EXTRACCION DE ADN A PARTIR DE SANGRE PERIFERICA
Objetivo: Que Objetivo: Que el alumno conozca la técnica de extracción de ADN y conozca físicamente la molécula de ADN. Introducción El ácido desoxirribonucleico, frecuentemente abreviado como ADN es un tio de ácido nucleico, una macromolécula !ue forma arte de todas las células. "ontiene la info inform rmac ació ión n #ené #enéti tica ca usad usada a en el desa desarr rrol ollo lo y el func funcio iona nami mien ento to de los los or#anismos vivos conocidos y de al#unos virus, siendo el resonsable de su transmisión $ereditaria. El ADN es un olímero de nucleótidos. %n olímero es un comuesto formado or muc$as unidades simles conectadas entre sí. En el ADN, cada nucleótido, a su vez, vez, está está formad formado o or un az&car az&car 'desox 'desoxirri irribos bosa(, a(, una base base nitro# nitro#en enada ada '!ue '!ue uede ser adenina) A, timina)T , citosina)C o o #uanina)G( y un #ruo fosfato. *o !ue distin#ue a un nucleótido de otro es la base nitro#enada, y or ello la secuencia del ADN se esecifica nombrando sólo la secuencia de sus bases. El ADN se resenta como una doble cadena de nucleótidos, en la !ue las dos $ebras $ebras están están unidas unidas entre entre sí or unas unas conexi conexione ones s denom denomina inada das s uente uentes s de $idró#eno. *as secuencias de ADN !ue constituyen la unidad fundamental, física y funcional de la $ere $erenc ncia ia se deno denomi mina nan n #ene #enes. s. "ada "ada #en #en cont contie iene ne una una arte arte !ue !ue se trans transcr crib ibe e a A+N y otra otra !ue !ue se enca encar# r#a a de defi defini nirr cuán cuándo do y dónd dónde e debe deben n exresarse. *a información contenida contenida en los #enes se emlea ara #enerar A+N y roteínas, !ue son los comonentes básicos de las células, los !ue se utilizan ara la formación de los or#ánulos celulares, entre otras funciones. Dent Dentro ro de las las célu célula las, s, el ADN está está or#a or#ani niza zado do en estr estruc uctu tura ras s llam llamad adas as cromosomas !ue, durante el ciclo celular, se dulican antes de !ue la célula se divida.
El conocimiento de la estructura del ADN $a ermitido el desarrollo de multitud de $erram $erramien ientas tas tecnol tecnoló#i ó#icas cas !ue utiliz utilizan an sus roie roiedad dades es fisico fisico!uí !uímic micas as ara ara analizar su imlicación en roblemas concreto. odemos clasificar las metodolo#ías de análisis del ADN en a!uellas !ue buscan su multilicación, in vivo, como la reacción en cadena de la olimerasa '"+(, in vitro, como la clonación, y a!uellas !ue exlotan las roiedades esecíficas de elementos concretos, o de #enomas adecuadamente clonados. Es el caso de la secuenciación de ADN y de la $ibridación con sondas esecíficas '-sout$ern bloty c$is de ADN(.
Materia /erin#a o sistema vacutainer torni!uete tubo de taón morado estéril 0 tubos de 1233 4 vasos de reciitados de 33 ml 4 vasos de reciitados de 453 ml incubadora centrifu#a ieta #raduada de 5 ml ieta asteur c$uón 6ubos eendorf de .5 ml centrifu#a esectrofotómetro ieta semiautomática de 33 7l untillas
Reactivo! •
8uffer de lisis9
"loruro de amonio 1 m: 8icarbonato de Amonio 3.; m: •
8uffer de di#estión9
53 m: tris < =.5 33 m: ED6A < >.3 033 m: Na"l 3.5 ? @D@ • • • • •
roteinasa Na"l B : Etanol al 33? Etanol al =3? A#ua inyectable
Procedi"iento M#todo SDS$P%
.C 6omar en dos tubos con anticoa#ulante 'taa morada(, 1.5 ml de san#re eriférica con una /erin#a o vacutainer, transferirla a dos tubo de lástico 'nal#ene( en artes i#uales y a#re#ar 10 artes del tubo, de buffer de lisis. ncubar 13 minutos en refri#eración 4.C "entrifu#ar 5 minutos a 1333 rm, a 0F", y decantar el sobrenadante con cuidado de no tirar el sedimento. 1.C +ealizar 4 lavados más en las mismas condiciones. 0.C +esusender el botón en 1 ml de buffer de di#estión 'buffer de leucocitos( y a#re#ar 53 G* de @D@ y 53 G* de . 5.C A#itar $asta !ue se disuelva el botón y de/ar a incubación tres dias a 1=F". B.C A#re#ar 4.5 ml de Na"l B: y a#itar fuertemente or inversión durante minuto. =.C "entrifu#ar a 1333 rm durante 43 minutos. A temeratura ambiente '45F "(. >.C 6ransferir la fase acuosa 'fase suerior( a otro tubo 1233. ;.C AHadir 4 vol&menes de etanol absoluto frió. 3.C Ibservar el ADN reciitado, seararlo con una ieta y transferirlo a un tubo eendorf de .5 ml. .C
_________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ____________________________________ Re!utado! Anota tus resultados obtenidos
Concu!ione!
_________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ____________________________________ Cue!tionario . Jor !ué se lava con etanolK 4. JQué otras técnicas son emleadas en biolo#ía molecular ara la extracción del ADNK 1. Jara !ue se utiliza la solución buffer de lisisK 0. J"uál es la función del buffer de leucos o de di#estiónK 5. Jor !ué se usa etanol al =3? frio y no a temeratura ambienteK exli!ue
&ibio'ra()a con!utada Anota la biblio#rafía !ue utilizaste ara contestar la ráctica.
I"*'ene! A#re#a tus foto#rafías tomadas durante la ráctica.
LLLLLLLLLLLLLLLLLLLLL
LLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLL
Nombre y firma
MI. 8I.
_______________________________ *u#ar y fec$a
