Trabajo Práctico Nº 1
Introducción
Objetivo
Fundamento
Materiales
Procedimiento
CONTROL MICROBIOLÓGICO DE MATERIAS PRIMAS Y PRODUCTOS FARMACÉUTICOS NO ESTÉRILES
Resultados
Conclusiones
Actividades adicionales
INTRODUCCIÓN
Bibliografía
Durante el proceso de fabricación, almacenamiento y uso, los medicamentos son susceptibles de contaminarse con microorganismos como bacterias, mohos y levaduras, y por consiguiente se pueden deteriorar.
La contaminación de los productos farmacéuticos, representa un riesgo para la salud del usuario; este riesgo se relaciona con la severidad de la infección o enfermedad que los microorganismos contaminantes, patógenos u oportunistas, pueden producir. Por otra parte, el deterioro microbiano podría conllevar a cambios en las características físicas y químicas que conducirían a que el producto deteriorado no sea apto para ser usado. Es por ello, que las materias primas y los productos farmacéuticos terminados, deben ser sometidos a un análisis microbiológico que demuestre que cumplen con ciertas especificaciones establecidas por los organismos oficiales, para garantizar que los productos son adecuados para el uso al que están destinados.
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Este análisis o control microbiológico de las materias primas y de los productos medicamentosos no estériles, involucra la realización de dos tipos de ensayos: a. Recuentos microbianos, referidos básicamente al recuento total de bacterias aerobias mesófilas y/o recuento de mohos y levaduras. b. Investigación de microorganismos patógenos objetables, llamados también indicadores específicos, como Escherichia coli, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus . OBJETIVO Al finalizar el trabajo práctico, el estudiante estará en capacidad, mediante la conconsulta bibliográfica y la aplicación de las técnicas microbiológicas, de realizar el control microbiológico de materias primas y productos farmacéuticos no estériles, utilizando metodologías oficiales (USP). FUNDAMENTO Consiste en determinar el número de bacterias aerobias mesófilas y el número de mohos y levaduras en materias primas y productos farmacéuticos no estériles, y realizar la investigación de los microorganismos objetables que puedan estar presentes en ese producto, mediante técnicas de siembra en placas. 1. Numeración de bacterias aerobias mesófilas. Recuento en placas (Método del vaciado en placas). MATERIALES Muestras de materias primas y medicamentos Placas estériles Pipetas estériles de 1 mL y de 10 mL Propipetas Tubos de agar soya-caseína (18-20 mL) fundido y enfriado a 45-50ºC Frascos de dilución con buffer fosfato pH 7.2 Baño de María a 45-50ºC Estufa o incubadora Contador de colonias PROCEDIMIENTO 1. Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la muestra homogeneizada por agitación, y añadirlos a un frasco de dilución que contiene 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 estéril. Agitar el frasco vigorosamente (25 veces). Rotular 10-1. 2. Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la dilución 10-1 a un frasco de dilución con 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 estéril. Agitar. Rotular 10--2.
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3. Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la dilución 10-2 a un frasco de dilución con 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 estéril. Agitar. Rotular 10--3. 4. Con una pipeta estéril, estéril, transferir porciones de 1 mL de la dilución 10-1 a cada una de 2 placas de Petri estériles. 5. Con una pipeta estéril, transferir porciones de 1 mL de la dilución 10-2 a cada una de 2 placas de Petri estériles. 6. Con una pipeta estéril, transferir porciones de 1 mL de la dilución 10-3 a cada una de 2 placas de Petri estériles. 7. Verter en cada una de las placas, 15 mL de agar soya caseína, fundido y enfriado a 45ºC, mezclando cuidadosamente las muestras con el agar. Dejar solidificar e incubar en posición invertida a 37ºC por 48 horas.
Esquema para la numeración de bacterias aerobias mesófilas.
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RESULTADOS Contar el número de colonias en las placas usando el contador de colonias. Calcular el número de microorganismos viables por mL de muestra, expresado como unidades formadoras de colonias por mL (u.f.c./mL) (ver Anexo de notación científica y diluciones). Anotar los resultados: Número promedio de de colonias (seleccionar las placas placas que tengan entre 30 y 300 colonias por placa):
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Factor de dilución de las placas seleccionadas: _____________________ Número de u.f.c./mL:
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CONCLUSIONES __________________________________________________________________
2. Numeración de mohos y levaduras. MATERIALES Muestras de materias primas y medicamentos Placas estériles Pipetas estériles de 1 mL y 10 mL Propipetas Tubos de agar Sabouraud o papa-glucosa (18-20 mL) fundido y enfriado a 4550ºC. Frascos de dilución con buffer fosfato pH 7.2 Mechero Baño de María a 45-50ºC Estufa o incubadora Contador de colonias PROCEDIMIENTO Proceder de la misma forma descrita para la numeración de bacterias aerobias mesófilas, pero utilizando agar Sabouraud o agar papa-glucosa, en vez de agar soya caseína, e incubar las placas (sin invertir) a 20-25ºC por 5 a 7 días. 1. 4
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RESULTADOS Contar el número de colonias en las placas usando el contador de colonias. Calcular el número de mohos y levaduras por mL de muestra, expresado como unidades formadoras de colonias por mL (u.f.c./mL) (ver Anexo de notación científica y diluciones). Anotar los resultados: Número promedio de colonias (seleccionar las placas que tengan entre 30 y 300 colonias por placa):
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Factor de dilución de las placas seleccionadas: _____________________ Número de u.f.c./mL:
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CONCLUSIONES __________________________________________________________________
3. Investigación de microorganismos patógenos objetables 3.a. Investigación de Salmonella (género) y Escherichia coli. MATERIALES Pipetas de 10 mL y de 1 mL Propipetas Placas estériles Caldo lactosado (90 mL) Caldo tetrationato Caldo selenito cistina Agar verde brillante Agar desoxicolato Agar sulfito bismuto Agar triple azúcar hierro (TSI) Agar MacConkey Agar Levine Asa y filamento Mechero Equipo para coloración de Gram Estufa 1. 5
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PROCEDIMIENTO Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la muestra a un balón que contiene 90 mL de caldo lactosado. Incubar a 30 - 35ºC por 24 a 48 horas. Aislamiento de Salmonella 1. Agitar la mezcla incubada y transferir 1 mL a un tubo con 10 mL de caldo selenito-cistina y 1 mL a un tubo con 10 mL de caldo tetrationato. Incubar a 35ºC por 12 - 24 horas. 2. Después del período de incubación, mediante un asa, hacer aislamientos a partir de los caldos selenito-cistina y tetrationato a los agares verde brillante, desoxicolato citrato y sulfito-bismuto. Incubar a 35ºC por 24 - 48 horas. 3. Notar Nota r la presencia de colonias típicas de Salmonella : Agar verde brillante: Pequeñas, incoloras, rosadas ó fucsias, transparentes u opacas, sobre el medio coloreado de rosado a rojo.
Agar desoxicolato- citrato: Pequeñas, incoloras, elevadas, opacas; algunas cepas producen colonias con el centro negro.
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Agar sulfito-bismuto: Marrones o negras, algunas veces con brillo metálico alrededor de la colonia ( S. typhi ). ). Algunas cepas producen colonias verdes con poco o ningún oscurecimiento del medio.
4. Si no hay colonias típicas, la muestra cumple los requisitos en cuanto a ausencia de Salmonella . 5. Si se encuentran colonias típicas, transferir a agar nutritivo inclinado y a agar hierro tres azúcares azúcares (TSI, triple triple sugar iron). Incubar a 35ºC por 18 - 24 horas. 6. Los cultivos típicos de Salmonella en agar TSI presentan la parte inferior del medio amarilla (formación de ácido) y el bisel rojo (alcalino), con o sin oscurecimiento, generalmente con formación de gas.
Bisel
Lactosa negativo
Taco
H2S positivo Glucosa positivo
Agar TSI (sin inocular)
Salmonella en agar TSI
7. Hacer una coloración de Gram: los miembros del género Salmonella , son bacilos Gram negativos no esporulados. 8. Confirmar la presencia de Salmonella por pruebas bioquímicas tradicionales y/o por sistemas miniaturizados tales como API o MicroID y mediante pruebas serológicas.
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Aislamiento de E. coli. 1. Con un asa, hacer un aislamiento a partir de caldo lactosado, a agar MacConkey. Incubar a 35ºC por 24 horas. 2. Las colonias de coliformes en agar MacConkey son de color rojo ladrillo, eventualmente rodeadas de zonas de bilis precipitada. 3. Si no hay colonias típicas, la muestra cumple los requisitos en cuanto a ausencia de coliformes. 4. Si hay colonias típicas, transplante una de estas colonias a agar eosina-azul de metileno-lactosa, según Levine. Incubar a 35ºC por 24-48 horas. Las colonias de E. coli en este medio, se caracterizan por dar color negro azulado al trasluz y brillo metálico dorado verdoso a la luz incidente.
E. coli
5. Transferir las colonias típicas del agar eosina-azul de metileno-lactosa (agar Levine), a agar nutritivo inclinado y a agar TSI. Incubar a 35ºC por 24 horas. 6. Los cultivos típicos de E. coli en agar TSI presentan el bisel amarillo, sin oscurecimiento y con formación de gas. Lactosa positivo
Bisel
Lactosa negativo
Taco
H2S positivo Agar TSI (sin inocular)
Glucosa positivo
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7. Hacer una coloración de Gram: E. coli es un bacilo Gram negativo no esporulado. 8. Confirmar la presencia de E. coli por medio de pruebas bioquímicas adicionales como por ejemplo el Test del IMViC, o utilizando sistemas miniaturizados tales como API o MicroID . 3. b. Investigación de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa .
MATERIALES Pipetas de 10 mL Propipetas Placas estériles Caldo Soya Caseína (90 mL) Agar Vogel-Johnson (o Baird Parker o manitol sal) Agar nutritivo inclinado Plasma EDTA (para coagulasa) Caldo cerebro corazón Agar cetrimide Papel de filtro Reactivo N,N-dimetil-p-fenilen diamonio dicloruro Asa y filamento Mechero Equipo para coloración de Gram Estufa PROCEDIMIENTO Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la muestra a un balón que contiene 90 mL de caldo soya-caseína. Incubar a 30 - 35ºC por 24 - 48 horas. Aislamiento de Staphylococcus aureus. 1. Agitar la mezcla incubada y mediante un asa hacer aislamiento a agar VogelJohnson (o agar Baird-Parker o agar manitol sal). Incubar a 35ºC por 24-48 horas.
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2. Las colonias típicas de Staphylococcus aureus en agar Vogel-Johnson o en agar Baird-Parker, son pequeñas, negras, rodeadas de una zona amarilla.
Agar Baird-Parker 3.
Agar Vogel-Johnson
Si no hay colonias típicas, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de Staphylococcus aureus.
4. Si hay colonias típicas, con ayuda de un filamento, transferir un número representativo de las colonias sospechosas a tubos de agar nutritivo inclinado. Incubar a 35ºC por 24 horas. 5. A partir de los tubos de agar nutritivo, hacer coloración de Gram: el S. aureus es un coco Gram positivo. Transplantar a tubos con caldo cerebro corazón. Incubar a 35ºC por 24 horas. 6. Efectuar Efe ctuar la prueba de coagulasa de la siguiente forma: En un tubo de Wassermann colocar 0,5 mL de Plasma EDTA (para coagulasa) reconstituido; añadir 2 gotas (0,1 mL) del cultivo de 24 horas del microorganismo desarrollado en caldo cerebro corazón. Incubar en baño de agua a 37ºC, durante 3 horas. Examinar al cabo de este tiempo y luego periódicamente durante 24 horas, para comprobar la formación de coágulos; cualquier grado de coagulación, por pequeño que sea , se considera positivo. Si no se observa coagulación, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de Staphylococcus aureus. 7. Confirmar Conf irmar la presencia de S. aureus por medio de pruebas bioquímicas.
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Aislamiento de Pseudomonas aeruginosa . 1. Mediante un asa hacer aislamiento del caldo soya caseína a agar cetrimide. Incubar a 35ºC por 24 horas. 2. Las colonias típicas de Pseudomonas aeruginosa en agar cetrimide son pequeñas, generalmente de color verdoso, con fluorescencia verdosa a la luz ultravioleta. 3. Si no hay colonias típicas, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de Ps. aeruginosa . 4. Si hay colonias típicas, transferir a agar nutritivo inclinado. Incubar a 35ºC por 24 horas. 5. A partir del agar nutritivo hacer una coloración de Gram: la Ps. aeruginosa es un bacilo Gram negativo no esporulado. 6. Efectuar la la prueba de oxidasa: En una placa de Petri colocar un disco de papel de filtro. Impregnar con el reactivo N,N-dimetil-p-fenilen diamonio dicloruro y dejarlo secar en la estufa. Con una pipeta Pasteur estéril con la punta cerrada, transferir una pequeña cantidad del cultivo del tubo de agar inclinado, al papel de filtro. El desarrollo de un color rosado, casi púrpura, se considera una prueba de oxidasa positiva.
Oxidasa positiva
7. Si esta última es negativa, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de Ps. aeruginosa. Oxidasa negativa
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8. Si la prueba de oxidasa es positiva, la presencia de Ps. aeruginosa debe confirmarse por pruebas bioquímicas adicionales. La validez de los resultados de los ensayos descritos (determinación del tipo de microorganismo), dependerá de la demostración de que las muestras bajo ensayo no presentan de por sí, efectos inhibidores de la multiplicación de los microorganismos que pudieran estar presentes. Por consiguiente, para demostrar el efecto inhibidor de las muestras, se realiza un ensayo adicional, preliminar o simultáneo considerado como control positivo que consiste en inocular los caldos de enriquecimiento que se utilizan en las técnicas descritas anteriormente, con 1 mL de una dilución 10-3 de un cultivo de 24 horas de cada uno de los microorganismos en investigación, añadir la cantidad apropiada de muestra y proceder de la misma forma como se describió para el ensayo de la muestra sola. RESULTADOS Anotar los resultados: __________________________________________________________________ __________________________________________________________________
CONCLUSIONES __________________________________________________________________
ACTIVIDADES ADICIONALES 1. Escoja un medio selectivo de los que Ud. utilizó en el trabajo trabajo asignado. Explique porqué fue seleccionado ese medio. 2. Qué significa el test del IMViC y cuáles microorganismos nos permite identificar. 3. Porqué en el medio agar TSI, se puede observar fermentación fermentación de azúcares y la producción de H2S. 1. 12
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4. En qué caso se considera que una placa proveniente de una numeración de microorganismos es contable. 5. Señale si existe alguna (s) diferencia (s) entre el método del recuento en placa por incorporación y el método del recuento en superficie. 6. Cuándo se considera que un producto está deteriorado y cuáles son las causas. BIBLIOGRAFÍA Brock T.D. Madigan M.T. Martenko J.J. y Parker J. (Eds) Biología de los microorganismos. 8ª Edición. Prentice P rentice Hall International. (1999). Prescott, L.M. y col. Microbiology. W.C. W .C. Brown Publishers. 4ª Edición. (1998). The Official Compendia os Standards USP 24 NF. The United States Pharmacopeia. The National Formulary. Pharmacopeial Convention Inc. Rockville MD (1999). www.bact.wisc.edu/bact102/102bactid2.html
Norma De Castro María Luisa De Curtis Enero 2002 Fotografías tomadas por el Farmacéutico Wilson Infante Agradecimiento al Preparador de la Cátedra Osmar Alvarado por la elaboración de los cultivos.
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