Extracción de ADN de tejidos animales y vegetales Fundamento
La extracción del Ácido Desoxirribonucleico (ADN) consta de una etapa de lisis, que consiste en romper las estructuras que confinan el citoplasma y liberar al medio su contenido, otra etapa es la purificación del ADN, que implica la retirada de la solución final de la mayoría de elementos que pueden interferir en posteriores análisis de Cambio de Reacción de la Polimerasa-PCR (Microbial, 2009) El ADN se encuentra en el interior del núcleo celular, disperso y muy replegado, unido a proteínas para formar la cromatina. Para extraerlo es necesario homogeneizar el tejido y romper las células para separar el núcleo, romper éste para liberar el ADN, separarlo de las proteínas y precipitarlo para extraerlo de la solución. Aparecerá como un agregado de fibras blanquecinas que se adhieren a la varilla de vidrio. Por último, se puede situar sobre un porta, teñirlo con un colorante básico y observarlo al microscopio (http://platea.pntic.mec. (http://platea.pntic.mec.es/~cmarti3/bi es/~cmarti3/bio/ADN/adn/adn.pdf). o/ADN/adn/adn.pdf). Objetivo
Extraer el ADN de tejidos animales y vegetales Materiales y Métodos Materiales y equipos
Tejido animal (hígado de pollo), vegetal (plátano maduro), 1 piña Mortero o batidora Licuadora Tenedor (limpio) Embudo Trozo de tela para filtrar (limpia) (limpia) Arena fina y lavada (si se usa mortero) Probeta Pipetas Varilla de vidrio Vaso de precipitados Matraz Erlenmeyer Pipeta Pasteur Alcohol 96º (congelar mínimo 3 horas antes del desarrollo de los experimentos) Agua destilada Solución de NaCl 2M Detergente tipo lavavajillas Papel filtro Microscopio Refrigerador Balanza Termómetro Soporte universal (para embudo) Bandeja Hielo
Metodología Experimento N° 1 Extracción de ADN de Hígado de pollo
1. 2. 3. 4.
Triturar en frío la muestra de hígado en el mortero junto con arena o mediante la batidora. Añadir 50 ml de agua y remover suavemente pero mezclando a fondo. Filtrar varias veces el resultado resultado a través de un pedazo de tela Añadir al filtrado resultante un volumen igual de solución de NaCl 2M.
5. Añadir ahora 1 ml de detergente (tipo Mistol o Woolite) y remover suavemente, mezclando bien pero evitando que se forme espuma. Repetir la mezcla varias veces dejando reposar un minuto cada vez. Si se forma espuma se puede retirar con un esquina de papel de filtro o con un cuentagotas. 6. Ahora se añaden unos 50 ml de alcohol muy frío ladeando el tubo o vaso de precipitados y dejando resbalar muy lentamente el alcohol por la pared de aquel para formar una capa sobre la solución anterior. Es muy importante evitar que se mezclen ambas soluciones, pues en la interfase precipitará el ADN. 7. El ADN irá apareciendo poco a poco en la interfase agua-alcohol en forma de grumos blancos. Se favorece la precipitación y recolección si se va recogiendo mediante la varilla de vidrio, u otro instrumento similar, introduciéndola ligeramente bajo la interfase y haciéndola girar suavemente mientras se extrae. Así se irán pegando en la varilla unas hebras blancas que corresponden a miles de fibras de ADN. 8. Se puede ahora tomar una muestra del ADN recogido, depositarla sobre un porta y teñir con azul de metileno durante 1 a 3 minutos. Tras limpiar bien el porta, se observa al microscopio. 9. Otra posibilidad es conservar el ADN obtenido por uno de los siguientes métodos: - En un frasco bien cerrado con alcohol etílico al 50% o 70%. - Dejándolo secar al aire extendido sobre papel de filtro. Experimento N° 2 Extracción de ADN de Plátano maduro
Con la ayuda de un cuchillo cortar unos 100g de plátano y lo trocear hasta obtener porciones muy pequeñas. Luego aplastar todos los trozos con un tenedor para formar una pasta más o menos homogénea. Depositar esta pasta en un vaso de precipitado. 2. Preparación de la solución de extracción: Pesar 3g de sal. En una probeta adicionar 100 ml de agua destilada y 10ml de jabón líquido (para lavar platos). Mezclar todo en un Erlenmeyer procurando no formar burbujas. 3. Detergente + plátano: Verter el detergente en el vaso de precipitado que contiene el plátano y mezclar todo procurando de no hacer burbujas. 4. Baño caliente: Poner agua a calentar y con un termómetro medir la temperatura hasta 60ºC (o utilizar baño María). Luego introducir el vaso de precipitado con la mezcla (en el agua caliente) y con una vara agitadora, mover ligeramente por 15 minutos (no hacer burbujas). Mantener la temperatura en 60ºC. 5. Baño frio: Preparar un recipiente con agua y hielo e introducir el vaso de precipitado. Dejar en el baño de agua helada por 5 minutos removiendo ligera y constantemente. 6. Preparación del zumo de piña: Trocear una piña y triturar la parte central o corazón en la batidora (licuar). Filtrar la pasta con un colador para obtener el zumo. 7. Filtración de la solución: Preparamos un Erlenmeyer con un colador encima y vertemos el contenido del vaso de precipitado (muestra del paso 5). A continuación preparar un embudo con un papel de filtro encima y verter la solución obtenida anteriormente recogiendo el líquido en un tubo de ensayo. Este segundo proceso puede tardar unos minutos. 8. Solución + zumo de piña: Con una pipeta Pasteur cogemos 1ml de zumo de piña y añadir a 5ml del extracto en un tubo de ensayo. Dejar que actúe el zumo en la solución de 2 o 3 minutos. 9. Solución + alcohol: Sacar el alcohol del congelador y transferir en un tubo de ensayo aproximadamente el mismo volumen de alcohol que de la solución de interés (volumen obtenido en el paso 8). 10. Observación del DNA: Verter muy lentamente el alcohol en el tubo de ensayo con la solución. Luego de pocos segundos se podrá observar tres capas bien diferenciadas. Encima de todo estará el alcohol, debajo de todo estarán los restos celulares (membranas, orgánulos) del plátano y los otros componentes de la solución y, en la interfase se observará una especie de hilos blancos rodeados de burbujas, es el ADN. 1. Trituración del plátano:
Resultados y Discusión
Anotar y /o tomar fotografías a los resultados obtenidos y discutir, comparando con la bibliografía Conclusión Recomendación Referencias
Martínez Martín Laura. 2015. EXTRACCIÓN DE DNA Experimento con reactivos de la vida cotidiana. Recuperado de: http://genetica.uab.cat/base/documents/genetica_gen/Laura%20Mart%C3%ADnez%20Mart%C3%ADn2015_ 4_19P21_19.pdf Microbial 2009. La extracción y purificación del ADN para el análisis por PCR. Mitos y realidades. Recuperado de: http://www.microbial-systems.com/web/docs/Newsletter_Microbial_03.pdf http://platea.pntic.mec.es/~cmarti3/bio/ADN/adn/adn.pdf
