que el DNA no contiene errores y está preparado para segregarse en la mitosis. Una vez superado este control, la célula entra en mitosis (M) que se subdivide en 4 fases. Previamente, los cromosomas sufren un fenómeno de conden sación y se empieza a formar el huso mitótico a través de la organización de los microtúbulos en dos cuerpos polares. En l a profase desaparece la membrana nuclear, uniéndose los cromosomas a los microtúbulos en la zona central de la célula (metafase). Hacia el final de esta fase, se define otro punto de control (M), que permitirá continuar con la mitosis, solo si la disposición de los cromosomas en el huso mitótico es la adecuada. En la anafase, las cromátidas se separan y migran hacia los polos celulares. Una vez estos son alcanzados (telofase), la célula se divide por la zona central dando lugar a dos nuevas células.
Figura 1 Una gran variedad de proteínas, controla y coordina el ciclo celular en células eucariotas. Las principales son las quinasas dependientes de ciclina (Cyclin-Dependent Kinases "CDKs"), que consisten en dos subunidades mayores, una catalítica y otra su bstrato (ciclina). Existen varios tipos de subunidades catalíticas, cuya actividad quinasa depende de su asociación con las ciclinas. Esta actividad quinasa, permite fosforilar proteínas, lo que se traduce en cambios en la actividad o estructura de las mismas. -2-
Existe también una gran variedad de ciclinas, que son necesarias en diferentes momentos del ciclo celular, fluctuando por tanto sus niveles en las distintas fases. Así algunas están elevadas en fase G1(ciclinas D y E), otras en G2/M o ciclinas mitóticas (A y B). Estas variaciones en la formación de complejos CDK-ciclina, es la reponsable de cambios en la actividad de ciertas proteínas, que promueven la progresión del ciclo celular. Así las ciclinas G1 se unen a CDKs durante G1 permitiendo el inicio de la fase S, mientras que las ciclinas mitóticas se unen a CDKs durante la fase G2, favoreciendo la entrada en mitosis. La regulación de los diversos puntos de control es compleja. El proceso central en la regulación de este "restriction checkpoint"(punto de control de restricción, R), es la fosforilación o defosforilación de la proteína codificada por el gen retinoblastoma (Rb). Cuando Rb está hipofosfo rilada, inhibe a E2F, evitando que éste induzca la expresión de genes que regulan la síntesis de DNA. La fosforilación de Rb conlleva alteraciones, que impiden su unión y por tanto la inhibición de E2F, quedando esta libre para promover la síntesis de DNA. El punto de restricción R se regula por diversas CDKs, reguladas a su vez por inhibidores (CDKIs) y otros moduladores. p21 CIP/WAF1, p27KIP1 y p57KIP2 inhiben tanto los complejos ciclina D-CDK4/6 como a los complejos ciclina E-CDK2 y ciclina A-CDK2 . p16INK4a, p15INK4b, p18INK4c y p19INK4d, interfieren de forma más selectiva sobre los complejos ciclina D-CDK4/6. La síntesis de ciclina D es inducida por factores de crecimiento y disminuida por inhibidores de la proliferación. La formación del complejo ciclina D-CDK4/6 provoca la fosforilación de Rb (completada posteriormente por ciclina E-CDK2), liberando a E2F. Además el complejo ciclina D-CDK4/6, secuestra los inhibidores de CDK2 (p21 CIP/WAF1, p27KIP1), lo que reduce el efecto inhibidor de estos CKIs sobre ciclina E-CDK2, incrementando la capacidad de fosforilación de CDK2 sobre Rb. Es evidente que alteraciones que conlleven altos niveles de ciclinas (D,E), sobreactivación de CDK4/6 ó 2 o pérdidas de inhibidores de quinasas dependientres de ciclinas(CDKIs) como p16INK4a, favorecerán la progresión del ciclo celular mediante, la supresión de este punto de control. Otras alteraciones en relación con Rb que causarían este fenómeno, serían el secuestro de la proteína por oncoproteínas virales o la pérdida (delección) del propio gen. Otro gen central en la regulación de este punto de restricción es el gen p53. Así, ante la presencia de un daño en el DNA, p53 se acumula induciendo la expresión de p21 CIP/WAF1, lo que conlleva el bloqueo de este punto de control R a través de la inhibición de los complejos cicli na D-CDK4/6 y complejos con CDK2. Una vez reparado el daño, p53 reinicia el ciclo mediante la sobreexpresión de MDM2. Si el daño no es reparado, p53 induce apoptosis o muerte celular programada, entre otros induciendo al gen proapoptótico Bax. Delecciones, mutaciones en el gen p53, secuestro proteico (infección HPV) etc, supondrían por tanto alteraciones de la progresión celular similares a las descritas previamente. En la fase S, el complejo ciclina A-CDK2 induce cambios en la estructura del DNA, controlando algunos aspectos de la síntesis de DNA.
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Pedro Carlos Lara Jiménez et al.
Otro de los puntos de control es el llamado G2/M, cuya función principal es asegurar la integridad del DNA, evitando la transmisión de mutaciones debidas a alteraciones cromosómi cas. Su regulación está controlada por la ciclina B y la quinasa Cdc2/CDK1. Los complejos ciclina B1-Cdc2/CDK1 son activados y translocados desde el citoplasma al núcleo favoreciendo la mitosis. La degradación de la ciclina B en la transición metafase-anafase, provoca la inactivación de Cdc2/CDK1 y la finalización de la mitosis. Las células tumorales, suelen tener alterado este punto de control. El punto de control M, evita los errores en la formación del huso acromático y de la placa ecuatorial y asegura el adecuado reparto de material genético entre las dos células hijas. Todos estos puntos de control, permiten que la ordenada progresión a través del ciclo celular, se produzca cuando la integridad del material genético está asegurada, permitiendo además la influencia de señales externas. La activación de estos controles y la subsequente detención del ciclo celular, permite evitar la progresión de células con daños en el DNA. Estos daños pueden ser causados por factores externos (drogas,radiaciones etc,) o por causas propias de la célula (reordenamientos genéticos, DNA parcialmente degradado por acción de nucleasas, acortamiento de los telómeros ("envejecimiento celular"). La progresión de células con daños graves, dará lugar a la inestabilidad genética y la adquisición por parte de la célula de características oncogénicas. En general la proliferación celular está sometida a la presencia de factores externos (factores de crecimiento, interacciones con otras células, nutrientes, etc). Los factores de crecimiento son generalmente proteínas, que actúan mediante uniones de alta afinidad a estructuras moleculares especificas presentes en la membrana celular, llamadas receptores. Estos factores de creci miento pueden ser inductores (en su gran mayoría) o supresores (TGFb) de la proliferación celular, a través de la promoción de la diferenciación celular, la movilidad y la adhesión celular entre otros. Los factores de crecimiento producidos por las células, actúan sobre otros elementos celulares por mecanismo endocrino (células situadas a distancia), mecanismo paracrino (células adyacentes) o por mecanismo autocrino (sobre sí misma). De forma sucinta, una vez unido el factor de crecimiento a su receptor, se inicia una cascada de procesos bioquímicos denominada sistema de transducción de señales, que permite la llegada de esta señal proliferativa hasta el núcleo, do nde, por ejemplo, por inducción de la expresión de Ciclina D, se favorece la proliferación celular. Los receptores de factores de crecimiento tienen 3 zonas o dominios importantes.
S
extracelular, que permite la unión con el ligando (factor de crecimiento), lo que induce la dimerización del receptor.
S
transmembranal, que sirve de anclaje en la membrana
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Proliferación Tumoral
S
citoplasmático, que tiene capacidad quinasa, fosforilando aminoacidos propios (mayoritariamente de tirosina, tirosin-quinasas) autofosforilándose o transfosforilándose, e induciendo nuevas fosforilaciones en proteínas que se unen a sus residuos de tirosina fosforilados. Estas proteínas tienen a su vez actividad quinasa, consiguiendose la transmisión de la señal (amplificada y diversificada) hasta el núcleo, a través de la activación sucesiva y posterior translocación nuclear de algunas de estas proteinquinasas. Este sistema de transducción de señales, induce la expresión de mediadores de la proliferación celular.
1.2
Apoptosis Debe existir un balance entre proliferación y muerte celular, de forma que el tejido no
crezca indefinidamente. Este tipo de muerte celular, se debe a la decisión de la propia célula de morir, también llamada apoptosis, muerte genéticamente programada, o "suicidio celular". Es por tanto un mecanismo de indudable importancia, en el modelado de nuestro organismo (periodo embrionario) y en el mantenimiento adecuado de nuestras funciones. Este proceso se debe a la activación de mecanismos específicos regulados por decenas de genes. De forma sucinta, la presencia de un daño en el DNA induce la sobreexpresión de p53, que detiene el ciclo celular. Si el daño no es reparado, p53 induce la expresión de Bax, un gen de la familia de BCL-2 con la que comparte gran parte de su estructura, y con la que puede forma heterodímeros. Si Bax predomina, la célula entrará en apoptosis. Si BCL-2 predomina, la célula entrará de nuevo en ciclo, portando graves defectos en su DNA, que puede comportar la adquisición de capacidades oncogénicas. La regulación de este fenómeno es mucho más compleja, pero se mantiene una estructura fina de genes inductores e inhibidores de la apoptosis. La característica fundamental de la apoptosis es la rotura del DNA en fragmentos homogéneos de aproximadamente 180 pares de bases. La muerte celular debida a deprivación de nutrientes, agentes tóxicos etc, tienen unas características distintas y se denomina necrosis.
Apoptosis
Necrosis
Programada genéticamente y selectiva
Accidental, no programada, no selectiva
No inflamación
Reacción inflamatoria
Encogimiento y fragmentación celular
Aumento del volumen y ruptura celular
Organelas intracelulares no alteradas
Ruptura de organelas intracelulares.
Fragmentos homogéneos de ADN
Fragmentos de ADN heterogéneos
Tabla 1. Características diferenciales de la apoptosis y la necrosis
-5-
Pedro Carlos Lara Jiménez et al.
1.3
Cuantificación de la proliferación y de la apoptosis La estimación de la capacidad proliferativa de los tumores y de la expresión del
fenómeno apoptótico, no es una cuestión baladí. Existe una correlación entre apoptosis y proliferación en tejidos sanos, pero también en tumores (Figura 2). Una mayor tasa de proliferación se ha asociado con peor pronóstico en la mayoría de los tumores, y una peor respuesta a los tratamientos oncológicos con quimioterapia y radioterapia. Así mismo, el porcentaje basal de células apoptóticas o la capacidad de inducir la muerte celular por diversos tratamientos, han demostrado un relevante papel pronóstico y predictivo de respuesta a tratamientos oncológicos.
MAMA
Pérez, Tesis 1998
Figura 2
Existen diversas técnicas para estimar la extensión de la expresión de estos fenómenos en los tumores, algunas de las cuales describimos de forma resumida. Así, en laminillas diagnósticas, teñidas con hematoxilina eosina, puede realizarse el recuento de mitosis y células apoptóticas, lo que permitirá información aproximada de acerca de estos fenómenos en un paciente concreto. (Figura 3). Sin embargo, las células proliferativas, no siempre están en mitosis, y por otra p arte hay células apoptóticas, en las que aún no se han hecho visibles los cambios morfológicos que requieren su diagnóstico de visu. De esta forma se utilizan técnicas de inmunohistoquímica, que en principio permitirían mejorar estos aspectos de detección, a la vez que podrían hacer mas objetiva su evaluación. -6-
Proliferación Tumoral
La inmunotinción con Ki67 permite detectar todas las células en ciclo celular, por lo que podría ser una buena medida de la fracción de crecimiento (Figura 4). Los ensayos TUNEL, que marcan la incorporación de bases nitrogenadas en el DNA fragmentado permitirían detectar precozmente la apoptosis.
Figura 3
Figura 4
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Pedro Carlos Lara Jiménez et al.
Sin embargo, estas técnicas de inmunohistoquímica permiten la evaluación de un número limitado de células. La utilización de citometría de flujo favorece el análisis de miles de células en espacios de tiempo corto. Tanto la proliferación, estimada a partir del porcentaje de células en fase S, como la apoptosis estimada mediante la tinción con yoduro de propidio y annexina V, son técnicas adecuadas de medida. Es posible realizar técnicas mas complejas de biología molecular o hibridación in situ.
2.
CINÉTICA TUMORAL 2.1 Compartimentos celulares:
S
Fracción de crecimiento. Es el porcentaje de células proliferativas, en ciclo celular. Representa por tanto, la proporción de células del tumor que contribuye al crecimiento del mismo. El tamaño de la fracción de crecimiento varía en un mismo tumor, en función de las condiciones ambientales, acceso a nutrientes, oxigenación, etc. Estas condiciones están directamente realacionadas entre otros aspectos, con el volumen tumoral y por ende la distancia a los capilares nutricios. Así el tamaño de la fracción de crecimiento es inversamente proporcional al volumen tumoral.
Células en fase G0
Células proliferantes
Células estériles
Células muertas
Fig 5: Compartimentos celulares de un tejido
S
Fracción de pérdida celular. Es el porcentaje de células que pierde el tumor. Entre las causas se encuentran la muerte celular, bien por apoptosis o necrosis (falta de nutrientes y oxigenación) y la mestatatización. Efectivamente la presencia de un microambiente tumoral hostil, asociado a la presencia de -8-
Proliferación Tumoral
subclones tumorales con capacidad de mestatatización provocan la pérdida celular hacia otros órganos. La fracción de pérdida celular se incrementa de forma proporcional con el volumen tumoral.
S
Fracción de células quiescentes . Es el porcentaje de células que se encuentran en fase G0, y que pueden ser reclutadas para entrar en ciclo celular, si las circunstancias ambientales o la presencia de fuertes estímulos proliferativos, así lo demandan.
S
Fracción de células estériles o diferenciadas. Es el porcentaje de células que no contribuyen al crecimiento tumoral.
2.2
Parámetros de cinética celular: Tiempo de ciclo: es el tiempo que tarda una célula en completar un ciclo completo, desde una mitosis a la siguiente. El tiempo de ciclo, muestra grandes variaciones de unas poblaciones celulares a otras.
Tiempo de duplicación: es el tiempo que tarda un tumor en duplicar su volumen. Este tiempo de duplicación, no es el mismo para todos los tumores, ni se mantiene estable durante toda la vida del tumor. Así cuando, el volumen tumoral es pequeño, la accesibilidad a los nutrientes y al oxigeno, supondrán unas mejores condiciones ambientales, por lo que la fracción de crecimiento será grande y la fracción de pérdida celular y de quiescencia será pequeña. Como consecuencia, el tiempo que tardará el tumor en du plicar su tamaño, será corto. Sin embargo cuando el tumor ha incrementado su volumen, el microambiente tumoral, será peor, debido a la falta de nutrientes y oxigenación en grandes regiones del mismo, por lo que la fracción de crecimiento será menor y las fracciones de pérdida celular y quiescencia serán mayores. Como consecuencia su tiempo de duplicación será mas largo.
2.3
Modelos de crecimiento Gran parte de la vida de un tumor, discurre de forma subclíni ca. Así clásicamente se ha
definido un "umbral de detección clínica" por debajo del cual la enfermedad tumoral, aunque presente no es detectable por la exploración clínica o las pruebas diagnósticas. De forma teórica, es necesaria la presencia de 109 células en el tumor, lo que correspondería a un centímetro de diámetro, para traspasar -9-
Pedro Carlos Lara Jiménez et al.
este umbral. Existen dos modelos de crecimiento, el exponencial y el gompertziano. 109 células es el umbral de detección clínica.
En el modelo exponencial: la fracción de crecimiento y el tiempo de duplicación permanecen constantes. (Figura 6).
109
Figura 6
En el modelo gompertziano: Los parámetros anteriores varían con el volumen del tumor y el microambiente tumoral, es decir, que los tumores pequeños crecen más rápido, pero al aumentar el tamaño, la fracción de crecimiento disminuye (por muerte celular, falta de "alimento", de O2....). (Figura 7).
109
Figura 7
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Proliferación Tumoral
3.
CRECIMIENTO TUMORAL Los tumores son heterogéneos. Si bien su origen es monoclonal (un tumor procede de una
misma célula), la constante promoción celular, permite la aparición de mutaciones, que sobrepasando los mecanismos de control, originan subclones celulares, con diferente carga genética y expresión fenotípica, constituyendose un tumor clínico de caracter policlonal. Estas subpoblaciones tienen diferentes características: afinidad, capacidad de metastatización, expresión de fenotipo receptorial para hormonas o factores de crecimiento, sensibilidad o resistencia a fármacos. Esta heterogeneidad tumoral es una de las principales limitaciones en el diagnóstico, estimación del pronóstico y efectividad de los tratamientos de los cánceres en la práctica clínica diaria.(Figura 8). El fenómeno que define la malignidad de un tumor es la aparición metástasis. El proceso de la mestatatización se inicia temprano, en la etapa de crecimiento subclínico de la enfermedad. No todos los subclones que componen un tumor tienen igual tenden cia a la metastatización. Esta heterogeneidad tumoral, limitará, como ya hemos descrito, la posibilidad de control tumoral por tratamient os oncológicos e impedirá la estimación pronóstica exacta para cada paciente concreto (Figura 9).
M etastasis
109
109
Figura 9
Figura 8
4.
BIBLIOGRAFÍA
1.
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2. 3. 4. 5.
-11-
Pedro Carlos Lara Jiménez et al.
6. 7. 8. 9.
Oltvai ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog Bax, that accelerates programmed cell death Cell 1993; 74:609 Vermeulen K, Van Bockstaele DR, Berneman ZN.The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Prolif. 2003 Jun;36(3):131-49 Yu J, Zhang L.Apoptosis in human cancer cells. Curr Opin Oncol. 2004 Jan;16(1):19-24. Yamasaki L.Role of the RB tumor suppressor in cancer. Cancer Treat Res. 2003;115:209-39.
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