IDENTIFIKASI BAKTERI DENGAN PEWARNAAN
RABU, 15 MEI 2013
JURNAL MIKROBIOLOGI FARMASI
OLEH: IFA ROSI MAHRIFAH 122210101068
BAGIAN BIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS JEMBER 2013
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Bakteri merupakan organisme yang memiliki morfologi bentuk tubuh dasar yang pada umumnya mirip satu sama lain dengan struktur tambahan yang berbeda-beda. Sel bakteri jika diamati dengan mata biasa sangatlah sulit karena ukurunnya yang sangat mikroskopik, untuk itu digunakan mikroskop untuk membantu dalam mengamati morfologi dan mengidentifikasinya. Jika dibuat preparat oles tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat karena bentuk selnya yang transparan dan bermacam-macam. Bakteri juga memiliki sifat yang dapat diabsorbsi oleh zat-zat tertentu. Dalam laboratorium mikrobiologi sifat-sifat tersebut digunakan untuk mengamati bakteri, karena sifat yang dapat menyerap suatu zat yang bersifat asam atau basa yang dapat memberikan suatu warna baik itu pada sel bakteri ataupun pada latar belakang dari bakteri tersebut. Pewarnaan dalam kegiatan identifikasi bakteri bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan. Di mana zat warna tersebut dapat memberikan muatan negatif atau positif. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, dan Malachite Green. Sedangkan zat warna basa sebagai contoh antara lain Eosin dan Congo Red . Berdasarkan hal di atas maka, dilakukanlah percobaan ini untuk mengetahui dari bagaimana cara kerja dari suatu zat warna dan sifatnya pada suatu bakteri.
1.2 Rumusan Masalah
1. Apa sajakah macam-macam pewarnaan kuman? 2. Bagaimana cara mewarnai kuman? 1.3 Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa mengenal macam-macam pewarnaan kuman. 2. Mahasiswa dapat melakukan pewarnaan kuman.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 1. Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif). Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan Reece, 2005). Banyak senyawa organik berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopik dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan untuk: a. Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar b. Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme c. Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa (Suriawiria, 1985). Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa hingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-zat warna (Hadioetomo, 1990). Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, yang yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer, 1998). Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatka. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan war na disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll (Irawan, 2008). 2. Pewarnaan Gram
Kebanyakan sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika dilarutkan dalam air dan diperlihatkan di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna kontras dengan medium
disekelilingnya. Beberapa zat yang digunakan untuk mengamati struktur bagian dalam sel. Dalam pewarnaan mikroba, dapat digunakan satu jenis warna, cara ini disebut pewarnaansederhana. Zat-zat warna yang biasa digunakan untuk pewarnaan bekteri dapat dibedakan atas beberapa golongan yaitu: pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial, pewarnaan strukturan dan pewarnaan untuk menguji adanya komponen tertentu di dalam sel (Anonim,2007) Karakteristik taksonomi penting bakteri adalah reaksi mereka terhadap pewarnaan gram. Pewarnaan gram menjadi penting karena reaksi gram berhubungan dengan sifat morfologi lain dalam bentuk hubungan filogenik. Organisme yang berpotensi gram positif mungkin hanya dapat dilihat dengan pewarnaan gram pada kondisi lingkungan yang sesuai dan pada biakan muda. Prosedur pewarnaan gram dimulai dengan pemberian pewarna basa,kristal violet. Larutan iodine kemudian ditambahkan semua bakteri akan diwarnai biru pada fase ini. Sel kemudian diberi alkohol. Sel gram positif akan tetap mengikat senyawa kristal violetiodine, tetap berwarna biru, sel gram negatif warnanya hilang oleh alkohol. Sebagai langkah terakhir, counterstain (misalnya Safranin pewarna merah) ditambahkan,sehingga sel gram negatif yang tidak berwarna, akan mengambil warna kontras; sedangkansel gram positif terlihat dalam warna biru (Jawetz, etc. 2001). Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853 – 1938) 1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram. Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
Zat warna utama (violet kristal) Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.
Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu 1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu. 2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ. 3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam. 4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan la pisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu: Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu: a. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 15 mm, berlapis tiga atau multilayer. b. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat. c. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin. d. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet. e. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana. f. Tidak resisten terhadap gangguan fisik. g. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat h. Peka terhadap streptomisin i. Toksin yang dibentuk Endotoksin Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu: a. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer. b. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat. c. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin. d. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal. e. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. f. Lebih resisten terhadap gangguan fisik. g. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut h. Tidak peka terhadap streptomisin i. Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri (mikroorganisme). Zat warna yang digunakan pada pengecatan Gram meliputi crystal violet , yodium , alkohol dan safranin. Fungsi dari masing-masing zat warna tersebut adalah : 1. Crystal Violet
Berwarna ungu. Merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna mikroorganisme target. Crystal Violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam , dengan begitu sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (Ungu). Kristal violet dipakai sebagai zat warna primer dikarenakan Kristal violet mampumelekatkan bakteri pada kaca mencegah autolisis pada sel, membuat sel-sel lebih kuat atau keras, mencegah mengkerutnya mengkerutnya globula-globula protein protein sel, mempertinggi sifat reaktif gugusan-gugusan, membunuh bakteri secara cepat dengan tidak mengubah bentuk dan strukturnya, dan mengubah afinitas cat. 2. Yodium
Merupakan pewarna Mordan , yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target. Pemberian yodium pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. 3. Alkohol
Solven organik yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan : 1. Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu 2. Bakteri menjadi tidak berwarna 4. Safranin
Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain , memberikan warna pada mikroorganisme non target (Wahyuningsih , 2008). Pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan itu merupakan tahap t ahap penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri (Lay,1994). Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel.
BAB III METODE KERJA 1.1 Pembuatan Preparat Oles Bersihkan kaca objek sehingga bebas bebas dari lemak dan kotoran
Teteskan beberapa tetes isopropyl alcohol 95% pada kedua permukaan kaca objek dan keringkan dengan lap kertas
Buatlah lingkaran di tengah-tengah permukaan bawah kaca objek. Hal ini untuk membantu meletakkan olesan mikroba dengan tepat
Ambil inokulum bakteri dan sebarkan olesan tersebut hingga merata
Biarkan pada olesan tersebut udara hingga betul-betul Ikuti langkah seperti goresan T,kering namun dengan lempeng agarkering dibagi menjadi 4 a
Lakukan fiksasi panas dengan melayangkan kaca objek diatas panas api
3.2 Pewarnaan Sederhana Siapkan preparat olesan bakteri B.subtilis dan E.coli yang telah di fiksasi panas dimana dibuat dua preparat untuk tiap bakteri
Letakkan kaca objek diatas bak pewarnaan dan genangi olesan tersebut dengan zat warna biru metilen untuk preparat pertama dan zat warna karbol fuksin untuk preparat kedua
Biarkan terwarnai biru metilen selama 1-2 menit atau selama 15-30 detik untuk pewarnaan dengan karbol fuksin
Peganglah kaca objek dengan penjepit dan miringkan kemudian bilas dengan air hingga 3.1.4 Goresan Sinambung zat warna hilang atau sedikit sekali
Keringkan air pada permukaan preparat dengan kertas serap
Amati morfologi spesien pada masing-masing preparat di bawah mikroskop
3.3 Pewarnaan gram Buat preparat oles dari bakteri
E.coli
dan S.aureus
Beri Kristal ungu selama satu menit
Buang kelebihan Kristal ungu dengan memiringkan kaca objek diatas bak pewarna
Bilas dengan air menggunakan botol pijit
Tiriskan kaca objek dan kembalikan ke atas rak pada bak pewarna
Beri larutan iodium gram selama 2 menit
Buang kelebihan iodium dengan memiringkan kaca objek
Bilas dengan air memakai boto pijit
Cuci dengan etanol 95% setetes demi setetes selama 30 detik atau sampai zat ungu Kristal tidak tampak lagi mengalir dari kaca objek
Cuci dengan sir lalu tiriskan
Beri safranin selama 30 detik
Buang kelebihan safranin lalu bilas dengan air
Tiriskan kaca objek dan serap kelebihan air dengan menekankan kertas serap diatasnya
Amati dibawah mikroskop
DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 2007.Petunjuk Praktikum Mikrobiologi.Mataram.Universitas Mataram Press.Burdon Ph.B., Sc.M., Ph.D., Kenneth L. & Williams, A.B., Sc.M., Ph.D., Robert P. 1969.Mycrobiology.. London, Collier-McMillan Publisher.Jawetz E., Melnick J.L., Adelberg 1969.Mycrobiology E.A., 1982. Mikrobiologi untuk profesi kesehatan. Jakarta,EGC Press.J awetz E., Melnick J.L., J .L., Alderberg E.A., 2001. Mikrobiologi kedokteran. Surabaya, Airlangga University Press.Pelgzar & Reid, 1958. Mycrobiology. Tokyo, McGraw-Hill Company Press.Pelczar, J Michael, 2005. Dasar-Dasar Mikrobiolog. Jakarta, Universitas Indonesia Press
DAFTAR PUSTAKA Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Erlangga. Jakarta. Hadioetomo, R, S., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta. Irawan, 2008. Teknik Pewarnaan Mikroba. http://wordbiology.wordpress.com http://wordbiology.wordpress.com.. Diakses pada hari Senin, 13 April 2008 pada pukul 19.00 WITA. Pelczar, M. W., 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi 1. UI Press. Jakarta. Suriawiria, U., 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.
Volk, W. A. dan Margareth F. W., 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga.