I.
CUESTIONARIO V 1. Qué materiales de laboratorio serian los indicados para ser esterilizados en estos equipos? Todos aquellos que estén en contacto directo con nuestra muestra o cultivo, y que puedan contaminar y cambiar el resultado de la experiencia buscada. 2. ¿Por qué es necesaria la esterilización? Porque permite la eliminación microbiana y por ende garantiza la no contaminación de muestras o cultivos, hechos fundamentales en la validez de un resultado en el laboratorio. 3. Elabore una tabla indicando otros materiales de laboratorio que se pueden esterilizar en autoclave y horno esterilizador. Materiales que se autoclavan Guantes de Caucho (Hule) 15 minutos Sondas (base tejida) 15 minutos Sondas (látex) 15 minutos Frascos de Vidrio, Cristalería en General 20 minutos Agua en frascos 20 minutos Jeringas de Vidrio 20 minutos Bandeja 30 minutos Equipo de transfusión 30 minutos Paquetes de maternidad 30 minutos Ropa 30 minutos Torundas 30 minutos Paquete quirúrgico 45 minutos Instrumental de acero inoxidable 45 minutos
II.
Materiales que se esterilizan en el horno Matraces Vasos de precipitado Pinzas Tubos de ensayo Buretas
CUESTIONARIO VI 1. Qué es agar, de donde se extrae? El agar-agar es una sustancia presente en algunos vegetales marinos, extraído principalmente de las algas rojas Gelidium. Por su alta capacidad para absorber agua, se hincha al contacto con ésta y produce un mucílago viscoso que al hervir forma una gelatina muy firme.
El agar-agar se extrae de las algas rojas Agarophytas, principalmente de las especies Gelidium y Gracilaria, dando agares de diversas características y calidades. Antiguamente, en Japón, el agar se obtenía solamente de algas Gelidium (Tengusa en japonés), pero a finales del s. XIX, debido al gran consumo mundial, se empezó a producir a partir de otro tipo de algas, principalmente la Gracilaria. 2. ¿Qué es gelatina de donde se extrae? La gelatina es una proteína natural que se obtiene del colágeno procedente de los tejidos conectivos de animales (la gelatina vegetal se conoce como agar-agar). Para su obtención, se extraen por hidrólisis las proteínas del colágeno obtenidas de la piel, hueso hervido y molido, pezuñas, huesos, tendones y vísceras de ganado vacuno, porcino, ovino, equino y avícola. Es decir, todo lo que no vale de los animales para venderlos en las carnicerías. 3. ¿Por qué se utiliza agua destilada en la preparación de los medios de cultivo? Porque el agua destilada está libre de otros microorganismos exteriores y así la prueba de cultivo saldrá más efectiva. 4. Elabore una tabla indicando medio de cultivo, tipo de medio, azúcar fermentable, sistema indicador, bacterias que se siembran, como se observa la bacteria. (10 medios de cultivo).
Medio de cultivo
Tipo de medio
Azucar fermenta ble
Sistem a indicad or
Bacterias que se siembran
Observacion
Agar eosina y azul de metileno
Diferenci al
Lactosa /sacarosa
Agar tioglicato
Selectivo
Tioglicato sin dextrosa
Streptococc us pyogenes
varios (presente s en la sangre)
Haemophilu s
Agar chocolate
Enriqueci do
Eosina
Todas las familias de las enterobacter ias
Clostridium perfringens
Y neisseria
Agar mueller hinton
Selectivo y diferenci al
Almidon
Neisseria y Moraxella
Agar verde brillante
Enriqueci do Selectivo y diferenci al
levadura
Salmonella
Agar cetrimida
Selectivo
Pseudomona s aeruginosa
Agar nutritivo
Medio basico
P. mirabilis
Agar sangre
Diferenci al y enriqueci do
varios (presente s en la sangre)
Estreptococ os hemoliticos
Agar salmonell a shigella
selectivo y diferenci al
Lactosa
salmonella shigella
Agar estafiloco cos 110
Selectivo y diferenci al
Levadura
E. coli
III.
CUESTIONARIO VII
1. ¿Cuándo realizaría cultivo por diluciones? Si el microorganismo que se busca en un cultivo mixto se encuentra en mayos cantidad que cualquiera de los otros microorganismos, es posible obtenerlo en cultivo puro mediante una serie de diluciones en tubo, del medio de cultivo apropiado. Cuando la muestra este muy diluida contendrá solamente la bacteria que buscamos. Aunque es recomendable confirmar mediante el procedimiento de la siembra en placa la pureza del cultivo que se aisló de la manera descrita. 2. Como se realizan los cultivos por diluciones en alimentos y agua, explique. El recuento por dilución proporciona una idea del número de organismos vivos presentes en una muestra que son capaces de multiplicarse en un medio líquido determinado. Se elige un medio líquido capaz de mantener el crecimiento de las bacterias que se están estudiando. Este método se utiliza cuando se sospeche un número muy bajo de gérmenes. Método
Hacer diluciones del alimento al 1/10. 1/100. 1/1000 o más si fuera necesario. (ver protocolo de diluciones).
Poner 1 mL de la última dilución en cada uno de los tubos de la última serie.
Hacer lo mismo con las demás diluciones de manera ascendente .
Incubar el tiempo necesario y a la temperatura adecuada según el que queramos investigar.
Pasado el tiempo de incubación hacer la lectura y anotar el número de tubos positivos de cada serie.
Consultar las tablas de probabilidad con el número de tubos positivos, Estos resultados se expresarán como número más probable de microorganismos por gramo o mililitro de alimento.
3. Que otras formas de siembra existe, explique. Siembra con rastrillo Sobre placa de Petri, con agar adecuado y con una muestra líquida. También se utiliza cuando previamente se ha incubado en un caldo de cultivo. Utilizado para realizar recuentos bacterianos. Con pipeta Pasteur esterilizada o micropipeta Se extrae pequeña cantidad de líquido, se deposita sobre el agar y se esparce utilizando rastrillo en base a una varilla de vidrio. Siembra con asa de cultivo Para traspasar colonias bacterianas de un agar a otro y en siembra de algunas muestras semisólidas y líquidas. Además para siembra de tubos: . Siembra en profundidad o picadura Asa hasta el fondo del agar. Para observar crecimiento de bacterias en la profundidad de éste. Siembra en placa por diseminación en superficie Para obtener colonias aisladas. Depositar asada de la muestra o cepa sobre superficie del medio de cultivo. Desde el borde de la placa, hacia el centro de ella en zig-zag. Siembra con Tórula Con tórula de algodón estéril, se pasa en distintas direcciones sobre agar en placa de Petri, girándola sobre si misma. Para siembra de secreciones y antibiograma.
IV.
CUESTIONARIO VII
1. Debido a que mecanismos se producen pigmentos en algunas colonias? Se debe a que su formación es dependiente de la presencia de la luz, composición del sustrato y la temperatura de incubación. Por ejemplo hay bacterias capaces de sintetizar pigmentos que se observarían tanto en medios generales como en medios con otros sustratos. Tenemos a los Micrococcus, tales como M. luteus y M. roseus producen colonias de color amarillo o rosa, respectivamente, cuando crecen sobre un medio sólido Están las Pseudomonas que sintetizan, según su especie, distintos pigmentos como por ejemplo la piocianina que azulea los cultivos permitiendo su identificación. La fluoresceína o pioverdina hace que las colonias adquieran un color verde fluorescente. Este pigmento lo posee Pseudomonas fluorescens. .
2. Elabore una tabla indicando las características de las colonias de las siguientes bacterias en el medio de cultivo:
BACTERIA
E. coli
Salmonella
Klebsiella
Azotobacter
TAMAÑO
Colonias medianas
Colonias grandes
Colonias grandes
Colonias medianas
FORMA
circular
circular
irregular
redonda
BORDE
redondeado
entero
ondulados
Circular
ELEVACIÓN
Convexa
convexa
Plano convexa
convexa
COLOR
Verde metálico
grisáceas
rosas
crema
LUZ TRANSMITIDA
Opaco
Bordes
opaco
Borde azuloso
transparente LUZ REFLEJADA
brillante
opaco
brillante
opaco
BACTERIA
Pseudomon a auriginosa
Staphylococus Clostridium Clostridiu aurius tetani m botulinum
Streptococos epidermidis
TAMAÑO
Colonias grandes
Colonias medianas
Colonias grandes
Colonias grandes
Colonias pequeñas
FORMA
elíptica
Circular
redonda
redonda
Elíptica
BORDE
irregular
redondeado
enteros
lobulado
redondeado
ELEVACIÓN
convexa
convexa
elevada
elevada
convexa
COLOR
Plomo metálico
blanco
Blanco crema
Blanco crema
Blanco griseado
LUZ TRANSMITID A
Opaco
Opaca
traslucida
opaca
Traslucida
LUZ REFLEJADA
Brillo metálico brillante
brillante
opaca
Opaco brillante
V.
CUESTIONARIO IX-X 1. Describa cada uno de los tipos de filtro mencionados. Filtro de tipo bujía.- Constituidos por tierras de diatomea, después de usarse deben cepillarse y hervirse con agua estéril, pueden ser de 3 tipos de acuerdo al tamaño del poro: ordinario, fino e intermedio. Filtros de porcelana.- Hechos en porcelana, sin vidrios y con varios tamaños de poros, por el más fino pasan únicamente ciertos virus pequeños. Filtros Seitz o discos filtrantes de asbesto.- Constituidos por asbesto de tipo crisólito (químicamente de silicato magnésico) insertados en un recipiente metálico conectado a un Erlenmeyer y conectados a una bomba de vacío, el disco tiene varios grados de porosidad: clarificación, normal y especial. Filtro de vidrio sintetizado.- Similar al anterior pero el disco está echo de vidrio finamente molido y fundido para conseguir la adherencia de las partículas. Filtros de membranas.- Compuestos por celulosa o de sus ésteres (nitrato de celulosa, acetato de celulosa) y politetrafluoretileno. Las membranas tienen varios diámetros y porosidad varía entre 8 y 0.01 micras. 2. Describa la técnica del antibiograma Consiste en el estudio de la sensibilidad o resistencia de determinado microorganismo (o grupo de ellos) a varios antibióticos. Se puede utilizar para tratar un patógeno, añadir a alimentos, en definitiva para saber cómo se comporta un germen frente a determinado antibiótico. El antibiograma se puede hacer tanto en medio líquido como en medio sólido. En nuestro caso vamos a utilizar un agar ordinario pero modificado de manera que gérmenes y antibióticos puedan difundir correctamente: agar de Muëller-Hinton. Se utilizan para poner los antibióticos, unos discos impregnados que llevan unas letras que nos indican el antibiótico del que se trata y un número que indica la concentración en mg/ml que tenía la disolución en la que se impregnaron. Ej: Cloranfenicol a concentración 30mg/ml Además utilizamos unas pinzas para poner los discos sobre el agar. Pipetas estériles para sembrar la placa. Un hisopo estéril para extender por la superficie el inóculo. Y asa de siembra y mechero para esterilizar.
Partimos de un cultivo puro de 48 horas. La cepa es potencialmente patógena de humano y como crece en nuestro cuerpo, la incubación se ha hecho a 37ºC. Vamos a sembrar 0.5ml que cogemos con la pipeta (agitando para resuspender las células del fondo) y lo vertemos sobre la placa. Con el hisopo estéril extendemos bien el inóculo por toda la superficie de la placa. Con las pinzas cogemos los cuatro discos de antibióticos y los ponemos en la placa bien separados entre sí y de los bordes. La placa se pone a incubar 48 horas a 37ºC y en posición invertida. Tras la incubación va a aparecer toda la superficie llena de colonias y alrededor de cada disco aparecerá o no un halo de inhibición dependiendo de que el germen sea sensible a ese antibiótico. El tamaño del halo nos va a permitir conocer el grado de sensibilidad al antibiótico o si es resistente. Puede aparecer un pequeño halo aun siendo resistente, esto se debe a la alta concentración de antibiótico en el medio inmediato al disco. 3. Explique sobre la actividad de los quimioterapicos Los quimioterápicos son sustancias con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostática) con toxicidad suficientemente baja como para poder ser administrados a un organismo por la vía adecuada, hasta alcanzar y mantener concentraciones eficaces en los tejidos. Las propiedades deseables de un quimioterápico siguientes:
ideal serían las
1) Que tenga toxicidad selectiva, es decir, actuar según el principio de “bala mágica” que daña al microorganismo respetando al hospedador 2) Que sea microbicida, es decir, que mate o inactive irreversiblemente el microorganismo, provocando la pérdida total de viabilidad. En el mundo real, sin embargo, hay muchos quimioterápicos microbiostáticos. En estos casos, los sistemas de defensa natural del hospedador (mecanismos de inmunidad) hacen el resto, eliminando el agente microbiano previamente inhibido por el quimioterápico. 3) Los microorganismos susceptibles no deberían desarrollar resistencias al quimioterápico. Pero desgraciadamente, en muchos casos, al cabo de un tiempo de uso del antimicrobiano comienzan a surgir cepas microbianas resistentes al mismo. La quimioterapia es una auténtica escalada de armamentos entre los microorganismos y los humanos, en los que ante una nueva arma de estos últimos los microbios pueden responder al cabo del tiempo con estrategias de resistencia, lo que obliga a un uso racional de los quimioterápicos, y a una búsqueda continua de nuevos agentes.
4) Que el quimioterápico sea efectivo contra un amplio espectro de microorganismos. Pero no existe (ni existirá) un solo agente capaz de inhibir a todos los microorganismos. Algunos antibióticos son de amplio espectro, pero no son eficaces contra todos los microorganismos. Por otro lado, existen quimioterápicos de espectro estrecho, pero muy selectivos contra ciertas bacterias que son patógenas importantes. 5) Que no sea alergénico, y que no tenga efectos secundarios. 6) Que permanezca de forma activa en plasma, tejidos, etc. durante el tiempo necesario. A ser posible, que sea soluble en agua y que alcance pronto la concentración terapéutica en los tejidos. 4. Explique la actividad de los diferentes tipos de radiaciones Radiaciones infrarrojas: Método usado en los centros de salud para esterilizar material e instrumentos de vidrio y metálicos por tiempos no mayores de 30 minutos desde el inicio hasta que se enfría el material, esta radiación alcanza temperaturas de 190ºC. Los microorganismos mueren por la oxidación como consecuencia del calor generado. Radiaciones U.V.: Son germicidas en una longitud de onda de 260 a 270nm. Son efectivas contra bacterias no esporuladas pero algunas esporas pueden sobrevivir si el tratamiento no se aplica con un tiempo efectivo. Este método de esterilización es usado en el laboratorio de microbiología para desinfectar superficies, aire, aguas, áreas de cirugía y cuartos estériles, no se trata de un agente esterilizante muy adecuado pues tiene bajo poder de penetración especialmente en atmósferas con excesiva cantidad de polvo o en aguas sucias. Los rayos X:Son pocamente usados debido a su alto poder de penetración que no ha permitido usar protectores eficaces para los operarios, ya que son altamente letales para microorganismos, así como para formas de vida superiores, actúan ionizando las moléculas a su paso especialmente el DNA nuclear y sobre los componentes vitales de la célula. Su aplicación máxima en microbiología es para producir mutantes microbianos. Los rayos gamma: Es aún más enérgica que los rayos X y más eficaces aunque actúen de igual manera, tienen menor longitud de onda (
1010 a10 12 nm), atractivos para esterilizar material de alto grosor o volumen, elmaterial de vidrio tiende a presentar un color pardusco. Se emplean dosfuentes para generar estos rayos: el Cobalto-60 y el Cesio137 producidospor reacciones atómicas. La desventaja de este método es la acción continua de los isótopos por lo cual no se puede suspender cuando se quiera. Los rayos catódicos: Son usados para esterilizar material quirúrgico, drogas, y otras cosas en países avanzados. La ventaja es que el
material se puede esterilizar a temperatura ambiente después de haber sido empaquetado. La ventaja es que esta radiación se genera con aparatos que se pueden conectar o desconectar cuando se requiera. La desventaja es que tiene bajo poder de penetración por lo que se aplica en artículos de pequeño tamaño. El tiempo de esterilización es de unos pocos segundos. 5. Describa el fundamento del agar Mac Conkey. En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora gram positiva. El agar es el agente solidificante. Por fermentación de la lactosa disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH ( rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales biliares, los microorganismos no fermentadores de la lactosa producen colonias incoloras.
VI.
CUESTIONARIO XI
1. Indique que tipo de microorganismos podemos encontrar en suelos contaminados Helicobacter pylor Pseudomonas fluorescentes Escherichia coli Staphylococcus 2. En insectos como moscas, y cucarachas que podemos encontrar? Helicobacter pylor Escherichia coli 3. Que medios de cultivo son los más indicados para los microorganismos ambientales y entero bacterias? Pylori, Agar Eosina-azul de metileno, Agar SMAC CT, Agar 4. Indique el fundamento de los medios de cultivo para moscas y cucarachas.
Pylori, Agar: determina la presencia de la bacteria Helicobacter pylor que provienen de aguas contaminadas. SMAC CT, Agar: permite hallar colonias de Escherichia coli las cuales provienen de suelos contaminados, y pueden encontrarse en las patas de moscas y cucarachas.
5. Discutir resultado del análisis:
50˚C: Crecieron abundantes colonias de diferentes colores,
tamaños y forma. 75˚C: Se observó una disminución de colonias con respecto a las
de 50˚C. 100˚C: Se observaron una considerable disminución de colonias,
aunque a esta temperatura se esperó que no crecieran bacterias. Factores químicos: Sal: Se observaron diversas colonias de diferentes colores, a pesar
de que la sal actúa como un inhibidor. Azúcar: Se observaron abundantes colonias, a pesar de que la
azúcar actúa como un inhibidor. Cristal violeta: Se observaron a lo más 7 colonias de color violera, las cuales resistieron al inhibidor.
