CURVA DE CRECIMIENTO DE LEVADURAS
I.
II.
OBJETIVOS
Estudiar las fases de crecimiento de las levaduras en un mosto de fruta bajo condiciones óptimas de desarrollo.
Obtener las curvas de crecimiento crecimient o para para una determinada cepa e interpretar los resultados aplicando los conocimientos de cinética de crecimiento de los microorganismos.
FUNDAMENTO TEORICO Las curvas de crecimiento comprenden varias fases. Fase lag o de latencia: Es la primera parte de la curva, en la que el número de ufc permanece constante aproximadamente, es una fase de adaptación al medio. Aunque no tiene lugar división alguna, se da una considerable actividad bioquímica, especialmente síntesis de proteína y de ARN. La duración de la fase lag depende de varios factores, principalmente dela temperatura de incubación, la composición del medio de crecimiento, su pH y potencial redox y del estado fisiológico del inoculo. Fase logarítmica o exponencial: Es cuando la multiplicación de las células de los microorganismos se da a velocidad óptima, el log de los números de ufc frente al tiempo muestra una relación en línea recta, la velocidad de crecimiento durante esta fase se puede calcular a partir de la pendiente de la curva de crecimiento y un modelo matemático. Fase estacionaria: Las ufc permanecen aproximadamente constantes durante un tiempo variable. No hay reproducción o el ritmo de multiplicación y el ritmo de muerte son más o menos iguales. Fase de muerte: La muerte de las células va seguida de autolisis. Esta libera de nuevo al medio diversos componentes celulares que proporcionan nutrientes para que otras células viables se multipliquen. Disminución paulatina de células vivas. El proceso de elaboración de levaduras secas activas (como nutrición, secado) podría influir en el rendimiento de la levadura, por lo que también se deben llevar a cabo experimentos con levaduras secas. La caracterización de levaduras incluye los aspectos de la producción de vinos de alta calidad, así como también el cumplimiento de la legislación en términos de seguridad alimentaria. Los criterios relevantes para los aspectos de seguridad no se indican de manera especial, ya que la legislación nacional y/o internacional podría diferir entre los estados miembros. La persona o compañía seleccionadora está, por tanto, obligada a tomar en cuenta estos requisitos legales.
Las líneas directrices se pueden aplicar igualmente para analizar cultivos de levaduras secas. Es necesario seguir las instrucciones del fabricante a la hora de reactivar e inocular levaduras secas.
VIGOR FERMENTATIVO Y CINETICA DETERMINADAS TEMPERATURAS
DE
LA
FERMENTACION
A
Ámbito de aplicación Criterio estándar para levaduras para vinificación
Fundamento El vigor fermentativo, entendido como la velocidad a la que la levadura inicia la fermentación, se expresa en gramos de CO 2 producidos de 2 a 3días después del comienzo de la fermentación. La cinética de la fermentación se controla utilizando una curva (gramos de CO 2 producidos o gramos de azúcar fermentado / tiempo) para seleccionar las cepas que muestran un rápido inicio de la fermentación, sin picos debidos a las variaciones de la temperatura y buen rendimiento al término de la fermentación. Una buena cinética de la fermentación se traduce en un menor consumo de energía debido al control de la temperatura. La temperatura es uno de los factores que varían entre los procesos de vinificación. Influye en la producción de acidez volátil y de metabolitos durante la fermentación, así como en la viabilidad de la levadura.
Equipo - Esterilizador - Balanza analítica, precisión de 0,1 g - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo - Matraces Erlenmeyer de 100 ml con válvula Müller Reactivos y materiales - El medio de fermentación se prepara diluyendo un mosto de uva concentrado hasta que la concentración de azúcar alcanza los 250 g.l -1. - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura son incubados durante 24h en el medio YEPD para obtener el cultivo madre.
Procedimiento Los cultivos de levadura que se deben analizar se obtienen al inocular 100µl de cultivo madre en 5ml demedio fresco. Se debe incubar durante 48 horas con 3 pases sucesivos. El medio definitivo para el cultivo debe contener 10 8 UFC ml-1. La concentración de levadura en el momento de la inoculación en el medio debe ser aproximadamente de 10 6 células vivas ml -1.
La microvinificación se controla por análisis gravimétrico, pero a diferentes temperaturas de fermentación (15ºC, 20ºC, 25ºC y 30ºC). Para cada temperatura se traza una curva que muestra las variaciones de CO 2 liberado al día, lo que permite estudiar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de fermentación.
Cálculos Utilizando las curvas se estudian los siguientes parámetros para cada cepa: longitud de la fase latente (retardo), pendiente de la curva en la fase logarítmica, longitud de la fase estacionaria, y longitud y pendiente de la curva en la fase final. El rango óptimo de la cepa de muestra se halla comparando las curvas obtenidas a diferentes temperaturas.
MEDIO DE CULTIVO YEPD YEPD o extracto de levadura peptona dextrosa, también a menudo abreviado como YPD, es un completo medio de crecimiento de levaduras. Contiene extracto de levadura, peptona, agua doblemente destilada, y glucosa o dextrosa. Se puede utilizar como medio sólido mediante la inclusión de agar. El extracto de levadura típicamente contendrá todos los aminoácidos necesarios para el crecimiento. Por ser un medio completo, YEPD no puede ser utilizado como un medio de selección para la prueba de auxótrofos. En lugar de ello, YEPD se utiliza como un medio de crecimiento para crecer cultivos de levaduras. La versión de agar YEPD consiste típicamente de 0,3% (masa / volumen) de extracto de levadura, 1% de peptona, 1% de glucosa / dextrosa, 2% de agar, siendo el resto agua destilada. La versión de caldo YEPD contiene típicamente 1% de extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de glucosa / dextrosa, y el resto es agua destilada.
III. MATERIALES
Refractómetro Mosto acondicionado Cepa de saccharomyces cereviseae Termómetro pH metro Densímetro 0.9 a 1.1 g/ml Equipo para medir acidez titulable Balón de 4 litros Probeta de 250ml Placas Petri Pipetas de 10, 5, 2 o 1ml
Tubos de ensayo 3 matraces Erlenmeyer de 1L y de 250ml Agua peptonada 200ml de agar patata glucosa, o OGA o agar suero naranja.
IV. PROCEDIMIENTO 1) Preparar el mosto adecuando la temperatura, ºBrix, pH, acidez. 2) Pasteurizar, enfriar, inocular la cepa. Iniciar el proceso de fermentación. 3) Controlar diariamente la temperatura, pH y densidad. Airear el mosto. Realizar la numeración de levaduras por recuento en placas. 4) Anotar. Construir la curva de crecimiento de levadura. Hallar el tiempo de duración de las fases lag, logarítmica, estacionaria. Hallar el tiempo de duplicación.
V.
RESULTADOS PROCESO DE VINIFICACION VINIFICACION Curva de crecimiento de levaduras de la elaboración de vino del curso de Enología. Se trabajó con 100 kg de uva. Se inició la fermentación con 25°Brix. Se utilizó metabisulfito de potasio y pie de cuba. Las cepas son nativas propias de la cáscara de la uva.
CUADRO Nº1: FICHA DE CONTROL DE LA FERMENTACIÓN N° Muestra Fecha Hora Nx106 T (°C) Observaciones 1 2
9/4 10/4
9:30 9:30
1 5,5
24 24
3 4 5 6 7 8 9 10 11
11/4 12/4 15/4 16/4 17/4 18/4 19/4 22/4 23/4
14:30 16:00 9:00 9:00 9:00 10:30 10:00 11:00 ---
5 3 37 57 63 64 42 19 ----
20 20 21 21 21 21 21 21 ----
Hongos 2x10 5 Hongos 1x10 5. Burbujeo Ayer se agregó agregó pie de cuba y Metabisulfito. Hongos 2x10 6 Hongos 1x10 5
Se agregó metabisulfito para parar la fermentación.
De la placa 10 -6 se picó una colonia aislada y se sembró en caldo YEPD (Caldo extracto de levadura, más glucosa y peptona) en un tubo de ensayo. Se observó que el proceso de fermentación duró de 3 a 5 días. Luego se sembró en un matraz Erlenmeyer se observó un buen crecimiento en 3 a 4 días. Se observó al microscopio microsc opio levaduras, Gram positivas, elípticas y en proceso de reproducción formando grupos y algunas células en proceso de gemación. Se sembró en otro matraz en iguales condiciones y en el caldo YEPD, y se analizó el recuento de levaduras todos los día a las 12 del día para obtener la curva de crecimiento, crecimie nto, todo a 25 °C. Esto se realizó del 27 de mayo al 3 de junio.
CUADRO Nº2: REGISTRO DE RECUENTO DE LEVADURAS Fecha de análisis de Millones de recuento de levaduras. ufc/ml 27/5 28/5 29/5 30/5 31/5 3/6 4/6
2 14 65 60 60 30 No medido
CURVAS DE CRECIMIENTO DE LEVADURA ( S. DURANTE LA VINIFICACION
cerevisiae
CUADRO Nº3: TABULACION DE DATOS Tiempo (T) Tamaño de (horas) células (X) Nx10^6 0
1
24
5.5
53
5
78.5
3
143.5
37
167.5 191.5
57 63
217
64
288.5
42
313.5
19
elipsoideus )
GRAFICA Nº1: CURVA DE CRECIMIENTO DE LEVADURAS EN LA VINIFICACION 6 70 ^ 0 1 x N 60 ) s a l u l e 50 c e d o 40 ñ a m a t ( 30 X
Nx10^6
20 10
Τ (tiempo
de crecimiento) (horas)
0 0
50
100
150
200
250
300
350
Hallando el tiempo de duración de las fases lag, logarítmica y estacionaria.
Hallando la velocidad especifica de crecimiento del microorganismo.
Hallando el tiempo de generación o duplicación del microorganismo.
CURVAS DE CRECIMIENTO DE LEVADURA (S. DURANTE LA FERMENTACION EN CALDO YEPD.
cerevisiae
) ellipsoideus
CUADRO Nº4: TABULACION DE DATOS Tiempo (T) Tamaño de (horas) células (X) Nx10^6 24
2
48
14
72 96
65 60
120
60
192
30
GRAFICO Nº2: CURVA DE CRECIMIENTO DE LEVADURA (s.c.ellipsoideus ) EN CALDO YEPD 80 6 ^ 0 70 1 x N ) 60 s a l u l e 50 c e d o 40 ñ a m 30 a t ( X
millones de ufc/ml
20 10 0 0
50
100
150
200
250
T (tiempo de crecimiento) (horas)
Hallando el tiempo de duración de las fases lag, logarítmica y estacionaria.
Hallando la velocidad especifica de crecimiento del microorganismo.
Hallando el tiempo de generación o duplicación del microorganismo.
VI. CONCLUSIONES
Se estudió y conoció las fases de crecimiento de las levaduras en un mosto de fruta bajo condiciones óptimas de desarrollo.
Se obtuvo las curvas de crecimiento para la cepa mencionada.
VII. BIBLIOGRAFIA 1. Boned, F.; Colomo, B.; Suárez, J. A. Selección de levaduras vínicas en la D. O. Bierzo. Vitivinicultura, 1992, 3, 37. 2. Calderón, F.; Gutiérrez-Granda, M. J., Suárez-Lepe, J. A. Isolation, identification and physiological characterization of indigenous yeast of Chardonnay grapes from Somontano. Am. J. Enol. Vitic. 1994, 45, 368. 3. Kunkee, R. E.; Goswell, R. W. Table wines. In: Alcoholic beverages. Ed. A. H. Rose. Academia Press, London, 1977, pp. 315-386.
