LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI PEWARNAAN SPORA
Rabu, 11 Maret 2015 Kelompok II Rabu, Pukul 10.00 – 13.00 WIB
Nama
NPM
Iman Firmansyah
260110130044
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN 2015
Nilai
TTD
PEWARNAAN SPORA
I. Tujuan Mengamati endospora bakteri dengan menggunakan prosedur pewarnaan spora (pewarnaan Klein). Memahami setiap langkah dan reaksi – reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.
II. Prinsip
1. Pewarnaan Spora Pewarnaan khusus digunakan untuk mewarnai dan mengisolasi bagian spesifik dari mikroorganisme, misalnya endospora, kapsul, dan flagela (Pratiwi, 2008). 2. Teknik Aseptis Cara kerja yang menjaga sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk mencegah kontaminasi terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan ( Siswaya, 2014 ). 3. Impermeabilitas dinding sel bakteri tahan asam Bakteri tahan asam memiliki kandungan senyawa dari peptidoglikan dan lipid kompleks (wax-D) yang disebut asam mycolat yang membangun struktur dinding selnya, sehingga menjadi impermeabel terhadap macam – macam prosedur perwarnaan termasuk pewarnaan Gram (Lay, 1994). 4. Penetrasi zat warna Difusi zat warna dari lapisan permukaan ke pusat. Agar penetrasi zatzat warna baik dan tahan cuci, maka gaya ikat antara zat warna dan sampel harus lebih besar dari pada gaya – gaya yang bekerja antara zat warna dan air (Etsha, 2013).
III. Teori Dasar Spora bakteri adalah bentuk bekteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Spora bakteri mempunyai fungsi yang sama seperti kista amoeba, sebab bakteri dalam bentuk spora dan amoeba dalam bentuk kista merupakan suatu fase dimana kedua mikroorganisme itu berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap faktor luar yang tidak menguntungkan (Dwidjoseputro, 1989). Jenis-jenis bakteri tertentu, terutama yang tergolong dalam genus Bacillus dan Clostridium mampu membentuk spora. Spora yang dihasilkan di luar sel vegetatif (eksospora) atau di dalam sel vegetatif (endospora). Bakteri membentuk spora bila kondisilingkungan tidak optimum lagi untuk pertumbuhan dan perkembangannya, misalnya: medium mengering, kandungan nutrisi menyusut dan sebagainya (Hastuti, 2012). Beberapa spesies bakteri menghasilkan spora eksternal. Streptomyces misalnya, meghasilkan serantaian spora (disebut konidia), yang disangga di ujung hifa, suatu filamen vegetatif. Proses ini serupa dengan proses pembentukan spora pada beberapa cendawan(Irianto, 2006). Spora pada bakteri adalah endospora, suatu badan yang refraktil terdapat dalam induk sel danmerupakan suatu stadium isrtirahat dari sel tersebut. Endospora memiliki tingkatme tabolisme yang sangat rendah sehingga dapat hidup sampai bertahun-tahun tanpa memerlukan sumber makanan dari luar (Irianto, 2006). Pembentukan spora dapat dianggap sebagai suatu proses diferensiasi dari suatu siklus hidup dalam keadaan-keadaan tertentu. Hal ini berbeda dari peristiwa pembelahan sel karena tidak terjadi replikasi kromosom (Pelczar, 1986). Kemampuan menghasilkan spora memberi keuntungan ekologis pada bakteri, karena memungkinkan bakteri itu bertahan dalam keadaan
buruk. Langkah-langkah utama di dalam proses pembentukan spora sebagai berikut : 1. Penjajaran kembali bahan DNA menjadi filamen dan invaginasi membran sel di dekatsatu ujung sel untuk membentuk suatu struktur yang disebut bakal spora. 2. Pembentukan sederet lapisan yang menutupi bakal spora, yaitu korteks spora diikuti dengan selubung spora berlapis banyak. 3. Pelepasan spora bebas seraya sel induk mengalami lisis (Pelczar, 1986).
Salah satu ciri endospora bakteri adalah susunan kimiawinya. Semua endospora bakteri mengandung sejumlah besar asam dipikolinat yaitu suatu substansi yang tidak terdeteksi pada sel vegetatif. Sesungguhnya, asam tersebut merupakan 5-10 % berat kering endospora. Sejumlah besar kalsium juga terdapat dalam endospora, dan diduga bahwa lapisan korteks terbuat dari kompleks Ca2+ asam dipikolinat peptidoglikan (Pelczar, 1986). Letak spora di dalam sel serta ukurannya selama pembentukannya tidaklah sama bagi semua spesies contoh, beberapa spora adalah sentral yaitu dibentuk ditengah – tengah sel yang lain terminal yaitu dibentuk di ujung dan yang lain lagi lateral yaitu di bentuk di tepi sel (Pelczar, 1986). Diameter spora dapat lebih besar atau lebih kecil dari diameter sel vegetatifnya. Dibandingkan dengan sel vegetatif, spora sangat resisten terhadap kondisi-kondisi fisik yang kurang menguntungkan seperti suhu tinggi dan kekeringan serta bahan-bahan kimia seperti desinfektan. Ketahanan tersebut disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras (Hadioetomo, 1985). Dalam pengamatan spora bakteri diperlukan pewarnaan tertentu yang dapat menembus dinding tebal spora. Pewarnaan tersebut adalah dengan penggunaan larutan hijau malakit 5%, dan untuk memperjelas pengamatan, sel vegetative juga diwarnai dengan larutan safranin 0,5% sehingga sel
vegetative ini berwarna merah. Dengan demikian ada atau tidaknya spora dapat teramati, bahkan posisi spora di dalam tubuh sel vegetative juga dapat diidentifikasi.Namun ada juga zat warna khusus untuk mewarnai spora dan di dalam proses pewarnaannya melibatkan treatment pemanasan, yaitu; spora dipanaskan bersamaan dengan zat warna tersebu tsehingga memudahkan zat warna tersebut untuk meresap ke dalam dinding pelindung spora bakteri (Volk & Wheeler, 1988). Beberapa bakteri mampu membentuk spora meskipun tidak dalam keadaan ekstrem ataupun medium yang kurang nutrisi. Hal ini dimungkinkan karena bakteri tersebut secara genetis, dalam tahapan pertumbuhan dan perkembangannya memang memiliki satu fase sporulasi (Dwidjoseputro, 1989). Jika medium selalu diadakan pembaruan dan kondisi lingkungan disekitar bakteri selalu dijaga kondusif, beberapa jenis bakteri dapat kehilangan kemampuannya dalam membentuk spora. Hal ini dimungkinkan karena struktur bakteri yang sangat sederhana dan sifatnya yang sangat mudah bermutasi, sehingga perlakuan pada lingkungan yang terus menerus dapat mengakibatkan bakteri mengalami mutasi dan kehilangan kemampuannya dalam membentuk spora (Dwidjoseputro, 1989). Spora bakteri ini dapat bertahan sangat lama, ia dapat hidup bertahun - tahun bahkan berabad - abad jika berada dalam kondisi lingkungan yang normal. Kebanyakan sel vegetatif akan mati pada suhu 60-70oC, namun spora tetap hidup, spora bakteri ini dapat bertahan dalam air mendidih bahkan selama 1 jam lebih. Selama kondisi lingkungan tidak menguntungkan, spora akan tetap menjadi spora, sampai kondisi lingkungan dianggap menguntungkan, spora akan tumbuh menjadi satu sel bakteri yang baru dan berkembangbiak secara normal (Volk & Wheeler, 1988).
IV. Alat dan Bahan 1. Alat : a. Bak Pewarna. b. Buku Gambar c. Cawan Petri d. Kaca Objek. e. Kapas. f. Kertas Saring. g. Korek api h. Mikroskop Majemuk. i. Ose. j. Pembakar Spirtus. k. Pensil warna Merah, Biru, Ungu l. Spidol m. Tabung Reaksi n. Water Bath 2. Bahan : a. Air Suling dalam Botol Semprot. b. Asam Sulfat 1% c. Desinfektan. d. Emersi Oil. e. NaCl Fisiologis f. Sampel Air Liur. g. Suspensi Bakteri Bacillus subtilis. h. Zat Warna Karbol Fuksin. i. Zat Warna Metilen Biru. 3. Gambar Alat
V. Prosedur Dibuat suspensi bakteri yang terdiri dari biakan bakteri dan NaCl fisiologis di tabung reaksi. Ditambahkan karbol fuksin sebanyak 1:1 kedalam suspensi tersebut. Campuran tersebut dipanaskan dalam pemanas air atau water bath bersuhu 80oC selama 10 menit. Di jaga jangan sampai mendidih atau kering. Kaca objek di sterilisasi dengan cara dicuci, lalu dimasukkan kedalam larutan desinfektan, kemudian dimasukkan kedalam larutan alkohol 70%. Setelah kaca objek disterilisasi, di lap menggunakan kapas sampai mengeluarkan suara berdecit. Lingkari bagian bawah kaca objek dengan spidol sebagai area untuk pengolesan sampel bakteri. Ose difiksasi dengan cara dibakar dengan pembakar spirtus sampai ose berpijar. Ose di dinginkan dengan cara didekatkan dengan pembakar spirtus. Di buat olesan dari campuran suspensi. Olesan tersebut digenangi dengan asam sulfat (H2SO4) 1% selama 2 detik, lalu dicuci atau dibilas dengan aquades. Kemudian olesan tersebut digenangi dengan pewarna tandingan biru metilen selama 5 menit, zat warna yang berlebih dibuang, dibilas dengan air suling, lalu dikeringkan dengan kertas saring. Kemudian olesan ditetesi minyak imersi, lalu diperiksa di bawah mikroskop. Diamati dan di gambarkan hasilnya.
VI. Data Pengamatan No
Perlakuan
Hasil
Olesan Sampel Bakteri + Asam Sulfat 1% + Dibilas dengan Aquades + Metilen biru + Dibilas dengan aquades + Dikeringkan 1
dengan kertas saring + Ditetesi minyak imersi + Diamati dengan mikroskop, dengan pembesaran 100X
VII. Pembahasan Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan bakteri berupa pewarnaan spora. Spora pada bakteri berbeda dengan spora pada jamur, pada bakteri sporanya tidak mempunyai fungsi sebagai alat reproduksi tetapi sebagai perlindungan dari kondisi yang tidak menguntungkan bagi bakteri tersebut. Endospora bakteri tahan terhadap kondisi lingkungan ekstrim seperti suhu yang tinggi, kekeringan, senyawa kimia beracun (desinfektan , antibiotik), dan radiasi sinar UV. Biasanya bakteri yang membentuk endospora merupakan fase tidur dari bakteri. Endospora ini mampu bertahan sampai kondisi lingkungan kembali menguntungkan bagi bakteri. Tetapi setelah keadaan lingkungan menguntungkan bagi bakteri maka bungkus spora akan pecah dan tumbuh bakteri. Pewarnaan spora merupakan pewarnaan yang tidak dapat di warnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan tekhnik pewarnaan khusus. Endospora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, tetapi sekali
diwarnai, zat warna tersebut akan sulit hilang. Pewarnaan yang dilakukan dalam praktikum ini dengan menggunakan pewarnaan Klein. Pewarnaan Klein merupakan pewarnaan spora yang paling banyak digunakan. Spora bakteri sangat sulit sekali bila diwarnai dengan pewarnaan gram. Untuk pewarnaan spora, perlu dilakukan pemanasan supaya pewarna bisa masuk kedalam spora, seperti pada pewarnaan tahan asam dimana pewarna karbol fuksin harus dipanaskan untuk bisa menembus lapisan lilin asam Mycolic dari Mycobacterium. Pertama yang dilakukan adalah membuat suspensi bakteri bakteri yang terdiri dari biakan bakteri dan NaCl fisiologis di tabung reaksi. Ditambahkan karbol fuksin sebanyak 1:1 kedalam suspensi tersebut. Karbol fuchsin merupakan pewarna dasar, yang mengandung fenol untuk membantu melarutkan dinding sel. Campuran tersebut dipanaskan dalam pemanas air atau water bath bersuhu 80oC selama 10 menit. Dilakukan pemanasan dikarenakan spora merupakan mekanisme pertahanan dari bakteri dalam lingkungan ekstrim (tidak memungkinkan bakteri hidup), sehingga ketika dipanaskan lilin yang melapisi spora akan meleleh dan zat warna akan masuk, tetapi ketika di dinginkan lilin kembali mengeras dan membeku, zat warna akan terperangkap dalam lapisan tersebut sedangkan sel vegetatifnya terwarnai oleh zat warna kedua. Dalam pembuatan suspensi digunakan NaCl fisiologis. Penggunaan NaCl fisiologis ini berperan sebagai penyangga pH agar sel bakteri tidak rusak akibat menurunnya pH lingkungan. Kemudian sterilisasi kaca objek dengan cara di celupkan kedalam larutan desinfektan kemudian dicelupkan kedalam alkohol 70%. Sterilisasi bertujuan untuk memusnahkan atau mengeliminasi semua mikroorganisme termasuk spora bakteri yang resisten dalam alat yang akan digunakan. Setelah melakukan sterilisasi, kemudian melakukan olesan bakteri pada kaca objek, tetapi sebelumnya ose di fiksasi di api pada pembakar spiritus yang bertujuan untuk mematikan bakteri dengan cepat pada ose, supaya tidak tercampur dengan bakteri yang akan di uji.
Sebelum melakukan pengolesan bakteri, kaca objek di beri tanda lingkaran di bawahnya sebagai tanda area untuk melakukan pengolesan sel bakteri dari suspensi. Pada percobaan kali ini pengolesan di lakukan dengan sampel suspensi bakteri Bacillus subtilis. Lalu di fikasasi di atas api pembakar spirtus api dengan cara di lewat – lewatkan tidak terlalu dekat api supaya bakteri tidak mati. Fiksasi dalam tahap ini bertujuan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya, mempermudah pengecetan,dan sediaan tahan untuk disimpan jika belum sempat dicat. Setelah di buat olesan dari campuran suspensi. Olesan tersebut digenangi dengan asam sulfat (H2SO4) 1% selama 2 detik. Penggunaan asam sulafat disini bertujuan sebagai peluntur warna karbol fuksin yang tidak masuk kedalam sel bakteri. Lalu dicuci atau dibilas dengan aquades. Kemudian olesan tersebut digenangi dengan pewarna tandingan biru metilen selama 5 menit. Metilen biru adalah pewarna yang biasa di pakai dalam pewarnaan umum. Biasanya hanya untuk membedakan sel bakteri dengan latar belakangnya, warna metilen biru ini akan menempel pada badan bakteri. Zat warna yang berlebih dibuang, dibilas dengan air suling. Pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Objek yang telah dibasuh aquades kemudian dikeringkan dengan menggunakan kertas saring, tidak ditiup-tiup karena dikhawatirkan ada kontaminasi bakteri lain yang menempel pada objek glass. Kemudian olesan di tetesi emersi oil sebanyak satu tetes. Minyak emersi adalah minyak yang di pakai untuk olesan pada mikroskop, yang fungsinya untuk memperjelas objek, dan melindungi mikroskop. Minyak emersi memiliki indeks refraksi yang tinggi dibandingkan dengan air, sehingga objek yang kita amati dapat terlihat lebih jelas dibandingkan dengan tanpa minyak emersi. Lalu diamati dengan mikroskop pada pembesaran 100X.
Dari hasil pewarnaan spora terlihat bakteri berwarna ungu ada titik merah, dengan bentuk basil. Letak sporanya berada pada subterminal. Letak endospora berbeda dengan spesies bakteri yang lain. Tipenya ada yang central yaitu lokasi dari sel vegetatifnya di tengah, terminal letak sel vegetatifnya berada di ujung atau pinggir dan tipe subterminal berarti lokasi endosporanya berada di antara tengah dan pinggir dari sel vegetatif. Bakteri yang berbentuk basil memiliki endospora yang terletak di subterminal.
VIII. Simpulan Dapat mengamati endospora bakteri dengan menggunakan prosedur pewarnaan spora (pewarnaan Klein), dengan hasil endospora terletak di subterminal. Dapat memahami setiap langkah dan reaksi – reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur dengan hasil bakteri berwarna biru pada bagian sitoplasma dan di bagian subterminal berwarna merah.
DAFTAR PUSTAKA
Etsha. 2013. Makalah Celup. Tersedia di http://www.slideshare.net/Etsha/ makalah-celup-iii [Diakses pada 16 Maret 2015]. Hadioetomo, R.S. 1985.Mikrobiologi Dasar dalam Praktek.Jakarta :PT. Gramedia. Hastuti, S.U. 2012. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi . Malang : UMM Press. Irianto, K. 2006. Mikrobiologi Jilid I. Bandung : Yrama Widya. Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : PT Raja Grafindo Persada. Pelczar, M.J. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi I. Jakarta: UI Press. Pratiwi, T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga Siswaya,Yoanne.2014.Teknik Kultur Secara Aseptik. Tersedia online di http://www.academia.edu/6138539/Praktikum_2 [Diakses pada tanggal 16 Maret 2015] Volk dan Wheeler. 1988. Mikrobiologi Dasar Edisi Kelima. Jakarta : Erlangga.
