17 de Marzo 2016
TECNOLOGIA AGROPECUARIA
TEMA: ENSAYO ADN RECOMBINANTE
ALUMNO: RENE FRANCISCO RUIZ DIAZ
PROF(A): VERONICA NUÑEZ OREGEL
CARRERA: IGN. EN DESARROLLO AGROINDUSTRIAL
INTRODUCCCION
El ADN recombinante, o ADN recombinado, es una molécula de ADN artificial formada de manera deliberada in vitro por la unión de secuencias de ADN provenientes de dos organismos de especies diferentes que normalmente no se encuentran juntos. Al introducirse este ADN recombinante en un organismo, se produce una modificación genética que permite la adición de un nuevo ADN al organismo, conllevando a la modificación de rasgos existentes o la expresión de nuevos rasgos.
Generación de moléculas de ADN recombinante La estrategia básica en la clonación molecular es insertar un fragmento de ADN de interés en una molécula que es capaz de replicarse de forma independiente en una célula huésped. El resultado es una molécula recombinante o clon molecular, compuesto de las secuencias del ADN insertado y del vector. Se pueden obtener grandes cantidades del ADN insertado si se permite replicarse a la molécula recombinante en un huésped apropiado.
ADN recombinante Esta técnica reposa sobre la observación de la recombinación del ADN in – vivo durante la conjugación y la transformación en el mundo de las bacterias.
Está regida por tres premisas fundamentales:
1.- Lectura precisa de la secuencia de nucleótidos del ADN.
2.- Recorte de ADN con las enzimas de restricción y el ligamento de los restantes
3.- fragmentos de ADN con otras enzimas.
Localización de vectores de clonación, es decir, fragmentos de ADN que deben de tener las siguientes propiedades:
1.- Deben ser capaces de replicarse, es decir, poseen un origen de replicación compatible con la especificidad de la célula donde ha sido introducido.
2.- Debe poseer un gen que le confiera una propiedad particular a la célula en el que se encuentra, para poder separar las células que contienen el vector de aquellas que no lo contienen.
Las secuencias de ADN recombinadas pueden ser obtenidas por diferentes medios:
1.- Por síntesis química.
2.-Por copia del ARN mensajero, una enzima llamada transcriptasa inversa, aislada de ciertos virus los retrovirus, en los que el genoma está constituido por ARN es capas de copiar bajo la forma de ADN tanto una secuencia de ADN como de ARN. Puede, a partir de una secuencia de ARN mensajero, formar una cadena de ADN complementaria. La manera más corriente de clonar este ADN complementario es hacerlo copiar por un ADN polimerasa ó transcriptasa para así obtener un ADN de doble cadena. Se deberán formar cortes colgantes para facilitar su inserción posterior por alguno de los tres procedimientos siguientes:
1.- Partiendo el ADN por una enzima de restricción.
2.- Adicionando colas de una serie de desoxinucleótidos idénticos formando una sola cadena a cada lado del ADN.
3.- Adicionando sitios de restricción obtenidos por síntesis orgánica. La utilización de secuencias de ADN recombinante ofrece una ventaja ligada a la estructura compleja de los genes de los organismos superiores. En efecto, las secuencias correspondientes a los intriones que interrumpen las regiones codificantes de los genes eucariotas no pueden ser reconocidas y recogidas por los ARN precursores de las bacterias, y evita la síntesis de proteínas aberrantes. Los ARN mensajeros citoplasmáticos de las eucariotas han sufrido ya el empalme y su copia en ADN complementario podrá ser utilizada como gen para las bacterias.
Por aislamiento de un gen de un cromosoma, de células de organismos superiores. Para realizarlo, se procede en dos etapas:
1.- Se construye una "biblioteca" del genoma, se recorta el cromosoma con la ayuda de una enzima de restricción y se inserta la mezcla de millones de fragmentos de ADN obtenidos en un número equivalente de vectores.
2.- Luego de haberse multiplicado esta población de vectores recombinados, se seleccionará el o los fagos que contienen el gen buscado. A este fin, se cierne la biblioteca a través de un medio de sondeo molecular del ADN específico del gen, el ADN complementario de su ARN mensajero o radiactivos se apareará e hibridará con la secuencia complementaria presente en el ADN del fago que contiene al gen. No quedará más que aislar al fago reparado, amplificarlo y preparar el ADN para estudiar al gen clonado.
La recombinación genética consiste en cortar las cadenas de ADN y a un plásmido, con la misma enzima de restricción, e insertar el fragmento del ADN en el plásmido, terminando con la acción del ligamento como el genoma del fago tiene un largo máximo y contiene genes inútiles es frecuente también remplazar fragmentos de ADN en lugar de insertar un nuevo fragmento, el que puede estar disponible al cortar al plásmido con la misma endonucleasa que se utiliza luego de la recombinación.
La elección del método y del gen a clonar dependerá evidentemente del fin perseguido y de la utilización posterior del organismo modificado, y a las posibilidades de expresión del organismo transformado. Los vectores utilizados son generalmente plásmidos, que preferiblemente deben de ser de talla pequeña y presentar sitios únicos de restricción fácilmente identificables para la inserción de los genes. Son aislados por la gelectroforesis o por ultracentrifugación y eventualmente modificados de acuerdo a las necesidades. Finalmente, la célula huésped ideal debe de ser fácil de transformar y de cultivar, producirse con rapidez, y estar genéticamente bien caracterizada.
La técnica del ADN recombinante se utiliza en estudios sobre la regulación de la expresión génica, en la regulación de la producción comercial de síntesis de proteínas como la Insulina o la hormona del crecimiento, en el desarrollo de organismos transgénicos y en la amplificación del ADN, es decir, en obtener un gran número de copias de un gen determinado. En este último caso, existe una técnica mejor, denominada con las siglas PCR.
La técnica consiste en introducir el gen seleccionado en el interior de un vector y éste, a su vez, dentro de una célula, denominada célula anfitriona. Aprovechando la maquinaria celular, el gen se expresa, sintetizándose así la proteína codificada en el gen. Además, al dividirse la célula, las nuevas células formadas contienen ese gen que también sintetizan esa proteína. Se genera un grupo celular que contiene un genoma distinto.
Las etapas en la producción de ADN recombinante son las siguientes:
1.- Preparación de la secuencia del ADN para su clonación
2.- Preparación de un vector de clonación
3.- Formación del ADN recombinante
4.- Introducción del ADN recombinante en una célula anfitriona
5.- Propagación del cultivo
6.- Detección y selección de clones recombinants
1.- Preparación de la secuencia del ADN para su clonación
Es la parte esencial del proceso, ya que el ADN debe separarse y concentrarse.
Partimos de células con núcleo, que deben ser lisadas. Las proteínas estructurales, enzimas, ARN y restos moleculares deben separarse del ADN. El ADN obtenido se concentra y se fragmenta por acción de las enzimas de restricción. Se aísla el ADN que se desea clonar, por ejemplo, mediante cromatografía líquida o por centrifugación. Si el ADN debe expresarse hay que añadir los segmentos reguladores de la expresión génica.
2.- Preparación de un vector de clonación
El vector es el portador de la secuencia de ADN que se desea clonar. Un vector debe presentar las siguientes características: Una pequeña secuencia de ADN fácil de aislar, como, por ejemplo, un plásmido. Contener distintos puntos de ataque a enzimas de restricción y que sean conocidos. Poder ser incluido en la célula anfitriona con facilidad. Replicarse de forma independiente al ADN de la célula anfitriona. Poseer un gen marcador con el que puedan identificarse y seleccionar las células clonadas. Un ejemplo de marcador puede ser la resistencia a un antibiótico.
Las etapas del proceso consisten en:
Cortar el vector con enzimas de restricción, las mismas enzimas que se utilizaron para cortar el ADN que se quiere insertar.
Unir el vector y el ADN que se va a clonar mediante los llamados extremos cohesivos, o pegajosos, o escalonados.
Una vez que el ADN ha sido introducido en el vector se denomina ADN inserto o un simplemente inserto.
Los tipos de vectores que se utilizan suelen ser plásmidos, virus como el fago mas cromosomas creados de forma artificial y quimeras.
3.- Formación del ADN recombinante
En esta etapa se produce la unión covalente del vector y el ADN inserto mediante una ligasa. Así se realiza el sellado de la llamada Mella, Muesca o Nick.
4.-Introducción del ADN recombinante en la célula anfitriona
Para la clonación (replicación del ADN recombinante) se necesita la maquinaria celular. Por ello, hay que introducir el ADN recombinante en una célula anfitriona.
Los tipos de células anfitrionas son:
Células bacterianas: son las más utilizadas, ya que tienen una alta velocidad de replicación, un bajo coste de mantenimiento de las colonias y son fácilmente manipulables.
Células eucariotas: aunque las células eucariotas son, en general, difíciles de mantener se usan levaduras y células tumorales:
Levaduras: se utilizan en procesos relacionados con la investigación de la expresión y la regulación génica y la síntesis de proteínas eucariotas. Células tumorales: apropiadas en procesos de clonación, ya que la velocidad de replicación es muy alta y se mantienen los caracteres sin producirse cambios, pues son muy estables.
Los métodos para la introducción del ADN recombinante facilitan la entrada de grandes fragmentos de ADN, puesto que la membrana celular es selectiva y no permitiría la penetración de grandes moléculas.
5.- Propagación del cultivo
Se induce la división de células anfitrionas, de forma que se producen también copias de ADN recombinante y, por ello, la clonación. Primero se efectúa una siembra en placas Petri con agar como medio de cultivo. Se dejan crecer las colonias. Cada una de ellas será seleccionada y transferida a distintos medios líquidos, donde seguirá aumentando el número de individuos de la colonia.
6.- Detección y selección de los clones recombinantes
En los procesos de clonación se utiliza un gran número de células. Al final del proceso se hace necesario separar las células que contienen ADN recombinante de las que no lo contienen. La detección y la selección de colonias se realiza en los medios de cultivo. En los procesos de clonación se obtienen células anfitrionas que no han incluido el vector, células recombinantes, es decir, que han incluido el vector con el ADN para recombinar, y células anfitrionas con vector que no lleva el ADN inserto. Los métodos para detectar y seleccionar son:
Método de hibridación: se utiliza una sonda marcada que hibrida con el ADN recombinante o con el ARN mensajero que se transcribe a partir de él.
Método inmunológico: se detecta la proteína codificada en el ADN recombinante mediante anticuerpos específicos.
Métodos genéticos: que, a su vez, pueden ser Inserción del vector y el ADN recombinante en un gen de la célula anfitriona que queda desactivado. Por ejemplo, si la colonia no produce enzima lactasa, es que el ADN recombinante se encuentra dentro del ADN bacteriano en ese gen. Vector con genes de resistencia a un antibiótico: en el medio se agrega el antibiótico y sólo crecerá aquella colonia que sea resistente a él, por tanto, que porte el ADN. Colonias con defectos nutricionales: se utilizan células anfitrionas mutantes que no puedan sintetizar, por ejemplo, un aminoácido. Para que la colonia sobreviva, el aminoácido debe ser añadido al medio de cultivo. Empleando un vector que lleve el gen correcto para la síntesis de dicho aminoácido, haciendo crecer las colonias celulares en medios carentes de él sólo crecerán las bacterias que lleven el ADN inserto.
Conclusión
La técnica del ADN recombinante es una herramienta de la biotecnología moderna que permite el uso del ADN para la elaboración de sustancias que necesita la medicina. B. El ADN recombinante, o ADN recombinado, es una molécula de ADN formada por la unión de dos moléculas de diferente origen. Esta técnica tiene muchos beneficios, pues permite obtener ciertas proteínas a bajo costo. También tiene sus detractores que opinan que su uso no es cien por ciento seguro. Entre los peligros que se pueden enfrentar con está técnica está la contaminación con agentes xenobióticos, que pueden causar un desequilibrio en la molécula de ADN recombinante, comprometiendo el resultado del proceso.
Además siempre que los avances científicos y tecnológicos se producen con esta rapidez, el entusiasmo por seguir adelante no deja lugar a una cavilación acerca de los pro y los contras que puede provocar. Casi cada aspecto de la IG presenta una controversia y exige un profundo análisis, de modo que las posibles consecuencias negativas causadas por la negligencia científica se eviten. En el caso de la IG orientada al agro, por ejemplo. Las cosechas transgénicas ya son abundantes en el mundo, pero no son testeadas correctamente las posibles consecuencias ecológicas que pudiesen causar. Esto provocó el levantamiento de los organismos ecológicos no gubernamentales, que han elaborado una extensa lista de faltas cometidas por las distintas compañías. Esta acción, a su vez, creo una concepción negativa de los organismos transgénicos. Se lo ve como algo completamente nocivo para la salud, a la vez que se desconoce de qué se trata. Está en el conocimiento popular que cualquier ser, planta o animal, genéticamente modificado es sinónimo de veneno o tóxico. Este miedo irracional fue utilizado por ciertas organizaciones protectoras del medio ambiente para aumentar este temor popular. "Podés estar comiendo plantas con genes de ratas o víboras", fue uno de los argumentos más sensacionalistas.
Ingeniería en Desarrollo Agroindustrial
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Tecnología agropecuariaUnidad 1. Biotecnología y agrobiotecnologíaActividad 1. ADN Recombinante
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Unidad 1. Biotecnología y agrobiotecnología
Actividad 1. ADN Recombinante