CURVA DE CRECIMIENTO DE ESCHERICHIA COLI: CUANTIFICACION DE MICROORGANISMOS NILVIO ESTRADA, EDISON FUERTES, ELIANA CHAMORRO, HELBERT TUCANES. FACULTAD DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL UNIVERSIDAD DE NARIÑO-IPIALES
RESUMEN En el laboratorio se analizo el crecimiento y al mismo tiempo la cuantificación de E. coli. Estos procesos sintéticos de crecimiento celular bacteriano implican transformación de energía, síntesis de pequeñas moléculas, así como cofactores y coenzimas necesarias para las reacciones enzimáticas. Las reacciones mas importantes para la síntesis de macromoléculas están relacionadas con la síntesis de ADN, ARN y de proteínas una vez completado este escenario complejo se produce el crecimiento celular. Nos pudimos dar cuenta que en las diluciones de 101 y 105 que se realizo con el inoculo de E.coli y midiéndole la absorvancia cada 30 minutos después de haber pasado por la incubación; esta tiende a aumentar lo cual indica que el ciclo de crecimiento de E.coli esta en este rango. Palabras claves: crecimiento, cuantificación, síntesis, E.coli, inoculo, absorvancia ,
1. INTRODUCCION Existen varios métodos para determinar el crecimiento de poblaciones de bacterias, puede ser por aumento de la masa del cultivo o por aumento del número de células, por métodos directos o métodos indirectos. Los métodos directos de cuantificación de microorganismos permiten establecer la población total de microorganismos existentes, tienen la ventaja de ser rápidos aunque no es posible diferenciar a las células vivas de las muertas. Entre estos métodos tenemos la turbidimetría y el conteo de células. Turbidimetría
En una suspensión microbiana la cantidad de microorganismos esta directamente relacionada con la turbiedad o densidad óptica. La metodología es útil con suspensiones de densidad microbiana baja y con cultivos en donde los microorganismos son unicelulares y con un tamaño de unos cuantos micrómetros, características que les permiten mantenerse suspendidos y homogéneamente distribuidos; en tanto que con microorganismos de mayor tamaño y con aquellos productores de polisacáridos esta metodología no es adecuada.
2. MATERIALES Y METODOS
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Teniendo el inoculo de E.coli se procede a tomar 1ml de la muestra y lo agregamos en dos tubos tapa rosca y dejamos uno para Blanco a los dos primeros los llevamos a incubación por 30 minutos lo mismo que a la bacteria en cuestión la cual se encuentra en el erlenmeyer. Los tubos van en una serie de 101 y 106. Cada tandada en un tiempo de 30 minutos con el fin de analizar en el uno la absorbancia, en el otro PH y en el ultimo se toma 100µl para realizar la siembra en caja petri con agar EMB.
TUB O
Tiempo (Minutos ) 0 40 70 100 130 160 Tabla 1. Datos de laboratorio.
Absorvanci a
6 0.006 7 0.132 7 0.178 7 0.244 7 0.252 7 0.261 la muestra dada en el
0.3 0.25 0.2 0.15 CURVA DE CRECIMIENTO
0.1 0.05 0 0
Los datos obtenidos se muestran en la tabla 1.
PH
En la siguiente grafica se muestra el crecimiento de bacterias en el tiempo. Grafica 1.
Numero de Bacterias
En la practica de laboratorio inicialmente se recibió una muestra inoculada de E.coli en 25ml de caldo nutritivo en erlenmeyer de 50ml, de esta sustancia se toma 2ml y se lo vierte en dos tubos con 1ml cada uno. Uno de los tubos se lo lleva al conteo en el espectrofotómetro y seguidamente se lo conduce a incubación por un tiempo de 30min; mientras el otro le determinamos el PH y extraemos 100µl los cuales vertimos en dos cajas petri con agar EMB y las conducimos a incubación. Este proceso lo repetimos cada 30min con el fin de analizar el crecimiento de E.coli.
200
400
Tiempo
Grafica 1. Se puede mirar las fases de crecimiento de E.coli. De la Grafica 1. Podemos decir que E.coli a medida que transcurre el tiempo presenta un crecimiento exponencial y como sabemos esta célula con buenos
factores tanto nutricionales como genéticos completa la fision binaria en 20 minutos aproximadamente lo cual genera una nueva célula.
De la misma manera en la tabla 2. Plasmamos los datos obtenidos en cada tubo.
TUBO Tiempo PH (Minutos) 0 6
104=330 105=580 106=710 y para calcular el numero de bacterias totales se hizo uso de la siguiente formula: Bacterias totales en cada caja petri= Nº de bacterias en el cuadrante * 4 * factor de dilución.
absorvancia 0.006
40
7
0.039
70
7
0.053
100
7
0.056
130
7
0.073
160
7
0.078
Tabla 2. Resultados de PH y absorvancias en cada tubo a medida que pasa el tiempo. Como nos podemos dar cuenta los datos obtenidos son lógicos ya que a medida que pasa el tiempo las células van a duplicarse lo cual va a aumentar la absorvancia de luz.
Si
tomamos nos queda.
un
ejemplo
en
= 235*4* =94.000 bacterias. Los datos los agrupamos en la tabla 3.
tubos
Bacterias totales en cada caja petri. 0 94.000 1’320.000 23’.200.000
Conteo de E.coli Para este proceso dividimos la caja de petri en cuatro partes y contamos el número de bacterias en uno de ellos. Los datos obtenidos son: 102=0 bacterias. 103=235
284’.000.000 Tabla 3.numero de bacterias (E.coli) En 102 el número de bacterias fue nulo y las causas pueden ser varias algunas que podemos mencionar: E.coli no se adapto al medio ya que no se sintetizaron enzimas que permitan
metabolizar los componentes presentes en el medio;la celula pudo ser dañada por calor toxicos,radiaciones, entre otros.
CUESTIONARIO 1. METODOS DIRECTOS E INDIRECTOS: Los métodos para el seguimiento de la evolución de un cultivo microbiano pueden clasificarse en directos e indirectos. Los métodos directos se basan en la medida de la evolución del número de células vivas (técnicas de plaqueo) o del número de partículas (técnicas microscópicas y de contadores de partícuas). Los métodos indirectos se basan en la medida de algún parámetro del cultivo que nos permite deducir información sobre la evolución del número de microorganismos. La elección de un método de seguimiento del cultivo en concreto depende de las características del cultivo y del proceso. Ejemplo de un método directo e indirecto respectivamente: a) Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter): Se hace pasar una suspensión microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente eléctrica. Cada vez que por un orificio (30 mm diámetro) pasa una partícula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrónico, que detecta el número y el tamaño de las partículas que van pasando. (El tamaño detectado es función de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partícula).
Comentarios: hay que usar suspensiones absolutamente libres de partículas extrañas (las pequeñas serían contabilizadas erróneamente como bacterias, y las mayores pueden obturar el orificio del aparato).
b) Recuento de viables en placa: Los métodos de recuento de número de células que hemos visto hasta ahora (los directos) no distinguen entre células vivas y muertas. En muchos casos conviene contar las células vivas, y esto en laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. (Una célula se define como viable cuando, colacada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia). El método habitual de lograr esto es sembrar pequeñas alícuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio sólido (con agar). Cada célula viable dará origen a una colonia visible después del tiempo adecuado de incubación. Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilución de la que proceden y el volumen de alícuota utilizado, es fácil deducir el número de células viables en la suspensión original. 2. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL MÉTODO UTILIZADO EN LA PRACTICA. Una ventaja muy clara es muy rápido.pero sólo sirve para suspensiones relativamente concentradas (>10x106 céls./ml). Por debajo de este valor el número de células vistas en el campo del microscopio es muy pequeño y poco
significativo estadísticamente. En bacterias móviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de alcohol. Este método también tiene la desventaja de no poder diferenciar las células vivas de las muertas.
3. CURVA DE CRECIMIENTO: Se pueden distinguir cuatro fases en el cultivo: (1) la fase lag en la que el microorganismo se adapta a las nuevas condiciones y pone en marcha su maquinaria metabólica para poder crecer activamente. La duración de esta fase es variable y en general es mayor cuanto más grande sea el cambio en las condiciones en las que se encuentra el microorganismo. (2) La fase exponencial cuando los microorganismos empiezan a duplicarse exponencialmente, pero las velocidades de crecimiento pueden variar esencialmente tal velocidad es influenciada por las condiciones ambientales asi como las características genéticas de la celula.(3) La fase estacionaria en la que no hay aumento neto de microorganismos, lo que no significa que no se dividan algunos, sino que la aparición de nuevos individuos se compensa por la muerte de otros. (4) La fase de muerte en la que el número de microorganismos vivos disminuye de forma exponencial con una constante k que depende de diferentes circunstancias como: liberación de metabolitos secundarios que se generaron en fase exponencial como estacionaria y esto hace que el medio donde habitan estos microorganismos se vuelva inhóspito para el crecimiento microbiano lo cual conduce a infecciones, intoxicacionesy la muerte.
4 .FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO Las bacterias enfrentan constantemente condiciones que limitan o impiden su crecimiento. Su habilidad para colonizar un ambiente requiere la capacidad para alternar periodos de rápida división celular y de crecimiento nulo.Las características de las células en estos periodos pueden analizarse en el laboratorio en condiciones controladas de temperatura, oxigenación y composición del medio de cultivo. Los factores que afectan el crecimiento pueden ser tanto nutricionales como genéticos. En el primer punto la célula debe tener una fuente rica de carbono, abundante nitrógeno y otros oligonutrientes para para que los aprovechen y fabriquen su material celular y en el caso de que la falla sea genética la celula no va a poder adaptarse al nuevo madio y por consiguiente va a morir o me va adar malos rendimientos en el cultivo y ese no es el objetivo. También cave destacar las condiciones del medio de cultivo. Generalmente, los organismos crecen mejor en el pH de su hábitat natural, por ejemplo en el caldo de las bacterias específicamente, E.Coli; la cual tiene los límites mínimos y máximos de pH entre 4.3 y 9.5; por lo cual no se considera el pH 3 óptimo para el desarrollo de este organismo. De manera general, la temperatura, el pH y otras características del medio, modifican intensamente el crecimiento y muerte de microorganismos, todos estos factores alteran los índices o velocidades de las reacciones bioquímicas. Cabe aclarar que hay diferentes tipos de células y cada una requiere sus condiciones por ejemplo: Cuatro grupos de microorganismos con relación a su temperatura optima: psicrofilos con temperatura optimas bajas 15°C; mesofilos con temperaturas optimas
moderadas; termofilos con altas temperaturas optimas por encima de los 45°C; e hipertermofilos con temperas optimas muy elevadas 80°C. Si hablamos de PH los extremofilos presentan un pH óptimo de crecimiento muy elevado a veces tan alto como pH 10 se denominan alcalofilos. Los microorganismos alcalofilos se encuentran por lo general en hábitat muy básicos como lagos sodicos y suelos muy carbonatados y tienen aplicación industrial porque producen enzimas hidroliticas como proteasas y lipasas que funcionan bien a pH alcalino y se usan como aditivos de los detergentes domesticos. . CONCLUSIONES ---En nuestra practica no podemos decir que el conteo realizado en el cultivo de E.coli fue adecuado por lo que no contamos con con métodos rápidos o mejor una automatización microbiologíca de cuantificacion que nos me permite un campo de estudio dinámico que conjunta la utilización de métodos microbiológicos, para el aislamiento más efectivo, la detección, caracterización y enumeración más rápida de microorganismos y sus productos en muestras, ambientales o de alimentos.
BIBLIOGRAFIA 1.http://www.biologia.edu.ar/microgeneral /tp4.pdf. 2.http://www.scribd.com/doc/15957855/8Cuantificacion-de-microorganismos-porturbidimetria
