PSEUDOMONAS MICROBIOLOGIA

EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA

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PSEUDOMONAS

Ingeniería Bioquímica ING. BIOQUIMICA

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INSTITUTO TECNOLOGICO DE TUXTLA GUTIERREZ 2

MICROBIOLOGIA

PSEUDOMONAS

(EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA)

ALUMNOS: DOMINGUEZ FLORES LAURA PATRICIA GUTIERREZ SARMIENTO WILBERT

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TUXTLA GUTIERREZ, CHIAPAS A 8 DE NOVIEMBRE DEL 2011

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INDICE I. II. III.

INTRODUCCION………………………………………………………………………. OBJETIVO………………………………………………………………………………

MARCO TEORICO……………………………………………………………………. III.I PSEUDOMONAS III.I.I CULTIVO III.I.II HABITAT III.I.III.CARACTERISTICAS III.I.III.CARACTERISTICAS GENERALES III.I.IV.GRUPOS DE BACTERIAS DE Pseudomonas ssp III.I.V PATOGENIA

5 6 7

a. Patógenos animales b. Patógenos de plantas

III.I.VI IMPORTANCIA DE PSEUDOMONAS a. b. c. d.

Su actividad como patógeno de animales Su actividad como patógeno de vegetales Su actividad como agentes alterantes de alimentos Su actividad como agentes descontaminantes ambientales

III.II.AISLAMIENTO III.II.AISLAMIENTO E IDENTIFICACION IDENTIFICACION DE PSEUDOMONAS III.II.I CARACTERISTICAS MINIMAS DE IDENTIFICACION III.II.III IDENTIFICACION CON PRUEBAS BIOQUIMICAS III.II.IV IDENTIFICACION POR PCR III.I.V ESPECIES DE PSEUDOMONAS a. b. c. d. e. f. g. h. i.

P. aeruginosa P. fluorescens P. putida P. maltophilia P. cepacia P. stutzeri P. alcaligenes y P. pseudoalcalagenes P. mallei P.pseudomallei

III.III HIDROCARBUROS III.III.I CLASIFICACION III.III.II CONTAMINACION DE HIDROCARBUROS III.III.III DEGRADACION DE HIDROCARBUROS III.III.IVCATABOLISMO III.III.IVCATABOLISMO DE LOS COMPUESTOS AROMATICOS a. Catabolismo aerobio b. Catabolismo anaerobio

III.IV.PETROLEO III.IV.I CARACTERISTICAS ING. BIOQUIMICA

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IV.

III.IV.III FORMACION III.IV.IV PRINCIPALES FUENTES DE CONTAMINACION III.IV.V PSEUDOMONAS DEGRADADORAS DE PETROLEO METODOLOGIAS………………………………………………………………………. 25

*Aislamiento de la diversidad microbiana de la rizosfera del suelo *Identificación de bacterias Gram positivas y Gram negativas *Identificación de Pseudomonas spp. mediante pruebas bioquímicas     

Prueba de oxidasa Prueba de triple azúcar hierro (TSI) Prueba de Fluoresceína Prueba de Piocianina: Prueba de Nitrato (MMM)

4

*Extracción de ADN de las Pseudomonas spp.aisladas para análisis de PCR *Identificación de Pseudomonas spp. por análisis de PCR *Determinación cualitativa de la capacidad de biodegradación de hidrocarburos aromáticos por Pseudomonas spp. aisladas *Determinación cuantitativa de la capacidad de biodegradación de hidrocarburos alifáticos por Pseudomonas spp. aisladas *Descripción para la identificación de Pseudomonas spp.

V. VI. VII. VIII. IX.

RESULTADOS…………………………………………………………………………… 32 DISCUSION DE RESULTADOS………… RESULTADOS………………………………………………………… ……………………………………………… CONCLUSION………………………………………………… CONCLUSION………………………………………………………………………….. ……………………….. BIBLIOGRAFIA…………………………………………………………………………. ANEXOS…………………………………………………………………………………

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I. INTRODUCCION El estudio de las Pseudomonas ssp en las ultima décadas se debe que tiene ciertas características importantes; ya que es capaz de utilizar compuestos orgánicos como fuentes de carbono y energía. Esto ha permitido mediante su estudio la comprobación de la capacidad de inhibir los coliformes, siendo los indicadores de contaminación de agua más usados en el mundo, pero no solo esa área ha sido de gran interés, puesto que en los últimos años se ha encontrado que es capaz de biorremediar el medio contaminado con ciertos hidrocarburos presentes en el petróleo. El petróleo es una mezcla homogénea de compuestos orgánicos, principalmente hidrocarburos insolubles en agua, estos compuestos están conformados de hidrógeno y carbono, en su mayoría parafinas, naftenos y aromáticos. Los hidrocarburos de este tipo llegan a se de gran problema para los ecosistemas, ya que contaminan fuentes de agua y suelos, ocasionando un gran impacto ecológico. Por tanto es la gran importancia que adquieren las Pseudomonas ssp para lograr la remoción de estos contaminantes del ambiente. Es por ello la importancia de poder aislar este tipo de bacterias presentes en el suelo El manejo inadecuado de los materiales y residuos peligrosos ha generado a escala mundial, un problema de contaminación de suelos, aire y agua. Entre las más severas contaminaciones se destacan las que se produjeron y todavía se producen a causa de la extracción y el manejo del petróleo en todos los países productores de hidrocarburos. Las Pseudomonas ssp son una un grupo de bacterias que se encuentran constituido por bacilos aerobios gran negativos y móviles, algunos de los cuales producen pigmentos solubles en agua. Las especies de este género se identifican sobre la base de varias características fisiológicas. El aislamiento de esta bacteria nos permitirá un mayor análisis de su capacidad degradadora de los hidrocarburos. Es por ello que en la realización de este trabajo, aislaremos a Pseudomonas ssp a partir de muestras de la tierra llevándolas a un crecimiento selectivo, para de esta manera poder separarlas debido a sus características taxonómicas , trabajado con ciertas pruebas bioquímicas además de PCR (Reacción de Cadena Polimerasa), y así ya una vez identificadas poderlas poner a prueba en la minimización de los hidrocarburos policíclicos y heterocíclicos, con esto poder medir su potencial biodegradativo que presentan las bacterias Pseudomonas ssp. a fin de seleccionar cepas bacterianas con una amplia capacidad degradadora, que garanticen de esta forma la remoción de los hidrocarburos complejos presentes en el suelo.

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II. OBJETIVO

General:



Aislar e identificar la bacteria pseudomonas a partir de la extracción de una muestra del medio

Específicos:







 

Diferenciar la familia de pseudomonas en una muestra de fuente natural (tierra), según las características que se presentan Diferenciar a partir de técnicas de taxonómicas la presencia de la bacteria pseudomonas ssp. Utilizar la técnica de PCR para una clara y concisa diferenciación de la bacteria pseudomonas ssp, según su ADN. Aislar la bacteria pseudomonas obtenida de la muestra Permitir el crecimiento de la bacteria a partir de igualar las condiciones necesarias de la misma

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III. MARCO TEORICO III.I PSEUDOMONAS Los organismos de este género son bacilos gran negativos o esporulados, de unos 3 Mm x 5 Mm, que se mueven mediante flagelos polares, que pueden producir un pigmento fluorescente, son oxidasa positivos, utilizan glucosa oxidativamente y no forman gas. Se hallan corrientemente en el suelo y el agua. Algunas especies se identifican como patógenas para el hombre y animales pero algunos otros, considerados al principio como saprofitos y comensales, se han implicado como patógenos oportunistas en infecciones adquiridas en hospitales y han llegado a colonizar aportes de agua destilada, jabones, desinfectantes, infusiones intravenosas y otros productos farmacéuticos. Las especies que colonizan las piscinas se han incriminado en infecciones del oído. (Collins & Lyne, 1989)

III.I.I CULTIVO Las Pseudomonas crecen en medios simples (Tabla 1). En caldo crecen abundantemente formando un anillo y un sedimento de color verde azulado. En agar simple forman colonias brillantes, confluentes, de borde continuo y a veces ondulado con un centro opaco. El pigmento (piocianina) se difunde en el medio dándole una tonalidad verdosa. Este pigmento tiene cualidades bactericidas sobre otras bacterias Gram positivas y Gram negativas.

III.I.II HÁBITAT Las especies del género Pseudomonas son organismos ubicuos, bacterias gram negativas que se encuadran dentro del grupo γ de las proteobacterias. Se han aislado bacterias de este género tanto en suelos limpios como en suelos contaminados por productos biogénicos y xenobióticos. También son microbiota predominante en la rizosfera y en la filosfera de plantas; del mismo modo, se han aislado de ambientes acuáticos, tanto de agua dulce como de aguas marinas. En general inocuas para el hombre también existen: patógenos oportunistas como P.aeruginosa; patógenos de animales y patógenos de plantas como P.syringae. Este género es uno de los más proclives a la degradación de compuestos orgánicos, especialmente cepas de la especie Pseudomonas putida. El amplio potencial catabólico de los componentes del género viene dado en muchos casos por la presencia de determinantes plasmídicos y transposones autotransmisibles. La ubicuidad de las bacterias del género Pseudomonas y su capacidad para explotar una amplia variedad de nutrientes refleja un sistema de

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adaptación al medio ambiente que no encuentra parangón en las bacterias de otros géneros. Las cepas del género Pseudomonas son capaces de procesar, integrar y reaccionar a una amplia variedad de condiciones cambiantes en el medio ambiente, y muestran una alta capacidad de reacción a señales físico-químicas y biológicas. Se han descrito cepas capaces de adquirir resistencia a metales pesados, disolventes orgánicos y detergentes, lo cual les permite explotar una amplia gama de fuentes de carbono como nutrientes, así como colonizar ambientes y nichos que difícilmente son colonizables por otros microorganismos. Por ello no es sorprendente que se considere a las bacterias del género Pseudomonas un paradigma de versatilidad metabólica, y microorganismos claves en el reciclado de materia orgánica en los compartimentos aeróbicos de los ecosistemas, jugando, por tanto, un papel esencial en la mejora y el mantenimiento de la calidad medioambiental. Además de su uso en biodegradación las especies del género Pseudomonas se emplean en distintos procesos industriales, tales como la fabricación de bioplásticos o en técnicas de biocontrol. La posición taxonómica de las distintas especies del género se encuentra sujeta a revisión.

III.I.III CARACTERÍSTICAS GENERALES Las pseudomonas son bacilos rectos o curvados pero no vibroides, son bacterias Gram negativas con flagelos polares , normamente aislados, no envainadas o con yemas, constan de un tamaño de 0,5 -1,0 M m por 1,5-4,0 M m, sin esporas. Dentro de su metabolismo respiratorio, nunca fermentativo aunque pueden producir cierta cantidad de acido a partir de glucosa en condiciones de aerobiosis; utilizan compuestos orgánicos de bajo peso molecular pero no polímeros; algunos son quimilitrotofos, utilizando H 2 o CO como único donador de electrones en anaerobiosis, algunos pueden utilizar arginina anaeróbicamente (madigan, martinko, & parker, 2008) (madigan, martinko, & parker, 2008)

III.I.IV. GRUPOS DE BACTERIAS DEL GÉNERO PSEUDOMONAS El grupo de bacterias relacionadas con el género Pseudomonas es muy amplio y comprende especies patógenas para humanos Pseudomonas cepacia (patógeno oportunista que puede causar infecciones muy serias con alta tasa de mortalidad en pacientes comprometidos, especialmente han aumentado los datos de infecciones producidas en los pulmones de pacientes con fibrosis cística) y Ps. aeruginosa. Hay especies patógenas vegetales como Ps. solanacearum que produce marchitación, Ps. syringae causante de manchas cloróticas en ciertas plantas y Ps. marginalis causante de pudriciones blandas en las raíces de las plantas.

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Por otra parte, existen varios géneros bacterianos estrechamente relacionados con el de Pseudomonas que también tienen una importancia especial: el género Xanthomonas comprende varias especies patógenas vegetales que producen necrosis del follaje. El género Zooglea comprende varias especies capaces de producir agregados celulares de gran tamaño que intervienen de forma importante en la digestión de las aguas orgánicas de ciudades e industrias, y los géneros Acetobacter y Gluconobacter, de los que hablaremos más adelante, que son capaces de oxidar alcoholes y tienen importancia industrial en la fabricación de vinagre

III.I.V PATOGENIA a. Patógenos animales P. aeruginosa es un patógeno oportunista humano, más comúnmente afecta a

los inmunosuprimidos, tales como aquellos con fibrosis quística o sida. Estas infecciones pueden afectar a muchas partes del cuerpo, pero típicamente afectan las vías respiratorias, causando 50 % de las pulmonías bacterianas nosocomiales. (Salazar Rodriguez, Gonzales Rizo, & Palma Monroy, (Mayo-ago. 2002) Rev Cubana Med Trop. [online]. 54) El tratamiento de dichas infecciones puede ser difícil debido a la frecuente y repetitiva resistencia antibiótica. P. oryzihabitans puede también ser un patógeno humano, aunque las infecciones

son raras. Puede causar peritonitis, endoftalmitis, septicemia y bacteremia. Síntomas similares, aunque poco frecuentes, pueden ser vistos con P. luteola. P. plecoglossicida es una especie patógena de peces, causando ascitis hemorrágica en los peces Ayu (Plecoglossus altivelis). P. anguilliseptica es también

un patógeno en los peces. Debido a su actividad hemolítica, las especies que no son patógenas pueden ocasionalmente causar problemas clínicos, en particular en la infección de transfusiones de sangre. Las Pseudomonas , por ser bacterias hidrófilas, han estado involucradas en otitis externa en particular asociada al agua, como es el caso del oído de nadador crónico o aquellas provocadas por la inserción de objetos penetrantes en el oído.

b. Patógenos de plantas P. syringae es un patógeno prolífico de plantas. Existe en más de 50 variantes,

muchas de las cuales muestran un alto grado de especificidad en las plantas. Hay numerosas especies de otras Pseudomonas que pueden actuar como patógenos de las plantas, aunque la P. syringae es la más distribuida y mejor estudiada.

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Aunque no es un patógeno estrictamente de plantas, P. tolaasii puede ser un gran problema agrícola, debido a que causa manchas bacterianas de setas cultivadas. Similarmente, P. agarici puede causar laminillas gotosas en ciertos setas.

III.I.VI. IMPORTANCIA DE LAS PSEUDOMONAS La importancia aplicada de las bacterias del grupo de Pseudomonas se debe a una serie de factores entre los que destacan: 10

a.

Su actividad como patógenos de animales

Las patologías asociadas a Pseudomonas suelen presentarse en animales afectados por algún tipo de disminución, permanente o transitoria, del sistema de defensa inmune. Por esto, se denominan patógenos oportunistas. El tratamiento de estas infecciones suele ser difícil debido a la alta resistencia de estas bacterias a la mayoría de los antibióticos usados normalmente en clínica. Desde el punto de vista humano, el patógeno principal es Ps. aeruginosa. La especie Ps. mallei es la causante de la enfermedad conocida como muermo en los caballos y Ps. pseudomallei es causante de la melioidosis humana.

b.

Su actividad como patógenos vegetales

La especie Ps. syringae es un verdadero parásito vegetal. Las especies del género Xanthomonas también son todas patógenos vegetales.

c.

Su actividad como agentes alterantes de alimentos

Las Pseudomonas son el grupo de bacterias más frecuente en los alimentos frescos. Debido a su gran potencial metabólico, las bacterias de estos grupos son agentes importantes en la alteración de alimentos. Sin considerar los aspectos de deterioro de vegetales producidos por especies antes citadas, las Pseudomonas son uno de los principales grupos responsables de la alteración de productos cárnicos almacenados incorrectamente en condiciones de aerobiosis. Algunas bacterias del grupo son psicrófilas por lo que la alteración de los alimentos que producen también tiene lugar durante la conserva en refrigenración. Cuando piezas de alimentos cárnicos son conservadas en refrigeración en ambientes impermeables al gas o en vacío, las Pseudomonas pueden producir H2S que reacciona con la hemoglobina dando lugar a la aparición de manchas verdes.

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d.

Su aplicación como agentes descontaminantes ambientales

La gran versatilidad metabólica de las bacterias del género Pseudomonas las han hecho candidatas para el tratamiento de contaminaciones ambientales producidas por la acumulación de metales pesados o por la acumulación de compuestos xenobióticos. Varias especies del Pseudomonas contienen plásmidos en los que se encuentran codificadas enzimas capaces de degradar, al menos parcialmente, compuestos orgánicos derivados del petróleo o compuestos organoclorados u organofosfatados. Estas enzimas suelen ser inducibles y la selección de las cepas adecuadas puede permitir reducir los niveles de contaminación por estos compuestos xenobióticos. La biodegradación de hidrocarburos y de otros compuestos orgánicos es realizada con eficiencia variable dependiendo de la estructura del hidrocarburo (lineal o ramificado, alifático o aromático) y de la presencia de átomos sustituyentes. Algo similar ocurre con la biodegradación de compuestos insecticidas, herbicidas y detergentes y emulgentes. Por otra parte, el tratamiento de la contaminación originada por la acumulación de metales pesados también es posible mediante la utilización de bacterias de este género. El efecto tóxico de los metales pesados suele estar asociado a la presencia de formas ionizadas (cationes) de los metales en cuestión. Ciertas bacterias de este género presentan enzimas capaces de reducir los cationes metálicos a las formas neutras que son mucho menos tóxicas. Los operones que controlan la producción de estos enzimas reductores suelen ser inducibles por la presencia del metal pesado. Otra forma de intervención en la eliminación de metales pesados por bacterias de este grupo la desarrollan las bacterias del género Zooglea que son capaces de acumular los metales pesados y formar agregados de gran tamaño que precipitan mediante floculación. La utilización dirigida de bacterias para la descontaminación de ambientes naturales se denomina biorremediación.

III.II. AISLAMIENTO E IDENTIFICACION Se siembran en agar nutritivo, en McConkey, agar nutritivo con 0,1% de cetrimida o algunos de los medios para pseudomonas y se incuban a 20-25 °C (materiales animales). Las colonias en agar nutritivo son generalmente grandes (2-4 mm), desarrollándose planas y pigmentadas. Pueden difundirse en el medio un ING. BIOQUIMICA

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pigmento fluorescente amarillo verdoso o amarillo azulado. En ocasiones se encuentran cepas melanogenicas. Se forma un pigmento pardo alrededor de las colonias. Se hallan a veces cepas mucoides (encapsuladas) en material clínico y puede confundirse con klebsiellas. Se hace la prueba de la oxidasa, reacción en el medio de Hugh y Leifson, siembras en caldo de arginina de Thornely (el método de Moeller es demasiado anaerobio), agar de McConkey y prueba de licuación de la gelatina(incubación durante cinco días). Se siembran caldos de nutritivos y se incuban a 4 y 42 °C. se utiliza para esta prueba de subcultivo de una cepa lisa. Las pseudomonas son móviles (en ocasiones pueden hallarse cepas inmóviles), oxidativas, no reaccionan y producen álcali en medio de Hugh y Leifson. La reacción de la oxidasa es positiva, excepto posiblemente con P.maltophilia. La reacción de arginina de Thornley es positiva salvo para P.maltophilia, P. cepacia, P. stutzeri y P. alcaligensis, que no son frecuentes. Aquellas pseudomonas que dan positivas a la arginina lo hacen mas rápidamente que otros bacilos Gram negativos y esta prueba es muy útil para identificar las cepas no pigmentadas. Alcaligenses, Achromobacterium y Vibrio ssp. no hidrolizan la arginina. Las pseudomonas varían en su capacidad para licuar la gelatina y crecen a 4 y 42 °C (véase tabla 2), pueden ser útiles para las pruebas de sensibilidad a discos de penicilina. (Collins & Lyne, 1989) La formación de pigmento se observa mejor en un medio sintético basal con 4% de gluconato cálcico o en un medio comercial para pseudomonas. Algunas cepas fluorescentes producen una opalescencia (reacción yema de huevo) en el medio de Willis y Hoob y también una lipasa (capa perlada). Para demostrar la última, se inunda la placa con solución saturada de sulfato de cobre; los ácidos grasos liberados por lipolisis forman un precipitado azul verdoso de jabones de cobre. Algunas variedad se relacionada con la alteración de alimentos son psicrofilas y pueden ser lipoliticas. No son raras las cepas tolerantes a la salmuera y las cepas fosforescentes

III.II.I CARACTERÍSTICAS MÍNIMAS PARA LA IDENTIFICACIÓN Gran negativas, bacilos rectos o ligeramente curvados, sin esporas, siempre móviles por flagelos polares; metabolismo oxidativo en medio para oxidaciónfermentación con glucosa, el tubo sin vaselina produce acido(amarillo) y el tubo sin vaselina no produce acido (neutro); no se produce gas de la glucosa (se distinguen fácilmente de las bacterias entéricas y de Aeromona); la oxidasa es casi siempre positiva (las entéricas son negativas); la catalasa siempre es positiva

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no presentan pigmentos fotosintéticos (lo distingue de las bacterias rojas no del azufre); el indol y el rojo de metilo son siempre negativos (Collins & Lyne, 1989).

IIII.II.II.IDENTIFICACION POR PRUEBAS BIOQUIMICAS Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes. 

Prueba de oxidasa

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El objetivo de la prueba Oxidasa es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa, esto a partir de que el citocromo óxido acepte electrones artificial: tetrametil (o dimetil) – p – fenilendiamina. Las colonias oxidasa positivas en agar pueden detectarse sumergiendo la placa en un reactivo y buscando colonias azuladas o marrones, da positivo para Pseudomonas. 

Oxidación-Fermentación (O-F)



Reducción de Nitrato

Se evalúa la capacidad de las bacterias para oxidar o fermentar produciendo acido que se detecta gracias al azul de bromotinol (pH), da positiva para pseudomonas. (Anexo 2)

Las Pseudomonas son positivos a estas pruebas, que trata acerca de la reducción de nitrato a nitrito.(Anexo 3). 

Gelatina

Se usa para valorar la licuefacción o licuación de la gelatina por acción de las gelatinasas bacterianas producidas. La reacción positiva hace que el medio permanezca líquido después de la incubación aún después de dejarse en refrigeración durante media hora. La reacción negativa permite nuevamente la solidificación; da positivo para pseudomonas.

III.II.III. IDENTIFICACION POR PCR Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse las polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.

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El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR común se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo están precedidos por un choque térmico (llamado "hold") a alta temperatura (> 90 °C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensión de producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros. Éstos incluyen la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y de los dNTP en la reacción, y la temperatura de unión de los cebadores, así como la longitud del ADN que se desea amplificar.

III.II.IV. IDENTIFICACION DE ESPECIES DE PSEUDOMONAS a. P. aeruginosa

Las colonias en medio agar, 18-24 horas a 25-30 °C, son grandes de superficie plana e irregular, de coloración verde grisacea. El pigmento verdoso se difunde en el medio. Los cultivos en caldo son de color azul verdoso. Se forman dos pigmentos, piocianina y fluorescencia: ambos son hidrosolubles,aunque solamente la piocianina es soluble al cloroformo. Laarginina es hidrolizada rápidamente. Licuan la gelatina. El crecimiento tiene lugar a 42°C pero no a 5°C.la reacción de la yema de huevo es negativa. Los organismos son muy resistentes a los antibióticos, salvo a la polimixina, gentamicina y cabernicilina. Es un saprofito, que se halla en el suelo y en el agua, producen alteraciones de los alimentos, entre ellas las “leche azul”, es pat ógeno para el hombre y los animales (“pus azul”), a menudo como infección secundaria y se halla con frecuencia ne

material clínico. Esta frecuentemente asociada a infecciones de los tractos respiratorios y urinario en humanos. Las infecciones por Pseudomona aeruginosa son frecuentes en grandes quemados u otros traumatismos severos que afecten a amplias zonas de la piel o bien en pacientes con fibrosis quística. Sin embargo, no es un parasito estricto, sino un oportunista típico, iniciando una infección cuando el individuo se encuentra bajo de defensas. También pueden causar infecciones sistemáticas, de nuevo con individuos con amplias lesiones de piel. Este microorganismo es naturalmente resistente a muchos de los antibióticos utilizados rutinariamente de modo que la quimioterapia es difícil. Frecuentemente la resistencia se debe a la transferencia de plásmidos R, que es un plásmido que se lleva genes para la descodificación de diversos antibióticos. Pseudomona aeruginosa se aísla fundamentalmente en medios hospitalarios y pueden enfermar a pacientes que están en tratamiento por otras causas. la polimixina, es un antibiótico poco utilizado en la terapia humana debido a su toxicidad, es sin

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embargo efectivo frente a Pseudomona aeruginosa, y puede utilizarse con precaución por los efectos laterales severos.

b. P. fluorescens

Las colonias sobre el agar y sus propiedades bioquímicas son similares a las de P. aeruginosa, pero produce solamente un pigmento (flourescencia). El crecimiento tiene lugar a 5°C pero no a 42°C. la reacción de yema de huevo es positiva. Este organismo es un saprofito que se hallan frecuentemente en el suelo, agua y en vertidos de alcantarillado. Es alterante de los alimentos. Pueden gelificar la leche UTH si se conserva por encima de 5°C. c. P. putida

Las colonias recuerdan a las de P. aeruginosa, pero únicamente forman fluorescencia. Es un psicrotofo que puede no crecer a 37 °C, pero crece a 22 °C. hay dos biotipos: uno crece a 4 °C y el otro no; los dos hidrolizan la arginina. Es negativa la reacción de la yema de huevo, no licua la gelatina y los cultivos viejos tiene un marcado olor a trimetilamina (a pescado podrido). Es un organismo patógeno importantes para los peces y alterante del pescado y ha sido aislado de materiales humanos.

d. P. maltophilia

Las colonias recuerdan a las de P. aeruginosa, aunque pueden producir pigmento difusible amarillo o pardo. Esta especie se ha señalado como oxidasanegativa por Gilardi, quien utilizo discos de oxidasa de Difco, aunque Snell observo cepas oxidasa-positivas cuando se hizo la prueba con clorhidrato de tatrametil-1-fenilendiamina. Parece importante para agar cetrimida. Es la única pseudomona que da una reacción lisina descarboxilasa positiva. Se ha aislado de una gran diversidad de fuentes y parece un organismo patógeno oportunista. e. P. cepacia

Las colonias producen un pigmento amarillo, hidrosoluble, no fluorescente, que en ocasiones puede ser purpura o pueden ser no pigmentadas. Se ha señalado crecimientos a 42°C.esta ampliamente distribuido en la naturaleza presentándose como “infección hospitalaria”.

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f. P.stutzeri Las colonias son duras, secas y rugosas y pueden extraerse enteras del medio. Las colonias viejas se vuelven pardas. Pueden no hidrolizar arginina y pueden crecer o no a 4 o a 42°Co en un medio de cetrimida. Se ha hallado en materiales clínicos g. P.alcaligenes y P.pseudo-alcaligenes

Se ha indicado que estos organismos crecen a 42°C pero no a 4°C. no licuan la gelatina y pueden o no crecer en agar cetrimida. P.alcaligenes no hidrolizan arginina. h. P. mallei

Estos organismos pueden aparecer en los exudados de aspecto granuloso perlado y pueden presentar tinción bipolar. Forma colonias de 1mm, brillante, lisas, convexas, amarillo verdosa, cremosas o ligeramente viscosas, que pueden ser adherentes en agar nutritivo, no hemolizan el agar sangre y no crecen en agar McConkey en cultivo primario. El crecimiento en el aislamiento primario puede ser pobre. Crece a temperatura ambiente, no lo hace en el medio de Hugh y Leifson, no producen acido en los carbohidratos, es nitrato positivo, da reacción variable a la ureasa y pueden crecer o no en medio con KCN. La prueba de la oxidasa da resultados variables. Es el agente causal de muermo. i.

P.pseudomallei

Los cultivos en agar sangre o en agar nutritivo a 37°C dan colonias mucoides o rugosas, secas, en 1-2 diasy pueden producir un pigmento anaranjado. No hay crecimiento en agar cetrimida. Este organismo no se identifica fácilmente. Debe diferenciarse de cepas no pigmentadas de P.aeruginosa, P.stutzer y P.mallei. Es un patógeno importante el hombre (meliodosis)y de los animales domésticos en el SE de Asia, en donde es endémico en los roedores y se halla en la mayoría de los suelos, sobre las verduras y frutas.

III.III HIDROCARBUROS Son los compuestos orgánicos más simples y pueden ser considerados como las sustancias principales de las que se derivan todos los demás compuestos orgánicos. Los hidrocarburos se clasifican en dos grupos principales, de cadena abierta y cíclicos. En los compuestos de cadena abierta que contienen más de un átomo de carbono, los átomos de carbono están unidos entre sí formando una

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cadena lineal que puede tener una o más ramificaciones. En los compuestos cíclicos, los átomos de carbono forman uno o más anillos cerrados. Los dos grupos principales se subdividen según su comportamiento químico en saturados e insaturados.

III.III.I CLASIFICACIÓN De acuerdo al tipo de estructuras que pueden formar, los hidrocarburos se pueden clasificar como: 

Hidrocarburos acíclicos, los cuales presentan sus cadenas abiertas. A su vez se clasifican en: Hidrocarburos lineales a los que carecen de cadenas laterales (Ramificaciones). Hidrocarburos ramificados, los cuales presentan cadenas laterales. o

o



Hidrocarburos cíclicos ó cicloalcanos, que se definen como hidrocarburos de cadena cerrada. Éstos a su vez se clasifican como: Monocíclicos, que tienen una sola operación de ciclización. Policíclicos, que contienen una sola operación de ciclización. o o

Los sistemas policíclicos se pueden clasificar por su complejidad en: o

o

o

o

o

Fusionados, cuando al menos dos ciclos comparten un enlace covalente. (Imagen 1) Espiroalcanos, cuando al menos dos ciclos tienen un sólo carbono en común.(Imagen 2) Puentes o Estructuras de von Baeyer, cuando una cadena lateral de un ciclo se conecta en un carbono cualquiera. Si se conectara en el carbono de unión del ciclo con la cadena, se tendría un compuesto espiro. Si la conexión fuera sobre el carbono vecinal de unión del ciclo con la cadena, se tendría un compuesto fusionado. Una conexión en otro carbono distinto a los anteriores genera un puente.(Imagen 3) Asambleas, cuando dos ciclos indepencientes se conectan por medio de un enlace covalente. Ciclofanos, cuando a partir de un ciclo dos cadenas se conectan con otro ciclo.(imagen 4)

Según los enlaces entre los átomos de carbono, los hidrocarburos se clasifican en: 

Hidrocarburos alifáticos, los cuales carecen de un anillo aromático, que a su vez se clasifican en:

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o

o



Hidrocarburos saturados, (alcanos o parafinas), en la que todos sus carbonos tienen cuatro enlaces simples (o más técnicamente, con hibridación sp3). Hidrocarburos no saturados o insaturados, que presentan al menos un enlace doble (alquenos u olefinas) o triple (alquino o acetilénico) en sus enlaces de carbono.

Hidrocarburos aromáticos, los cuales presentan al menos una estructura que cumple la regla de Hückel (Estructura cíclica, que todos sus carbonos sean de hibridación sp2 y que el número de electrones en resonancia sea par no divisible entre 4).

Los hidrocarburos extraídos directamente de formaciones geológicas en estado líquido se conocen comúnmente con el nombre de petróleo, mientras que los que se encuentran en estado gaseoso se les conoce como gas natural. La explotación comercial de los hidrocarburos constituye una actividad económica de primera importancia, pues forman parte de los principales combustibles fósiles (petróleo y gas natural), así como de todo tipo de plásticos, ceras y lubricantes. Según los grados API, se clasifican en:

Si es:     

> 40 - condensado 30-39.9 - liviano 22-29.9 - mediano 10-21.9 - pesado < 9.9 - extrapesado

Los hidrocarburos sustituidos son compuestos que tienen la misma estructura que un hidrocarburo, pero que contienen átomos de otros elementos distintos al hidrógeno y el carbono en lugar de una parte del hidrocarburo. La parte de la molécula que tiene un ordenamiento específico de átomos, que es el responsable del comportamiento químico de la molécula base, recibe el nombre de grupo funcional.

III.III.II CONTAMINACION POR HIDROCARBUROS La creciente utilización de hidrocarburos en actividades cotidianas deriva en un constante problema de contaminación. Sin embargo existen microorganismos que han desarrollado la capacidad de degradar este tipo de compuestos, siendo este un método práctico que pudiera ser eficaz para disminuir el problema en los

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sitios contaminados. En este trabajo se pretende marcar la atención a la biorremediación, dando especial atención a un grupo de genes catabólicos capaces de remover hidrocarburos aromáticos bajo condiciones aerobias y anaerobias. La extraordinaria versatilidad de las bacterias para utilizar diferentes hidrocarburos como única fuente de carbono y de energía se evidenció debido a su potencial por oxidar diferentes compuestos xenobióticos. Estos compuestos son de origen natural o químicamente sintetizados por las actividades humano-industriales, sin embargo, estos compuestos diariamente son descargados al medio ambiente, generando un gran problema de contaminación. Para tratar de disminuir la contaminación de estos compuestos aromáticos se han utilizado bacterias, estas bacterias contienen una amplia variedad de rutas catabólicas. Sin embargo, hay limitaciones para aislar microorganismos con capacidad de crecer en diferentes compuestos orgánicos y en la comprensión acerca de los genes que codifican para las proteínas relacionadas con la degradación de los compuestos xenobióticos. Diferentes estudios han determinado el efecto de la contaminación con hidrocarburos en la germinación y crecimiento vegetativo de diferentes especies de pastos sometidos a diferentes concentraciones de hidrocarburo, concluyendo que hay una inhibición en la germinación del trébol común y un marcado retrasó en el crecimiento de todas las plantas evaluadas. Así mismo, otros estudios evaluaron el efecto de los hidrocarburos poliaromáticos (PHA) en ecosistemas forestales y plantas madereras, demostrando un efecto de necrosis foliar y reportando que aproximadamente 3200 hectáreas son afectadas por los derrames y el 90% de estos son pantanos o zonas inundables aledañas a plantas con tuberías corroídas por tener mas de 50 años de antigüedad, al igual que se emplean pozos sin crudo para almacenamiento de los cuáles un 30% están contaminados con desechos aceitosos. Sin embargo, lo que complica la problemática actual de los sitios contaminados con hidrocarburos, es que hasta hace pocos años, prácticamente no existía una conciencia del grado de dificultad y del enorme costo de la remediación de suelos, cuerpos de agua y atmósfera contaminados, lo que representa hoy para la sociedad un gran costo económico. Dicha contaminación esta ocasionando el deterioro progresivo de la calidad del medio ambiente y genera una amenaza real a la salud publica, así como la extinción de gran cantidad de especies vegetales y animales.

III.III.III DEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS La presencia de los compuestos aromáticos en la biosfera a través de la historia, explica por qué los microorganismos han desarrollado diferentes vías metabólicas usando estos compuestos como un sustrato y una fuente de energía para su crecimiento, consiguiendo así que una gran variedad de microorganismos puedan mineralizar los compuestos de interés. Las primeras investigaciones

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acerca de este tema se enfocaron en el medio ambiente que rodeaba a los microorganismos que se localizaban en los depósitos de petróleo (Chakraborty y Coates, 2004). Diferentes procesos han sido diseñados para la remoción de compuestos aromáticos, como: métodos físicos (adsorción por carbono activado), químicos (por extracción con solventes, oxidación química) y biológicos (utilizando microorganismos aerobios y/o anaerobios. Siendo, los procesos microbiológicos, por su versatilidad bioquímica y molecular, así como por razones de protección ambiental, la mejor alternativa para la remoción de los compuestos aromáticos, ya sea en condiciones aerobias o anaerobias (Cuadro 1) (Kleerebezem y cols., 1999).

III.III.IV CATABOLISMO DE LOS COMPUESTOS AROMÁTICOS a. CATABOLISMO AEROBIO.

En los procesos aerobios, la remoción de los compuestos aromáticos puede llevarse a cabo por hongos, actinomicetos y bacterias que contienen mono o dioxigenasas, utilizando el oxígeno para la activación y ruptura del anillo aromático. El oxígeno sirve también como aceptor final de electrones para la oxidación completa de estos compuestos. Sin embargo, la disminución del oxígeno disuelto de los sitios contaminados limita la biodegradación del Benceno, Tolueno, Etilbenceno y Xileno (BTEX). Los estudios por la vía aerobia para el catabolismo de los compuestos aromáticos han demostrado que estas enzimas (mono-oxigenasas y di-oxigenasas), llevan a cabo el primer paso que es la activación para la conversión de los compuestos aromáticos. Posteriormente, los compuestos son transformados a un número ilimitado de productos intermedios como son el protocatecuate y catecol. La ruptura del catecol es catalizada por la 1, 2 dioxigenasa y la del protocatecuate por la 3,4 di-oxigenasa, convirtiéndolos en piruvato o acetaldehído. Cuando el anillo del catecol o protocatecuate se rompe en su posición meta u orto, se convierten a β-Cetoadipato. Dos pasos adicionales completan la conversión de β-Cetoadipato a productos intermedios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Si el anillo se rompe en su posición para, se convierte en piruvato o acetaldehído y entran directamente al ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Heinaru y cols., 2000). Los estudios filogenéticos de la secuencia de aminoácidos de las proteínas relacionadas con la biodegradación de los BTEX demostraron una alta similitud en sus secuencias, lo cual indica que estas proteínas provienen de un gen ancestral común. b. CATABOLISMO ANAEROBIO

La biodegradación anaerobia es un simple pero efectivo proceso biológico para el tratamiento de diferentes residuos orgánicos y la producción de energía en

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forma de biogás CH4 (Karakashev y cols., 2005). Además es un proceso mediado por la asociación sintrófica (consorcios) de grupos de bacterias (tabla) como las: 1) 2) 3) 4)

fermentativas (Acidogénicas y Acetogénicas) Desnitrificantes (BD) Sulfato Reductoras (BSR) Metanogénicas (BM)

III.IV PETROLEO 21

Es un líquido oleoso bituminoso de origen natural compuesto por diferentes sustancias orgánicas. Se encuentra en grandes cantidades bajo la superficie terrestre y se emplea como combustible y materia prima para la industria química. El petróleo y sus derivados se emplean para fabricar medicinas, fertilizantes, productos alimenticios, objetos de plástico, materiales de construcción, pinturas o textiles y para generar electricidad.

III.IV.I CARACTERÍSTICAS Todos los tipos de petróleo se componen de hidrocarburos, aunque también suelen contener unos pocos compuestos de azufre y de oxígeno. El petróleo contiene elementos gaseosos, líquidos y sólidos. La consistencia varía desde un líquido tan poco viscoso como la gasolina hasta un líquido tan espeso que apenas fluye. Existen categorías de petróleos crudos los de tipo parafínico, los de tipo asfáltico y los de base mixta.

III.IV.II FORMACIÓN El petróleo se forma bajo la superficie terrestre por la descomposición de organismos marinos. Los restos de animales minúsculos que viven en el mar se mezclan con las arenas y limos que caen al fondo en las cuencas marinas tranquilas. Estos depósitos, ricos en materiales orgánicos, se convierten en rocas generadoras de crudo. El proceso comenzó hace muchos millones de años, cuando surgieron los organismos vivos en grandes cantidades, y continúa hasta el presente. Los sedimentos se van haciendo más espesos y se hunden en el suelo marino bajo su propio peso. A medida que van acumulándose depósitos adicionales, la presión sobre los situados más abajo se multiplica por varios miles, y la temperatura aumenta en varios cientos de grados. El cieno y la arena se endurecen y se convierten en esquistos y arenisca; los carbonatos precipitados y los restos de caparazones se convierten en caliza, y los tejidos blandos de los organismos muertos se transforman en petróleo y gas natural. Una vez formado el petróleo, éste fluye hacia arriba a través de la corteza terrestre porque su densidad es menor que la de las salmueras que saturan los intersticios de los esquistos, arenas y rocas de carbonato que constituyen dicha

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corteza. El petróleo y el gas natural ascienden a través de los poros microscópicos de los sedimentos situados por encima. Con frecuencia acaban encontrando un esquisto impermeable o una capa de roca densa: el petróleo queda atrapado, formando un depósito. Sin embargo, una parte significativa del petróleo no se topa con rocas impermeables sino que brota en la superficie terrestre o en el fondo del océano. Entre los depósitos superficiales también figuran los lagos bituminosos y las filtraciones de gas natural.

III.IV.III PRINCIPALES FUENTES DE CONTAMINACIÓN Una investigación realizada en 1981 por el Instituto Americano de Petróleo (API) identifico entre las principales fuentes de contaminación: a. Lodos de perforación de tipo inversa y recortes Estos lodos contienen un tipo de aceite muy similar a diesel en concentraciones de aproximadamente 10% y son sumamente arcillosos. Este material se deposita en presas, las cuales anteriormente eran construidas con materiales permeables y filtraban los hidrocarburos al medio ambiente. b. Suelo contaminado por derrames de tuberías corroídas

Existen campos petroleros con alrededor de cincuenta de 50 años de antigüedad, ubicados enzonas pantanosas, manglares u otras selvas inúndales. Los ductos de estos se instalaron conectando los pozos individuales a baterías de separación y desde ahí hasta las petroquímicas y refinería, generándose corrosión anaerobia, debido principalmente a bacterias reductoras de sulfato dando como resultado ductos corroídos y derramamientos. Los tipos de suelos afectados son de zonas bajas con altos contenidos de materia orgánica y arcilla y los menos afectados, son por lo general los más aptos para la agricultura por poseer texturas menos finas y alta fertilidad. Los sitios que se encuentren en la planicie costera, son los que más preocupan en caso de contaminación por el impacto que puede tener sobre los acuíferos, debido a su alta permeabilidad. c. Tiraderos de desechos aceitosos semisólidos

Se utilizan pozos que nunca produjeron petróleo o un pozo antiguo que no produce y esta tapado, puesto que nunca fueron diseñados para dicho fin y son construidos de materiales impermeables, muchas veces se termina el espacio disponible y se sigue depositando el relleno sobre la plataforma lo que resulta en escurrimientos e infiltraciones de hidrocarburos al medio ambiente cercano. d. Sitios contaminados por descargas petroquímicas y refinerías

Estos tienen sistemas antiguos de tratamiento de aguas residuales, las cuales generalmente contienen sales de los yacimientos de petróleo, lo que puede afectar los pantanos y cuerpos de agua.

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III.IV.IV PSEUDOMONAS DEGRADADORAS DE PETROLEO Las bacterias del género Pseudomonas poseen la habilidad para utilizar diversos substratos, incluyendo aquellos creados por el petróleo. Las Pseudomonas son bacterias Gram negativas, obicuas, que pertenecen a la subclase gamma de las Proteobacterias. Las Pseudomonas son bacterias productoras de biosurfactantes como los ramnolipidos involucrados en procesos de remoción de aceites y productos relacionados, Bushnell y Hass fueron de los primeros en describir bacterias productoras de biosurfactantes, como el Corynebacterium simplex y cepas de Pseudomonas. Algunos microorganismos productores de biosurfactantes extracelulares que solubilizan y facilitan la penetración de los hidrocarburos a través de la pared celular hidrofílica; contienen además enzimas degradadoras de hidrocarburos en la membrana citoplasmática. La Pseudomonas aeruginosa, es otro de los microorganismos más usado y estudiado en biorremediación y presenta una serie de actividades naturales sobre xenobióticos. Lamentablemente, también es conocida por ser un patógeno oportunista en humanos y causante de complicaciones graves en personas inmunosuprimidas, con quemaduras severas o con fibrosis quística. Por estas razones existe mucho interés en el estudio de las relaciones filogenéticas entre serotipos clínicos y ambientales. Estudios con relación al desempeño metabólico de la Pseudomonas aeruginosa ha permitido identificarla como degradadota de gran cantidad de sustratos como el n-hexadecano, mineralización de compuestos alifáticos en condiciones anaerobias, y degradadora de hidrocarburos aromáticos y poli aromáticos, así como del pireno en estudios in vitro. La P. aeruginosa tiene la capacidad de sintetizar ramnolipidos cuando se encuentra en la fase estacionaria de su crecimiento, por tal razón esto sólo se puede realizar en la primera fase del proceso de biorremediacion y contribuyendo así con la movilización y solubilización de los contaminantes durante la fase siguiente de mineralización. Al mismo tiempo que pueden tranformarse bajo microcosmos en el suelo con un tratamiento físico o químico especifico, carácter ística que comparte con el Agrobacterium tumefasciens. La Pseudomona putida es un saprofito del suelo ,oportunista, cosmopolita, metabólicamente versátil, por poseer una dioxigenasa inicial, una tolueno dioxigenasa, aunque no presenta la dioxigenasa específica para los PAHs por lo cuál es una buena candidata para las aplicaciones biotecnológicas, tales como agricultura, biocatálisis, biorremediación, biocontrol en protección de las plantas y producción de bioplásticos. La P. putida posee la capacidad de colonizar la rizosfera de plantas de cosecha y una gran capacidad metabólica que facilita el desarrollo de biopesticidas y promotores de crecimiento de la planta. La degradación de los alcanos por Pseudomona putida se ha estudiado por secuenciación en el plásmido OCT que codifica una enzima dioxigenasa que convierte alcanos a aldehídos a través del hidroperoxidasa del n-alkyl sin un intermediario del alcohol, conocido como la vía ING. BIOQUIMICA

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de Finnerty; un proceso similar lo presentan los géneros Acinetobacter sp y Nocardiodes sp. aunque ellos no poseen este plásmido. La Pseudomonas fluorescens es degradadora de naftaleno y fenantreno, ventaja que tiene frente a las otras Pseudomonas, que solo metabolizan naftaleno y asfaltenos. Estudios realizados demuestran que Flavobacterium y Pseudomonas son los microorganismos más aislados en la fase de degradación de los TPH (Hidrocarburos Totales). La Pseudomonas stutzeri es una degradadora de PHA s. ‘

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IV.

METODOLOGIAS

Aislamiento de la diversidad microbiana de la rizosfera del suelo

1 gr. de muestra de la rizosfera.

Suspender en 99 ml de agua destilada estéril.

Determinación de colonias puras.

25 Inocular 1ml de la última dilución sobre medio agar nutritivo.

Realizar diluciones en serie

Aislamiento por diferente morfología colonial en medio agar nutritivo.

Incubar a 20-25°C por 24 horas.

Analizar todas las colonias resultantes.


Descripción macroscópica de las bacterias aisladas.

Identificación de bacterias Gram positivas y Gram negativas

Fijación de cada una de las muestra de bacterias.

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Tinción de Gram

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Descripción microscópica de las bacterias aisladas. QFB. AURA FLORES


Identificación de Pseudomonas spp. mediante pruebas bioquímicas 

Prueba de la Oxidasa

Colocar un disco OX sobre portaobjeto y humedecer con agua esteril.



Analizar los resultados

Prueba de Triple azúcar y hierro (TSI)

Agar TSI solido inclinado



Agregar una muestra de cultivo sobre el disco

Siembra por estría sobre superficie inclinada y picadura en la columna.

Incubar a 37°C por 24 horas.

Analizar los resultados.

Prueba de Fluoresceína

Siembra por estría de colonias puras en medio King B.

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Análisis bajo luz visible de colinas desarrolladas.

Análisis bajo luz UV de colinas fluorescentes.

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

Prueba de Piocianina

Siembra por estría de colonias puras en medio King A.




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Determinación de la producción de piocina.

Prueba de Nitrato (MMM)

Medio Glucosa Nitrato

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Inoculacion directa por asa.

Incubar a 37°C por 24 horas.

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Agregar reactivos Griess A y B

Analizar resultados

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Extracción de ADN de las Pseudomonas spp.aisladas para análisis de PCR

Medio Centrimide agar tras 18 horas de inoculo puro.

Vortexear la mezcla.

Incubar a 37°C por una hora.

Agregar a un tubo nuevo eppendorf esterilizado.

Agregar 50 μl de

ING. BIOQUIMICA alcohol isoamilico.

Tomar 200 μl de suspensión bacteriana.

Agregar 3 μl de Proteinasa K.

Agregar 1000 μl d NaCl 5 M.


Agregar 30 μl de SDS al 10%.

Resuspender el pellet con 0.567 ml de TE buffer.

Retirar el sobrenadante con una micropipeta.

Mezclar perfectamente.

Agregar 80 μl de CTAB 10% y NaCl 0.7 M.


Incubar a 65°C por 10 min.

Extraer el sobrenadante que contiene el ADN.

Mezclar perfectamente.

Centrifugar por 2min a 28 10,000 rpm.

Agregar a un tubo eppendorf esterilizado.

Centrifugar por 7 min a 10,000 rpm

Centrifugar por 5 min ITTG a 10,000 rpm

Vortexear la mezcla

Agregar 40 μl de fenol y 40 μl de cloroformo.

Extraer el Agregar a un tubo sobrenadante nuevo eppendorf que contiene el QFB. AURAesterilizado. FLORES ADN.


Agregar 200 μl de isopropanol.

Mantener a temperatura ambiente por 30 min.

Centrifugar por 7 min a 12,000 rpm

Drenar el sobrenadante y dejar secar por 30 min.

Disolver en TE (10mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8)

29 Identificación de Pseudomonas spp. por análisis de PCR

Realizar la mezcla PCR 15 muestras de DN

Agregar 5 μl de ADN a cada tubo.

Agregar 20 μl de H2O mQ.

Agregar 2 μl de 10X buffer.

Tubos eppendorf con carga para PCR.

Distribuir la mezcla en tubos pequeños.

Agregar 1μl de taq polimerasa.

Productos de PCR Programar al termociclador.

Observar al transiluminador.

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Revelar gel con bromuro de etidio.

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Agregar 0.2mM de dNTP´s.

Agregar 2mM de MgCl2.

Programar la cámara de electroforesis.

Agregar 1μl de primer específico.

Cada producto de PCR mezclar con colorante.

Agregar a cada pozo.

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Determinación cualitativa de la capacidad de biodegradación de hidrocarburos aromáticos por Pseudomonas spp. aisladas

Placas de MMM y agar al 1.5%

Incubar por 24 hr. Para eliminar solvente por evaporación.

Rociar las placas con hidrocarburos.

Observar la presencia de halos que confirmen la biodegradación de hidrocarburos.

Inoculación de las cepas aisladas sobre placas con hidrocarburos.

30

Incubar a 37°C por 15 dias.

Determinación cuantitativa de la capacidad de biodegradación de hidrocarburos alifáticos por Pseudomonas spp. aisladas

Maztraz Erlenmeyer con hidrocarburos como única fuente de carbono.

Maztraz Klett con hidrocarburos como única fuente de carbono.

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Extraer los gases mediante jeringa Hamilton e inyectar al espectrofotómetro para analizar.

Tomar en un vial una muestra al principio y al final del experimento.

Tomar 1ml del caldo inoculado a cada dia.

Colocarlo la muestra en una celda de 5mm para fotómetrootometro. ITTG

CE GC 8000 TOP cromatografía de gases equipado con una llama detector de ionización y un 0,75 mm x 30 m de vidrio capilar columna (ZB-Cera). El horno, inyector y detector de temperatura se fija en 50, 250 y 200 ◦ C, respectivamente.

Medir la transmitancia y/o absorbancia cada día a 550nm para determinar la biomasa presente. QFB. AURA FLORES


Descripción para la identificación de Pseudomonas spp.

AISLAMIENTO Tinción de Gram +

-

Bacilos Gram negativas

Gram positivas

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Prueba de Oxidasa +

-

Enterobacterias

Aeromonas, Pseudomonas, Vibrio Prueba de TSI Acido (+)

Acido

-

Pseudomonas

Vibrio spp., Aeromonas

Prueba de fluoresceína -

+

P. aeruginosa, P. chlororaphis,

Otras especies de

P. cichorii, P. fluorescens,

Pseudomonas

P. putida, P. syringae Prueba de piocianina +

-

P. aeruginosa

P. chlororaphis, P. cichorii, P. fluorescens, P. putida, P. syringae Prueba reducción del nitrato -

+

P. cichorii,

P.

P. putida,

chlororaphis,

P. syringae

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V .RESULTADOS IDENTIFICACIÓN TAXONOMICA DE Pseudomonas spp. Aislamiento de la diversidad bacteriana de la rizosfera del suelo:

Fig. 1. Desarrollo de las diversas bacterias que componen la rizosfera del suelo.

Fig. 2. Desarrollo de colonias puras aisladas.

32

H

Tinción de Gram:

Fig. 3. Pseudomonas spp. Bacilos cortos, Gram negativos, rectos o ligeramente curvados.

g

Prueba de la Oxidasa:

Fig. 4. Prueba positiva de la Oxidasa para Pseudomonas spp.

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Prueba de fermentación de azucares (TSI): Fig. 5. Pseudomonas spp. no ermenta ninguno de los tres azucares presentes en la prueba, tampoco produce ácido sulfúrico, y no produce gas.

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Prueba de Fluoresceína en King B agar:

Fig 7. Fluoresceína identificada bajo luz UV producida por Pseudomonas spp. .

Fig 6. Desarrollo de colonias puras de Pseudomonas spp.

Prueba de Piocianina en King A agar:

Fig 8. Producción de Piocianina por Pseudomonas aeruginosa.

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Prueba Reducción del Nitrato:

Fig 9.(Tubo a la izquierda) Resultado positivo con Pseudomonas putida , (Tubo a la derecha) Resultado negativo con Pseudomonas fluorescens.

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PCR de cepas identificadas por pruebas bioquímicas como Pseudomonas spp.

DmZ11 DZ12 DZ13

SQ2a SQ2b DmZ16 DBP1 DBP2 DBP3

DNA marker Fig 10. Perfiles de PCRBOX de Pseudomonas spp. aisladas. Carriles 1-9: cepas aisladas DmZI1, DZI2, DZI3, SQ2a, SQ2b, DmZI6, DBP1, DBP2, DBP3. Carril 10 Marcador molecular de ADN.

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Comparación de huella genética de una Pseudomonas aeruginosa con dos cepas problemas.

Fig 12. HaeIII patrones de restricción. Carriles: 1. Marcador molecular (GeneRuler 100bp ADN); 2. SQ2a; 3. SQ2b; 4. P. aeruginosa ATCC 27583; RsaI patrones de restricción. Carriles: 5. SQ2a; 6. SQ2b; 7. P. aeruginosa ATCC 27583 ; AluI patrones de restricción. Carriles: 8. SQ2a; 9. SQ2b; 10. P. aeruginosa ATCC 27538

Fig 13. DdeI patrones de restricción. Carriles: 1. Marcador molecular (GeneRuler 100bp ADN); 2. SQ2a; 3. SQ2b; 4. P. aeruginosa ATCC 27583; MspI patrones de restricción. Carriles: 5. SQ2a; 6. SQ2b; 7. P. aeruginosa ATCC 27583 ; HinfI patrones de restricción. Carriles: 8. SQ2a; 9. SQ2b; 10. P. aeruginosa ATCC 27538

Fig 14. NotI patrones de restricción. Carriles: 1. Marcador molecular (GeneRuler 100bp ADN); 2. SQ2a; 3. SQ2b; 4. P. aeruginosa ATCC 27583; restricción. Sau3AI patrones de Carriles: 5. SQ2a; 6. SQ2b; 7. P. aeruginosa ATCC 27583 ; CfoI patrones de restricción. Carriles: 8. SQ2a; 9. SQ2b; 10. P. aeruginosa ATCC 27538

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Fig 15. Árbol filogenético que muestra la posición de SQ2a y SQ2b de acuerdo a la secuencia del gen 16S rDNA afiliados dentro del grupo de Pseudomonas spp. construido con el método de máximas verosimilitud y un filtro (50%) de la secuencia de datos. Las barras de escala representan el 10% de diferencia de secuencia.

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Determinación de la capacidad de degradación de Hidrocarburos alifáticos:

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Fig 16. Tazas de crecimiento de Pseudomonas spp. sobre octadecano, dodecano y octano, como única uente de carbono a 30° C.

Fig 18. Tazas de crecimiento de Pseudomonas spp. sobre ciclohexano, heptano y pentano, como única uente de carbono a 30° C.

Fig 20. Perfil de cromatografía de gases de hidrocarburos antes de la biodegradación por Pseudomonas spp.

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Fig 17. Tazas de crecimiento de Pseudomonas spp. sobre hexano, catecol y fuel oil, como única fuente de carbono a 30° C.

Fig 19. Comparación en los tiempos de desarrollo de Pseudomonas spp en los diferentes sustratos.

Fig 21. Perfil de cromatografía de gases de idrocarburos después de la biodegradación or Pseudomonas spp. QFB. AURA FLORES


Determinación de la capacidad de degradación de Hidrocarburos aromáticos:

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Fig . Crecimiento de cepas de Pseudomonas spp. en hidrocarburos aromáticos policíclicos y heterocíclicos como única uente de carbono y energía.

Fig . Crecimiento de cepas de Pseudomonas spp. en hidrocarburos aromáticos policíclicos y heterocíclicos como única uente de carbono y energía.

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VI.DISCUSION DE RESULTADOS

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V.

CONCLUSION

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BIBLIOGRAFÍA

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BIOREMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS DERIVADOS DEL PETRÓLEO: 82 – 90 www.unicolmayor.edu.co 84 NOVA - PUBLICACIÓN CIENTÍFICA ISSN:1794-2470 VOL.4 No. 5 ENERO - JUNIO DE 2006:1-116 http://www.micromadrid.org/pdf/tomo1_tema25.pdf http://www.itescham.com/Syllabus/Doctos/r1985.PDF http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/17-bacterias%20grampositivas%20aerobias.htm

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ANEXOS Anexo 1.

Fermentación de la lactosa (Mc Conkey)

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El agar Mc Conkey es un medio sólido, diferencial y selectivo. Se usa para la discriminación de bacterias con capacidad de fermentar la lactosa (Lac + y ).Composición g/l : - Peptona 20.0 : fuente de nitrógeno y carbono para las Lac -. - Lactosa 10.0 : fuente de carbono para las Lac +. - Sales biliares 2.5 : le confiere carácter selectivo, inhibiendo el crecimiento de Gram +. - Cloruro sódico 5.0 : para mantener la tonicidad del medio (evitar osmosis). - Rojo neutro 0.05 : indicador que va hacer que el medio vire de coloración. Si las bacterias son Lac +, producirán ácidos derivados de la fermentación que darán al medio un aspecto rosáceo; si por el contrario son Lac -, el medio se basificará por el uso de la peptona y se tornará amarillo. - Cristal violeta 0.001 : interfiere junto con las sales biliares en la selectividad del medio. - Agar-agar 15.0: da consistencia al medio.

Anexo 2. OXIDACIÓN-FERMENTACIÓN (PRUEBA DE HUGH Y LEIFSON)

Esta prueba realiza para la determinación del metabolismo oxidativo o fermentativo de los carbohidratos.

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MEDIO DE CULTIVO Medio base de Hugh y Leifson 10,0 1,0 0,04 2,0 1000,0

Triptona Extracto de levadura Púrpura de Bromocresol Agar Agua destilada

g g g g mL

Ajuste el pH a 7,2. Esterilice a 121°C (15 libras de presión) por 15 minutos. Dispense en tubos 9 mL por tubo. 

Agregue la solución de glucosa al 10% esterilizada por filtración

En el caso de los cocos gram positivos su forma de metabolizar la glucosa es una característica importante para su identificación, por eso en este caso el glúcido añadido al medio base es la glucosa.

PROCEDIMIENTO Para cada microorganismo a identificar,se inoculan por punción dos tubos de medio. En uno de los dos tubos se cubre la superficie con parafina estérilpara crear condiciones de anaerobiosis. Se incuba a 35°C hasta por 14 días.

RESULTADOS La producción de ácido se evidencia por el cambio de color de púrpura a amarillo. Los microorganismos fermentadores producen ácido en ambos tubos, los microorganismos oxidadores (respiradores) sólo lo producen en el tubo sin parafina.

Anexo 3.

Reducción de Nitratos Va a poner de manifiesto la capacidad de transformar los Nitratos en Nitritos. Para esto inoculamos tres tubos en el medio para dicha prueba y los incubamos 24, 49 y 72 horas respectivamente. Tras 24 h. añadimos 2 o 3 gotas del reactivo "AB", si aparece coloración rojo cereza indica que es positivo, si no aparece coloración es un presunto negativo, para confirmarlo ING. BIOQUIMICA

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basta con añadir una punta de espátula de Zinc y si realmente es negativo se tornara rojo. Si el ultimo día (72 h.) la bacteria da negativo, entonces podemos decir con seguridad que no tiene capacidad para reducir los nitratos.

45 Anexo 1.

Fermentación de la lactosa (Mc Conkey) El agar Mc Conkey es un medio sólido, diferencial y selectivo. Se usa para la discriminación de bacterias con capacidad de fermentar la lactosa (Lac + y -).Composición g/l : - Peptona 20.0 : fuente de nitrógeno y carbono para las Lac -. - Lactosa 10.0 : fuente de carbono para las Lac +. - Sales biliares 2.5 : le confiere carácter selectivo, inhibiendo el crecimiento de Gram +. - Cloruro sódico 5.0 : para mantener la tonicidad del medio (evitar osmosis). - Rojo neutro 0.05 : indicador que va hacer que el medio vire de coloración. Si las bacterias son Lac +, producirán ácidos derivados de la fermentación que darán al medio un aspecto rosáceo; si por el contrario son Lac -, el medio se basificará por el uso de la peptona y se tornará amarillo. - Cristal violeta 0.001 : interfiere junto con las sales biliares en la selectividad del medio. - Agar-agar 15.0: da consistencia al medio.

Anexo 2. OXIDACIÓN-FERMENTACIÓN (PRUEBA DE HUGH Y LEIFSON)

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Esta prueba realiza para la determinación del metabolismo oxidativo o fermentativo de los carbohidratos.

MEDIO DE CULTIVO Medio base de Hugh y Leifson 10,0 1,0 0,04 2,0 1000,0

Triptona Extracto de levadura Púrpura de Bromocresol Agar Agua destilada

g g g g mL

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Ajuste el pH a 7,2. Esterilice a 121°C (15 libras de presión) por 15 minutos. Dispense en tubos 9 mL por tubo. 

Agregue la solución de glucosa al 10% esterilizada por filtración

En el caso de los cocos gram positivos su forma de metabolizar la glucosa es una característica importante para su identificación, por eso en este caso el glúcido añadido al medio base es la glucosa.

PROCEDIMIENTO Para cada microorganismo a identificar,se inoculan por punción dos tubos de medio. En uno de los dos tubos se cubre la superficie con parafina estérilpara crear condiciones de anaerobiosis. Se incuba a 35°C hasta por 14 días.

RESULTADOS La producción de ácido se evidencia por el cambio de color de púrpura a amarillo. Los microorganismos fermentadores producen ácido en ambos tubos, los microorganismos oxidadores (respiradores) sólo lo producen en el tubo sin parafina.

Anexo 3.

Reducción de Nitratos Va a poner de manifiesto la capacidad de transformar los Nitratos en Nitritos. Para esto inoculamos tres tubos en el medio para dicha prueba y los incubamos 24, 49 y 72 horas ING. BIOQUIMICA

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respectivamente. Tras 24 h. añadimos 2 o 3 gotas del reactivo "AB", si aparece coloración rojo cereza indica que es positivo, si no aparece coloración es un presunto negativo, para confirmarlo basta con añadir una punta de espátula de Zinc y si realmente es negativo se tornara rojo. Si el ultimo día (72 h.) la bacteria da negativo, entonces podemos decir con seguridad que no tiene capacidad para reducir los nitratos.

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TABLAS

P.mallei P.pseudomallei Pseudomonas ssp

Reacción HL Ox Ox Ox o ninguna

Oxidasa

Licuacion gelatina V +

Crecimiento en McConkey +

Motilidad

v +

Hidrólisis Arginina + +

+

v

v

+

+

+

Tabla 1.Clave para pseudomonas que crecen en agar nutritivo.

Prueba HL

Hidrólisis arginina

Licuación gelatina

Ox Ox Ox Alk Alk

+ + + +

+ + -

Crecimient oa 4°C/42°C -/+ +/v/-/+ -/v

Alk Ox Ox + Ox + Ox V Tabla 2. Pseudomonas ssp (Collins & Lyne, 1989)

+ + V + -

-/-/v -/-/+ v/v

P.aeruginosa P.fluorescens P.putida P.alkaligenes P.pseudoalkaligenes P.maltophilia P.cepacia P.mallei P.pseudomallei P.stutzeri

Pigmento fluoresce nte + + + -

*Todos estos organismos son oxidasa positivos. (Ox, oxidativos; Alk, reacción alcalina: v, variable) ING. BIOQUIMICA

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CUADROS

Cuadro 1. Comparación de los procesos aerobios y anaerobios en la degradación de compuestos aromáticos.

AEROBIO O2

ANAEROBIO CH3, H2O, COOH

O2

NO-3, SO2-4 , Fe (III) y CO2-3 Menor producción Mayor

Activación del anillo aromático Aceptador final de electrones Producción de biomasa Requerimientos nutricionales Productores intermedios

Catecol, protocatecuate

Benzoil CoA, Floroglucinol, resorcinol

Enzimas

Mono, di-oxigenasas

CoA ligasa, Benzoil CoA

Productos finales

CO2, H2O

CH4, CO2, H2S/N2

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Mayor producción Menor

IMAGENES

Imagen 1. Cicloalcano bicíclico de fusión

Imagen 2. Cicloalcano bicíclico espiro Imagen 3. Cicloalcanos tipo puente ( "Bridged cycloalkanes")

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PSEUDOMONAS MICROBIOLOGIA

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