Desenvolvimento de Metodo Para Identificação de Off-Flavours - Gisele

Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu Mestrado Profissional em Ciência e Tecnologia de Alimentos Campus Rio de Janeiro

Gisele Chaves da Silva

DESENVOLVIMENTO DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA IDENTIFICAÇÃO DE “OFF-FLAVOURS” EM CERVEJA

Rio de Janeiro - RJ 2013



Trabalho de Conclusão de Dissertação apresentado ao Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos.

Orientador: Prof. Dr. Ronoel Luiz de O. Godoy Co-orientadora: Profa. Dra. Renata S. L.Raices

Rio de Janeiro-RJ 2013

S586

Silva, Gisele Chaves da. Desenvolvimento de método para identificação de “off -flavours” em cerveja / Gisele Chaves da Silva. – 2013. 2013. 71 f. : il. ; 21 cm. Dissertação - (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos) – Instituto Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2013. Bibliografia: f.: 69-71. 1. Cerveja – Análise Análise sensorial. 2. Cerveja – Compostos Compostos voláteis. I. Título. CDU 663.4



Trabalho

de

Conclusão

de

Dissertação

apresentado ao Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por tudo que sou e por tudo que que conquistei, a Ele toda honra e toda glória. À minha família, que sempre me inspirou a lutar pelos meus sonhos e me ensinou que para Deus nada nada é impossível. impossível. Ao meu esposo, que com seu apoio e paciência, me estimulou a nunca desanimar, mesmo nos momentos mais difíceis. Ao Professor Doutor Ronoel Luiz de O. Godoy, D.Sc. e à Professora Doutora Renata S.L. Raices, D.Sc., pela orientação e incentivo na elaboração desta dissertação. Aos bolsistas Abner Alves Serapião da Silva e Larissa de Souza Nunes da Silva e aos técnicos Wagner Costa da Silva e Cosme da Costa Santos pelo empenho e dedicação na realização dos testes analíticos. Aos membros da banca examinadora, pela participação. A todos os amigos que, de forma direta ou indireta, contribuíram para a conclusão desta etapa da minha vida.

Silva, G.C. Desenvolvimento de método para identificação de “off -flavours” em cerveja.71p.

Trabalho de Conclusão de Dissertação apresentado ao Programa de Pós-graduação Stricto Sensu em Ciência e Tecnologia de Alimentos- IFRJ, Campus Rio de Janeiro, 2013.

RESUMO Atualmente, tem-se disponível no mercado externo Kits de cápsulas contendo “flavours” de possíveis defeitos da cerveja. cerveja. Essas Essas cápsulas cápsulas podem ser ser diluídas em cerveja cerveja e usadas, na análise análise sensorial, para a c apacitação de degustadores na identificação de “off -flavours” indesejáveis ao sabor do produto. Nas cervejarias, essa técnica usa o homem como único instrumento de medição, o que desperta desperta a real necessidade de desenvolver desenvolver uma metodologia analítica analítica alternativa para a identificação destes destes compostos. Este trabalho trabalho desenvolveu métodos de fácil aplicação que possibilitam possibilitam a identificação de ésteres e dicetonas dicetonas vicinais a um tempo hábil para atender as necessidades necessidades da indústria. Para o seu desenvolvimento, fez-se necessário necessário investigar compostos de impacto impacto da cerveja (de menor menor limiar de percepção) percepção) a fim de identificar o aroma dos mesmos através da composição de sua essência. As análises de voláteis foram realizadas através da técnica de microextração em fase sólida seguida de cromatografia gasosa de alta resolução acoplada a detector e espectrometria de massas (SPME-CGAR-EM) e extração “Headspace” (HS) com posterior cromatografia gasosa de al ta resolução acoplada a detector de

captura de elétrons elétrons (HS-CGAR-DCE) em 15 cervejas de marcas conhecidas conhecidas nos mercados nacional e internacional. Pôde-se observar, para a identificação dos ésteres acetato de etila, acetato de isoamila e hexanoato de etila através da primeira técnica aplicada (SPME-CGAREM), resultados abaixo do limiar de percepção do degustador (acetato de etila – 90000 90000 ppb, acetato de isoamila- 4200 ppb e hexanoato de etila- 600 ppb). No entanto, não foram observados sinais referentes às dicetonas vicinais nos cromatogramas avaliados. Por fim, aplicou-se a segunda técnica (HS-CGAR-DCE) para avaliação de dicetonas vicinais, que também apresentaram resultados para a análise do “off -flavour” diacetil abaixo do limiar de percepção do degustador (1455 ppb). As técnicas empregadas para análise de voláteis, HS-CGAR- DCE e SPME-CGAR-EM se mostraram eficientes e de fácil aplicabilidade em uma indústria alimentícia.

Critérios de validação usados como instrumento de medição para avaliar o

desempenho do método desenvolvido, desenvolvido, possibilitam que o mesmo seja usado usado na avaliação de “off -flavours” em cerveja, visto que , mostrou ser seletivo, linear, preciso, exato e robusto.

Palavras-Chave: Cerveja. Análise sensorial. Compostos voláteis. Silva, GC. Method development for identification of "off-flavors" in cerveja.71p Research Project Master level presented to the Post-graduate studies in Science and Technology-Food IFRJ, Campus Rio de Janeiro, 2013.

ABSTRACT

Currently, there are kits which are available in the external market with capsules containing flavors of possible beer defects. These capsules can be diluted and used in beer sensory analysis to train tasters to identify "off-flavors", which are undesirable flavors in the product. In breweries, this technique uses the man as the sole measuring instrument, which demonstrates the real need to develop an alternative analytical methodology for the identification of these compounds. This paper has developed easy-to-apply methods that enable the identification of esters and vicinal diketones in time to meet the needs of the industry. For the development of such methods, it was necessary to investigate the impact of beer compunds (of low l ow perception threshold) in order to identify the aroma of the these compounds through their composing essence. Volatile analysis were performed using the SPME extraction technique followed by gas chromatography with mass selective detector (SPME-GC-MS) and Extraction "Headspace" with subsequent gas chromatography with electron capture detector (HS-GC-ECD) in 15 beers of known brands in domestic and international markets. The first technique (SPME-CGAREM) demonstrated results below the tasters’ perception threshold for the identification of the ethyl acetate, isoamyl acetate and ethyl hexanoate esters (ethyl acetate – 90000 90000 ppb, isoamyl acetate- 4200 ppb and ethyl hexanoate- 600 ppb). However, no signals could be observed for vicinal diketones in the assessed chromatograms. The second technique used for assessing vicinal diketones (HS-CGAR-DCE) also demonstrated results below the tasters’ perception threshold (1455 ppb) for the identification of the “off -flavour diacetyl”. The applied applied techniques

for the volatile analysis (HS-CGAR- DCE e SPME-CGAR-EM) proved to be efficient and easy to be applied by the food industry. Validation criteria used as measurement instruments to assess the method developed by this research allow it to be used in “off -flavour” assessment in

beer, once it proved proved to be selective, selective, linear, precise precise and robust. Keywords: Beer. Sensory analysis. Volatile compounds.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 Estruturas das Humulonas e Lupulunas..... Lupulunas ..... Figura 2 Esquema de de uso do amostrador SPME para processo processo de extração extração ............. e de dessorção do material extraído para análise por CGAR

17 43

Figura 3 Cromatograma de ésteres de amostra cerveja cerveja preparada com o ................ Mix de “Off -flavours” por SPME-CGAR-EM

49

Figura 4 Cromatograma de dicetonas vicinais de amostra amostra preparada com ...................2,3................... 2,3- Butanodiona (Diacetil) e 2,3-Pentanodiona por HS-CGAR ...................DCE ................... DCE

50

Figura 5 Curva de calibração calibração 1 preparada preparada com 2,3- Butanodiona Butanodiona (Diacetil) ...................ee 2,3-Pentanodiona por HS-CGAR-DCE. ...................

53


53


53

Figura 8 Curva de calibração1, calibração1, 2 e 3 preparada preparada com com Acetato Acetato de isoamila ................... por por SPME-CGAR-EM.

54

Figura 9 Curva de calibração 1, 2 e 3 preparada com com Acetato de etila por ................ SPME-CGAR-EM.

55

Figura 10 Curva de calibração calibração 1, 2 e 3 preparada com Hexanoato Hexanoato de etila ................... por por SPME-CGAR-EM.

56

Figura 11 Curva de calibração calibração preparada com Acetato de isoamila isoamila por ...................SPME-CGAR-EM ................... SPME-CGAR-EM – fibra fibra quebrada.

60

Figura 12 Curva de calibração calibração preparada com Acetato de etila etila por SPME,............ CGAR-EM – fibra fibra quebrada.

60

Figura13 Curva de calibração preparada com Hexanoato de etila por .................SPME-CGAR-EM ................. SPME-CGAR-EM – fibra fibra quebrada.

60

LISTA DE TABELAS Tabela 1 Termos descritivos descritivos empregados empregados com as as suas expectativas expectativas definições e ............ ....referências ....referências

24

Tabela 2 “Off -flavours” relacionados com origem na produção de cerveja.. cerveja..

26

Tabela 3 Valores de concentração e área das curvas 1, 2 e 3 de 0,2 a .120 % - 2,3 ..................Butanodiona .................. Butanodiona (Diacetil) em cerveja por HS-CGAR-DCE

57

Tabela 4 Equações das curvas 1, 2 e 3-2,3 -Butanodiona (Diacetil) por HS-CGAR-DCE HS-CGAR-DCE

57

Tabela 5 Valores de concentração e área das curvas 1, 2 e 3 de 26,7 a 140 % - Acetato ..................de .................. de Isoamila em cerveja por SPME-CGAR-EM

58

Tabela 6 Valores de concentração e área das curvas 1, 2 e 3 de 26,7 a 140 % - Acetato ..................de .................. de Etila em cerveja por SPME-CGAR-EM

58

Tabela 7 Valores de concentração e área das curvas 1, 2 e 3 de 26,7 a 140% ................ Hexanoato ................ Hexanoato de Etila em cerveja por SPME-CGAR-EM

58

Tabela 8 Equações das curvas 1, 2 e 3dos ésteres cerveja por SPME- .CGAR-EM

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Tabela 9 Repetitividade padrão 4 (2,3Butanodiona) (2,3Butanodiona) nas curvas 1, 2 e 3 em .cerveja – ..................HS-CGAR-DCE .................. HS-CGAR-DCE

61

Tabela 10 10 Repetitividade padrão padrão 4 (Acetato (Acetato de Isoamila) Isoamila) nas curvas curvas 1, 2 e 3 .em cerveja 62 – SPME-CGAR-EM .................. – SPME-CGAR-EM Tabela 11 11 Repetitividade padrão padrão 4 (Acetato (Acetato de Etila) Etila) nas curvas 1, 2 e 3 em .cerveja – ..................SPME-CGAR-EM .................. SPME-CGAR-EM

62

Tabela 12 12 Repetitividade padrão padrão 4 (Hexanoato (Hexanoato de Etila) nas curvas curvas 1, 2 e 3 .em cerveja .................. – SPME-CGAR-EM SPME-CGAR-EM

62

Tabela 13 13 Cálculo Precisão e Exatidão

63

Tabela 14 Avaliação da Robustez - 2,3-Butanodiona 2,3-Butanodiona em .cerveja .cerveja – HS-CGAR-DCE HS-CGAR-DCE

64

Tabela 15 Avaliação da Robustez - Acetato Acetato de Isoamila em cerveja – SPME-CGAR-EM SPME-CGAR-EM

65 65

Tabela 16 Avaliação da Robustez - Acetato de Etila em cerveja – SPME-CGAR-EM SPME-CGAR-EM Tabela 17 Avaliação da Robustez – Hexanoato Hexanoato de Etila em cerveja – SPME-CGAR-EM SPME-CGAR-EM

66 67

Tabela 18 Concentrações dos principais “ off -flavou -flavours” encontrados em 15 cervejas de

.................marca reconhecida no mercado analisado pelas.técnicas HS-CGAR-EM e HS.................marca .................CGAR-DCE ................. CGAR-DCE

LISTA DE ABREVEATURAS E SIGLAS

HS SPME

“Headspace”

......

Microextração Microextração em Fase Sólida

CGAR-DCE... CGAR-DCE... Cromatografia Gasosa de Alta Resolução em Detector de Captura de ..........................Elétrons .......................... Elétrons CGAR-EM... CGAR-EM... Cromatografia Gasosa de Alta Resolução em Espectrometro de Massa CV ................ Coeficiente de variação DP ............

.Desvio Padrão .Desvio

DPR ..........

Desvio Padrão Relativo

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO..................................................

12

BIBLIOGRAFICA................... 2 REVISÃO BIBLIOGRAFICA ............................................ ............................................... ........................

14

2.1 CERVEJA: DEFINIÇÃO E UM BREVE HISTÓRICO............................. HISTÓRICO.............................

14

2.2 INGREDIENTES DA CERVEJA

16

2.2.1 Malte.......................... ................................................ ............................................ ............................................ .................................. ............

16

Lúpulo................... 2.2.2 Lúpulo. ........................................ ............................................ ............................................ ...................................... ................

17

2.2.3 Levedura

18

2.2.4 Água

19

2.3 PROCESSO DE PRODUÇÃO DA CERVEJA...................................... CERVEJA ......................................

19

2.3.1 Brassagem

19

2.3.2 Fermentação

20

2.3.3 Maturação

20

2.3.4 Filtração

21

2.3.5 Envase e Pasteurização

21

2.4 ANÁLISE SENSORIAL SENSORIAL E A CERVEJARIA............................................. CERVEJARIA.............................................

22

2.4.1 “Off-flavours” do processo produtivo ....................................................

24

S” EM CERVEJA 2.5 TÉCNICAS PARA ANÁ LISES DE “OFF -FLAVOUR S”

34

3 JUSTIFICATIVA..................... ........................................... ............................................. ............................................. ..........................

38

4 OBJETIVOS................ ...................................... ............................................ ............................................ ...................................... ................

39

4.1 OBJETIVO GERAL......................... GERAL............................................... ............................................ ...................................... ................

39

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................... .............................................. ............................................... ..........................

39

5 MATERIAIS E MÉTODOS...................... ......................................... ......................................... ................................ ..........

40

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO

48

7 CONCLUSÃO................... ......................................... ............................................ ............................................ ......................... ...

68

REFERENCIAS..................................................... 8 REFERENCIAS.

69

......................................... ................... ............................................ ............................................. ............................. ......

1 INTRODUÇÃO A Cerveja, assim como o vinho, é uma bebida alcoólica obtida através de processos fermentativos. Para a sua produção são usados malte, lúpulo, levedura e água como ingredientes. Seu processo produtivo engloba diversas etapas, tais como: brassagem, fermentação, maturação, filtração e envase. Estão disponíveis no mercado cervejas do tipo “Ale” e do tipo “Lager”. As cervejas do Tipo “Ale” são oriundas de processos fermentativos considerados de alta fermentação e as do tipo “Lager” de baixa fermentação, sendo o sabor

po “Lager” mais e aromas das cervejas ti po

suaves e leves (ARAÚJO, SILVA e MININ, 2003). O consumidor dessa bebida tem sido cada vez mais exigente quanto à qualidade sensorial dos produtos disponíveis nas prateleiras dos mercados. Além disso, a busca pelo produto que tenha melhor qualidade e menor preço tem sido crescente. Por esses motivos as cervejarias preocupam-se em ter no mercado mercado uma cerveja que que tenha suas características características sensoriais e físicoquímicas inalteradas. O controle de qualidade de todas as etapas do processo de produção da cerveja é fundamental para a indústria, que deseja manter um produto de reconhecida r econhecida marca no mercado. Além das análises físico-químicas, é necessário garantir também a confiabilidade da análise sensorial na indústria. Essa análise é realizada pelo painel de degustação, que é composto por cervejeiros com formação externa e leigos, isto é, funcionários selecionados e capacitados para a degustação. A capacitação desse painel é realizada através de treinamentos periódicos com os possíveis “off -flavours” inerentes da produção da cerveja, os quais são sabores ou odores residuais que

estão fora do perfil característico da cerveja. Para o preparo desses “off -flavours”, o gestor gestor de análise sensorial sensorial conta com com um kit disponível no mercado internacional, de rápida e prática utilização, o que o torna adequado para a rotina dinâmica da indústria. No entanto, essa técnica usa o homem como único instrumento de medição para a identificação de “off -flavours” em cerveja. Em virtude da preocupação preocupação da indústria com a saúde de degustador, o número de provas a serem degustadas por pessoa é limitado, necessitando necessitando um maior número de degustadores degustadores para degustação de rotina, o que desperta nas cervejarias a real necessidade de desenvolver uma metodologia analítica alternativa para a identificação destes, com um maior número de resultados liberados. 12

lavours” tendo em vista Este trabalho desenvolveu métodos para a identificação de “off -f -f lavours”

as necessidades da indústria. Para isso, a identificação de aromas de impacto na cerveja contou com as análises de voláteis através da técnica de microextração em fase sólida seguida de cromatografia gasosa de alta resolução acoplada a detector e espectrometria de massas (SPMECGAR-EM) e extração “Headspace” (HS) com posterior cromatografia gasosa de alta r esolução acoplada a detector de captura de elétrons (HS-CGAR-DCE) em 15 cervejas de marcas conhecidas nos mercados nacional nacional e internacional. internacional.

13

BIBLIOGRAFICA 2 REVISÃO BIBLIOGRAFICA 2.1. CERVEJA: DEFINIÇÃO E UM BREVE HISTÓRICO A cerveja é uma bebida carbonatada que possui teor alcoólico entre 3% e 8%. Sua produção exige o uso de cevada germinada (malte), lúpulo, levedura e água. Pode conter também outras outr as fontes de carboidratos tais como: milho, arroz e trigo (SIQUEIRA, BOLINI e MACEDO, 2008; BELITZ e GROSCH, 1999; FERREIRA, 2007). Essa bebida pode ser considerada uma boa fonte de polifenóis provenientes do malte ou lúpulo e pode trazer alguns benefícios a saúde para quem a consome moderadamente. Sua capacidade antioxidante antioxidante e baixo teor alcoólico permitem melhorar a atividade antioxidante do plasma evitando doenças coronárias. Seu consumo moderado é capaz de influenciar positivamente o nível de lipídeos do plasma e sua capacidade anticoagulante (SIQUEIRA, 2008). Essa capacidade antioxidante antioxidante pode ser comparada a do vinho branco, no entanto, é inferior a do vinho tinto, além de possuir compostos antioxidantes diferentes devido a composição de malte e lúpulo. Quanto ao valor valor nutricional, contém quantidades quantidades significativas de vitaminas do complexo B, carboidratos carboidratos e minerais (cálcio, magnésio, magnésio, ferro e selênios) (SIQUEIRA, BOLINI BOLINI e MACEDO, 2008; BELITZ e GROSCH, 1999). A maioria das bebidas elaboradas com cereais nos últimos 8000 anos é hoje considerada como cerveja. Era conhecida pelos sumérios, egípcios e mesopotâmios, desde pelo menos 4000 a.C. Como os ingredientes usados para fazer cerveja diferem de acordo com o local, suas características (tipo, sabor e cor) variam amplamente. Os babilônios já fabricavam mais de dezesseis tipos de cerveja de cevada, trigo e mel há mais de 4000 aC. O Código de Hamurabi, criado entre os anos de 1792 e 1750 a.C., incluía várias leis de comercialização, fabricação e consumo da cerveja, relacionando direitos e deveres dos clientes das tabernas. A pena de morte, por exemplo, poderia ser imposta aqueles aqueles que diluíam a cerveja cerveja que vendiam (HISTORIA (HISTORIA DA CERVEJA,2010; CERVEJAS DO MUNDO,2013). Posteriormente, no antigo Egito, a cerveja, segundo o escritor grego Ateneu de Náucratis (século III d.C.), teria sido inventada para ajudar a quem não tinha como pagar o vinho. Inscrições em hieróglifos e obras artísticas ar tísticas testemunham sobre o gosto deste povo pelo produto. Até um dos faraós, Ramsés III (1184-1153 a.C.), passou a ser conhecido como "faraó14

cervejeiro" após doar aos sacerdotes do Templo de Amon um milhão de litros de cerveja provenientes de de suas cervejarias cervejarias (FERREIRA, 2007). Na Idade Média, a cerveja foi utilizada como mercadoria para comércio, pagamento e impostos. Os monges aperfeiçoaram a tecnologia cervejeira e serviram como vendedores por atacado (FERREIRA, 2007). No século 14, a cidade de Hamburgo, no norte da Alemanha, era o centro cervejeiro da Europa, com mais de mil mestres cervejeiros. Considera-se Gambrinus o patrono dos cervejeiros em todo mundo. Dentre muitas teses para a origem desse nome a mais aceita é a de que deriva do nome Jan Primus, conhecido como Duque Brabant, que viveu em torno do ano de 1251(Século 13). Os cervejeiros de Bruxelas (Bélgica) teriam oferecido a ele a posição de membro honorário em sua associação, associação, o que foi por por ele aceito e considerado por por esses cervejeiros uma uma grande honra, honra, e desse modo, os cervejeiros cervejeiros passaram a contar com um poderoso patrono. patrono. A Reinheitsgebot, Reinheitsgebot, ou Lei Lei da Pureza, foi proclamada em 23 de abril de 1516, 1516, na Alemanha. Essa lei definia que apenas quatro insumos deveriam estar presentes na fabricação da cerveja: água, o malte, o lúpulo e o fermento (HISTORIA DA CERVEJA, 2010; CERVEJAS DO MUNDO, 2013). A cerveja chega ao Brasil, na segunda metade do século XIX, em 1808, trazida da Europa pela família Real Portuguesa. Nessa época época seu consumo era restrito à uma pequena pequena parcela da população e só haviam marcas marcas importadas. Em 1836, surge a primeira notícia sobre sobre fabricação fabricação de cerveja no Brasil, publicada no Jornal do Comércio, Rio de Janeiro (HISTORIA DA CERVEJA, 2010; CERVEJAS DO MUNDO, 2013). A cerveja do tipo Pilsener nasce em Pilsen (Tchecoslováquia) em 1842 e é a mais consumida no mundo. De sabor delicado, leve, clara e de baixo teor alcoólico (3 à 5%), é também a preferida dos brasileiros. No Brasil o consumo da pilsen chega a 98% do total ingerido, ficando o restante para as do tipo bock, light, malzbier e stout (FERREIRA, 2007). A ciência cervejeira surgiu de fato a partir do século XX, o que resultou em um avanço das tecnologias e domínio da produção. Houve também aprimoramento no controle de qualidade de leveduras, matérias-primas e do produto final. Tudo para atender consumidores que buscam qualidade, variedade e preços atrativos (FERREIRA, 2007).

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2.2 INGREDIENTES DA CERVEJA 2.2.1 Malte O Malte é o termo técnico usado para definir a matéria-prima resultante da germinação de qualquer cereal (milho, trigo, cevada, aveia, centeio, triticale - cruzamento de trigo e centeio, sorgo e até arroz) (FERREIRA, 2007 e ALVISI, 2011). O principal ingrediente usado na produção de cerveja é a cevada maltada. A cevada é uma planta da família das gramíneas e seu cultivo é realizado em climas temperados como o do Brasil ( Rio Grande do Sul) e Argentina (NOGUEIRA, 2006). Dentre os demais cereais, a cevada foi a escolhida para a produção da cerveja por possuir características particulares, tais como: a) facilita o controle da germinação; b) possibilita a produção de cerveja com sabor de maior aceitabilidade no mercado; c) apresenta alto teor de amido; d) apresenta enzimas em sua constituição e possibilita a formação de mais enzimas durante a germinação; e) possibilita a formação de uma camada filtrante natural, devido à sua casca; f) apresenta apresenta teor de proteínas em proporção proporção ideal em relação relação ao teor de amido e g) apresenta características características superiores tecnológicas tecnológicas de paladar (ALVISI, 2011). Quando não há definição do cereal maltado, maltado, subentende-se por malte de cevada. Para Para avaliá-los, são considerados dois métodos: no primeiro, o poder germinativo da cevada é igual ao número de grãos que germinam num total de 100 grãos e o valor deve ser maior que 95%; e, no segundo, o potencial de germinação deve ser igual à percentagem de grãos que germinam em 72h devendo ser de 65 à 85%, o qual está diretamente ligado à atividade enzimática do grão (FERREIRA, 2007). O malteio é um processo biológico controlado da germinação, com o propósito de atingir alterações básicas de metabolismo que abrangem a decomposição do amido e das proteínas e que possui três etapas: maceração, germinação e secagem. Esse processo possui três objetivos: a) formar enzimas; b) ativar enzimas já existentes, transformando substâncias de alto peso molecular e insolúveis em água em sub-produtos de alto, médio e baixo peso molecular que são solúveis em água e c) formar os componentes característicos de aroma, cor e paladar (FERREIRA, 2007; ALVISI, 2011).

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2.2.2 Lúpulo O Lúpulo é responsável por conferir a cerveja um sabor amargo e contribui também para o aroma do produto. Encontramos no mercado para a sua comercialização na forma de pellet , extratos de CO 2 ou hexano e em flor (FERREIRA, 2007). Nas cervejarias, o lúpulo mais utilizado, Humulus lupulus, pertence à família das Cannabinaceae . É uma

trepadeira cujas flores apresentam grandes quantidades de resinas

amargas e de óleos essenciais que caracterizam o aroma e sabor da cerveja. Seu cultivo é feito em climas frios como em países do norte europeu e Estados Unidos (NOGUEIRA, 2006). Perfis amargos na cerveja são bem compreendidos, compreendidos, já que apenas alguns precursores estão presentes no lúpulo: alfa-ácidos ou humulonas (1) e beta-ácidos beta-ácidos ou lupulonas (2). As estruturas estão representadas na Figura 1 (KEUKELEIRE, 1999).

FIGURA 1 – Estruturas das Humulonas e Lupulunas (KEUKELEIRE, 1999). O processamento do lúpulo possui 4 etapas: colheita, peneiramento, secagem e prensagem. Primeiro, as vinhas são cortadas do fio principal e transportadas para as máquinas “coletoras de cones”; após isso os

cones são separados nessas máquinas especiais (tambores Rotativos) que

movem apenas as flores (cones) da vinhas; na terceira etapa, os rejeitos de folhas, galhos e outros são peneirados e separados dos cones. Por fim, a secagem é realizada de 80% à 10%, semelhantemente semelhantemente ao processo de malteação e comprimido em pellets para reduzir o espaço de estocagem (ALVISI, 2011).

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O lúpulo pode ser analisado pelas seguintes metodologias: precipitação com acetato de chumbo, ultravioleta e HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência) (FERREIRA, 2007 e MAARSE e BELZ ,1981). 2.2.3 Levedura A levedura é um microorganismo unicelular, pertencente ao gênero da família Saccharomyces, que pode obter a energia que precisa na presença ou na ausência de oxigênio

através de respiração aeróbia e anaeróbia, respectivamente (ALVISI, 2011 e NOGUEIRA, 2006). Sua membrana celular permite assimilar açúcares, aminoácidos, peptídeos simples, vitaminas e sais minerais, produzindo uma série de reações de forma a usar esses nutrientes para o crescimento crescimento e fermentação fermentação (NOGUEIRA, 2006). de leveduras que caracterizam o tipo de cerveja: “Ale” e “Lager”. Existem dois tipos de As cervejas de alta fermentação ou “Ale” são provenientes de leveduras da espécie Saccharomyces cervevisiae , as quais que não decantam, isto é flutuam na superfície da cerveja

no decorrer da fermentação, que dura de 3 a 4 dias. As temperaturas de fermentação são mais elevadas, variando de 15 à 25 °C. Já as cervejas de baixa fermentação ( ou “Lager”) são provenientes de leveduras leveduras pertencentes a espécie Saccharomyces uvarium (antes denominada Saccharomyces carlsbergensis). Essas leveduras decantam e floculam no final da fermentação,

que dura de 5 a 8 dias com temperaturas de 10 à 15°C. (ALVISI, 2011 e NOGUEIRA, 2006). As leveduras de baixa fermentação são diferenciadas de acordo com a sua capacidade de sedimentação: pulverulentas (baixa floculação) e floculentas (alta floculação, aglutinação) (ALVISI, 2011). O fermento ideal deve possuir algumas características importantes, tais como: fermentação eficiente, pouca formação de espuma, pequenas perdas de amargor, facilidade para a redução do diacetil, floculação, boa sedimentação, facilidade de recolha do fermento, formação de aroma e sabor compatível com a marca de cerveja produzida, arranque vigoroso, queda do pH, menor risco de contaminação, resistência a contaminação microbiológica e resistência a mutação (alterações de características). Há também algumas características indesejáveis: formação de aromas desagradáveis, dificuldade de recolha do fermento, formação elevada de espuma, altas perdas de amargor, sensibilidade a contaminação e dificuldade de redução do diacetil (ALVISI, 2011). 18

Um dos problemas que podem acontecer com o fermento é a autólise. Essa reação provoca um aumento aumento do pH da cerveja cerveja devido a passagem do conteúdo conteúdo do citoplasmático citoplasmático para o meio extracelular. extracelular. A causa desse problema problema é devido devido a formação formação de CO 2 e álcool, que “estressam” a levedura (ALVISI, 2011).

2.2.4 Água A água é considerada o principal componente da cerveja em quantidades absolutas, constituindo uma proporção de 92g em cada 100g de produto. A alteração de suas propriedades físico-químicas pode afetar a qualidade final do produto pr oduto (NOGUEIRA, 2006). Por exemplo, os sais da água usado no preparo do fabrico, exercem ação sobre a qualidade da cerveja, influenciando as condições enzimáticas e coloidais que se passam no decorrer da fabricação da cerveja. Além disso, algumas substâncias presentes na água, proveniente de recursos naturais, podem alterar as propriedades químicas originais da cerveja, sendo as de maior importância: pH, alcalinidade, dureza, condutividade e turbidez (ALVISI, 2011 e FERREIRA, 2007). A água também apresenta uma grande variedade de sais ionizados na forma de partículas carregadas eletricamente ou íons. Os principais cátions presentes são: H +, Ca+, Mg+, , Na+, K +, Fe 2+ ou Fe 3+, Al 3+, e NH4 +. Os principais ânions presentes são: OH -, HCO3-, Cl-, NO3-, SO4e SiO32-. A intensidade de alcalinidade alcalinidade ou acidez representam representam um indicador para a capacidade capacidade de corrosão (NOGUEIRA, 2006). 2.3 PROCESSO DE PRODUÇÃO DA CERVEJA 2.3.1 Brassagem A primeira etapa do processo produtivo ocorre na chamada sala de fabricação, onde as matérias-primas (malte e adjuntos) são misturadas em água e dissolvidas, visando a obtenção de uma mistura líquida açucarada chamada chamada mosto, que é a base da futura cerveja (FERREIRA, 2007). O mosto recebe a adição de lúpulo e é fervido por aproximadamente 3 horas. O objetivo desta operação é concentrar o mosto até o ponto desejado, esterilizá-lo, inativar as enzimas, coagular certas proteínas pelo calor, modificar o odor de malte e extrair o cheiro e tanino das resinas do lúpulo (SHREVE e BRINK, 1997). 19

O malte utilizado uti lizado na preparação do mosto necessita ser beneficiado antes da utilização na brassagem. Esse beneficiamento é composto por três etapas: transporte, tr ansporte, limpeza e pesagem final, que visam garantir o abastecimento de malte para a moagem, moagem, executar a mistura dos tipos de malte (“ blending”), limpar as impurezas da massa de grãos e pesar os maltes (ALVISI, 2011). Os processos envolvidos na brassagem brassagem são: moagem do malte e adjuntos, mistura com água, aquecimento para facilitar a dissolução, transformação transformação do amido em açúcar fermentáveis e não fermentáveis pelas enzimas do malte, filtração filtração com o objetivo de separar as cascas cascas do malte e dos adjuntos, adição de lúpulo, fervura do mosto para esterilização e dissolução do lúpulo e, por último, resfriamento (FERREIRA, 2007). 2.3.2 Fermentação Após o resfriamento o mosto recebe o fermento que é acondicionado em grandes tanques chamados chamados de fermentadores, dando dando inicio a etapa de fermentação. fermentação. Nessa etapa, ocorre um processo de transformações de açúcares para álcoois, gás carbônico, ácidos orgânicos, cetonas, ésteres e calor, resultado da ação da levedura l evedura (ALVISI, 2011 e FERREIRA, 2007). Durante todo processo é muito importante o controle preciso da temperatura (10 a 13°C) para a obtenção de uma cerveja com as características físico-químicas e sensoriais desejadas (FERREIRA, 2007). Outros fatores também são necessários para uma boa fermentação: o controle do teor de oxigênio, a gestão de reaproveitamento do fermento, a dosagem do fermento e a quantidade de nutrientes adequados (açúcares, aminoácidos, vitaminas e metais - Zn, Mg e Fe) (ALVISI, 2011). 2.3.3 Maturação Uma vez concluída a fermentação, a cerveja é resfriada resfri ada a 0°C, a maior parte do fermento é retirada por decantação (sedimentação) e tem início a maturação que costuma levar de 6 a 30 dias, variando de uma cervejaria para outra. Ao final dessa etapa, a cerveja está praticamente concluída, com aroma e sabor finais definidos (FERREIRA, 2007). Os objetivos principais da maturação são: arredondamento do paladar e aroma, clarificação da cerveja, amadurecimento e eliminação de substâncias sulfonadas que são arrastadas pelo gás carbônico (ALVISI, 2011). 20

O resfriamento provoca a formação de ligações entre taninos e proteínas (turvação a frio), os quais somente se tornam insolúveis e se precipitam a baixas temperaturas. No entanto, se essas ligações não forem precipitadas, elas poderão mais tarde levar a turvação (turvação a quente - estabilidade coloidal). Uma vez que a turvação a frio tenha se precipitado, ela será retirada da cerveja no processo de filtração filtr ação (ALVISI, 2011). 2.3.4 Filtração Após a maturação, a cerveja passa por uma filtração, que visa eliminar partículas em suspensão, suspensão, principalmente células de fermento, deixando deixando assim a bebida transparente transparente e brilhante. A filtração não altera a composição e o sabor da cerveja, mas é fundamental para garantir sua apresentação, conferindo-lhe um aspecto cristalino (FERREIRA, 2007). A cerveja se aquece na trasfega devido ao bombeamento e deficiência no isolamento das tubulações. Devido a esse reaquecimento (1 a 2°C), a cerveja re-dissolve parte da turbidez, inclusive aquela acumulada no filtro. Para evitar isso é necessário resfriar a cerveja antes do filtro (ALVISI, 2011). Essa etapa do processo produtivo da cerveja conta com a participação dos “auxiliares de filtração” ou “coadjuvantes de filtração”, os quais incluem muitos materias como: placas de

metal, tecidos não metálicos, telas metálicas, papéis, celulose, terras diatomáceas, perlitas e a combinação de alguns desses elementos (ALVISI, 2011). 2.3.5 Envase e Pasteurização O envase ou enchimento é a fase final do processo de produção da cerveja. Pode ser feito em garrafas de vidro, latas de alumínio e barris de aço inoxidável (FERREIRA, 2007). Logo após o envase, a cerveja é submetida ao processo de pasteurização, principalmente principalmente quando são envasadas envasadas em garrafas ou latas. No barril, a cerveja normalmente não é pasteurizada e por isso recebe o nome de Chopp. A pasteurização é um processo no qual a cerveja é submetida a um aquecimento a 60°C e posteriormente resfriada para garantir maior estabilidade, assegurando assegurando uma validade de seis meses ao produto (FERREIRA, 2007). Em alimentos de baixa acidez (pH< 4,5), a pasteurização é usada para minimizar possíveis danos a saúde do consumidor devido à contaminação contaminação com microrganismos patogênicos e para aumentar a vida de prateleira de alimentos por vários meses. Na cerveja, o objetivo principal da pasteurização é a destruição de microrganismos deteriorantes (como 21

leveduras selvagens, espécies de lactobacillus) e leveduras residuais (espécies de Saccharomyces) (FELLOWS, 2006).

2.4 ANÁLISE SENSORIAL E A CERVEJARIA Para produzir e vender produtos de reconhecida qualidade no mercado, é necessário a indústria cervejeira ter processos produtivos modernos, matéria-prima de primeira linha e comprometimento com a qualidade (FERREIRA, 2007). Apesar de existirem no mercado vários tipos de cerveja, um dos aspectos mais importantes na qualidade da cerveja é a sua estabilidade do sabor. Essa característica influi na decisão do consumidor e no crescimento do negócio. Sendo a qualidade fator decisivo na compra do produto, faz-se necessário uma criteriosa análise sensorial da cerveja. cerveja. A análise sensorial é uma disciplina científica usada para evocar, medir, analisar e interpretar reações produzidas pelas características dos alimentos e materiais e como elas são percebidas pelos órgãos da visão, olfato, gosto, tato e audição (FERREIRA, 2007; NORONHA,2003). NORONHA,2003). Compostos responsáveis responsáveis pelo gosto são geralmente não voláteis em temperatura ambiente. Portanto, eles interagem somente com receptores localizados na língua. O gosto é a sensação percebida pelos pelos órgãos gustativos quando quando estimulados estimulados por determinadas determinadas substâncias substâncias solúveis solúveis e envolve a percepção percepção dos 5 gostos básicos: básicos: doce, salgado, salgado, ácido, amargo amargo e umami (glutamato de sódio) (BELITZ e GROSCH, 1999; NICOLINO, 2001). O odor dos alimentos provém das substâncias aromáticas que são compostos voláteis que se desprendem, entram nas narinas e acionam milhares de receptores de odor localizados na mucosa olfativa (BELITZ e GROSCH, 1999; NICOLINO, 2001). O “aroma” é sentido por duas vias: nariz

e boca. Quando um alimento ou um líquido é

ingerido, são liberadas liberadas várias substâncias voláteis que retornam parcialmente ao nariz, nariz, neste fluxo contrário a respiração, chamado retro nasal e alcançam a mucosa olfativa (BELITZ e GROSCH, 1999; NICOLINO, 2001). A análise sensorial sensorial tem sido reconhecida como como fator chave para a seleção seleção de produtos na indústria de alimentos e bebidas. É de grande aplicabilidade na pesquisa e no desenvolvimento de novos produtos, teste de vida de prateleira, controle do processo de fabricação, controle de qualidade e estudos de mercado com consumidores. A avaliação sensorial também permite: a) garantir uma linguagem comum entre consumidor e produção; b) detectar problemas, contribuindo com a melhoria do processo 22

produtivo; c) analisar a qualidade do produto antes da liberação para o mercado e d) garantir que “flavours” específicos estejam em harmonia com a pr oposta oposta do “flavour” geral da marca

(FERREEIRA, 2007; BELITZ e GROSCH, 1999; NICOLINO, 2001). O principio básico é tratar t ratar os degustadores como instrumentos de medida. Como tais, esses profissionais são são altamente altamente variáveis e muito propensos a serem tendenciosos. Os Os testes devem ser organizados de forma a controlar essas variações e minimizar favoritismo, ou seja, o treinamento de provadores é uma necessidade permanente, os testes devem ser frequentemente repetidos e os resultados devem ser avaliados estatisticamente para confiabilidade dos trabalhos do painel de degustadores (NICOLINO, 2001). A união da ciência e cozinha nos treinamentos de análises sensoriais é um recurso que pode ser usado essencialmente para a divulgação dos defeitos da cerveja ligados ao cotidiano da preparação de alimentos nas nossas casas. Isso permite facilitar o processo de ensinoaprendizagem. Por ser uma bebida que apresenta um equilíbrio entre sabor e aroma, a cerveja é quimicamente instável e sofre diversas reações químicas e enzimáticas durante seu processamento processamento e estocagem. Sendo assim, “off -flavours” como ésteres, aldeídos, dicetonas vicinais, ácidos orgânicos, álcoois superiores, fenóis, iso- α-ácidos e outros compostos podem afetar diretamente sua qualidade. A queda de qualidade pelo surgimento de sabores e aromas indesejáveis e alterações nas propriedades físico-químicas da cerveja é um problema que a indústria cervejeira procura solucionar (SIQUEIRA, BOLINI e MACEDO, 2008). No Brasil foi realizado um estudo com seis marcas de cervejas do seguimento nacional com o objetivo de avaliar sua qualidade pelas características físico-químicas e sensoriais. Os métodos usados para avaliação sensorial - análise sensorial descritiva quantitativa (teste de intensidade) e teste de aceitação - permitiram observar uma maior intensidade de atributos sensoriais nas marcas de micro cervejarias, fato comprovado pelas análises físico-químicas. Para que o grupo realizasse uma avaliação sensorial eficiente, fez-se necessário a aplicação de um recrutamento e levantamento dos termos descritivos de modo que participantes dos testes fossem capazes de reconhecer nas cervejas os atributos pesquisados. pesquisados. A tabela 1 apresenta uma lista de termos descritivos empregados, empregados, suas suas respectivas definições definições e referências (ARAÚJO, (ARAÚJO, SILVA e MININ, 2003). Termos descritivos empregados com as suas expectativas definições e referências TABELA 1 – T

23

Fonte: ARAÚJO, SILVA e MININ, 2003. Recentemente, Recentemente, testes nos quais foram aplicadas as técnicas de microextração em fase sólida em “headspace” estático e cromatografia gasosa acoplada a EM demonstraram ser eficientes para a determinação do “off-flavour ” (E)-2-nonenal em cervejas brasileiras (SCHERER et al, 2010). É provável que o uso uso dessas técnicas técnicas sejam eficientes eficientes para aplicação aplicação no controle de qualidade dos demais voláteis da cerveja. No entanto, a literatura apresenta relatos r elatos de eficiência na pesquisa de componentes que contribuem para o sabor sem ser apreciavelmente volátil. Isso ocorre com os componentes do lúpulo na cerveja que foram analisados aplicando a cromatografia líquida de alta eficiência, que obteve uma boa separação separação de polifenóis, ácidos fenólicos fenólicos e nucleosídeos (MAARSE e BELZ, 1981).

24

2.4.1 “Off-flavours” do processo podem ser definidos como od ores ou sabores desagradáveis, que são Os “off -flavours” podem

indesejáveis à bebida. Esses odores frequentemente são associados a sua deterioração interna e inclui componentes de sabor. Há também t ambém substâncias precursoras precursoras que são materiais a partir dos quais alguns “off -flavours” são formados (BROTHERS, 2009). A combinação dos ingredientes descritos anteriormente (água, etc.) dá origem orig em ao sabor da cerveja, o qual é bem conhecido pelos consumidores. É importante destacar que o estudo dos compostos responsáveis responsáveis pelo sabor da cerveja está no domínio da química orgânica e analítica, permitindo determinar compostos na cerveja cerveja para o nível de compostos compostos isolados ou grupos grupos de compostos. Em contraposição, a percepção sensorial é uma experiência que permite avaliar um sistema completo e não a separação separação das respectivas partes componentes (HUGHES e BAXTER, 2001). O equilíbrio de compostos voláteis e não voláteis é responsável responsável pela aceitação e qualidade da bebida. A composição em ésteres, aldeídos, dicetonas vicinais, ácidos orgânicos, álcoois superiores, fenóis, iso-alfa-ácidos iso-alfa-ácidos e outros compostos compostos está relacionada à sua qualidade qualidade (SIQUEIRA, BOLINI e MACEDO, 2008). Alguns compostos como o dióxido de carbono, o etanol e os alfa e beta-ácidos provenientes do lúpulo desempenham um papel preponderante na definição do sabor da cerveja, no entanto, outros compostos, decorrentes tanto de defeitos ou por estarem em níveis muito superiores às unidades de sabores aceitáveis podem conferir ao produto um sabor fora dos padrões estabelecidos (“off-flavour ”) (HUGHES e BAXTER, 2001). A Tabela 2 apresenta uma referência para termos associados, materiais de referência e origem dos “off-flavours” mais comuns em cerveja (FERREIRA, 2007).

25

TABELA 2 – “off – “off -flavours” relacionados com origem na produção de cerveja "Off-Flavour"

Termos associados

Materiais de referência

Origem na cerveja

Observações

Alcoólico

Álcoois superiores Perfume Sensação de aquecimento

Álcool Isoamílico Álcool Etílico Etílico

Fermentação

Produzido pela levedura durante a fermentação.

Acetato de Isoamila

Banana

Álcool Isoamílico

Fermentação

Produzido pela levedura durante a fermentação. fermentação. Um dos ésteres mais importantes da cerveja.

Hexanoato de Etila

Maçã Anis Éster Frutado

Hexanoato de de Et Etila

Fermentação


Acetaldeído Acetaldeído

Maçã verde Solvente Vinho Branco

Acetaldeído

Fermentação

Produzido pela levedura durante a fermentação. Pode ter origem na incorporação de oxigênio no processo ou ser resultante de contaminação bactéri bactériana. ana.

2-Feniletanol

Floral Rosas

2-Feniletanol

Fermentação


Brassagem/ Fermentação

É um componente do óleo de lúpulo lúpulo (óleo essencial de Humulus Lupulus). Sua concentração na cerveja depende da variedade do lúpulo, da forma de processam processamen ento to do lúpu lúpullo, da fervura do mosto e das condições em que a cerveja foi fermentada.

Brassagem

Transmiti Transmitida da a cerveja c erveja pela p ela adição deliberada de uma dose de lúpulo (normalmente lúpulos de aroma) à caldeira mais para o final da fervura.

Geraniol

Lúpulo Floral

Floral

Floral Chá de erva Cidreira

Geraniol

Cetonas Terpenos derivados de lúpulo

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(continuação Tabela 2) "Off-Flavour"

Termos associados

Lúpulo Condimentado

Fenólico Cravo

Amêndoa Amêndoa

Óleo de Amêndoa Licor Frangélico Licor Maraschino

Grama Verde Cortada

Grão

Malte

Mosto

Grama Verde Cortada

Barro Mato Verde

Malte Extrato de Malte

Mosto Kr Kronenbier


Cetonas Terpenos derivados de d e lúpulo lúpulo

Benzaldeído

E- 2-Hexenol

Extratos de cevada e malte Isobutaldeído

Extratos de Malte

Extratos de de Ma Malte

Origem na cerveja

Observações

Brassagem

Transmitida a cerveja pela adição deliberada de uma dose de lúpulo (normalmente lúpulos de aroma) à caldeira mais para o final da fervura.

Armazenamento

Pode chegar chegar a este estado e stado durante o período de armazenamento (envelhecimento).

Brassagem

A sua presença é influenciada pela pela práti prática de ferv fervur uraa do mosto e pela variedade de lúpulo utilizada.

Brassagem

Transmitida a cerveja pelo malte de cevada. Também é associado ao uso de malte que não foi armazenado tempo suficiente, antes do uso. Retorno de condensado na fervura pode causar esta característica.

Brassagem

Transmitida a cerveja pelo uso de cevada de malte. Formação influenciada pela fervura.


Desenvolvida durante a produção produção do mosto mosto (tax (taxaa de evaporação) e método de fermentação (normalmente é removido pela levedura durante a fermentação). fermentação).

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Caramelo

Termos associados

Bala Toffee Algodão doce

Queimado

Queimado Torrado

Fenólico

Cravo Tempero Especiarias

Clorofenol

Medicinal Antisséptico "Cheiro de Hospital"

Caprílico

Sabão Sabão de coco Cera

Isovalérico

Que Queijo Parmesão


Caramel Cara melos os comerciais comerciais Maltose de d e Etilo

Extratos de Malte

4-vinil-guaiacol

Origem na cerveja

Observações

Brassagem/ Pasteurização/ Armazenamento

Transmitida pela adição de açúcar caramelizado caramelizado ou ou faberbier. Pode-se formar na produção produção do mosto mosto e na na cerveja pela pela reação de Maillard Maillard durante a pasteuri pasteuriza zação ção e armazenamento.

Brassagem

Originado pela adição de cereais torrados (cevada , malte chocolate e malte preto). preto). Também Também pode ter pel pela adição de algumas espécies de caramelos.

Fermentação

Produzido por leveduras selvagens ou fermentos especiais.

2,6-Diclorofenol

Contaminação externa das matérias-primas e/ou materiais Armazenamento de de embalagens com Matériasclorofenol. Cerveja em prim primas/Todas as/Todas as contato com solução a base etapas de de cloro ou água clorada processo. processo. utili utilizada zada no processo proce sso reagindo reagindo com fenóis.

Ácido Octanóico

Fermentação

Produzido pela levedura durante o acondicionamento acondicionamento na adega de fermentação.

Brassagem

Transmiti Transmitida da a cerveja c erveja pela p ela adição adiçã o de lúpulo lúpulo antigos decompostos ou mal estocados estoc ados (clivagem (clivagem de alfaalfaácidos e produção de ácido isovalérico).

Ácido Isovalérico

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Butírico

Diacetil

Sulfítico

Termos associados

Vômito de criança "Golfada"

Manteiga

Poluição Sensação de irritação nas vias nasais

Sulfídrico

Ovo Ovo Podre Enxofre Fósforo queimado queimado

Mercaptana

Gás de d e cozi co zinha nha Esgoto Rato Morto


Ácido Butírico

2,3- Butanodiona

Dióxido de enxofre

Ácido Sulfídrico Sulfídrico

Etanotiol

Origem na cerveja

Observações

Brassagem

Pode ser produzido produzido por p or bactéri bactérias nos nos moi moinh nhos, os, durante a produção do mosto ou nos xaropes de açúcar durante o armazenamento.

Fermentação

Formado na cerveja por um precursor precursor produzi produzido do pelo pelo fermento durante a fermentação. fermentação . Seus níveis níveis elevados pode podem m ter origem origem em problemas com a levedura na redução do Diacetil, alto teor de aminoácidos e contaminação contaminação bacteriana quando os padrões de higiene são inadequados.

Fermentação

Podem ser adicionados à cerveja na forma de antioxi antioxidante. dante. Os fermentos fermentos de de cervejas claras produzem naturalmente sulfitos dependendo das condi co ndições ções de de ferm fermentação entação e da cepa cep a do fermento.

Fermentação/ Maturação

Produz Prod uzido ido pela pe la levedura levedura durante a fermentação e/ou maturação. Pode ser formada por autól autóliise do ferm ferment entoo ou por bactéri bactériaa quando quando os padrões de hi higiene giene são inadequados.

Fermentação/ Maturação

Produz Prod uzido ido pela pe la levedura levedura durante a fermentação e também pela autólise do fermento fermento durante d urante a maturação. maturação.

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Lightstruck

Borracha queimada

DMS

Termos associados

Gambá Suor

Borracha qu queimada

Vegetais Vegetais cozidos Milho Milho cozido


3-Metilo-2-buteno-1-tiol

Propanoditiol

Dimetil Sulfeto

Origem na cerveja

Observações

Armazenamento

Formada na cerveja pela exposição a luz. Cervejas que foram adicionadas exclusivamente exclusivamente com c om lúpulos lúpulos reduzidos não desenvolvem este sabor, se processadas sem contato com lúpulos regutares.

Pode ser transmitido a cerveja quando em contato com Todas as etapas de junt juntas as e tubos tubos de borrach borrachaa processo processo que possuam compostos sulfurados.


Formado por um precursor derivado do malte durante a produção produção do mosto mosto ou por bactéri bactéria duran durante te a fermentação.

Cebola

Cebola Cebola cozida

Trissulfeto de trimetila


Produz Prod uzida ida durante a fervura fervura do mosto a partir de aminoácidos que contenham enxofre. enxofre. Removido Removido da cerveja durante fervura do mosto e/ou durante a fermentação pela ação deo CO 2. Pode ter origem na autólise do fermento. Também está presente presente no no óleo óleo de lúpu lúpullo.

Levedura

Fermento Pão Levedura Extratos de Levedura

Extrato de fermento

Fermentação

Aroma típico de fermento fresco.

Brassagem

Contam Co ntamin inação ação de matériasmatérias prim primas com precursor precursor de aroma Catty. Risco de migração de tintas de paredes, pisos pisos para para o mal malte, te, mosto mosto ou cerveja.

Catty

Maracujá Urina de gato

p-Metano-8-tiol p-Metano-8-tiol-3-ona -3-ona

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Termos associados

Papelão

Papelão Papelão Molhado

Terra

Terra Terra Molhada Terra Filtrante

Mofado

Acético Acétic o

Láctico

Ácido

Doce

Mofo Mofado

Vinagre

Ácido Iogurte

Ácido Limão

Doce


E-2-nonenal

2-etilo de fenol

2,4,6-tricloroanisol

Ácido Acético

Origem na cerveja

Observações

Formado durante o armazenam armazenamento ento da d a cerveja c erveja dependendo do tempo, Armazenamento temperatura e teor teo r de oxigêni oxigênioo da cerveja processada ou envasada. Fermentação/ Maturação

Pode ser produzido por contaminação microbiana da água ou das paredes úmidas da adegas.

Brassagem

Contaminação externa das matérias-primas e/ou materiais de embalagens com cloroanisol.

Fermentação

Produz Prod uzido ido pela pe la levedura levedura durante a fermentação e também por contaminação contaminação com as bactérias Acetobacter e Gluconobacter.

Ácido láctico

Produz Prod uzido ido pela pe la levedura levedura durante a fermentação e Fermentação/ também por contaminação contaminação Maturação/ Envase com as bactérias durante a fermentação, maturação e na cerveja envasada.

Ácido Cítrico


Produz Prod uzido ido na fermentação fermentação e também por contaminação contaminação bactéri bactériana do produto produto ou processo. processo. Tam Também pode ter origem nas matérias-primas.


Doçura derivada dos açúcares com origem no malte e auxili auxiliares ares de fermentação. fermentação. Os nívei níveiss residu res iduais ais de açúcar são s ão determinados pela atividade fermentativa da levedura.

Sacarose

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Salgado

Termos associados

Salgado

Amargo Amargo

Amargo

Alcalino Alcalino

Oleoso Escorregadio Flat

Metálico

Ferro Metálico Amálgama

Adstringe Adstringente nte

Caqui e banana verde Boca seca Sensação de cica na boca

Acetato de de Etila

Esmalte Solvente de esmalte esmalte

Defumado

Defumado

Materiais de referência referência

Cloreto de sódio

Iso-alfa-ácidos

Bicarbonato de sódio

Sulfato Ferroso

Ácido Tânico

Acetato de Etila

Guaiacol

Origem na cerveja

Observações

Brassagem

Sanilidade derivada da adição de sal a solução em fabricação ou a mistura de farinha de malte com água.

Brassagem

Amargor derivado da adição de lúpulos durante a fervura do mosto, ou pela adição de mosto ou cerveja de extratos de lúpulo.

Contaminação externa da Todas as etapas de cerveja com produto cáustico proces processo so (resíduo de limpeza).

Todas as etapas de proces processo so

Derivado pelo contato da cerveja com substâncias contendo características metálicas. Podem também derivar do processo de oxidação.

Brassagem

Sua origem está nos polifenóis proven proveniientes entes do mal malte te e lúpulo.

Fermentação

Produzido por leveduras selvagens ou de cultivo durante a fermentação.


Através de matéria-prim atéria-p rimaa exposta à fumação. Pode ser extraído durante a mostura ou fervura fervura do mosto.Ocasionalmente, formado por ação bacteriana na fermentação.

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Baunilha

Carbonatação

Corpo

Termos associados

Sorvete de Baunilh Baunilhaa Bala

Gás carbônico


Vanilin

Dióxido de carbono

Dextrinas

Origem na cerveja

Observações


Ocasionado pelo rompimento da parede celular do malte. Pode ser formado pela degradação de com co mpostos fenólicos produzidos por levedura selvagem.

Fermentação

Produzido pela levedura durante a fermentação. Esse efeito pode ser controlado após a fermentação dependendo de blendagem e estilo de cerveja.

Brassagem

Os materiais responsáveis pelo pelo corpo são extraí extraídos dos na na brassage brassagem m, para restri restring ngiir a fermentação ou inibir a levedura de degradá- los, eles são parcialmente deixados sem degradação na cerveja final.

Fonte: FERREIRA, 2007.

33

2.5 TÉCNICAS P ARA ANALISES DE “OFF -FLAVOUS” EM CERVEJA 2.5.1 Técnicas de extração de voláteis 2.5.1.1 “Headspace” (HS) A técnica de HS consiste em amostrar a atmosfera gasosa que que circunda uma amostra de interesse. Essa coleta pode ser feita de modo estático ou dinâmico, utilizando no segundo modo um gás inerte que tem como função o arraste dos compostos voláteis, em geral para um adsorvente. Os compostos voláteis podem ser retidos em adsorventes, condensados em superfície fria ou transferidos diretamente para o cromatógrafo. A vantagem desta técnica é a obtenção de uma amostra rica em compostos voláteis sem necessidade de aquecimento da matriz (BELITZ e GROSCH, 1999; MIRANDA, 1999). 2.5.1.2 Microextração em fase sólida (SPME) A SPME tem sido a técnica técnica de amostragem de voláteis mais utilizada nos nos últimos 10 anos na literatura científica. Facilidades como a ausência de solvente, alto poder de concentração, aplicação a diversos tipos de analitos, uso de aparelhagem em fase gasosa ou líquida (por contato), fases sólidas de natureza química distintas e facilidade de transporte do material extraído para o cromatógrafo cr omatógrafo explicam seu sucesso (AUGUSTO e VALENTE,1998). O dispositivo básico da SPME é uma fibra, de sílica fundida, cuja espessura varia entre 30 a 100μm, recobe rta com um

filme fino de um polímero [(e.g.,polidemetilsiloxano (PDMS),

poliacrilato (PA) ou Carbowax (Cwx)] ou de sólido adsorvente [e.g., carvão ativo microparticulado (Carboxen)] na extremidade da agulha. A extração ocorre mergulhando-se a seção recoberta recoberta na amostra, ou no seu HS. Realizada a extração, a fibra é recolhida e inserida no injetor do cromatógrafo, onde os analitos são termicamente dessorvidos sob fluxo do gás de arraste e carregados para a coluna cromatográfica (VALENTE e AUGUSTO, 2000). As vantagens do método método de SPME prendem-se ao ao fato de o procedimento analítico analítico ser simples, rápido e não usar solventes orgânicos no processo de extração (ZAMBONIN, QUINTO e VIETRO, 2003).

34

2.5.1.3

Cromatografia gasosa de alta resolução acoplada a detector de captura captura de elétrons

(HS-CGAR-DCE) A cromatografia gasosa é uma técnica usada usada na separação e determinação determinação de compostos voláteis e/ou volatilizáveis. volatilizáveis. Os componentes de um cromatógrafo gasoso gasoso são: cilindro de gás, injetor, coluna, detector e integrador. Podemos considerar a separação cromatográfica como resultado de uma interação entre a fase móvel (gás de arraste) e fase estacionária. O gás de arraste passa por um regulador de pressão e vai para o injetor de amostra, arrastando-a para a coluna. Os componentes da amostra são separados durante sua passagem pela coluna e, um após o outro passam passam pelo detector que, que, por sua vez, envia envia um sinal elétrico que é registrado registrado graficamente sob a forma de picos pelo integrador. (PENTEADO, MAGALHÂES e MASINI, 2008; CIOLA,1985). De acordo com a natureza da fase estacionária, estacionária, a cromatografia gasosa gasosa pode ser classificada em: a) em cromatografia gás-sólido – fase estacionária é um sólido e b) cromatografia gás-líquido - fase estacionária é um líquido imobilizado sobre um suporte inerte integrador (PENTEADO, MAGALHÂES e MASINI, 2008). O detector de captura de elétrons (DCE) possui uma fonte de ionização que emite elétrons (β). A passagem de gás de arraste não altera a corrente devido à emissão β (10 -8 A);

no entanto, ao passar um aceptor de elétrons, essa corrente diminui o valor da ordem de 10

-10

,

10 -12 e 10 -13 A. O valor de queda da corrente é proporcional à queda do composto o que permite o cálculo de espécies que tenham afinidade por elétrons. Esse detector é muito usado na análise de compostos que apresentam halogênios em sua estrutura, ou em compostos oxigenados, para os quais sua sensibilidade é bem menor (CIOLA,1985). (C IOLA,1985). Análises de poluentes de água como o trihalometano tri halometano (THM) geralmente são realizadas com o DCE devido a sua sensibilidade sensibilidade e seletividade, para análise análise de compostos halogenados halogenados (AUGUSTO e VALENTE, 1998). Multirresíduo em amostras de uva, foram analisados por CGAR-DCE e os resultados obtidos mostraram que a técnica é eficiente para análise de agrotóxicos em uva (SOARES, 2011).

35

2.5.1.4 Microextração em fase sólida seguida de cromatografia gasosa de alta resolução acoplada a detector e espectrometria de massas (SPME-CGAR-EM) A SPME-CGAR-EM é uma ferramenta analítica analítica usada na separação e determinação determinação de compostos voláteis e/ou volatilizáveis. No entanto, a qualidade de um método analítico depende da técnica de amostragem, pois quase nenhuma matriz pode ser diretamente injetada no cromatógrafo gasoso, isso porque possuem constituintes não voláteis, termodegradáveis, etc e água em quantidade incompatíveis com as colunas cromatográficas e com os detectores de cromatografia gasosa (PENTEADO, MAGALHÂES e MASINI, 2008; VALENTE e AUGUSTO, 2000 ; BELITZ e GROSCH, 1999; MIRANDA, 1999; CIOLA,1985;). A espectrometria de massa é uma técnica que demonstra demonstra ser eficiente na identificação de substâncias, aplicáveis a sólidos, líquidos e gases. É baseada na fragmentação de moléculas que seguem padrões previsíveis para cada tipo de substâncias segundo sua funcionalidade. Possui recursos de biblioteca de espectros com dezenas de milhares de espectros padrões arquivados, que podem podem ser acessáveis acessáveis rapidamente e permitem validar uma identificação identificação ou confirmar a estrutura de uma substância (FRAGA, 2005). A utilização da SPME-CGAR-EM é relativamente simples, levando-se em consideração que o funcionamento do cromatógrafo a gás é compatível com a necessidade necessidade de alto vácuo do espectrômetro de massas (CHIARADIA, COLLIN e JARDIM, 2008). Quando são utilizadas utilizadas colunas capilares, capilares, pode-se conectar a saída saída da coluna diretamente diretamente à fonte do espectrômetro, sendo isso possível ao sistema de bombeamento do espectrômetro espectrômetro de massas, que é capaz de captar todo o eluente da coluna (CHIARADIA, COLLIN e JARDIM, 2008). Quando são utilizadas colunas recheadas, a vazão do eluente deve ser reduzida antes da sua entrada na fonte de ionização do espectrômetro, através do uso de divisores de fluxo; no entanto, seu desempenho não é tão satisfatório por gerar perdas na detectabilidade. Para minimizar esse efeito, o interfaceamento pode ser feito por meio m eio de um separador de jato, que é constituído por dois capilares alinhados e separados por uma distância de cerca de 1 mm, tendo vácuo estabelecido entre eles por meio de uma bomba. Deste modo, quando o eluente da coluna atravessa o primeiro capilar, grande parte do gás carregador (geralmente He), que possui baixa massa atômica, é bombeado para fora dos capilares, enquanto as moléculas de analito (com maior massa) mantêm-se em fluxo linear e penetram no segundo capilar que as direciona para a fonte de íons do espectrômetro de massas (CHIARADIA, COLLIN e JARDIM, 2008). 36

Relatos apontam para a eficiência da técnica SPME-CGAR-EM para separar e identificar voláteis presentes nas amostras de sucos de frutas e refrigerantes durante o processo de envelhecimento envelhecimento (natural e acelerado). Para sucos, sucos, os resultados obtidos mostraram a presença pineno, αde compostos voláteis obtidos durante o processo de envelhecimento : nonanal, α- pineno, pineno, α-p-dimetilestireno e geraniol. Para o terpinoleno, terpineol-octanal, linalol, 2- β- pineno,

refrigerante, foram foram determinados os compostos compostos voláteis responsáveis responsáveis por sua fragrância fragrância específica: hexanoato de etila, valenceno, 1-hexanol, 2- pentanol, acetato de α-terpineol, butanoato de etila, terpinoleno, hexylacetate, hexylacetate, decanal, hexilo butirato, linalol, mirceno e α pineno (SEQUEIRA, (SEQUEIRA, 2009). O E-2-nonenal é um “off -flavour” relacionado a cerveja envelhecida, conferindo ao produto aroma aroma de papelão. papelão. Foi desenvolvido e aplicado aplicado em amostras de cerveja brasileiras, um novo método para determinação de (E)-2-nonenal usando HS-SPME-GCAR-EM. O método desenvolvido mostrou ser simples, eficiente e altamente sensível para a determinação deste analito, o qual também pode ser facilmente aplicado no controle de qualidade da fabricação de cerveja. (E)-2-nonenal foi encontrada em todas as amostras de cerveja analisadas, com níveis entre 0,17 e 0,42 μ gL

-1 (SCHERE et al, 2010).

37

3 JUSTIFICATIVA A falta de um método preciso para a identificação e quantificação de “off -flavours” é um problema para cervejarias que desejam assegurar a qualidade de seus produtos nas prateleiras do mercado. Faz-se necessário um estudo aprofundado para o desenvolvimento de métodos que atendam as necessidades da indústria. O presente trabalho pretende suprir a lacuna em relação a métodos que possam identificar e quantificar “off -flavours” de maior incidência em cervejarias, abaixo do limiar de percepção dos degustadores: 2,3-Butanodiona (Diacetil), 2,3-Pentanodiona, Acetato de Etila, Hexanoato de Etila e Acetato de Isoamila. Para tal, a identificação de aromas de impacto na cerveja contará com as análises de voláteis através da técnica t écnica de HS-CGAR-DCE e SPME seguida por CGAREM). A vantagem do método indica a tendência de aumento dessas substâncias antes da percepção do cervejeiro. No Brasil, a preferência nacional de consumo de cerveja, dentre os diversos tipos existentes, é a do tipo pilsen. Por essa razão, todos os testes serão realizados r ealizados somente com esse tipo de cerveja (ALVISI, 2011). Após este estudo, espera-se ter um método preciso para a identificação e quantificação de “off -flavours” em cerveja tipo pilsen.

38

4 OBJETIVOS 4.1 OBJETIVO GERAL Desenvolver métodos para identificação e quantificação dos principais “off -flavours” de impacto na cerveja tipo pilsen. 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Os objetivos específicos referem-se a um estudo abrangente que possibilitem: a) Desenvolver Desenvolver métodos alternativos que otimizem a identificação identificação de “off -flavours” em cerveja tipo pilsen. b) Investigar os “off -flavours” de maior incidência em cervejarias: 2,3-Butanodiona (Diacetil), 2,3-Pentanodiona, Acetato de Etila, Hexanoato de Etila e Acetato de Isoamila, c) Operacionalizar análises de ésteres e dicetonas vicinais através da técnica de HSCGAR-DCE e SPME seguida por CGAR-EM).

39

5 MATERIAIS E MÉTODOS 5.1 MATÉRIA-PRIMA •

15 cervejas tipo pilsen de marcas reconhecidas do mercado local.

5.2 MÉTODOS 5.2.1 Análises de voláteis em água e cerveja 5.2.1.1 Extração SPME (ou MEFS) 5.2.1.1.1 Preparo da solução estoque do Mix de “off -flavours” •

Transferiu-se cerca de 10 mL de metanol para um balão volumétrico de 25 mL.

•

Pesou-se, no mesmo balão, 0,025g de 2,3-Butanodiona, 0,105g de Acetato de Isoamila,

0,015g de Hexanoato de Etila e 2,25g de Acetato de Etila. •

Completou-se o volume volume até a linha de referência referência com metanol à 20,0 20,0 ± 1,0ºC 1,0ºC e

homogeneízou-se homogeneízou-se [M1]. 5.2.1.1.2 Preparo da solução diluída do Mix de “off -flavours” •


•

Adicionou-se, ao mesmo balão, 1,00mL da solução estoque [M1].

•

Completou-se o volume até o traço de aferição com metanol à 20,0 ± 1,0ºC e

homogeneízou-se homogeneízou-se [E1]. 5.2.1.1.3 Preparo da solução estoque do Padrão Interno (2,3- Pentanodiona) •


•

Pesou-se, no mesmo balão, 0,0125g de 2,3-Pentanodiona. 2,3-Pentanodiona.

•

Completou-se

o volume até a linha de referência referência com metanol metanol à 20,0 20,0 ± 1,0ºC e

homogeneízou-se homogeneízou-se [M2]. [ M2]. 5.2.1.1.4 Preparo da solução diluida do Padrão Interno (2,3- Pentanodiona) 40

•


•


•


homogeneízou-se homogeneízou-se [E2]. 5.2.1.1.5 Preparo Preparo dos padrões da curva de calibração calibração do em água •

Transferiu-se cerca de 10 mL de água deionizada para um balão volumétrico de 25 mL.

•

Adicionou-se, ao mesmo balão, uma alíquota de 150µL da solução diluída do Mix de

“off -flavors” [E1] e •

250 µL da solução diluída do Padrão Padrão Interno de 2,3-Pentanodiona 2,3-Pentanodiona

Completou-se o volume com água destilada à 20,0 ± 1,0ºC até o traço de aferição e

homogeneízou-se homogeneízou-se [PAD1] . •

Repetiram-se os procedimentos anteriores, substituindo-se o volume da alíquota da

solução diluída do Mix de “off -flavour” [E1] para 4

balões de 25 mL os seguintes volumes:

200µL, 250µL, 300µL e 350µL. Essas soluções corresponderam aos padrões PAD2, PAD3, PAD4 e PAD5 respectivamente. respectivamente. Prepararam-se Prepararam-se mais 5 amostras do do PAD3 para avaliação avaliação do coeficiente de variação(CV). •

Pesou-se, em 05 frascos de HS 30mL, 3,0g de Cloreto de Sódio em cada um.

•

Adicionou-se a cada um deles os padrões: PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 e PAD5

respectivamente. •

Tamparam-se rapidamente os frascos de HS com septo de silicone e lacrou-se com

tampa de polietileno com rosca, a medida em que foram transferidos t ransferidos os padrões a cada vial. 5.2.1.1.6 Preparo dos dos padrões da curva de calibração do em cerveja •

Transferiu-se cerca de 10 mL de cerveja tipo pilsen gelada para um balão volumétrico

de 25 mL. •

Adicionou-se, ao mesmo balão, uma alíquota de 66 µL da solução diluída do Mix de

“off -flavors” [E1] e •

250 µL da solução diluída do Padrão Padrão Interno de 2,3-Pentanodiona 2,3-Pentanodiona

Completou-se o volume com água destilada à 20,0 ± 1,0ºC até o traço de aferição e

homogeneízou-se homogeneízou-se [PAD0] . •


solução diluída do Mix de “off -flavour” [E1], para 4 balões de 25 mL, os seguintes volumes: 41

100µL , 150µL, 200µL, 250µL, 300µL e 350µL. Essas soluções corresponderam aos padrões PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, PAD5 e PAD 6 respectivamente. Prepararam-se mais 5 amostras do PAD4 para avaliação avaliação do coeficiente coeficiente de variação(CV). •

Pesou-se, em 05 frascos de HS 30 mL, 3,0g de Cloreto de Sódio em cada um.

•

Adicionou-se a cada um deles os padrões: PAD2, PAD3, PAD4 e PAD5

respectivamente. •


tampa de polietileno com rosca, a medida em que foram transferidos t ransferidos os padrões a cada vial. 5.2.1.1.7 Preparo da amostra •

Transferiu-se cerca de 10 mL de cerveja tipo pilsen gelada a ser avaliada para um balão

volumétrico de 25 mL. •

Completou-se o volume com água destilada à 20,0 ± 1,0ºC até o traço de aferição [A1].

•

Repetiram-se os procedimentos anteriores, substituindo-se o volume da alíquota de

cerveja a ser avaliada por mais 14 cervejas cervejas de marca reconhecida reconhecida no mercado. •

Pesou-se, em 15 frascos de HS 30mL, 3,0g de Cloreto de Sódio em cada um.

•

Adicionou-se a cada um deles as amostras: A2, A3, A4, ... e A15 respectivamente.

•


tampa de polietileno com rosca, a medida em que foram transferidas as amostras a cada vial. 5.2.1.1.8. Microextração em fase sólida seguida de cromatografia gasosa de alta resolução acoplada a detector e espectrometria de massas (SPME-CGAR-EM) •

Climatizaram-se as amostras e padrões em banho termostático à 70 ± 1,0ºC.

•


•

Perfurou-se o septo que recobre o frasco de “headspace” com a fibra retraída na agulha

e então a fibra foi exposta à amostra por aproximadamente 30 minutos a temperatura de 60 ± 1,0ºC. •

Terminado o tempo de extração, retirou-se a agulha do septo com a fibra retraída.

•

Perfurou-se o septo do injetor do CGAR e então a fibra foi exposta para a dessorção

térmica por 1 minuto. •

Terminada a dessorção, retirou-se a agulha com a fibra retraída. O processo de extração

está representado na Figura 2 (VALENTE e AUGUSTO, 2000). 42

FIGURA 2 – Esquema Esquema de uso do amostrador SPME para processo de extração e de dessorção do material extraído para análise por CG (VALENTE e AUGUSTO, 2000).

5.2.1.1.9. Condições cromatográficas (SPME-CGAR-EM) •

Modo de varredura: scan

•

Coluna : Agilent HP-5 (19091J-413): polissiloxano: 350ºC: 30m comprimento, 250 µm

diâmetro interno e 1 µm espessura espessura filme. •

Detector: MSD (“Mass Selective Detector”)

•

Gás de arraste: Hélio

•

Pressão na cabeça da coluna: 6,8 psi

•

Temperatura da linha de transferência: 250ºC

•

Programação da temperatura no forno cromatográfico

43

Temperatura(°C)

Taxa de aquecimento(°C/min)

Tempo(min)

35 100

8

2 0

160 220

20 30

0 0

5.2.1.2 Técnica Headspace Cromatografia Gasosa com detector de captura de elétrons (HS-CGECD) 5.2.1.2.1 Preparo da solução estoque de 2,3-Butanodiona (Diacetil) •

Transferiu-se cerca de 10 mL de etanol para um balão volumétrico de 25 mL.

•

Pesou-se 0,025g de 2,3-Butanodiona.

•

Completou-se

o volume volume até a linha de referência com etanol etanol à 20,0 ± 1,0ºC 1,0ºC e

homogeneízou-se homogeneízou-se [M1]. 5.2.1.2.2 Preparo da solução diluída de 2,3-Butanodiona (Diacetil) •


•


•


homogeneízou-se homogeneízou-se [E1]. 5.2.1.2.3 Preparo da solução estoque do Padrão Interno (2,3- Pentanodiona) •


•

Pesou-se, no mesmo balão, 0,0125g de 2,3-Pentanodiona. 2,3-Pentanodiona.

•

Completou-se o volume até a linha de referência com etanol à 20,0

± 1,0ºC e homogeneízou-

se [M2]. 5.2.1.2.4 Preparo da solução diluída do Padrão Interno (2,3- Pentanodiona ) •


•

Adicionou-se, ao mesmo balão, 1,00mL da solução estoque [M2]. 44

•


homogeneízou-se homogeneízou-se [E2]. 5.2.1.2.5 Preparo dos padrões da curva de calibração em água •

Transferiu-se cerca de 10 mL de água deionizada para um balão volumétrico de 25 mL.

•

Adicionou-se, ao mesmo balão, uma alíquota de 66 µL da solução diluída de 2,3-

Butanodiona[E1] e 250 µL da solução solução diluída do Padrão Interno de 2,3-Pentanodiona 2,3-Pentanodiona •

Completou-se o volume com água destilada à 20,0 ± 1,0ºC e homogeneízou-se homogeneízou-se até o

traço de aferição [PAD0] . •


solução diluída de 2,3-Butanodiona 2,3-Butanodiona [E1], para 4 balões de 25 mL, os seguintes volumes: 100µL , 150µL, 200µL, 250µL, 300µL e 350µL. Estas soluções corresponderam aos padrões PAD2, PAD3, PAD4 e PAD5 respectivamente. Prepararam-se mais 5 amostras do PAD4 para avaliação do coeficiente coeficiente de variação(CV). •

Transferiu-se para frascos de HS cada um deles os padrões: PAD1, PAD2, PAD3,

PAD4, PAD5 e PAD6 respectivamente. •

Tampou-se rapidamente os frascos de HS com septo de silicone e lacre de alumínio, a

medida em que os padrões foram transferidos para cada vial. 5.2.1.2.6 Preparo dos dos padrões padrões da curva de calibração em cerveja cerveja •

Transferiu-se cerca de 10 mL de cerveja tipo pilsen gelada para um balão volumétrico

de 25 mL. •

Adicionou-se, ao mesmo balão, uma alíquota de 0,5µL da solução diluída de 2,3-

Butanodiona [E1] e 250 µL da solução solução diluída do Padrão Interno de 2,3-Pentanodiona 2,3-Pentanodiona •

Completou-se o volume com água destilada à 20,0 ± 1,0ºC e homogeneizou-se homogeneizou-se até o

traço de aferição [PAD 0] . •


solução diluída de 2,3-Butanodiona [E1], para 6 balões balões de 25 mL, os seguintes seguintes volumes: volumes: 200µL, 250µL, 300µL e 350µL. Estas soluções corresponderam aos padrões PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, PAD5 e PAD6 P AD6 respectivamente. Prepararam-se mais 5 amostras do PAD4 para avaliação do coeficiente coeficiente de variação(CV). 45

•

Transferiu-se para frascos de HS cada um deles os padrões:PAD0, padrões:PAD0, PAD1, PAD2, PAD3,

PAD4, PAD5 e PAD6 respectivamente. respectivamente. •

Tampou-se rapidamente os frascos de HS com septo de silicone e lacre de alumínio, a

medida em que os padrões foram transferidos para cada vial. 5.2.1.2.7 Preparo da amostra •

Transferiu-se cerca de 10 mL de cerveja tipo pilsen gelada a ser avaliada para um balão

volumétrico de 25 mL. •

Completou-se o volume com água destilada à 20,0 ± 1,0ºC até o traço de aferição [A1].

•

Repetiram-se os procedimentos anteriores, substituindo-se o volume da alíquota de

cerveja a ser avaliada por mais 14 cervejas cervejas de marcas reconhecidas reconhecidas no mercado. •

Adicionou-se a cada um deles as amostras: A2, A3, A4, ... e A15 respectivamente.

•


tampa de polietileno com rosca, rosca, a medida em que foram transferidas as amostras a ccada ada vial. 5.2.1.2.8. Extração “Headspace” (HS) com posterior cromatografia gasosa de alta resolução acoplada a detector de captura de elétrons (HS-CGAR-DCE) •


•


•

Transferiram-se as amostras e os padrões para o cromatógrafo gasoso.

5.2.1.2.9. Condições cromatográficas (HS-CGAR-DCE) •

Modo de varredura: scan

•

Coluna : Agilent DB-5 (125-5062): polissiloxano; 320ºC: 60 m comprimento, 530 µm

diâmetro interno e 1.5 µm espessura filme. •

Detector: ECD (“ Electron Capture Detector”)

•

Gás de arraste: Nitrogênio

•

Pressão na cabeça da coluna: 15 psi

•

Temperatura da linha de transferência: 150ºC

•

Programação da temperatura no forno cromatográfico Temperatura(°C)

Taxa de aquecimento(°C/min)

Tempo(min)

50

-

10

46

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A qualidade de um método analítico depende da qualidade de execução de todas as etapas analíticas e seus erros experimentais. Dentre essas podemos destacar a etapa de amostragem em que a técnica escolhida que pode ser determinante para a eficácia de um método. A primeira técnica escolhida para iniciar os testes foi a SPME no HS, por ser uma técnica utilizada para muitos tipos de analitos e por facilitar o transporte dos mesmos para o cromatógrafo gasoso (VALENTE e AUGUSTO, 2000). Foram realizados testes com o Mix de “off -flavors” contendo os ésteres (acetato de etila, acetato de isoamila, e hexanoato de etila) e as dicetonas vicinais (2,3-butanodiona e 2,3 pentanodiona) pentanodiona) em água e cerveja cerveja do tipo pilsen. pilsen. No processo de determinação do método SPME a ser adotado para o avaliação dos “off flavours”,

foram realizados diversos diversos testes alterando alterando os seguintes seguintes parâmetros: parâmetros: a) tempo de

análise em água e cerveja; b) temperatura e tempo de dessorção no injetor; e c) fibras SPME. No CGAR foram otimizados as condições cromatográficas, cromatográficas, no entanto, o tempo t empo de análise é grande porque é necessário ativar a fibra para a próxima injeção. Esse tempo pode se otimizado com o uso de mais de uma fibra para agilizar a rotina. Estão disponíveis na literatura diversas fibras para análise de voláteis em bebidas e alimentos, entre as quais as mais utilizadas são: fibras não-polares (polidimetilsiloxanoPDMS), polares (poliacrialto- PA) e bi-polares (polidimetilsiloxano- PDMS, carboxendivinilbenzeno-CAR/DVB). A melhor resposta em termos de número de constituintes e separação cromatográfica cromatográfica foi obtida com a fibra a fibra bi-polar, cuja aplicação é sugerida para voláteis e não voláteis de baixa a alta polaridade (VALENTE e AUGUSTO, 2000). Após o preparo das amostras para a análise por SPME seguida por CGAR-EM, foi realizada a saturação das amostras com 3,0g de cloreto de sódio, por ser um sal muito solúvel em água e por poder influenciar a eficiência eficiência da extração mudando a polaridade polaridade do meio, meio, forçando a passagem dos “off -flavors” para o “headspace”. Essa “salting-out” (MIRANDA,1999; STERCKX,SAISON e

técnica é conhecida como

DELVAUX,2010).

Durante o preparo das amostras e de padrões em cerveja foi observada uma dificuldade para avolumar estas soluções em virtude da formação de espuma proveniente da cerveja adicionada. Para minimizar este efeito, foram usadas amostras de cerveja gelada, o que demonstrou ser importante para a obtenção de linearidade da curva. 47

Na Figura Figura 3 pode-se observar o cromatograma cromatograma relativos aos voláteis de amostra de cerveja preparada com com o Mix de “off -flavour” obtidos pela técnica SPME seguida por CGAR-EM. Os resultados obtidos foram satisfatórios para os ésteres acetato de etila (tr: 2,275 min-90000 ppb), acetato de isoamila (tr: 6,783 min- 4200 ppb) e hexanoato de etila (tr: 9,410min - 600 ppb) apresentando R2>0,99 para estes em cerveja e água. No entanto, não foi observado sinal referente as dicetonas vicinais: 2,3-Butanodiona (Diacetil- 1455 ppb) e 2,3-Pentanodiona (100 ppb).

al lai i t m al

E a

it e

os d

d

e d I ot e

e

a o

ot

ot n

at

at a x

e c

e A

c A

e H

FIGURA 3 – Cromatograma de ésteres de amostra de cerveja preparada com o Mix de “Off flavours” por SPME -CGAR-EM

No processo processo de extração SPME as moléculas do analito se deslocam deslocam da matriz e penetram no recobrimento vencendo resistências a transferências de massa até que seja estabelecido um equilíbrio de partição (ou adsorção). Na aplicação dessa técnica, também foram analisados os compostos individualmente com essa mesma fibra e foram observados sinais referentes aos 48

ésteres e dicetonas dicetonas vicinais. Por esse motivo, é razoável razoável considerar que só só foram identificados ésteres nas an álises do Mix de “off -flavous” devido a uma provável competição competição entre ésteres e dicetonas vicinais pela fibra, dando essa preferência preferência aos ésteres (VALENTE e AUGUSTO, AUGUSTO, 2000). Em virtude do fato mencionado anteriormente, adotamos a técnica HS-CG-DCE para análises das dicetonas vicinais: 2,3-Butanodiona (Diacetil) e 2,3-Pentanodiona, a qual também apresentou R2>0,99 em cerveja e água – Diacetil( Diacetil( tr:2,595 min -1455 ppb) e Pentanodiona (tr: 4,527 min - 100 ppb), conforme apresentado na Figura 4.

FIGURA 4 – Cromatogramas Cromatogramas de dicetonas vicinais de amostra de cerveja preparada com 2,3Butanodiona (Diacetil) e 2,3-Pentanodiona por HS-CGAR-DCE. As cervejas do tipo pilsen usadas nos procedimentos analíticos descritos nos procedimentos precisam estar estar geladas( 0°C) para que sejam sejam evitadas perdas perdas indesejáveis de voláteis a serem analisados. 49

Visando verificar o bom desempenho desempenho da metodologia desenvolvida, desenvolvida, alguns parâmetros de validação foram avaliados (DOQ-CGCRE-008- rev. 04, JULHO,2011 ; RE nº 899, 29, MAIO, 2003):



SELETIVIDADE/ESPECIFICIDADE - É a capacidade que o método possui de

medir exatamente um composto em presença de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradação degradação e componentes componentes da da matriz.

Critérios de aceitação: A aceitação da seletividade é atribuída à ausência de sinais interferentes no tempo de retenção da substância de interesse. Para a avaliação da seletividade foram comparados os cromatogramas obtidos da curva de calibração do"off-flavours" Diacetil em água e em cerveja. Para essas amostras foram observados sinais referentes ao tempo de retenção do padrão Diacetil( tr:2,595min) pela técnica HS-CGAR-DCE( Figura 4) e ao tempo de retenção do padrão padrão dos ésteres acetato acetato de etila (tr: 2,275 min- prob.%: 95,7), acetato de isoamila (tr: 6,783 min- prob.%: 96,0) e hexanoato de etila (tr: 9,410min – prob.%: prob.%: 86,8) pela técnica SPME seguida seguida de CGAR-EM não sendo detectado detectado sinais interferentes no tempo de retenção da substância de interesse (Figura 3). O efeito da resposta cromatográfica acentuada acentuada induzida pela matriz é um dos parâmetros de desempenho que devem ser avaliados, visto que esse pode afetar acentuadamente as concentrações concentrações da amostra. Comparando-se as concentrações concentrações das amostras obtidas pela curva de calibração realizada em em água e em cerveja, observa-se observa-se o efeito de matriz. A inclinação da curva de calibração difere em água e em cerveja, indicando que há efeito de matriz. O que é esperado, uma vez que a cerveja possui outros voláteis que certamente competem com o analito pela fibra. A vantagem é que esse efeito incorpora uma correção de recuperação dos resultados obtidos demostrando um um valor mais próximo do real (MORELLI, ARMI e ABRANTES, 2008). 2008).



LINEARIDADE - Consiste na demonstração demonstração de que a relação entre a concentração do

analito (x) e a resposta medida (y) se ajusta a uma equação do tipo y=a+bx, onde a e b são os parâmetros próprios da equação equação obtida.

50

Critérios de aceitação: O coeficiente de correlação (r) deve ser superior a 0,99. A linearidade foi estabelecida por regressão linear pelo método dos mínimos quadrados a partir da relação r elação entre a concentração e área e obtida por padronização padronização interna ou externa, no caso em questão, foi utilizado como padrão interno a 2,3-Pentanodiona. As curvas de calibração foram preparadas em cada dia de validação do método e são utilizadas para o estabelecimento da linearidade e para a quantificação de amostras pela técnica HS-CGAR-DCE (Figuras 5, 6 e 7) e pela técnica SPME seguido por CGAR-EM (Figuras 8, 9 e 10). Inicialmente as curvas eram em torno do ponto central, limite de percepção do cervejeiro, no entanto, as amostras analisadas previamente para uma estimativa da concentração, demonstraram valores bem inferiores ao intervalo da curva. Por este motivo, ampliaram-se as curva com mais dois pontos.

250000000

y = 115.596,2409x 115.596,2409x - 10.370.007,3276 R² = 0,9974

200000000

150000000 100000000 50000000 0 0

5 00

1000

1500

2000

FIGURA 5 – Curva Curva de calibração 1 preparada com 2,3- Butanodiona (Diacetil) e 2,3Pentanodiona por HS-CGAR-DCE. 250000000 y = 121.193,7436x - 11.433.084,7723 R² = 0,9955

200000000 150000000 100000000 50000000 0 0

5 00

1000

1500

2000

51

FIGURA 6 – Curva Curva de calibração 2 preparada com 2,3- Butanodiona (Diacetil) e 2,3Pentanodiona por HS-CG-DCE 200000000 y = 101.583,5434x - 1.988.919,4301 180000000 R² = 0,9950 160000000 140000000 120000000 100000000 80000000 60000000 40000000 20000000 0 0

500

1000

1500

2000

FIGURA 7 – Curva Curva de calibração 3 preparada com 2,3- Butanodiona (Diacetil) e 2,3Pentanodiona por HS-CG-DCE. 8000000 y = 1.012,9921x 1.012,9921x - 2.333.970,0099 2.333.970,0099 7000000 R² = 0,9923 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

10000000 1.917,4979x - 8.295.652,5711 8.295.652,5711 9000000 y = 1.917,4979x R² = 0,9946 8000000 7000000 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 0

2000

4000

6000

8000

10000

52

2500000 y = 379,7596x 379,7596x - 1.029.027,3363 1.029.027,3363 R² = 0,9916 2000000 1500000 1000000 500000 0 0

2000

4000

6000

8000

10000

FIGURA 8 – Curva Curva de calibração 1, 2 e 3 preparada com Acetato de isoamila por SPMECGAR-EM

1400000 y = 9,0106x 9,0106x - 184.505,8846 184.505,8846 R² = 0,9908

1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 0 2000000

50000

100000

150000

200000

150000

200000

y = 17,6598x 17,6598x - 1.333.107,5316 1.333.107,5316 R² = 0,9944

1800000 1600000 1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 0

50000

100000

53

400000 y = 2,1005x 2,1005x - 171.647,1318 171.647,1318 R² = 0,9904

350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0 0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

FIGURA 9 – Curva Curva de calibração 1, 2 e 3 preparada pr eparada com Acetato de etila por SPME-CGAREM.

12000000 y = 10.394,3971x 10.394,3971x - 3.362.064,1981 3.362.064,1981 R² = 0,9935

10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 0 0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

16000000 y = 20.607,2777x 20.607,2777x - 11.903.360,3261 11.903.360,3261 R² = 0,9994

14000000 12000000 10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 0 0

200

400

600

800

1000

1200

1400

54

5000000 y = 5.066,3207x 5.066,3207x - 440.923,4741 440.923,4741 R² = 0,9966

4500000 4000000 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 0

200

400

600

800

1000

1200

FIGURA 10 – Curva Curva de calibração 1, 2, e 3 preparada com Hexanoato de etila por SPMECGAR-EM.

Os valores de área obtidos para as três curvas da 2,3-Butanodiona (Diacetil) por HSCGAR-DCE estão apresentados na tabela 3 e as respectivas equações obtidas estão apresentadas apresentadas na tabela 4. Todas apresentaram linearidade linearidade exigida pelo método.

TABELA 3 – Valores Valores de concentração e área das curvas 1, 2 e 3 de 0,2 a 120 %2,3Butanodiona (Diacetil) em cerveja por HS-CGAR-DCE Curva de calibração do " Off-fl Off-flavour" avour" D iacetil iacetil Padrão

PAD 0

PAD 1

PAD 2

PAD 3

PAD 4

PAD 5

PAD 6

Concentração Teórica

Concentração Real

0,2% (3 ppb) 13% (200 ppb) 80% (1200 ppb) 90% (1350 ppb) 100% (1500 ppb) 110% (1650 ppb) 120% (1800 ppb)

0,204 % (3,1 ppb) 13,2 % (203,7 ppb) 77,6% (1164 ppb) 87,3% (1309 ppb) 97% (1455 ppb) 106,7% (1600 ppb) 116,4% (1746 ppb)

Curva 1

C urva 2

Curva 3

Área (ua)

Área (ua)

Área (ua)

526976

535484

543929

17329153

18460844

17075023

134265426

138691622

115543107

140855005

148468034

142750995

167958550

177893663

147826136

180748052

183706047

156988194

201889917

215543758

174834931

TABELA 4 – Equações Equações das curvas 1, 2 e 3 2,3- Butanodiona (Diacetil) cerveja por HSCGAR-DCE

55

Curva

Equação

R2

1

115596,24x-10370007,33

0,9974

2

12193,74x-11433084,77

0,9955

3

101583,54x-1988919,43

0,9950

A Tabelas 5, 6 e 7 contém os valores de área obtidos para as três curvas dos ésteres Acetato de Isoamila, Acetato de Etila e Hexadoato de Etila em cerveja por HS-CGAR-EM e as respectivas equações equações obtidas estão estão apresentadas apresentadas na tabela 8. Todas apresentaram linearidade linearidade exigida pelo método.

TABELA 5 – Valores Valores de concentração e área das curvas 1, 2 e 3 de 26,7 a 140 % Acetato de Isoamila em cerveja por SPME-CGAR-EM Curva de calibração calibração do "Off-flavour" "Off-flavour" Acetato de Isoamila Isoamila Padrão

PAD 0 PAD 1 PAD 2 PAD 3 PAD 4 PAD 5 PAD 6

Concentração Concentração Teórica Real 26,7% (1120 ppb) 40% (1680 ppb) 60% (2520 ppb) 80% (3360 ppb) 100% (4200 ppb) 120% (5040 ppb) 140% (5880 ppb)

27,2% (1142,76 ppb) 40,8% (1712 ppb) 61,1% (2568 ppb) 81,5% (3424 ppb) 101,9% (4280 ppb) 122% (5136 ppb) 142,7% (5992 ppb)

Curva 1

Curva 2

Curva 3

Área (ua)

Área (ua)

Área (ua)

2572002

92436

76411

3133551

470548

-

4303160

2384330

769243

5037492

4129351

-

5951351

-

1239307

-

7552254

1629471

7342056

8732922

1939818

TABELA 6 – Valores Valores de concentração e área das curvas 1, 2 e 3 de 26,7 a 140 % - Acetato de Etila em cerveja por SPME-CGAR-EM

56

Curva de d e calibração do "Off-flavour" "Off-flavour" Acetato de E tila tila Padrão PAD 0 PAD 1 PAD 2 PAD 3 PAD 4 PAD 5 PAD 6


27% (24322,6 ppb) 40,5% (366438,4 ppb) 60,7% (54657,6 ppb) 81% (72876,8 ppb) 101,2% (91096 ppb) 121,5% (109315,2 ppb) 140% (127534 ppb)

C urva 1

C urva 2

Curva 3

Área (ua)

Área (ua)

Área (ua)

331 812

75317

16 8021

425 651

22992 7

-

594 013

57756 6

21 8726

818 700

-

-

980 811

11 4267 5

30 7485

10747 94

15 7991 8

35 1771

12306 69

215 5437 58

37 0553

TABELA 7 – Valores Valores de concentração e área das curvas 1, 2 e 3 de 26,7 a 140 % Hexanoato de Etila em cerveja por SPME-CGAR-EM Curva de calibração calibração do "Off-flavour" "Off-flavour" Hexanoato d e Etila Etila Padrão PAD 0 PAD 1 PAD 2 PAD 3 PAD 4 PAD 5 PAD 6


30,8% (160 ppb) 46,1% (276,8 ppb) 69,2% (360 ppb) 92,3% (553,6 ppb) 115,3% (692 ppb) 138,4% (830,4 ppb) 161,5% (968,8 ppb)

C urva 1

C urva 2

C urva 3

Área (ua)

Área (ua)

Área (ua)

38 45 83 8

974 36

11 30 87 9

48 06 75 9

14 56 48 5

-

-

39 33 89 4

20 23 98 8

70 56 85 5

63 30 93 7

27 78 29 7

88 58 78 5

-

33 87 40 2

94 63 96 1

1 155 13 27

39 03 04 3

1 10 15 02 6

1 392 45 38

1 74 83 49 31

57

TABELA 8 – Equações Equações das curvas 1, 2 e 3dos ésteres cerveja por SPME-CGAR-EM Equação

R2

1

1.012,9921x - 2.333.970,0099

0,9923

2

1.917,4979x - 8.295.652,5711

0,9946

3

379,7596x - 1.029.027,3363

0,9916

1

9,0106x - 184.505,8846

0,9908

2

17,6598x - 1.333.107,5316

0,9944

3

2,1005x - 171.647,1318

0,9904

1

10.394,3971x - 3.362.064,1981

0,9935

2

20.607,2777x - 11.903.360,3261

0,9994

3

5.066,3207x - 440.923,4741

0,9950

Curva al i ot at

m A e

a o e sI c d

ot

al e

E

it at c e d A

ot al a it o n E a x

e e H

d

Resultados foram satisfatórios para a 2,3-Butanodiona (método HS-CGAR-DCE) e para os ésteres (método SPME-CGAR-EM), apresentando R2>0,99 em cerveja e água, conforme representado na Figuras Figuras 5, 6 e 7 e Figuras 8, 9 e 10, respectivamente. respectivamente. Na avaliação das curvas de calibração, em cerveja, foi observada uma perda de linearidade nos dois últimos pontos, de concentração concentração de padrão mais elevada, tornando a curva decrescente (Figuras 11, 12 e 13). Avaliando esse fato, foi constatado que a fibra usada na construção da curva apresentava uma pequena parte quebrada, o que provavelmente prejudicou o processo de adsorção para as concentrações mais elevadas. É importante que a fibra esteja íntegra para a execução do procedimento de amostragem SPME.

58

6.000.000

5.000.000

4.000.000

3.000.000

2.000.000

1.000.000

0 0

10 00

2 000

3 0 00

40 00

5 000

6 0 00

70 00

FIGURA 11 – Curva Curva de calibração preparada com Acetato de isoamila por SPMECG-EM – fibra fibra quebrada.

1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 0

2 0 00 0

4 000 0

6 0 00 0

8 0 00 0

1 0 00 0 0

1 20 200 0 0

1 40 4000 0

FIGURA 12 – Curva Curva de calibração preparada com Acetato de etila por SPME-CG-EM – fibra fibra quebrada

12000000

10000000

8000000

6000000

4000000

2000000

0 0

20 0

4 00

600

800

1 000

FIGURA 13 – Curva Curva de calibração preparada com Hexanoato de etila por SPME-CG-EM – fibra quebrada. 59



REPETITIVIDADE - A repetitividade ou precisão intra-ensaio, apresenta a variação

em torno da média de uma série de amostras preparadas na mesma concentração pelo mesmo analista, no menor espaço de tempo possível. A repetitividade foi determinada com com injeções de 5 amostras na cconcentração oncentração 100% em três dias consecutivos.

Critérios de aceitação: O coeficiente de variação (CV) deve apresentar, no máximo, 5 % entre os valores de área das replicatas no dia. O procedimento de injeção das amostras padrão 4 (PAD4) em quintuplicata nas duas metodologias aplicadas, HS-CGAR-EM e HS-CGAR-DCE, visava avaliar a eficiência do analista e equipamento. equipamento. Para ambas as técnicas técnicas foram obtidos resultados resultados do coeficiente de variação satisfatórios e inferiores a 5%. O sistema foi repetitivo já que o desvio padrão relativo (DPR) das amostras injetadas em quintuplicata, em três dias consecutivos, cumpriram os critérios de aceitação exigidos pelo método, Tabela 10, 11, 12 e 13.

TABELA 9 – Repetitividade Repetitividade padrão padrão 4 (2,3Butanodiona) nas curvas curvas 1, 2 e 3 em cerveja – HS-CGAR-DCE HS-CGAR-DCE

Parâmetro

média DP CV (% )

Área - dia 1 135286725 135068660 143159054 143336344 144590980 140288353 4698543,7 3,3

Área - dia 2 184884813 180503406 192889453 178070737 182244779 183718638 5698082,5 3,1

Área - dia 3 152557550 143749476 149149069 145441971 146774620 147534537 3432213,8 2,3

60

TABELA 10 – Repetitividade Repetitividade padrão padrão 4 (Acetato de Isoamila) nas curvas curvas 1, 2 e 3 em cerveja – SPME-CGAR-EM SPME-CGAR-EM

Parâmetro

média DP C V (% )

Área - dia 1

Área - dia 2

Área - dia 3

5951351 6244909 6454208 5951351 5732117 6066787 283053,6

5533221 5550480 5650896 5657433 5479103 5574227 77613,4

3605622 3769576 3769576 3902402 4030838 3815603 159835,2

4,7

1,4

4,2

TABELA 11 – Repetitividade Repetitividade padrão padrão 4 (Acetato de Etila) nas curvas 1, 2 e 3 em cerveja – SPME-CGAR-EM Parâmetro

média DP CV (% )

Área - dia 1 628 616 663 816 664 376 664 376 688 531 661 943 21406,5 3,2

Área - dia 2 11 42675 12 36359 12 46502 11 32299 11 42675 11 80102 56259,4 4,8

Área - dia 3 1298464 1312048 1348772 1372226 1460815 1358465 64252,4 4,7

TABELA 12 – Repetitividade Repetitividade padrão padrão 4 (Hexanoato de Etila) nas curvas curvas 1, 2 e 3 em cerveja – SPME-CGAR-EM

Parâmetro

média DP CV (% )

Área - dia 1

Área - dia 2

Área - dia 3

8858785 9566813 9918687 9932445 9918687 9639083 462738,0

5996154 5904409 5904409 6122911 6164411 6018459 121165,7

10543903 10546811 11097497 11111141 10640558 10787982 291420,3

4,8

2,0

2,7

61



PRECISÃO e EXATIDÃO - É a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em

uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. Pode ser expressa como desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação (CV%).

Critérios de aceitação: A precisão interensaio deve a ser inferior a 5%. A precisão intra-ensaio foi determinada através do DPR (%) da média das concentracões concentracões das replicatas dos calibradores numa mesma corrida analítica. A precisão interensaio foi determinada através do DPR (%) do valor médio de uma mesma replicata para cada concentração concentração em 3 corridas analíticas diferentes. A exatidão foi expressa como percentual de acerto em relação à concentração nominal. A exatidão intra-ensaio foi avaliada pelo valor médio das replicatas para cada concentração numa mesma corrida analítica. A exatidão inter-ensaio foi avaliada pelo valor médio de uma mesma replicata para cada concentração concentração em 3 corridas diferentes. Os valores recuperados recuperados (exatidão inter-ensaio) inter-ensaio) referentes a relação entre concentração concentração obtida e a adicionada deve estar compreendida no intervalo de 93,7 a 108,8 %. Os resultados de precisão e exatidão intra-ensaio e precisão inter-ensaio estão apresentados na Tabela 13 e atendem aos critérios de aceitação.

TABELA 13 – Cálculo Cálculo Precisão e Exatidão. Parâmetro

Curva - 2,3- Butanodiona Adic Adicioiona nado do (%) (%) Obse Observ rvad adoo (%) (%)

97

Curva - Acetato de Isoamila Adic Adicioiona nado do (%) (%)

Obse Observ rvad adoo (%) (%)

Curva - Acetato de Etila Adic Adicioiona nado do (%) (%)


Curva - Hexanoato de Etila Adic Adicioiona nado do (%) (%)


100,10

94,74

101,20

129,27

94,32

95,04

109,50

124,52

97,87

101,9

96,76

101,2

110,40

115,3

129,09

95,44

96,87

100,28

115,30

96,31

93,81

101,20

129,09

Média

96,81

95,44

104,51

125,46

Precisão (%)

2,33

1,39

4,77

4,80

Exatidão (%)

99,80

93,66

103,28

108,81

62



ROBUSTEZ - método é avaliada diante de pequenas modificações no método

analítico.

Critérios de aceitação: O DPR entre as condições inicial e modificada não deve exceder 5 %. A robustez do método foi avaliada a partir de variações nas condições de tempo de extração no preparo da amostra. Todas Todas as variações foram foram comparadas com as condições condições iniciais do método analítico. As Tabela 14,15, 16 e 17 apresentam os DPR com variações de concentração para as variações de tempo de extração, sendo 56,4min, 60min e 63,6min respectivamente e atendem aos critério de aceitação.

TABELA 14- Avaliação da Robustez -2,3Butanodiona em cerveja – HS-CGAR-DCE HS-CGAR-DCE Tempo(min) 56,4

Concentração(%) 106,76

110,01

111,88 m é di a DP DP R( % )

60

63, 6

Área( ua) 194280753 209376669 200389459 195389593 194258571 189719197 199041189 204867282 187172532 197166138, 3 7049600,135 3,58

187672195 192521265 189564167 189766278 201641077 195673324 195833156 196709347 204557669 194882053,1 5658821,633 2, 90

201853738 202296645 197551918 189638384 197519335 194169268 202292377 186708915 190499681 195836695,7 5898986,312 3,01

63

TABELA 15- Avaliação da Robustez -Acetato de Isoamila em cerveja – SPME-CGAR-EM SPME-CGAR-EM Tempo(min) 56, 4

Concentração(%)

60

63,6

Área( ua)

106,76

290689

3616951

6138451

110,01

269286

3347467

5773635

111,88

272625

3405803

5601093

m é di a

277533,3333

3456740,333

5837726,333

DP DP R( % )

11514,81239 4,15

141779,2845 4,10

274352,2905 4, 70

SPME-CGAR-EM TABELA 16- Avaliação da Robustez -Acetato de Etila em cerveja – SPME-CGAR-EM Tempo(min) 56,4

Concentração(%)

60

63,6

Área( ua)

106,76

247995

403836

772874

110,01

242555

405996

747031

111,88

234782

390345

708524

mé di a

241777,3333

400059

742809,6667

DP

6640,739141

8481,612288

32382,02227

DPR(%)

2,75

2,12

4,36

64

TABELA 17- Avaliação da Robustez – Hexanoato Hexanoato de Etila em cerveja – SPME-CGAR-EM SPME-CGAR-EM Tempo(min) 56, 4

Concentração(%)

60

63,6

Área( ua)

106,76

261638

6666121

9707449

110,01

277786

6599596

9671355

111,88

277811

6369878

9467811

m é di a DP DP R( % )

272411,6667 9330,277399 3,43

6545198,333 155432, 649 2,37

9615538,333 129202,2367 1, 34

A Tabela 18 apresenta as concentrações concentraçõ es dos ésteres e dicetonas vicinais encontrados nas 15 cervejas de marca reconhecida reconhecida no no mercado através através das técnicas técnicas HS-CGAR-EM e HSCGAR- DCE, respectivamente. Para a obtenção desses resultados foram processadas novas curvas levando em consideração a concentração dos “o ff-flavours” existentes na cerveja usada

na construção das curvas.

65

TABELA 18 – Concentrações dos principais “ off -flavours” encontrados em 15 cervejas de marca reconhecida no mercado analisado pelas técnicas HS-CGAR-EM e HS-CGAR- DCE.

Cervejas de marca marca

SPME-CGAR-EM

HS-CGAR-DCE

reconhecida no Conc. Ac. de

Conc. Hex. de

Conc. Ac. de Etila(ppb)

Isoamila(ppb)

Etila(ppb)

Conc. Diacetil(ppb)

mercado A1

4 1,67 41

4,03

0,62

0,10

A2

3 9,43 39

4,54

0,72

0,09

A3

4 3,51 43

4,11

0,64

0,10

A4

4 4,04 44

3,69

0,60

0,09

A5

4 6,11 46

4,43

0,75

0,09

A6

4 2,72 42

4,05

0,62

0,09

A7

4 0,77 40

4,55

0,63

0,09

A8

4 4,76 44

4,09

0,53

0,10

A9

3 7,33 37

3,98

0,60

0,10

A10

35,43 35

2,60

0,38

0,10

A11

36,01 36

4,05

0,70

0,10

A12

33,86 33

3,46

0,63

0,10

A13

20,62 20

3,57

0,57

0,10

A14

39,63 39

3,97

0,83

0,10

A15

46,28 46

3,04

0,38

0,10

A aplicação das técnicas HS-CGAR-EM e HS-CGAR- DCE para a determinação de “off -flavours” proporciona algumas vantagens para a indústria cervejeira :

a) precisão na

identificação e quantificação dos “off -flavours”; b) análise ilimitada de “off-flavours” em

cerveja, sem sem que haja haja preocupação preocupação com a quantidade quantidade máxima de cerveja a ser ingerida pelo degustador, uma vez que a ingestão em excesso de cerveja pode causar alcoolismo; c) aumento de amostragem em várias etapas do processo produtivo e d) análise das amostras em todos os dias da semana e turnos, sem a preocupação de horário máximo permitido para ingestão de bebidas alcoólicas, alcoólicas, dada a preocupação da indústria com o consumo responsável responsável da cerveja e a direção de automóveis.

66

CONCLUSÃO

De acordo com os resultados discutidos anteriormente conclui-se que: •

A técnica de extração do “headspace” com fibra SPME constituiu constituiu um bom método para

a obtenção de ésteres em cerveja. •

É provável que a fibra usada na análise dos voláteis tenha apresentado uma seletividade

aos ésteres e, por esse motivo, não foi observado sinal referente às dicetonas vicinais. •

A técnica de “headspace” e cromatografia gasosa (DCE) apresentaram bons resultados

para análise do “off-flavour” Diacetil .

•

As técnicas empregadas para análise de voláteis, HS-CGAR- DCE e SPME-CGAR-

EM se mostraram eficientes e de fácil aplicabilidade em uma indústria alimentícia. •

Critérios de validação usados como instrumento de medição para avaliar o desempenho desempenho

avaliaç ão de “off -flavours do método desenvolvido, possibilitam que o mesmo seja usado na avaliação -flavours”

em cerveja, visto que , mostrou ser seletivo, linear, preciso, exato e robusto.

67

REFERÊNCIAS

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Desenvolvimento de Metodo Para Identificação de Off-Flavours - Gisele

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