CRISTALIZACION DE PROTEINAS PROTEINAS Las proteínas son compuestos químicos muy complejos que se encuentran en todas las células vivas: en la sangre, en la leche, en los huevos y en toda clase de semillas y pólenes. Hay ciertos elementos químicos que todas ellas poseen, pero los diversos tipos de proteínas los contienen en diferentes cantidades. En todas se encuentran un alto porcentaje de nitrógeno, así como de oxígeno, hidrógeno y carbono. En la mayor parte de ellas existe azufre, y en algunas fósforo y hierro. Las proteínas son sustancias complejas, formadas por la unión de ciertas sustancias más simples llamadas aminoácidos, que los vegetales sintetizan a partir de los nitratos y las sales amoniacales del suelo. Los animales herbívoros reciben sus proteínas de las plantas; el hombre puede obtenerlas de las plantas o de los animales, pero las proteínas de origen animal son de mayor valor nutritivo valor nutritivo que las vegetales. Esto se debe a que, de los aminoácidos que se conocen, que son veinticuatro, hay nueve que son imprescindibles para la vida, y es en las proteínas animales donde éstas se encuentran en mayor cantidad. El valor químico (o "puntuación química") química") de una proteína se define como el cociente entre los miligramos del aminoácido limitante existentes por gramo de la proteína en cuestión y los miligramos del mismo aminoácido por gramo de una proteína de referencia. El aminoácido limitante es aquel en el que el déficit es mayor comparado con la proteína de referencia, es decir, aquel que, una vez realizado el cálculo, da un valor químico mas bajo. La "proteína de referencia" es una proteína teórica definida por la FAO con la composición adecuada para satisfacer correctamente las necesidades proteicas. Se han fijado distintas proteínas de referencia dependiendo de la edad, ya que las necesidades de aminoácidos esenciales son distintas. Las proteínas de los cereales son en general severamente deficientes en lisina, mientras que las de las leguminosas lo son en aminoácidos azufrados (metionina y cisteina). Las proteínas animales tienen en general composiciones mas próximas a la considerada ideal. El valor químico de una proteína no tiene en cuenta otros factores, factore s, como la digestibilidad de la proteína o el hecho de que algunos aminoácidos pueden estar en formas químicas no utilizables.. Sin embargo, es el único fácilmente medible. Los otros parámetros utilizados para evaluar la calidad de una proteína (coeficiente de digestibilidad, valor biológico o utilización neta de proteína) se obtienen a partir de experimentos dietéticos con animales o con voluntarios humanos.
La característica principal de un cristal es su estructura interna periódica y ordenada en tres dimensiones. El hecho de que un sistema renuncie a sus grados de libertad parece una contradicción desde el punto de vista entrópico y, sin embargo, la cristalización de moléculas es un fenómeno espontáneo y reversible cuyos parámetros cinéticos y termodinámicos dependen de las propiedades químicas y físicas del solvente y del soluto involucrados. La cristalización se produce cuando, bajo ciertas condiciones (de supersaturación), el sistema se dirige hacia el estado de equilibrio entre dos fases, una soluble y una sólida. A pesar de que las moléculas individuales pierden libertad rotacional y translacional, disminuyendo así la entropía del sistema, establecen al mismo tiempo nuevas interacciones. Esto reduce la energía libre del sistema y provée la fuerza directriz del proceso de ordenamiento. Las moléculas, por tanto, cristalizan minimizando su energía libre al disponerse periódicamente en unidades repetitivas y simétricas en el estado sólido, maximizando las interacciones intermoleculares favorables. La solvatación es un factor vital para la cristalización de macromoléculas. En soluciones extremadamente concentradas, donde no hay agua suficiente para mantener la hidratación, las moléculas pueden o bien agregar como un precipitado amorfo o bien cristalizar (figura 1). La estrategia para inducir la cristalización consiste en llevar al sistema hacia el estado de mínima solubilidad lentamente y lograr así un grado limitado de supersaturación. Para lograr que las moléculas tengan oportunidad de formar el mayor número de interacciones favorables con los vecinos se modifican las propiedades del solvente con agentes precipitantes o se alteran algunas propiedades físicas como la temperatura. 1. MÉTODOS PARA CRISTALIZAR La determinación de la estructura cristalográfica empieza con el crecimiento de un cristal adecuado. Para ello pueden aplicarse distintos métodos que se diferencian por las condiciones y solutos que emplean. Para decidir el método mejor para cristalizar una proteína determinada debemos entender los fundamentos de la cristalización. La formación de un cristal de proteína macroscópico que contiene hasta 10 15 moléculas, empieza con la aparición de agregados de proteína mediante contactos intermoleculares (agregación ). Estos agregados prenucleares eventualmente alcanzan el tamaño nuclear crítico. Una vez formado un núcleo estable (nucleación ), el crecimiento prosigue por la adición de moléculas a la red cristalina. Tanto la nucleación del cristal como el crecimiento ocurren en soluciones supersaturadas donde la concentración de proteína es mayor que su valor de solubilidad en equilibrio. La región del parámetro de solución aconsejable para la cristalización viene recogida en el diagrama de fase (figura 2). La supersaturación es una función de la concentración de la macromolécula y de diversos parámetros que afectan su solubilidad. En general, se logra a altas concentraciones de macromoléculas y a valores crecientes de parámetros de solución reductores de la solubilidad macromolecular. Los factores que pueden influir en la solubilidad proteica son por ejemplo, la inclusión de aditivos tales como
alcoholes, polímeros hidrofílicos y detergentes que puedan disminuir la solubilidad proteica. Estos son agentes precipitantes ya que influyen en la solubilidad, pudiendo causar la precipitación macromolecular. Otro factor que influye sobre la solubilidad proteica es la presencia de sal, que varía generalmente como una curva asimétrica en forma de campana indicando que la solubilidad decrece tanto a altas como a bajas concentraciones de sal. Parámetros de la solución tales como pH o temperatura también pueden afectar dramáticamente a la solubilidad macromolecular. Las condiciones de supersaturación óptimas para la nucleación y para el crecimiento del cristal son diferentes. Esto se muestra en el diagrama de fase donde la región de supersaturación es además dividida en regiones de más alta supersaturación (región lábil) donde tanto el crecimiento como la nucleación ocurren y la disminución de supersaturación (fase metastable) donde sólo se alcanza el crecimiento. El método de cristalización más simple. Los métodos de cristalización en baño (“batch”) consisten mezclar y dejar
reposar todos los componentes en una sola solución. La técnica puede miniaturizarse sumergiendo gotas pequeñas de proteína dentro de un aceite inerte. Este método funciona bien con la lisozima de huevo, catalasa y citocromo c554. Separación del proceso de nucleación y crecimiento. Dado que las condiciones ideales para la nucleación y crecimiento difieren, una estrategia lógica de cristalización involucra la optimización separada de esos procesos. Esto puede lograrse por siembra (“seeding”), una técnica donde los
cristales son transferidos de condiciones de nucleación a aquellas que sólo soportan el crecimiento. Métodos de cristalización que permiten nucleación transitoria y localizada en soluciones supersaturadas que promueven sólo el crecimiento. Estos métodos se basan en la capacidad de alcanzar condiciones de nucleación transitoria o local en una solución suficientemente supersaturada, que por el contrario promueve sólo el crecimiento. La temperatura de la solución es inicialmente ajustada para inducir la nucleación, y posteriormente cambiada para disminuir la supersaturación y permitir solo el crecimiento. Métodos de diálisis. Como los métodos de baño, la concentración macromolecular permanece constante durante la cristalización por diálisis. La diferencia es que en este método la composición de la solución es alterada difundiendo componentes de bajo peso molecular a través de una membrana semi-impermeable. Métodos de difusión de vapor. Las condiciones dentro de una solución que contiene proteína son manipuladas mediante la difusión a través del aire (figura 3). Como con los otros métodos de cristalización, el objetivo inicial es formar núcleos. En este método, la nucleación ocurre cuando se aumenta la concentración de proteína por medio de la reducción del volumen de la solución. Esto ocurre porque el vapor de agua de la gota que contiene la proteína se deshidrata buscando el equilibro con la solución de reserva más higroscópica. Como muestra la figura 3, una vez que se han alcanzado las condiciones de nucleación, la solución permanece altamente
supersaturada, de modo que puede producirse simultáneamente la nucleación y el crecimiento de cristales. Para evitar que los valores de supersaturación excedan los requeridos para la nucleación, se han diseñado métodos para alcanzar muy lentamente el equilibrio. A pesar que dentro de un marco teórico pareciera que las condiciones no son óptimas para cristalizar una proteína, la difusión de vapor por gota colgante (“hanging drop”) y gota posada (“sitting drop”) son amplia y muy
exitosamente usados para el crecimiento de cristales de proteína. El hecho que la mayoría de gotas de difusión de vapor no estén llenas de cristales microscópicos sugiere que el alto grado de supersaturación que motiva nucleación no es mantenido a lo largo del experimento de cristalización. Varios factores, incluso la disminución de concentración de macromolécula debido a la formación de núcleos o precipitados, la incorporación en cristales crecientes o la desnaturalización macromolecular en la interfase solución-aire podría disminuir la concentración proteica a valores menos propicios para la nucleación y más adecuados para el crecimiento. Figuras
Figura 1. Algunos cristales de proteínas crecidos mediante una variedad de técnicas y usando diferentes agentes precipitantes. (a) catalasa de hígado, (b) fructosa 1,6-difosfatasa, (c) proteína de unión a cortisol, (d) concanavalina, (e) catalasa de hígado, (f) proteína de función desconocida de piña, (g) factor de elongación Tu, (h) tRNA fenilalanina, (i) proteína de desenrollamiento de DNA, (j) glicerol 3-fosfato deshidrogenasa, (k) canavalina.
Figura 2. Diagrama de fase. La curva de solubilidad (sólida) divide el espacio de fase en regiones que promueven el proceso de cristalización (soluciones supersaturadas) de aquellas donde se disolverá el cristal (soluciones insaturadas). La curva de supersolubilidad (líneas entrecortadas) divide además la región supersaturada en condiciones de más alta supersaturación donde compiten la nucleación y crecimiento (fase lábil) y niveles menores donde sólo crecerán
cristales (fase metastable). Como se muestra, a mayores concentraciones macromoleculares, ocurre la supersaturación a medida que los valores de parámetros reductores de solubilidad disminuyen. Por ejemplo mayores concentraciones de sal (mayores valores de este parámetro reductor de solubilidad) son necesarias a menores concentraciones macromoleculares.
Figura 3. Diagrama esquemático de la cristalización por difusión de vapor. En este método de cristalización, las soluciones de proteína que contienen precipitante insaturado (indicado en el diagrama de fase por círculos abiertos) son suspendidos sobre un reservorio. El equilibrio, por medio de vapor de la gota y el reservorio, causa que la solución de la proteína alcance un nivel de supersaturación donde ocurren la nucleación y el crecimiento inicial (círculos sólidos). Como se ve en el texto, es probable que cambios en la concentración de la gota disminuyan la supersaturación a lo largo del tiempo del experimento (círculos sólido de izquierda).
En disolución acuosa, los aminoácidos muestran un comportamiento anfótero, es decir pueden ionizarse, dependiendo del pH, como un ácido liberando protones y quedando (-COO'), o como base , los grupos -NH2 captan protones, quedando como (-NH3+ ), o pueden aparecer como ácido y base a la vez. En este caso los aminoácidos se ionizan doblemente, apareciendo una forma dipolar iónica llamada zwitterion
CRISTALIZACION La cristalización es un proceso por el cual esos átomos, iones o moléculas se ordenan de tal forma que llegan a constituir cristales (formas geométricas que podemos apreciar a simple vista), manifestación visible de la estructura cristalina de sus componentes. "Si el proceso de cristalización se conduce en condiciones de casi equilibrio, la tendencia de las moléculas a depositarse en las superficies compuestas por moléculas semejantes produce un notable incremento en la pureza del material cristalino obtenido" (Pasto J. Daniel, 2003) La formación de cristales minerales tiene lugar en la naturaleza, fundamentalmente, según alguno de estos procesos: Precipitación (por evaporación del agua de una disolución), sublimación (paso de gas a sólido), solidificación (paso de líquido denso a sólido por enfriamiento) En todos los casos se requieren las adecuadas condiciones de espacio y tiempo. Cuanto mejores sean las condiciones, mayores serán los cristales que se obtengan. "No es raro conseguir una sustancia pura después de varias recristalizaciones en distintos solventes, a los que se añade a veces carbón activo como absorbente de las impurezas" (Hans Beyer, 1987) La cristalización es el proceso mediante el cual las moléculas se ordenan de un modo natural formando un retículo repetitivo que denominamos cristal. No es objeto de estas páginas hacer una presentación exhaustiva de las diferentes técnicas de cristalización que se pueden encontrar en muchos libros de texto o en diferentes páginas web, y sólo nos detendremos brevemente en algunas de las técnicas más extendidas que se usan para obtener cristales de proteínas. El experimento de cristalización comienza con una solución de proteína relativamente concentrada (entre 2 y 50 mg/ml) a la que, de algún modo, se le añade lentamente algún reactivo, con la intención de reducir la solubilidad de la proteína y generar una precipitación controlada de la misma. Si posteriormente se fuerza un incremento paulatino de concentración y se controlan las condiciones normalmente se generan diminutos núcleos cristalinos cuyo lterior crecimiento puede dar lugar a cristales de tamaño adecuado para los experimentos de difracción (entre 0.1 y 0.5 mm). La purificación de moléculas por cristalización está basada en la diferencia de solubilidad que presenta en distintos disolventes o en una mezcla de ellos.
El
proceso
de
cristalización
conlleva
las
siguientes
etapas:
• Disolución de la molécula impura en un disolvente a la temperatura de su punto
de
ebullición
o
próxima
a ella. • Filtración de la solución en caliente para eliminar l as partículas insolubles o impurezas • Enfriamiento de la solución para permitir que cristalice el compuesto • Separación de los cristales de las aguas madres por filtración • Determinación del punto de fusión del compuesto para comprobar su purez a • Repetición del proceso en caso de no haber conseguido la pureza deseada
Las características que debe presentar el disolvente para la cristalización son las siguientes: • Gran poder de disolución de la sustancia a su temperatura de ebullició n pero
bajo
a
temperatura
ambiente
• Bajo poder de disolución de las • Permitir la formación de buenos cristales de • Facilitar una buena separación de los cristales.
impurezas la sustancia
Técnicas de cristalización de proteínas Existen varias técnicas para cristalizar las proteínas, todas ellas basadas en alcanzar de una forma u otra un grado de sobresaturación de la disolución de proteína de forma que se formen unos pocos núcleos a partir de los cuales crecerán los cristales. GOTA COLGANTE El método más común para estos experimentos es el basado en la técnica de la gota colgante . Se colocan unos pocos microlitros (1- 2 μl) de la solución de proteína en el centro de un cubre-objetos de vidrio y se le añaden otros tantos microlitros de la solución del precipitante contenido en un pocillo, al cual previamente se le ha equilibrado su pH mediante un tampón. El cubre-objetos que contiene a la gota de mezcla se le da la vuelta y con él se tapa el pocillo mencionado. Este sistema cerrado evolucionará por equilibrio de vapor y como la mezcla de proteína y precipitante en la gota está menos concentrada que la solución de precipitante en el pocillo, el agua de ésta se evaporará, uniéndose a la solución del pocillo. Como resultado de este proceso, la concentración de la proteína y del precipitante aumentarán lentamente en la gota, y si las condiciones son las adecuadas, se formarán cristales. En el mercado existen cajas que contienen un número elevado de estos pocillos (24 o más), de tal modo que se puedan etiquetar y almacenar con facilidad para su ulterior observación a través de una lupa-microscopio, tal como se muestra en la figura de abajo. GOTA SENTADA Es el mismo proceso que la gota colgante pero esta se encuentra en la base del posillo. DIALISIS La diálisis es en método de separación liquido liquido similar a la ósmosis porque son dos líquidos de diferente concentración separados por una membrana semi permeable que en que la solución mas concentrada atraviesa la membrana para diluirse con la menos concentrada y así estar ambas concentraciones con la misma concentración.
