Extraccion y Electroforesis Del ADN en Hongos

UFPS, Facultad de ciencias agrarias y del ambiente, Ingeniería Biotecnológica, Biología Molecular, 2013

Informe IV

Extracción y purificación del ADN de hongos Nayeli Alejandra Jaimes Jaimes (1610629), Yeily Adriana Rangel basto (1610620) e Ismael Enrique Garcia Ochoa (1610624).

INTRODUCCION La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primara etapa de la mayoría de los estudios de biología molecular y de todas las técnicas de recombinación de ADN. En este caso, los métodos de extracción permiten obtener ácidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para después realizar análisis específicos de modificaciones genéticas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza de los ácidos nucleicos son dos de los elementos más importantes en ese tipo de análisis. Si se desea obtener ácidos nucleicos muy purificados, que no contengan contaminantes inhibidores, es preciso aplicar métodos de extracción adecuados. Un punto clave en la extracción de ADN de buena calidad del micelio de hongos fitopatógenos es el crecimiento óptimo del micelio sobre un medio de cultivo. Se utiliza, generalmente, este tipo de tejido del hongo porque tiene un crecimiento más homogéneo que otros tejidos del hongo. Las esporas, por ejemplo, son más difíciles de procesar que el micelio, porque son estructuras muy rígidas que requieren protocolos de extracción especiales; además, pertenecen, por su formación, a la etapa madura o senescente del crecimiento del hongo. Para lograr un buen crecimiento del micelio de un hongo es necesario aplicar las buenas prácticas microbiológicas (BPM), entre ellas las siguientes: esterilidad, identificación correcta de las muestras y cultivo del hongo en la fase exponencial de crecimiento. La electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucléicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño van a emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa. Y si el dicha electroforesis se aplican marcadores de peso molecular (en éste caso del fago λ) se

puede conocer el tamaño aproximando del ADN de estudio (Padilla et. al., 2005).

OBJETIVOS 

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Conocer los fundamentos de la extracción y purificación del ADN genómico a partir de moniliophthora roreri o o fusarium sp. como modelo. Describir y explicar cada una de las etapas del protocolo y definir la importancia importanci a de cada uno de los reactivos en las diferentes etapas. Conocer los principios básicos para la extracción de del material genético de un microorganismo. Visualizar el material genético extraído extraído con el uso de herramientas básicas de biología molecular.

Informe de laboratorio. Profesora Liliana Yaneth Suarez Contreras.

Jaimes Jaimes, Rangel Basto, Garcia Ochoa.

MATERIALES Y MÉTODOS Materiales

Reactivos

Equipos

2 microtubos de 2ml 2 microtubos de 1ml 1 caja de petri estéril 1 asa microbiológica Pistilos Bisturí de disección Puntas o tips

Buffer de extracción Fenol/cloroformo Isopropanol Etanol TE 1X

Incubadora Centrifuga Vortex Rotor Micropipetas

EXTRACCION DE ADN Añadir 0.5 a 2.0 gr de micelio de hongo crecido previamente a 28ºC por 8 a 12 días en caldo papa dextrosa en un microtubo de 2ml

Adicionar un volumen de 500 µl de buffer de extracción; macerar la muestra con el buffer de extracción

Agitar en vortex por un minuto y centrifugar a 6000 rpm/10 minutos

Sacar el sobrenadante a un tubo Eppendorf de 1 mililitro e incubar a 70ºC por 15 minutos

Extracción y purificación del ADN de hongos Separación de ADN por electroforesis horizontal en geles de agarosa

Jaimes Jaimes, Rangel Basto, Garcia Ochoa. PURIFICACION DEL ADN Adicionar un volumen de fenol/cloroformo de (1:1) y llevar a centrifugar a 10000 rpm durante 10 minutos

Transferir la fase acuosa a otro microtubo y agregar un volumen de isopropanol o etanol

Llevar a 0ºC por 10 minuto; centrifugar a 10000 rpm durante 10 minutos

Adicionar un volumen de etanol y centrifugar a 10000 rmp durante 10 minutos

Descartar el etanol por inmersión, así mismo secar el precipitado a 37ºC y resuspender a 50 ml de TE VISUALIZAR EL ADN Electroforesis en gel de agarosa al 0.7-1.0% de o.5 a 5 voltios por centímetro entre los electrodos por 20 minutos

RESULTADOS PRIMERA ELECTROFORESIS El protocolo usado en la práctica fue de gran precisión, al final de la prueba se obtuvo ADN de hongo sobre la superficie de cada uno de los tubos; cada uno de los reactivos fue punto clave para la extracción, purificación del ADN, siendo los reactivos más relevantes buffer de extracción, fenol/cloroformo y etanol. Era de vital importancia el trabajo realizado con la micropipeta pues con ayuda de esta sacábamos las fases que eran de nuestro interés. Ya terminado el protocolo pudimos darnos cuenta que el ADN aislado se podía observar en el interior del tubo, para el caso de moniliophthora roreri se obtuvo el ADN de color traslucido adherido a las paredes del microtubo y en fusarium sp. el ADN se precipito al fondo del tubo formando un botón de color purpura. Se realizó el procedimiento debidamente enunciado en la guía de laboratorio siguiendo todas las indicaciones y normas de precaución, las cuales son importantes ya que ciertas sustancias utilizadas en electroforesis como lo es el bromuro de etidio son mutagénicos y debe evitarse su contacto con la piel y aspirar sus vapores. A continuación se muestra un esquema general del proceso llevado a cabo.



Una vez realizado el procedimiento, se llevó a cabo la visualización del ADN donde se observó específicamente ADN del hongo fusarium, ya que no se tuvo éxito con la visualización de la información genética de Monilia, lo cual se puede observar con más precisión en la figura a continuación:


Jaimes Jaimes, Rangel Basto, Garcia Ochoa. SEGUNDA ELECTROFERESIS A continuación se presentan los resultados de la segunda electroforesis realizada, en la cual se observa que fue un poco el ADN que se logra visualizar, esto debido a que en el momento de realizar la práctica se cometió un error al olvidar aregar el bromuro de etidio al gel de agarosa, sin embargo después se dispuso el gel en una solución que contenía dicho compuesto para provocar una absorción y asi una posterior visualización del ADN. Una vez colocado el gel en tras iluminador solo se logra observar ADN en las bandas numero 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, y 12, las cuales corresponden a los microorganismos fusarium sp, y monilia sp, en la siguiente imagen se observa el tipo de organismo correspondiente a cada banda, por otro lado las dos bandas que mayor luminiscencia presenta es la 6 y la 9 correspondiente a fusarium y monilia respectivamente.

DISCUSIONES

CONCLUSIONES

CUESTIONARIO EXTRACCION Y PURIFICION DEL ADN DE HONGOS 1. ¿Cuál es la diferencia entre ADN genómico y ADN Cromosómico? Extracción y purificación del ADN de hongos Separación de ADN por electroforesis horizontal en geles de agarosa

Jaimes Jaimes, Rangel Basto, Garcia Ochoa. ADN Cromosómico, ADN de los cromosomas de los organismos y el ADN genómico, ADN cromosómico nuclear que ha sido aislado directamente de células o tejidos. 2. ¿Qué son las nucleasas? El DNA es el depositario y transmisor de la información genética organizada en genes que codifican productos génicos (proteínas o ARNs). Las nucleasas son enzimas que producen la rotura de los enlaces fosfodiester de la cadena polinucleotídica de los ácidos nucleicos. La vida media para el enlace fosfodiester en el DNA a pH 7 y 24 ˚C se ha estimado en 130.000 años.

En las mismas condiciones, la vida media del ARN es de solamente 4 años. Las nucleasas son enzimas hidrolasa del tipo esterasa que degradan ácidos nucleicos. Las fosfodiesterasas o nucleasas son enzimas hidrolasas que catalizan la ruptura de los enlaces fosfodiéster, como por ejemplo los que se establecen en los ácidos nucleicos entre la pentosa de un nucleótido y el grupo fosfato de otro. Su acción regula la concentración dentro de las células del AMP cíclico y del GMP cíclico. Están descriptas 5 isoenzimas. En la actualidad hay fármacos usados como inhibidores de las fosfodiesterasas (cafeína, aminofilina, sildenafilo, etc.). Se clasifican según el tipo de ácido nucleico y el tipo de enlace que hidrolizan. 3. ¿Qué son lisozima y mutanolisina? La lisozima es una enzima presente en las lágrimas y la saliva en donde actúa como una barrera frente a las infecciones. También es muy abundante en la clara del huevo, de donde se extrae para su uso industrial, en particular para el control de las bacterias lácticas en los vinos. La lisozima fue descubierta por Fleming, el mismo que descubrió la penicilina. Además de encontrarse en la saliva y en las lágrimas, la lisozima está presente en el bazo, los pulmones, los leucocitos, el plasma, la leche y el cartílago. La deficiencia en lisozima, debida a mutaciones en el gen LYZ situado en el cromosoma 12, ha sido asociada a displasias esqueléticas y a un aumento de la propensión a las infecciones. Su acción catalítica consiste en la rotura del enlace glicosídico 1-4 característico de los peptidoglicanos bacterianos, cuyo disacárido constitutivo es N-acetil glucosamina-N-acetil murámico. La lisozima es activa sobre todo frente a las bacterias gram-positivas, siendo menor su actividad frenta a las bacterias gram-negativas. La mutanolisina es una enzima especifica gram positiva que hidroliza componentes de la pared celualar. 4. ¿Qué papel juega cada uno de los reactivos utilizados en el proceso de extracción y purificación? Buffer de extracción: El cual tiene la función de disolver la bicapa lipídica así como proteger al

ADN de la acción de enzimas nucleasas por acción del EDTA contenida en dicha solución que captura los iones magnesio y no permiten que actúen como cofactores de las nucleasas. Las altas concentraciones de NaCl se emplean para prevenir la contaminación de la muestra con polisacáridos que afectan la pureza del ADN, pudiendo inhibir la actividad de algunas enzimas como polimerasas, ligasas y endonucleasas de restricción; la base para la separación de los polisacáridos de los ácidos nucleicos, es su solubilidad diferencial en presencia de las altas concentraciones de NaCl los polisacáridos precipitan bajo la acción de fuerzas centrifugas. Extracción y purificación del ADN de hongos Separación de ADN por electroforesis horizontal en geles de agarosa

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Jaimes Jaimes, Rangel Basto, Garcia Ochoa. Tris, tris (hidroximetil) aminometano (C4H11NO3; Mr = 121,14). Se utiliza como amortiguador porque es una sustancia inocua para la mayor parte de las proteínas. Su pka es 8,3 a 20 °C, lo que lo convierte en un amortiguador idóneo para el intervalo de pH entre 7 y 9. Dodecilsulfato sódico(SDS) (C12H25NaO4S; Mr = 288,38). Es el agente disociador más habitual para desnaturalizar proteínas nativas en sus polipéptidos individuales. Cuando se calienta brevemente una mezcla de proteínas a 100 °C en presencia de SDS, el detergente que cubre el polipéptido alrededor de su eje central, manteniéndolo desplegado. En este proceso, las cargas intrínsecas del polipéptido son despreciables en comparación por las aportadas por el SDS. De este modo los polipéptidos se transforman después del tratamiento en estructuras con forma de bastón que poseen una densidad de carga uniforme en toda su longitud. La movilidad de estas proteínas es una función aproximadamente lineal del logaritmo de su masa molecular. NaCl. Con el NaCl conseguimos producir el estallido de los núcleos para que queden libres las fibras de cromatina.

Fenol cloroformo isoamilico: la mezcla nos sirve para aislar proteínas 

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Isopropanol: Disminuye la solubilidad del DNA para que pueda precipitar de la solución. Puesto que las moléculas de la DNA son iónicas, debido a los grupos fosfatos, son altamente solubles en agua pero no soluble en solventes orgánicos. El isopropanol es de uso general precipitar ácidos nucleicos de soluciones acuosas. Cloroformo. El cloroformo (o más usualmente fenol) es un desnaturalizador activo de proteínas que suprime la solubilidad de las proteínas en la preparación y las precipita. Puesto que el fenol y la solución salina amortiguadora no se mezclan, solo se requiere centrifugar la suspensión para separar las bases, permaneciendo el DNA (y el RNA) en la solución dentro de la fase acuosa de arriba y la proteína presente como un precipitado concentrado en la interfase. Fenol. Nos ayuda a lisar la membrana celular, vuelve más fluida la membrana.

Solución de etanol: etanol se utiliza para precipitar la solución del ADN y para retirar sales Buffer TE: protege al ADN de la degradación.

5. Describa cual es el objeto de cada una de las siguientes etapas: Macerado del hongo: La maceración es un proceso de extracción sólido-líquido. El producto

sólido posee una serie de compuestos solubles en el líquido extractante que son los que se pretende extraer. Adición de buffer de extracción: permite la disgregación de la estructura tisular y celular, para

facilitar la salida de los ácidos nucleicos. Adición de fenol/cloroformo: el fenol desnaturaliza las proteínas y componentes celulares, y

el cloroformo permite la separación de fases durante la centrifugación. Precipitación con alcohol : permite la obtención de un acido nucleico listo para ser

almacenado o diluido en la concentración deseada para su análisis. 6. Explique otros métodos de extracción


Jaimes Jaimes, Rangel Basto, Garcia Ochoa. El protocolo de extracción mediante Fenol-cloroformo se describe a continuación: 1. La capa de leucocitos obtenida de un volumen de 10 ml de sangre total, es sometida a lisis por adición de 500 ul Tris-Cl 10 mM- EDTA 5mM pH: 8.0 FRIO. 2. La lisis celular es completada agregando 5 ml de buffer de lisis (LSN). Se mezcla suavemente por inversión. 3. A lo anterior se le adiciona 2.5 ml de Fenol, y se mezcla suavemente por inversión durante 5 min. 4. Agregar 2.5 ml de Cloroformo-Isoamílico 1:24. Mezclar por inversión 5 min. 5. Centrifugar a 3.000 rpm durante 10 min. 6. Obtener el sobrenadante ( DNA ) en un tubo a parte. Adicionar a este sobrenadante 2.5 ml de fenol + 2.5 ml de cloroformo y mezclar por inversión durante 5 min. 7. Centrifugar a 3.000 rpm por 10 min. 8. Repetir los pasos 6 y 7. 9. Hacer una última extracción agregando 2.5 ml de Cloroformo al sobrenadante obtenido. Mezclar suavemente por inversión por 5 min. 10. Centrifugar 10 min a 3.000 rpm. 11. Obtener el sobrenadante y adicionarle 1/10 del volumen en NaCl 5M. 12. Adicionar 2 volumenes de etanol absoluto. EL DNA SE PRECIPITA EN LA INTERFASE. 13. Hilar con pipeta Pasteur estéril (de vidrio) hasta asegurarse que se ha obtenido la totalidad del DNA. 14. Pasar por soluciones de etanol a 90%, 80% y 70% con el fin de retirar el exceso de sales. Dejar secar al aire libre. 15. Resuspender en 700 ul de Tris 10 mM- EDTA 1 mM pH: 8.0. 16. Incubar a 56°C durante 1 hora, mezclando suavemente cada 10 min. Aqui el DNA se desenrrolla y homogeniza en solución. El protocolo de extracción mediante precipitación por sales se describe a continuación: Paso 1. Se añade solución de lisis a la muestra. En este paso es necesario asegurar una lisis celular eficiente, por lo que si la muestra se observa homogénea se puede continuar con el paso siguiente del protocolo; por el contrario, si se observa la presencia de cuerpos celulares en la solución se recomienda una incubación a 37ºC o 65ºC hasta una homogeneización completa de la muestra. En cualquier caso, las muestras son estables en solución de lisis durante al menos 2 años a temperatura ambiente, de modo que el proceso puede pararse en este paso, manteniendo las muestras en oscuridad, y continuar en días posteriores. Paso 2. Si se pretende obtener una muestra libre de ARN se procede a la adición de RNAsa con una incubación a 37ºC de entre 15- 45 min. Este paso no es necesario en muestras de sangre periférica en las que la contaminación por ARN es prácticamente indetectable. Sí que es aconsejable en otro tipo muestras como células, saliva o tejidos. No obstante, la cantidad de RNAsa a añadir es proporcional al tipo y cantidad de muestra de partida, recomendándose seguir las indicaciones del protocolo específico correspondiente para cada tipo de muestra. Paso 3. Se añade una solución salina que permite la precipitación de las proteínas citoplasmáticas y nucleares de la muestra. Se procede a una agitación vigorosa de la muestra (con vórtex) durante 20-30 segundos. A continuación, se lleva a cabo una centrifugación a la velocidad y tiempo necesarios para asegurar la precipitación total de las proteínas. Las proteínas precipitadas se observarán en el fondo del tubo como un botón de color marrón. El sobrenadante debe observarse sin turbidez o presencia de partículas o trazas de color marrón; si no fuese así, debe procederse a una incubación de la muestra durante 5 minutos en hielo repitiendo de nuevo la centrifugación. Extracción y purificación del ADN de hongos Separación de ADN por electroforesis horizontal en geles de agarosa

Jaimes Jaimes, Rangel Basto, Garcia Ochoa. Paso 4. El sobrenadante que contiene el ADN en solución se transfiere a un nuevo tubo con isopropanol. La muestra se mezcla con el isopropanol invirtiendo el tubo suavemente aproximadamente 50 veces. En este paso se puede observar la aparición de la hebra de ADN. No obstante, la observación de esta hebra va a depender de la cantidad de muestra de ADN procesada. Paso 5. Se procede a la centrifugación de la muestra para precipitar el ADN en el fondo del tubo. El ADN se observará como un precipitado de color blanquecino. Paso 6. Con mucho cuidado, se elimina el sobrenadante por decantación y el tubo con el precipitado de ADN se coloca invertido sobre una hoja limpia de papel absorbente para eliminar al máximo el remanente de isopropanol. Paso 7. Se añade Etanol al 70%, se tapa el tubo y se invierte con suavidad varias veces para lavar el precipitado de ADN. Paso. 8. La muestra se centrifuga y el etanol se elimina por decantación o extracción mediante punta de pipeta (con mucho cuidado puesto que el ADN puede despegarse del fondo del tubo). Debemos asegurarnos de que el precipitado de ADN sigue observándose en el fondo o en las paredes del tubo. Paso 9. El exceso de etanol se elimina mediante inversión del tubo sobre una hoja limpia de papel absorbente o dejando secar el tubo al aire durante unos minutos hasta que no se observen restos de etanol. No obstante, es importante evitar que el precipitado quede demasiado seco porque de este modo se dificulta su posterior resuspensión. Paso 10. Se procede a la hidratación del ADN con una solución tamponada adecuada, o bien con tampón TE (Tris HCl 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM) o agua estéril. Paso 11. Se recomienda realizar una incubación durante aproximadamente 1 hora a 65ºC para facilitar la resuspensión del ADN. Tras esta incubación, el ADN en solución se deja agitando a temperatura ambiente hasta que se comprueba con punta de pipeta que el ADN se encuentra completamente resuspendido, sin presencia de grumos o restos viscosos en la solución. Nota: las cantidades de las diferentes soluciones utilizadas en este protocolo pueden variar dependiendo del tipo y cantidad de muestra de partida. Dado que se utilizan diferentes kits basados en el método de precipitación por sales se recomienda seguir las instrucciones específicas de cada kit respecto a cantidades de reactivos, los tiempos de incubación así como los tiempos y velocidades de centrifugación indicados de forma específica para cada tipo de muestra. El protocolo de extracción mediante chelex se describe a continuación: 1. Coger de la nevera tubos de 1,5 mL con 300 µL de 10% Chelex(5). Se coge 1 tubo por muestra. 2. Añadir 50 µL de cultivo (o un poco de cultivo en agar) al tubo correspondiente. 3. Agitar en el vórtex durante 10-15 seg. 4. Incubar los tubos a 95ºC durante 30 min (con agitación) 5. Agitar en el vórtex durante 10-15 seg (cuidado porque las tapas de los tubos de 1,5 mL se pueden abrir). 6. Centrifugar 5 min a alta velocidad (>10.000 rpm). 7. El ADN está en el sobrenadante. Pasar el sobrenadante para otro tubo de 1,5 mL (no coger el Chelex porque es inhibidor de la PCR). Extracción y purificación del ADN de hongos Separación de ADN por electroforesis horizontal en geles de agarosa

Jaimes Jaimes, Rangel Basto, Garcia Ochoa. 8. Purificar el sobrenadante. Nuestra experiencia con el Real Clean Spin kit (REAL, Durviz S.L.U., Valencia, Spain) ha dado resultados satisfactorios aunque puede servir otro método o kit de purificación. 9. Congelar a -20ºC. 10. Coger 1-2 µL para la PCR SEPARACION DE ADN POR ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA 1. Qué función cumple el buffer de carga y que otros colorantes se utilizan como buffers de carga? Es un buffer contiene sucrosa o glicerol, lo cual da peso a la muestra para que el DNA se precipite al fondo de los pozos de siembra y los frentes de migración o colorantes azul de bromofenol y cylenxyanol, permiten identificar el frente de corrido. Se usan marcadores de peso molecular para tener una referencia del tamaño de los fragmentos por separar e identificar. 

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Otros colorantes: naranja de acridina Verde de bromocresol azul brillante de coomassie (Para proteínas) Fat red 7b Ponceaus

2. Que otras macromoléculas se pueden separar por electroforesis en gel? Y que polímero se utiliza para cada una. Muchas macromoléculas biológicas importantes como los aminoácidos, los péptidos, las proteínas, los nucleótidos, ya que poseen grupos ionizables y, a un pH determinado, existen en solución como especies cargadas eléctricamente, sean cationes (+) o aniones (-). Según la naturaleza de la carga neta, las partículas cargadas migrarán hacia el cátodo o hacia el ánodo. Proteinas: acrilamida Fluidos biológicos: acetato de celulosa Aminoácidos: geles de agarosa o almidón 3. Consulte los tipos de electroforesis que existen y sus aplicaciones Extracción y purificación del ADN de hongos Separación de ADN por electroforesis horizontal en geles de agarosa


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Electroforesis de frente móvil o libre Electroforesis de zona: Electroforesis en papel Electroforesis en gel

Existe una gran variedad de tipos de electroforesis en gel, que se pueden agrupar en dos categorías: a) Electroforesis en gel en una dimensión (continuo o discontinuo)

○ Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) ○ PAGE en condiciones desnaturalizante ○ PAGE en condiciones no desnaturalizantes ○ SDS – PAGE ○ Isoelectroenfoque ○ Electroforesis en campos pulsantes b) Electroforesis en gel en dos dimensiones (bidimensional)

Electroforesis capilar Electroforesis capilar de zona (CZE) Electroforesis capilar en gel (CGE) Isotacoforesis capilar (CITP) Isoelectroenfoque capilar (CIEF) Cromatografía electrocinética capilar micelar (MEKC) Ahora centraremos en las más importantes: Electroforesis de frente móvil o libre Las sustancias a separar se introducen en un tubo en forma de U, disueltas en un tampón de pH y fuerza iónica adecuados. Se colocan dos electrodos en sendos brazos del dispositivo, entre los que se crea un campo eléctrico, provocando que las moléculas de proteína cargadas emigren hacia los electrodos de polaridad opuesta. Las diferentes proteínas se desplazan a velocidades diferentes de acuerdo con sus cargas y coeficientes de fricción respectivos, formándose nubes (o frentes) que se desplazan en la disolución tampón. Electroforesis de zona En esta técnica, la muestra está obligada a desplazarse sobre un soporte sólido de papel, celulosa o gel. La pequeña cantidad necesaria de muestra permite que las moléculas migren en discretas zonas o bandas. La electroforesis zonal de biomoléculas cargadas, generalmente se lleva a cabo en una disolución estabilizada con un medio que sirve de soporte. Electroforesis en papel La muestra se aplica sobre una tira de papel de filtro humedecido con una 2 disolución tampón, bien en el centro o en cualquiera de los extremos del papel, dependiendo de las sustancias a separar y del pH del tampón. Los extremos de la tira se sumergen en dos recipientes separados que contienen la disolución tampón y en los que se hallan colocados los electrodos. Extracción y purificación del ADN de hongos Separación de ADN por electroforesis horizontal en geles de agarosa

Jaimes Jaimes, Rangel Basto, Garcia Ochoa. Electroforesis en gel Un gel es un estado intermedio entre el sólido y el líquido. Este tipo de electroforesis se halla entre los métodos más resolutivos y convenientes empleados en la separación de macromoléculas. Los geles de uso más generalizado son: poliacrilamida y agarosa. Éstos poseen poros de diferentes dimensiones moleculares que delimitan la velocidad de traslado y moléculas trasladadas durante el proceso electroforético. De esta forma, la separación no se produce sólo por las diferentes cargas de las moléculas, sino también por las diferencias de tamaño. Los geles están formados por un reticulado de polímeros (constituyendo una red enmarañada) y el líquido intersticial en el que se encuentrainmerso esta red. Existe una gran variedad de tipos de electroforesis en gel, que se pueden agrupar en dos categorías: 

ƒ Electroforesis en gel en una dimensión (continuo o discontinuo)

o PAGE-nativa o SDS-PAGE o Isoelectro enfoque 

ƒ Electroforesis en gel en dos dimesiones (bidimensional)

Según las aplicaciones u objetivos que se pretendan conseguir en una práctica o experimento, se utilizará un tipo u otro de electroforesis en gel. Los geles discontinuos mejoran la resolución de la electroforesis pues se consigue agudizar las bandas en gran medida por el uso de esta técnica conocida como electroforesis a pH discontinuo que precisa de dos geles y dos tampones diferentes. La PAGE-nativa se utiliza para separar proteínas en condiciones no desnaturalizantes, por tanto, en función de la carga intrínseca de las mismas. La SDS-PAGE es muy útil para calcular el peso molecular de una proteína concreta ya que separa las proteínas según su tamaño. El isoelectroenfoque es un tipo de PAGE en una dimensión que se basa en la separación de moléculas de acuerdo a sus diferentes puntos isoeléctricos. La electroforesis en gel en dos dimensiones combina el isoelectro enfoque (primera dimensión) con la SDS-PAGE (segunda dimensión). Es una técnica muy resolutiva, y el mejor método analítico para separar proteínas que existe hoy en día. Electroforesis capilar Aunque la electroforesis en gel en sus diversas formas resulta un método común y efectivo para la separación de moléculas, el proceso de separación puede durar varias horas, siendo difícil de cuantificar y automatizar. La técnica aquí presentada se lleva a cabo en el interior de tubos capilares (1 –10 µm de diámetro). Estos capilares disipan el calor rápidamente permitiendo la aplicación de campos eléctricos elevados, reduciendo así los tiempos de separación. 4. ¿Qué tipo de marcadores moleculares existen y son de interés? Basados en proteínas Extracción y purificación del ADN de hongos Separación de ADN por electroforesis horizontal en geles de agarosa

Jaimes Jaimes, Rangel Basto, Garcia Ochoa. 

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isoenzimas proteínas de reserva

Basados en el ADN 

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RFLP (o Polimorfismo en la longitud de fragmentos de restricción) AFLP (o Amplified fragment length polymorphism) RAPD (o Random amplification of polymorphic DNA) VNTR (o Número variable de repeticiones en tándem) Microsatélites, SSR o STR SNP (o Single nucleotide polymorphism) SFP (o Single feature polymorphism) TRAPs (o Polimorfismos para la amplificación de regiones blanco) 5. El voltaje sugerido para la electroforesis en gel de agarosa es de 1 a 5 V/cm. Explique a que se refiere esa relación.

Voltaje aplicado. Con voltajes bajos, la velocidad de migración de los fragmentos de ADN es proporcional al voltaje aplicado. Sin embargo, el intervalo efectivo de separación disminuye al incrementarse el voltaje, por lo que no debe de aplicarse más de 5 u 8 V/cm.

WEBGRAFÍA http://ciat.cgiar.org/wp-content/uploads/2013/04/guia_practica9.pdf http://farmupibi.blogspot.com/2011/12/obtencion-de-dna-genomico-de-hongos.html http://www.iqb.es/cbasicas/farma/farma04/l039.htm http://www.javeriana.edu.co/Genetica/PDFDOC/030315.pdf http://www.redbiobancos.es/pages/docs/Protocolos__extracci%C3%B3n_ADN.pdf http://bangen-pct.org/descargables/procedimientos_protocolos_geneticos.pdf


Extraccion y Electroforesis Del ADN en Hongos

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