EXTRACCION DE ADN CASERO – BIOLOGIA MOLECULAR
EXTRACCION DE ADN CASERO – BIOLOGIA MOLECULAR
INTRODUCCIÓN Todos los seres vivos están formados por células, en el interior de las mismas se encuentra el material hereditario que son las instrucciones de las que depende cualquier ser vivo. La totalidad del material hereditario de un individuo se denomina genoma, que esta formada por una molécula denominada ADN. Los cambios en el ADN dan lugar a variaciones en las instrucciones y, por lo tanto, en ocasiones, a la pérdida o adquisición de propiedades en el individuo que ha sufrido dichos cambios. Estos cambios se dan constantemente de forma espontánea en la Naturaleza con la aparición de mutaciones espontaneas o el cruce sexual. Aunque también existen técnicas artificiales que permiten llevar a cabo modificaciones genéticas realizadas por la mano del hombre. Los científicos, entre 1961 y 1966, relacionaron el lenguaje de 4 letras de los nucleótidos del ADN, A-T, C-G, con el de los 20 aminoácidos con los que se construyen las proteínas, creando así el código genético. La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayoría de los estudios de biología molecular y de todas las técnicas de recombinación de ADN. En este caso, los métodos de extracción permiten obtener ácidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para después realizar análisis específicos de modificaciones genéticas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La técnica utilizada en esta actividad experimental, se basa por un lado, en el principio de que el componente fundamental de las membrana plasmática y nuclear, son los lípidos, por lo cual se utiliza un detergente (surfactante) para romper estas estructuras y permitir la salida del ADN. Por otro lado, el ADN de vegetales y animales se encuentra asociado a proteína de tipo histona, por lo tanto, al agregarle alcohol se precipitan las proteínas y de esta forma se obtiene el ADN como una estructura más pura
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I.
II.
OBJETIVOS: Realizar la extracción de ADN en vegetales y reflexionar sobre la simpleza de su composición con sencillas tecnicas. Observar la estructura fibrilar del ADN. Establecer la relación entre el proceso de extracción y propiedades quimico-fisicas del ADN.
FUNDAMENTO TEORICO: 1. EL ADN
El ADN es el Ácido DesoxirriboNucleico. Es el tipo de molécula más compleja que se conoce, ya que su secuencia de nucleótidos contiene la información necesaria para poder controlar el metabolismo un ser vivo. El ADN es el lugar donde reside la información genética de un ser vivo. El DNA podría ser la molécula genética fundamental que surgió de manera inesperada producto de los estudios de bacterias causantes de neumonías. En 1928, el microbiólogo inglés Frederick Griffith realizó el descubrimiento asombroso de que las capas no virulentas de las bacterias se tornaban virulentas cuando se las mezclaba con sus contrapartidas patógenas muertas por el calor. La investigación posterior confirmó esta interpretación genética. La patogenicidad refleja la acción de un gen capsular, que codifica una enzima fundamental para la síntesis de la cápsula (con contenido carbohidratos) que rodea la mayor parte de las bacterias causantes de neumonía. Varios años después de la observación original de Griffith se comprobó que extractos de las bacterias muertas eran capaces de inducir transformaciones hereditarias y se dio así la búsqueda de la identidad química del agente transformador. En esa época se creía que los genes eran proteínas.
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Estructura Primaria.- El ADN está compuesto por una secuencia de nucleótidos formados por desoxirribosa. Las bases nitrogenadas que se hallan formando los nucleótidos de ADN son Adenina, Guanina, Citosina y Timina. No aparece Uracilo. Los nucleótidos se unen entre sí mediante el grupo fosfato del segundo nucleótido, que sirve de puente de unión entre el carbono 5' del primer nucleótido y el carbono 3' de siguiente nucleótido. Como el primer nucleótido tiene libre el carbono 5' y el siguiente nucleótido tiene libre el carbono 3', se dice que la secuencia de nucleótidos se ordena desde 5' a 3' (5' → 3').
Estructura Secundaria.- La estructura secundaria del ADN fue propuesta por James Watson y Francis Crick, y la llamaron el modelo de doble hélice de ADN. Este modelo está formado por dos hebras de nucleótidos. Estas dos hebras se sitúan de forma antiparalela, es decir, una orientada en sentido 5' → 3' y la otra de 3' → 5'. Las dos están paralelas, formando
puentes de Hidrógeno entre las bases nitrogenadas enfrentadas. Cuando en una hebra encontramos Adenina, en la otra hebra hallamos Timina. Cuando en una hebra encontramos Guanina, en la otra hallamos Citosina. Estas bases enfrentadas son las que constituyen los puentes de Hidrógeno. Adenina forma dos puentes de Hidrógeno con Timina. Guanina forma tres puentes de Hidrógeno con la Citosina. Las dos hebras están enrolladas en torno a un eje imaginario, que gira en contra del sentido de las agujas de un reloj. Las vueltas de estas hélices se estabilizan mediante puentes de Hidrógeno. Esta estructura permite que las hebras que se formen por duplicación de ADN sean copia complementaria de cada una de las hebras existentes.
Estructura Terciaria.- El ADN es una molécula muy larga en algunas especies y, sin embargo, en las células eucariotas se encuentra alojado dentro del minúsculo núcleo. Cuando el ADN se une a proteínas básicas, la estructura se compacta mucho. Las proteínas básicas son Histonas o Protaminas. La unión con Histonas genera la estructura denominada nucleosoma. Cada nucleosoma está compuesto por una estructura voluminosa, denominada core, seguida por un eslabón o "Linker". El core está compuesto por un octámero de proteínas, Histonas, denominadas H2A, H2B, H3 y H4. Cada tipo de histona se presenta en número par. Esta estructura está rodeada por un tramo de ADN que da una vuelta y 3/4 en torno al octámero. El Linker está formado por un tramo de ADN que une un nucleosoma con otro y una histona H1.
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El conjunto de la estructura se denomina fibra de cromatina de 100Å. Tiene un aspecto repetitivo en forma de collar de perlas, donde las perlas serían los nucleosomas, unidos por los linker. El ADN debe encontrarse más compacto en el núcleo de los espermatozoides. En este caso, el ADN se une a proteínas de carácter más básico, denominadas Protaminas. El ADN se enrolla sobre estas proteínas, formando una estructura muy compacta, denominada estructura cristalina del ADN. Nucleosomas vistos al microscopio electrónico, formando un "collar de perlas".
Estructura Cuaternaria.- La cromatina en el núcleo tiene un grosor de 300Å. La fibra de cromatina de 100Å se empaqueta formando una fibra de cromatina de 300Å. El enrollamiento que sufre el conjunto de nucleosomas recibe el nombre de solenoide. Los solenoides se enrollan formando la cromatina del núcleo interfásico de la célula eucariota. Cuando la célula entra en división, el ADN se compacta más, formando los cromosomas.
2. DNA DE VEGETALES Las células de las plantas tienen tres juegos diferentes de ADN: por un lado la célula tiene su propio genoma en su núcleo, por otro las mitocondrias tienen su propio genoma y por otro los cloroplastos tienen su propio genoma. Las mitocondrias y los cloroplastos se reproducen dentro de la célula, y cuando la célula que los alberga se divide, algunos se van para una de las hijas y otros para la otra, de forma que nunca quede una célula sin mitocondrias ni cloroplastos. El núcleo de las células de las plantas contiene genoma de tipo eucariota: al igual que en los animales, el ADN está ordenado en cromosomas, cada cromosoma es una sola molécula de ADN lineal, empaquetada. En cambio, las mitocondrias y los cloroplastos tienen genoma de tipo bacteriano: poseen una molécula de ADN circular por plástido, al igual que sus ancestros que eran bacterias. El tamaño del ADN es mucho mayor en el núcleo que en los orgánulos: en el núcleo es tan grande que se mide en "mega bases", en las mitocondrias en cambio, es de unas 200 a 2.500 kilo bases, en los cloroplastos es de unas 130 a 160 kbases (una kbases es igual a mil bases, o mil "peldaños de la escalera"). La forma de heredar el ADN también difiere en el núcleo y los orgánulos: mientras que el ADN núcleo se hereda de forma biparental (como el ADN del núcleo de los animales), el ADN de las mitocondrias y el de los cloroplastos se hereda por parte de uno solo de los padres, en general por parte de la madre (al igual que las mitocondrias de los animales). Esto es debido a que en general los orgánulos que
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serán transmitidas a la generación siguiente son las que están albergadas en el óvulo.
III.
METODOS:
EXTRACCION DE DNA “CASERO” La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula. Se empieza por lisar (romper la membrana plasmática) las células mediante un detergente, vaciándose su contenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampón contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en menor proporción. Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán fraccionado en cadena más pequeña y separado de él por acción del detergente. Sólo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampón y detergente, para lo cual se utiliza alcohol etílico. PASOS EN LA EXTRACCIÓN DE ADN: Los pasos necesarios para una correcta extracción y purificación del ADN mediante un procedimiento químico son: 1. Maceramiento de la muestra. 2. Lisis celular: Las sales caotrópicas ayudan a romper la estructura tridimensional de macromoléculas como las proteínas o los ácidos nucleicos consiguiendo su desnaturalización. La adición de un detergente como el SDS es necesaria a menudo para eliminar las membranas. 3. Precipitación de proteínas: Se lograra la precipitación atraves de alcohol (etanol 100%), fenol, cloroformo, alcohol isoanilico. 4. Precipitación de Acidos Nucleicos: Fase de visualización (Acetato de amonio 10M). 5. Resuspensión: El sedimento se puede resuspender en agua o tampón Tris tras ser secado completamente (TE 20:5 , agua bidestilada) En una extracción de ADN casera se empieza por romper las células mediante un detergente, vaciándose su contenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampón contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares. Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán fraccionado en cadenas más pequeñas y separadas de él por acción
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del detergente. Sólo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampón y detergente, para lo cual se utiliza alcohol isoamílico
IV.
MATERIALES:
Licuadora o mortero estéril Cucharita plástica 5 ml Cuchara sopera plástica (10 ml) Tubo de ensayo Pipeta Pasteur plástica Varilla de vidrio pequeña Mechero 2 Vasos de precipitación o vasos plásticos de 200 ml Filtro cónico de café n° 2 o varias capas de gasa para hacer filtro
V.
Champú o lavalozas Sal de mesa Agua destilada Etanol 95ᵒ helado Frutas: plátano; verduras: cebolla
PROCEDIMIENTO:
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7. Se forman dos capas, en la interfase precipita el ADN.
6. Añadir 50ml de alcohol helado por las paredes del vaso.
5. Pasa el sobrenadante a un beaker de 200 ml.
4. Centrifugar a 2000 rpm por 5-10 minutos.
3. Mezclar las soluciones 1 y 2 por 10 minutos sin producir espuma.
2. Mezclar 2 ml de solución de lavavajilla líquida al 20% con 50 ml de NaCl2 2M. Sin producir espuma.
1. Preparar una mezcla homogenea de platano pelado (10 gr) con agua destilada (50 ml)
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7. Se forman dos capas, en la interfase precipita el ADN.
6. Añadir 50ml de alcohol helado por las paredes del vaso.
5. Pasa el sobrenadante a un beaker de 200 ml.
4. Centrifugar a 2000 rpm por 5-10 minutos.
3. Mezclar las soluciones 1 y 2 por 10 minutos sin producir espuma.
2. Mezclar 2 ml de solución de lavavajilla líquida al 20% con 50 ml de NaCl2 2M. Sin producir espuma.
1. Preparar una mezcla homogenea de cebolla con agua destilada (50 ml)
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VI.
RESULTADOS:
El resultado obtenido en la experimentación es positivo ya que se logró cumplir con el objetivo de extracción y visualización de ADN en vegetales con una apariencia de sustancia mucosa blanca y filamentosa. A pesar de haber realizado una centrifugación el producto obtenido de la extracción no es ADN puro, ya que, entremezclado con él, hay fragmentos de ARN. Una extracción “profesional” se
realiza añadiendo enzimas que fragmentan las moléculas de ARN y que impiden que se unan al ADN.
VII.
CONCLUSIONES
Tras haber realizado la experiencia de obtener un ADN “casero” la cual fue realizada con total éxito ya que hemos podido visualizar, llegamos a la conclusión: Que el ADN es la molécula de la vida ya que todos los organismos la contienen por lo que se encarga de hacernos diferentes. Distintos organismos presentan diferente número de cromosomas, es decir, diferente información genética; lo que se traduce en diferentes características morfológicas. Realizando este proyecto se pudo conocer mejor las características de ADN y su importante función, así también, se pudo observar de manera macroscópica el ADN de dos organismos los cuales pertenecen al reino vegetal.
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VIII.
DISCUSIÓN:
La extracción de ADN es quizás el más desconocido y sobre el que más control podemos ejercer. Hay diversas formas de extracción de ADN, con recetas particulares y protocolos caseros de laboratorios. Además, en el mercado, se encuentran diversos kits de extracción de ADN, normalmente más rápido y menos agresivos que los protocolos tradicionales, y que suelen ofrecer un óptimo rendimiento. El método “casero” es más laborioso y lento, aunque más económico.
Sin embargo, ambos ofrecen un rendimiento de trabajo parecido. Por lo tanto, dependiendo de la naturaleza de la especie, se selecciona el protocolo de aislamiento de ADN total más adecuado. Los pasos necesarios para una correcta extracción y purificación del ADN mediante un procedimiento químico son: Lisis de las células o virus. Las sales caotrópicas ayudan a romper la estructura tridimensional de macromoléculas como las proteínas o los ácidos nucleicos consiguiendo su desnaturalización. La adición de un detergente como el SDS es necesaria a menudo para eliminar las membranas. Degradación de la fracción proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adición de una proteasa. La fracción proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sódico. Precipitación del ADN. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol frío o isopropanol y recuperar mediante una centrifugación. El alcohol del sobrenadante se llevará las sales añadidas previamente. Hay sustancias interfieren con lasADN polimerasas termoestables ya sea medianteel bloqueo directo total o parcial de su actividad catalítica o mediante la unión directa alADN de doble cadena. Por ejemplo, algunas sustancias interaccionan con los iones Mg2+(un cofactor crítico de la actividad catalítica) o disminuyen sudisponibilidad pudiendo inhibir la PCR. Otra importante fuente de inhibición son los propios reactivosque se usan en el proceso de extracción de ADN, como porejemplo, el exceso de KCl, NaCl y otras sales, detergentes iónicos,etanol e isopropanol, fenol y otros. El que exista pared celular implica, un poco demayor resistencia para poder romper la célula y extraer el ADN. Pero, consultando la bibliografía, como se utiliza detergente, ésta sustancia tiene la facilidad de romper tanto lapared como la membrana plasmática en un solo paso.
IX.
BIBLIOGRAFIA:
B. Alberts, D. Bray, K. Hopkin, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts y P. Walter. (2006) Introducción a la Biología Celular. 2ª Edición. Editorial Médica Panamericana.
Lodish, H, "Biología Celular y Molecular" (5ª ed.), Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires. 2004
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Pierce BA. Genética: Un enfoque conceptual. 2ª Edición. 2005. Ed. Médica Panamericana.
Watson J., T. Baker, S. Bell, A. Gann, M. Levine y R. Losick. (2006) Biología Molecular del Gen. 5ª Edición. Editorial Médica Panamericana.
CUESTIONARIO: Compara las preparaciones obtenidas a partir de diferentes frutas o verduras. ¿Tienen toda la misma cantidad de ADN? Las especies vegetales contienen ADN en cloroplastos y mitocondrias, el tamaño del ADN mitocondrial varía entre 250 y 2.500 Kpb; El ADN de cloroplastos (ADNcp) de las células de plantas es una molécula doble hélice circular que posee un tamaño que varía entre 120 y 160 Kpb. El número de cloroplastos varía de unas células a otras dentro de la misma especie y de unas especies a otras. Las células de hojas de la remolacha contienen en su citoplasma alrededor de 40 cloroplastos, cada cloroplasto posee entre 14 y 18nucleoides y cada nucleoide puede estar constituido por 4 a 8 moléculas de DNcp. Por tanto, una célula de remolacha puede llegar a contener 40 x 18 x 8 = 5760 moléculas de ADNcp doble hélice circular. En maíz se estime que existen entre 20 y 40 móleculas de ADNcp doble hélice circular por cada cloroplasto. La cantidad de cromosomas en una cebolla consta de 16 cromosomas divididos en 8 pares, mientras que el plátano tiene 11 cromosomas con un total de 500 a 600 millones de pares de bases, tratándose de uno de los genomas más pequeños de todas las plantas.
¿Qué habría pasado si antes de de agregar a la solución de ADN; al alcohol la hubieras agitado fuertemente? ¿Por qué? Se habría agregado energía cinética (la energía cinética de un cuerpo es aquella energía que posee debido a su movimiento) al soluto, produciendo así que
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el solvente se mezcle con este soluto y produjera una solución homogénea (la visualización de la cadena de ADN habría sido difusa y muy complicada porque solo se observaría una solo fase) .Al suceder esto no se hubiera podido distinguir bien la separación del ADN.
Cuales son las diferencias entre los detergentes catiónicos y anionicos DETERGENTES ANIÓNICOS
DETERGENTES CATIÓNICOS
Los tensioactivos aniónicos son compuestos que al disociarse en disoluciones acuosas, un ión cargado negativamente aporta las propiedades de actividad superficial a un ión cargado positivamente.
Los tensioactivos catiónicos actúan de igual forma, sólo que en este caso, es el ión cargado positivamente el que aporta las propiedades de actividad superficial. Veamos a continuación los más representativos:
Se describirán a continuación los más usuales:
SALES DE AMINA Son sales resultantes de la mezcla de JABONES: aminas grasas con ácidos. Se suelen Sus propiedades tensioactivas preparar in situ y su principal disminuyen marcadamente cuando la aplicación recae en las formulaciones cadena de hidrocarburos tiene menos de inhibidores de corrosión. de 10 átomos de carbono y en su lugar tiende a mostrar propiedades COMPUESTOS DE AMONIO hidrotrópicas. Los hidrótopos son CUATERNARIO sustancias que tienden a aumentar la Este es un grupo genérico en el que solubilidad de sustancias orgánicas, una amina terciaria reacciona con un incluyendo los tensioactivos, en agua. agente cuaternario. Dependiendo de Los jabones más normalmente la amina terciaría y del agente utilizados son los sódicos, los cuaternario se obtendrán los potásicos y los amónicos. siguientes tipos de sustancias:
SULFATO DE SODIO LAURIL. Es una mezcla de sulfato de sodio alquil teniendo como principal constituyente al lauril de sulfato de sodio. Es bastante soluble en agua y sus propiedades humectantes están unidas a su proceso de ionización.
DERIVADOS DE MONOALQUIL DIMETIL AMINA El uso de estos preparados es muy variado y podemos encontrarlos en bactericidas, agentes antiestáticos, emulsificantes en el cuidado del cabello, y en formulaciones de ÉTER DE LAURIL lavandería e industriales. DIETILENGLICOL EN Los amonios cuaternarios obtenidos SULFATO DE SODIO. con cloruro de bencilo o haluros de Este detergente diluido en agua recibe bencilo poseen unas propiedades
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el nombre de Tergentol y ha sido biocidas importantes y son utilizados ampliamente usado en endodoncia. como bactericidas contra las bacterias Gram positivas. ALCOHOL SULFATOS Son excelentes agentes espumantes, DERIVADOS DE DIALQUIL tienen excelente capacidad MONOMETILAMINAS detergente y son buenos agentes El producto más importante de esta dispersantes. Los cationes más clase es el ditallow dimethil comunes son el sodio, amonio, ammonium chloride (DTDMAC) trietanolamina y magnesio. utilizado principalmente en la elaboración de suavizantes ALFA-SULFO METIL domésticos. ESTERES Debido a su buen poder tensioactivo, DERIVADOS DE LA su capacidad de dispersar los jabones IMIDAZOLINA de cal y sus propiedades detergentes Generalmente también se emplean puede ser utilizado como sustituto del en la elaboración de suavizantes LABS. Son ampliamente utilizados en textiles. Japón en polvos de lavandería y CLORURO DE presentan buenos perfiles de BENZALCONIO: biodegradabilidad. Tensoactivo muy conocido con diversos nombres comerciales (Zephiran, Germitol, Benzal, etc.) Una solución al 0.1% tiene un alto poder bacteriostático, bajo poder inflamatorio, con largo tiempo de vida útil y relativamente inocuo.