Cultivo de tejido animal.
Podemos decir que es el conjunto conjunto de técnicas que nos permiten mantener células células in vitro con una gran aproximación a sus propiedades y funciones in vivo. Dependiendo del grado de preservación de la estructura del tejido u órgano de origen y del tiempo de su duración distinguimos diferentes tipos de cultivos: de órganos, explantes, primarios, secundarios, etc. El término “cultivo de tejidos suele ser usado como un término genérico que incluye el de cultivo de órganos y el de cultivo de células. Tipos de cultivos de tejidos 1.- Cultivo de órganos: En este tipo de cultivo la organi!ación tridimensional del
órgano in vivo se mantiene, aunque sólo sea parcialmente, y mantiene todas o algunas de las caracter"sticas #istológicas del tejido original. El órgano o porción del mismo se mantiene en un medio l"quido del que extrae los nutrientes y al que elimina los desec#os meta$ólicos. %os diferentes tipos de células se mantienen en su forma diferenciada y constituye una $uena réplica del órgano original. Pero, sin em$argo, em$argo, generalmen generalmente te no permite permite la propagac propagación, ión, ya que el crecimi crecimiento ento de células se produce &nicamente en la periferia. 'ormalmente este tipo de cultivo es dif"ci dif"cill de manten mantener er dura durante nte un tiempo tiempo prolo prolong ngad ado o de$ido de$ido a las difer diferen encia cias s potencia potenciales les de crecimie crecimiento nto de los distint distintos os tipos tipos celulare celulares s que constitu constituyen yen el órgano. %a falta de propagación tiene como consecuencia que para repetir el expe experi rime ment nto o se nece necesi site te nuev nuevo o mate materi rial al,, por por lo que que se prod produc uce e cier cierta ta #eterogeneidad de muestras. (onstituid uidos os por fragment fragmentos os peque) peque)os os de tejidos tejidos u 2.- Explantes Explantes primarios primarios: (onstit órganos que se ad#ieren a una superficie en la que generalmente crecen las células células m*s perifér periféricas icas del explante explante.. +n cultivo cultivo se denomin denomina a cultivo cultivo primario primario cuando las células o tejidos procedentes de un ser vivo crecen sin #a$er pasado previamente por una fase de crecimiento in vitro. +n cultivo se denomina cultivo secundario cuando procede de una fase previa de crecimiento in vitro.
3.- Cultivo de células : Este tipo de cultivo est* formado por células dispersas
disgregadas de un tejido vivo, de un cultivo primario, o de una l"nea celular, mediante distintos sistemas mec*nicos, qu"micos o en!im*ticos. %as células crecen en suspensión o ad#eridas a una superficie. eneralmente son cultivos que contienen un &nico tipo de célula y éstas suelen ser #omogéneas genéticamente. Es el tipo de cultivo m*s utili!ado en la actualidad de$ido a su capacidad de propagación, es decir de crecimiento mantenido. Ventajas
%as principales ventajas de la utili!ación de las técnicas de cultivo de tejidos son: - (ontrol del medio extracelular. Podemos controlar en un cultivo distintos factores como: p, temperatura, #umedad, presión osmótica, tensiones de /0 y de (/0, concentración de nutrientes, etc. - omogeneidad de la muestra. %as células de un cultivo son $astante #omogéneas en comparación con la varia$ilidad existente entre animales de experimentación. - Disminución del gasto. 1i se experimenta con f*rmacos, al utili!arse cultivos de células se utili!an concentraciones muy $ajas de dic#os productos. 2ecientemente la utili!ación de sistemas ro$oti!ados que utili!an peque)os vol&menes, permite la reali!ación de determinados tra$ajos que necesitan un gran n&mero de determinaciones
repetitivas
en
diferentes
tiempos
o
con
diferentes
concentraciones de productos. - Disminución de la necesidad de reali!ar ensayos in vivo. Evit*ndose,
aunque
no
completamente,
el
sacrificio
de
animales
de
experimentación. - Desarrollo de cultivos #istot"picos y organot"picos que incrementan la fia$ilidad de los modelos experimentales.
esventajas
- Excesiva sensi$ilidad. El crecimiento de las células es relativamente lento y es dependiente en muc#os casos de factores no del todon conocidos. 3dem*s, existen contaminantes como #ongos, levaduras, $acterias, micoplasmas y virus que suelen tener un crecimiento m*s r*pido y pueden llegar a matar las células en cultivo. - %"mite de producción. eneralmente el l"mite de producción de un la$oratorio normal es menor a 45g de células. - 6nesta$ilidad. 7uc#as l"neas celulares cont"nuas son inesta$les por ser aneuploides. - 8alidación del modelo. (uando reali!amos un modelo en cultivo celular, estamos utili!ando un conjunto de células disgregadas cuyo origen fue de un tejido, pero que se diferencia de éste porque: •
1e #a perdido la organi!ación tridimensional espacial propia deltejido
•
original 1e #an perdido las interacciones #eterot"picas, entre los distintos tipos
•
celulares y entre las células y la matri! extracelular (arece de los sistemas de regulación in vivo y especialmente de los constituyentes del sistema nervioso y del sistema endocrino.
!lmacenamiento de células
%as células procedentes de cultivos primarios o de l"neas celulares esta$lecidas pueden almacenarse durante largos per"odos de tiempo en temperaturas $ajo cero. Para ello se utili!an sistemas criogénicos como veremos en el apartado siguiente. (on la criopreservación se favorece: - El mantenimiento de células sin tener que utili!ar tejidos animales primarios
- Evitar la pérdida de la l"nea por contaminación - Evitar la pérdida de la l"nea por cam$ios genéticos El su"strato # el medio de cultivo
Para poder reali!ar un cultivo de tejidos es preciso: •
• • • •
+n recipiente, donde se reali!a el cultivo Placa de Petri de tama)os 9., ;.5 y 45 cm 7ultiplacas, con varios pocillos de ; a <; son las m*s frecuentes =rascos de 2oux de diferentes formas y tama)os Especiales, como las “roller $ottles o los que llevan incorporados un portao$jetos
- +n su$strato, donde las células se ad#ieren y crecen • • •
2ecipientes de vidrio, de los indicados en el apartado anterior 2ecipientes de pl*stico, de los indicados en el apartado anterior 7icrosoportes, peque)as esferas de distinta naturale!a, que se mantienen
•
en suspensión, so$re las que crecen las células 1u$stratos met*licos 1uperficies tratadas con componentes de la matri! extracelular como
•
col*geno, fi$ronectina, vitronectina, etc... “=eeder layers, que son restos de celulas que creciereon en monocapa y
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que se esterili!an y se in#i$e su crecimiento con radiación gamma o >. 7atrices tridimensionales como geles de col*geno, celulosa, fosfato c*lcico,
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etc ... 1u$stratos no ad#erentes como agar o agarosa que permiten cierta
•
separación entre las células para formar colonias - +na fase gaseosa donde es de gran importancia el ox"geno y el dióxido de car$ono. El primero de ellos, imprescindi$le para la vida de las células. El segundo, fundamental para la regulación del p del medio de cultivo. +n medio l"quido que recu$re o en el que est*n suspendidas las células y que las nutre. Este es el medio de cultivo que presenta una serie de caracter"sticas como:
• •
Propiedades f"sicas p, generalmente alrededor de ?.@ y controlado por el (/0 del incu$ador y por su$stancias amortiguadoras incluidas en la formulación del medio como el EPE1. El medio de cultivo suele incluir rojo fenol que es un indicador del p, medio es de color rojo a p ?.@, naranja a p ?.5, amarillo a p ;.,
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a!ulAroji!o a p# ?.; y de color p&rpura a p ?.B /smolaridad, que suele estar comprendida generalmente entre 0;5A905
•
m/smCg. emperatura, es fundamental para el correcto crecimiento de las células e
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• •
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influye asimismo en el p 8iscosidad, relacionada con la concentración de suero ensión superficial, que de$e de mantenerse lo suficientemente $aja para evitar la formación de espumas (omposición qu"mica 1olución salina equili$rada FG11H:
me!cla
de
sales
inorg*nicas
suplementada con glucosa 3mino*cidos, es necesario suplementar con amino*cidos esenciales, generalmente se a)ade glutamina a una concentración 0mm antes de la
• • • •
utili!ación del medio 8itaminas lucosa /tras moléculas, como l"pidos, piruvato, etc... 1uero, que aporta #ormonas y factores de crecimiento. %os m*s utili!ados son el suero de ternera F(=H, el suero $ovino fetal F=(1H, el suero de ca$allo F1H y el suero de origen #umano Fu1H. El suero es un elemento determinante en el correcto crecimiento de un cultivo. Existen l"neas que sin suero no crecen y existen otras l"neas que no crecen en la presencia de suero. Esto se de$e a la presencia de diferentes moléculas en el suero, generalmente en concentraciones m"nimas, que pueden estimular o in#i$ir el crecimiento celular.
3dem*s, los distintos lotes de suero suelen ser diferentes en las concentraciones de estos elementos, con lo a veces la repetición de un experimento no es posi$le al desconocer exactamente las concentraciones de estas moléculas en los distintos sueros utili!ados.
•
3nti$ióticos y antif&ngicos, para evitar el crecimiento de $acterias y #ongos. %os m*s utili!ados son penicilina, estreptomicina, gentamicina, fungi!ona y anfotericinaAG
3ctualmente se pueden utili!ar ciertos medios con fórmulas definidas que incluyen factores de ad#esión,
in#i$idores
de proteasas, #ormonas,
crecimiento, oligoelementos como (u, 1e y =e, y prote"nas
factores de