ФАРМАКОЛОГИЈА КАРДИОВАСКУЛАРНОГ СИСТЕМА проф. др Слободан Јанковић Катедра за фармакологију и токсикологију Медицински факултет у КрагујевцуFull description
Opšta farmakologija skripta - dopunjeno izdanje stare skripte Novi Sad, medicinski fakultet
For 3rd year medicine_ farmacology
This is an article on Colour therapy in Hindi from my website www.anandlife.com. Please do visit us for more :)Full description
bảng giá rạng đông
Rang Moyen Et AnterioriteDescription complète
Full description
Full description
"Rubaie" a kind of poetry in Urdu, Arabic and Persian, which consists of fours verses, a poet has to describe his subject in four verses. This book is collection of "Rubaiyat" (parular of "R…Full description
Stereoplay Rang & Namen 1978-2003Full description
Full description
••
la Prvo srpsko izdanje
Peto izdanje
Prvo srpsko izdanj6
l
Humphrey P.
Rangc~IB BS MA DPhli FMedScl FRS
Senior Research Associate, Novartis Institute for Medical Sciences, London; Emeritus Professor of Pharmacology, University College, London
Maureen M. Dale MBBChPhD Senior Teaching Fellow, Department of Pharmacology, University of Oxford; Honorary Lecturer, Department of Pharmacology, University College, London
James Mi Ritter MADPhilFRCPFMedScl Professor of Clinical Pharmacology, The Guy's, King's College and St Thomas' Hospitals' Medical and Dental School, King's College, London
Philip K. Moore BSc PhD Professor of Pharmacology, National University of Singapore
Ilustracije
Peter Lamb Urednik srpskog izdanja
Dr Zoran Todorovic Vanredni profesor farmakologije I toksikologlJe, Instltut za farmakologiju, klinlcku farmakologiju i tokslkologlju, Medicinskl fakultet, Univerzltet u Beogradu
FARMAKOLOGIJA Prevod sa engles~og ie.: ka petog I,donia knlige
PHARMACOLOGY Cooyrlght Science Llm~ed, Ali rights rsse!Vsd,
1991,1995,1999,2003
Izdavac
dOMno'VI Beograd www.datastatus.co.vu tel/fax: 011 311 4552 Izvrsnllzdavac IP NAUKA, Beograd
(
,
Zalzdava6a PREDRAG DURKOVIC, DIPL. ING.
Za Izvrsnog izdavaca NIKOLA DONCEV
Urednlk PROF. DR lORAN TODOROVIC
Lektor MiUJANA JELOVAC
Tehnlckl urednlk VOJISLAV NESTOROVIC
Kompjuterska oOrada VLADIMIR NESKOVIC
Obrade /Iustracga SRflAN BOJINOVIC
Stampa SP PRINT, Novl Sad Tirol:
1000 prlmeraka Beograd 2005 ISBN 86·7478·006·3 No port of this pUblicalk," may be replOduce(t stored in CI relr1eVol system, or t·'Onsmltted In orr( form Of
meanS. electronic, mechanlCal, photocopy
ing, recording or oft'.erwtse, withOut elli1ef!hie prior permisSion of toe publishers or a .cence permitting copying In the Un~ed KlngClom ~,ued by the copy1gr.t licensing Agency, 90 Tofi""oorn Court Road, Londoo WIT tL~ Permissions may be sought dlracl1y from Elsevier', Health SCience, ~igh1s Deportment In Phlladel:>hfo. USA: phone: (+ 1) 215 238 7869, lox: 1+ 1) 215 238 2239, ",-mali: heoithperrr>sslons@elsevler,com. You may also compiete your request oo-line via the e.ev",r Science homepoge [http://www.elsevler.com). by selecting 'Customer SUopOlt' and Ihen 'Obtaining ~. Svo provo ladrlano_ Nl )eClon deo ave knlige "e mele bitl reprodukovar" 'nL",llen, III em~ovan no bllo k", nach: eleKlronsld, mehanl6kl, fotokoplran)em II druglm
vldom, be, piSOne dozvole ildavaeo.
ell' - KmaAOrJ.13au,J.1ja y ny6M1Kau,HjH HapOAHa 6J.16AHOreKa Cp6l-1je, 6eOrpaA
615.03 Farmakologlla I Humphrey P. Rang.. , ret al.l : Hustracije Peter lamb; urednlk srpskog Izdanja Zoran TodorovIc; 5, izd, [Izvornlkaj [[prevellj Draginja Andelkovlc ... et al.]. - 1, srpsko izd, Beograd: Data starus, 2005 (Novi Sad: SP print), XII, 798 str. : llustr, ; 29 cm Prevod dela: Pharmacology. - Tiraz 1,000. Napomene uz tekst, - Blbflografija uz svako poglavlje. - Registar. ISBN 86-7478-008-3 1. PeHr, XeMcppVl n. aJ Cl>apMaKoAorVlja COBISS.SR-ID 119906828
Predgovor
U ovom, petom izdanju, kao i u prethodna cetiri, naS pristup bio je ne same da opisemo dejstvo lekova, vee i da istakne mo mehanizme kojim to dejstvo ostvaruju - na celijskom i molekulskoll1 nivou, gde godje moguce. Terapijska sredstva zastarevaju velikom brzinom a nove supstance se pojavljuju' svake godine. Usvajanje mehanizama delovanja jedne grupe lekova kojoj pripada novi agens obezbeduje dobru osnovu za razumevanje i racionalno koriscenje novog jedi~enja. FarIJlakologija je dinamicna naucna disciplina koja se razvija sopstvenim putem i ciji znacaj prevazilazi osnovne postavke koriscenja lekova u terapiji. Mi smo stoga, gde god je to bilo prikladno, dodali kratak pregled koriMenja lekova kao markem za razjasnjenje 6elijskih i fizioloskih funkcija, cak i kada te supstance nemaju klinicku primenu. Zadrzali smo kratke preglede znacajnih fizioloskih i bio heroijskih procesa, uglavnom na pocetku poglavlja, s ciljem da stvorimo osnove za dalje razmatranje farmakoloskih dej stava. Kao i ranije, u svim poglavljima nalaze se uokvireni tekstovi koji sadrZe kratak izvod kljucnih cinjenica. Svrha uokvirenih tekstova nije da budu sveobuhvatni rezimei, ve6 pre da istaknu farmakoloske informacije koje smo srnatra Ii vliZnim. Cinjenicno znanje u farmakologiji dostize takve razmere i razvija se tako brzo da se studentima velika koB cina inforrnacija moze lako uciniti zatrasujueom; kljucne na pomene treba da olakSaju studentima dostizanje cilja preko sustinskih saznanja u okviru predmeta. Takode, kao i u ce tvrtom izdanju, terapijskoj primeni lekova dato je istaknuto mesto izdvajanjem u lako uocljive «uokvirene tekstove sa klinickim sadrZajem». U ovom izdanju, kao sto ee vee primetiti pronicljiv po smatrac, pdbegli smo zivim bojama. Veeina shema je 08a vreme~ena, sve su preslikanc u boji i rnnoge nove slike su dodate. U sldadu sa dosadasnjom praksom iz ranijih izdanja, koristili smo u shemama, gde godje bilo izvodljivo, pre stvar nc nego izmi~ljene podatke. Kao i pre, isticali smo hemijsku strukturu lekova kada ta infomlacija moze da pomogne u shvatanju njihovog mehanizma dejstva, ali takode smo izo stavljali mnoge strukturne formule koje ne doprinose razume vanju farmakologije u zamenu za sheme koje to cine. Sva poglavlja su osavremenjena i «rezimei» su uneti na pocetku svakog, da bi omogueili citaocu lete6i start na te ~u. Pri unosenju novih 8adrZaja, uzeli smo u obzir ne samo nove agense, vee i nove doprinose bazicnom znanju koje predstavlja osnovu za buduei razvoj lekova. Takode, dati smo kmtak pregled novih terapija koje su jo~ u povoju. Novi pasusi sa {(sitnijim fontom» ukljuceni su u mnoga poglavlja.
Oni sadrZe vise detaIja, a nekada i same pretpostavke. koje uzurbani 9italac moze preskociti bez gubljenja glavne niti, a mogu bit{ qd interesa citaocima koji zele dublje da proniknu u materiju. I u ovom izlaganju, na kraju svakog poglavlja dodali smo prilicno obiman odeljak sa «Referencama i dodatnom Ii teraturom». P.o§to se u programu medicinskihstudija poscb no mesto daje izradi projekata i pripremi posebnih nastl1vnih jedinica, reference su pratene komentarima da bi se istakli ~ihovi najvaZniji aspekti i tako studentimaolaksalo kori~ce ~e ovog poglavlja. Prvi odeljak sada obuhvata novo uvodno poglavlje i dva nova poglavlja 0 ~elijskim mehanizmima na koje deluju mnogi znatajni lekovi opisani u daljem tekstu. U Poglavlju 4 bavimo se mehanizmima ukljucenim u kratkotr~jne reak cije kao sto su ekscitacija, kontrakcija i sekrecija; one su u osnovi brzog dejstva rnnogih lekova kqji uticu na kardiova skulami, nervni, respiratomi i endokrini sistem. U Poglavlju 5 bavimo se eelijskom proliferacijom i apoptozom, odnosno reakcijama koje se desavaju znatno sporije i ukljucene su u fenomene koji se odigravaju u veeoj meri postepeno, kao ~to su inflamacija, imuni odgovor, obnova tkiva i maligniteti, i koje modulisu Iekovi koriSeeni za te poremeeaje. U ovim poglavljima su koncentrisane, osavremenjene i dopunjene informacije koje su ranije bile rasute kroz ceo teks!. Te infor macije Stl namenjene uspostavljanju zajednicke osnove na kojoj pocivaju mnogi, na prvi pogled razliciti efekti lekova, ne samo u tekucoj upotrebi, vee i Iekova u razvoju iIi cijc se stvaranje tek planira. U novom poglavljuo «Otkricu lekovID) dati 81110 pogled na brz napredak u ovoj oblasti, pokrenut novijim saznanjima u molekulamoj biologiji. Ovo poglavlje sadrzi kratak bilans zakonske regulative koja je ukljucena u stavljanje novog le ka u promet. Osim pomenutih novih poglavIja i osavremenjenog tck sta, ovo izdanje sadrZi i sledeee nove informacije: • Koriseenje modela oboljenja, ukljucujuci i modele sa transgenim zivotinjanla, u testiranju lekova (Poglavlje 6). • Uloga urodenog imuniteta i znacaja dye strane adaptiv nog imunog odgovora - nova saznanja koja ee verovat no biti znacajna za budueu farmakoterapiju. • Molekulska kontrola sinteze azot oksida, i znatno vise spomo pitanje transporta i oslobadanja aktivnog azot ok sida od strane eritrocita (Poglavlje 14). • Medijatori poreklom iz endotela, ukljucujuei endotelin i ta janstveni endotelni hiperpolariSuci faktor (Poglavlje 18).
V
• Novija otkrica u lecenju srcane insuficijencije (Poglavlje 17). • Statini - danas veoma znacajni u klinickoj praksi do datno su istaknutj u poglavlju 0 «Aterosklerozi i metabo lizmu lipoproteimm; u Poglavlju 19 razmatraju se mnogi farmakoloski efekti tib lekova koji nisu direktna posledica dejstva na LDL~holesterol i danas su u zizi interesovanja. • Tiazolidindioni (danas siroko koriSeeni u lecenju dijabe tesa), ukljucujuci i njihov mehanizam dejstva preko nu klearnih PPAR-gama receptora (Poglavlje 25).
· ! Poglavlje
0 «Gojaznosti», koje je iznenadilo mnoge u 4. ! izdanju, sada opravdava sv~je mesto pregledom novih ,lekova u terapiji ovog poremecaja. Ocekuje se da usme renje ka «novim lekovima» dovede do stvaranja brojnih tak,vih sredstava - sto ce sa zadovoljstvom Citati osobe koje nisu skIone fizickoj aktivnosti. Osavremenjen je sa driaj posvecen biologiji gojaznosti i ukazano je na cilje ve koji ee usrneriti razvoj novih lekova.
ZAHVALNOST . Zeleli bismo da zahvalimo sledecim saradnicima na pOl11oci i savetima u pripremi ovog izda'1ja, a to su: profesor J. H. Abramson, profesor J. Mandelstam, profesor R. J. P. Willi ams, profesor K. G. H. Duke, dr W. James i zaposleni u Bi blioteci Kraljevskog medidnskog drustva (Royal Society of Medicine). Zeleli bismo da odamo priznanje izdavackom timu Chur chill Livingstone koji su radili na pripremi ovog izdanja: La urence Hunter (odgovomi urednik i siva eminencija), Barba ra Simmons (menadzer koji radi na razvoju projekta), Nancy Amott (rukovodilac projekta), Erik Bigland (dizajner), Jane Ward (honorami urednik izdanja), Peter Lamb (honm-ami ilustrator) i Laurence Errington (honorarni bibliotekar). Do bijanje izdanja u punom koloru trazi vremena, posvecenosti j iskustva, sto je izvedeno spokojno i sa savrSenom efikasnos cu. Barbara Simmons je bila posebno posve6ena resavanju problema koje su postavljali autori sa Ijubaznom, vedrom predusretijivoseu i mi joj dugujemo posebnu zabvalnost.
• Novo poglavlje '0 erektilnoj disfunkciji, koje je preslo put od sarlanatstva do klasicne medicine (Poglavlje 29).
H. P. Rang M. M.Dale 1. M. Ritter P. K. Moore
• Novi pristup u leeenju neurodegenerativnih bolesti (Po glavlje 34). • Nov! podaci 0 interakciji izmedu osteoklasta i osteobla sta; razmatra se i uloga liganda za osteoprotegerin i pro tegerina, kao i potencijalni novi lekovi za osteoporoZll (Poglavlje 32). • Razmatraju 'se brojna nova saznanja 0 patogenezi raka i naglasenje njihov znaCaj u razvoju novih antineoplastic nih lekova. Poglavlje obuhvata ideo posvecen novim lekovima koji su nastali na osnovu tib otkriea, a vee su u klinickoj up'otrebi (Poglavlje 45). • U poglavlju 0 «Antivirusnim lekovima», mogu se naei nove informacije 0 interakciji virusa i organizma doma cina, mehanizmi dejstva ovih lekova, kao i novi pristup u lecenju HIV infekcije. Odeljak 0 «Hemioterapiji infekcija i malignih bolesti» ima novi naziv: «Lekovi koji se koriste u lecenju infekcija i ma lignih bolesti». Prvo poglavlje 0 «Osnovnim principima he mioterapije» daje pregled osnovnih mehanizama dejstva le kova koji su zajednicki i za lekove koji deluju na parazitarne infekcij e i antineoplasticne lekove. Namenj enD je prvenstve no studentimakoji ne studiraju medicinu vee farmakologiju, kojima treba letimican pregled ove problematike, a nemaju dovoljno predznanja iz mikrobiologije, parazitologije i pa tologije malignih oboljenja da bi pratili preostala poglavlja iz odeljka 0 «Selektivnoj toksicnosti». Po~to su ti studenti potvrdili da im ovaj pristup koristi, uvodno poglavlje je zadr tano i osavremenjeno. Zahvalni smo citaocima koji preuzimaju na sebe i tu muku da nam ~alju konstruktivne napomene i sugestije; sve smo dali od sebe da ih usvojimo. Dobrodosli su i komentari vi na novo izdanje.
PREDGOVOR PRVOM SRPSKOM IZDANJU Prvo izdanje na srpskom jeziku populame i rado citane Farmakologije Ranga i saradnika plod je politike izdavaca da predstavi nasoj publici prevode najboijih svetskih nasI 0 va iz domena medicine, kao i svih nasih farmakolo~kih kuca da u tome ucestvuju. Ne bez ponosa, moze se ista6i da su tekstove cesto prevodili iii priredivali najkompetentniji far makolozi i toksikolozi u naS~i zemlji za odgovarajuce obla sti i na tome im posebno hvala. S druge strane, knjiga 6e ispuniti svrhu ako i Citaoci i prevodioci budu jedva cekali slede6e izdanje, prvi da bi se ponovo sreli sa zanimljivim i korisnim tekstom, a drugi i da bi popravili neizbezne greske iz prvog izdanja. Nadamo se da 6e citaod slobodno i rado IJcestvovati u proceni ovog prevoda i slati svoje komentare. Posebno, prevodioci j urednik duboku zahvalnost du guju svim doma6im autorima udZbenika iz farmakologije, klinicke farmakologije i toksikoiogije za redovnu i posle diplomsku nastavu. Da nije osam decenija duge tradicije u stvaranju posebnog, dragocenog jezika struke i nauke, ovaj prevod ne bi ni docekao svetlost dana. Zato, hvala nasim cenjenim uciteljima na hotimicnoj iIi nehoticnoj pomoCi u prevodenju. Nadamo se da ee ova knjiga posluZiti kao inspi racija za pisanje budueih udzbenika iz farmakologije na nasem jeziku.
U Beogradu, januar 2005. god.
Zoran Todorovic
Sadrzaj
OPSTI PRINCIPI (lJ
iTA JE FARMAKOLOGIJA? 2 FarmakologlJa u 20. veku
®
6. METOD I MERENJE U FARMAKOLOGIJI 80
Blolosko Isplflvanje 80
3
KAKO LEKOVI DELUJU: OPSTI PRINCIPI
7
VezivanJe molekula lekova za ceille Desenzltlzaclja I tahifllakslJa 19
7
Modell bolestl na zivotlnjama 84
Kllnicka ispltlvanja 96
Uskladivanje.koristll rlzlka 89
(~) KAKO LEKOVI DELUJU: MOLEKULSKI ASPEKTI 22
.,.
Clljna mesfa delovanja leka 22
ReceptorskJ proteini 26
Jonskl kanall kao cillev! za delovanje leka Kontrola ekspreslle receptora 47
POSEBNE TEME Q INDIVIDUALNE VARIJACIJE I INTERAKCIJE IZME£>U
(~ NEZEUENA DEJSTVA LEKOVA 724
-
Vrste nezelJenlh dejstava lekova Toksicna dejstva lekova 725
DODATAK
INDEX
xii.
724
753
761
ISPRAVKE*
~ GENSKA TERAPIJA
738
Tehnlckiaspekti 739
Bezbednost 743
Terapijski aspektl 743
LEKOVA 712
Utlcaj etnlckog porekla 712
Utica) uzrasta 713
Utica) trudno6e 714
Genetskl faktorl 714
Idiosinkrazija 716
Utlcaj bolest! 71 7
Interakcije Izmedu lekova 718
798
• Tokom ~tampanja knjige primecena je nekolicina gresaka, pa je naknadno dodata ova stranica. Molimo citaoce da uvaze ovu do punu i obrate paznju na navedene ispravke.
@OTKRICEI RAZVOJ LEKOVA 747
\ Pretklinicke studije 747
~linicki razvoj 749
K:
Zakljucak 751
/
I
I
v
Sta Je farmakologija?
U uvodnom poglaviJu objasnleemo kako je farmakoJo gija namla Jkako se razvlJala kao nauena dlsclpllna. Takode. opisaeemo njenu danainJu strukt~u, kao I povezanost sa ostallm blomedlclnsklm naukama. NastaJa strukturo osnovo je organizaclje preostalog dela knjige. Cltoloc koji iurl do stlgne do savremenih farmakoJoiklh einjenica, moZe slobodno dopreskoel ovo poglovlje.
POREKlO I PRETECE
2
Fannakologija se mote definisati kao nauka koja se bavi ispi tivanjem delovanja hemijskih supstanci na zive organizme. Farmakologija kao nau~na disciplina, prvi put se spominje sredinom 19. veka, kao jedna od brojnih, novih biomedicin skih nauka koje su se pojavile u tom izuzetnom periodu i koje su bile zasnovane na principima eksperimentisanja pre nego na dogmi. Davno pre toga - od samog osvita civilizaci je bilo je rasprostranjeno kori~cenje biljnih lekova, pisane su farmakopeje i cvetao je apotekarski zanat Medutim, ute rapiji nije bilo ni traga od nau~nih principa. Cak je i Robert Boyle, koji je postavio osnove hemije kao nauke sredinom 17. veka, bio zadovoljan da u domenu terapije (A Collection of Choice Remedies - Kolekcija odabranih lekova, 1692) preporuci primenu kuvane me~avine crva, balege, urina i mahovine sa lobanje-mrtvog coveka. Podsticaj za fannako logiju potekao je iz potrebe da se pobolj~ ishod terapijske intervencije lekara, koji su tada bili ve~ti u klinickoj opser vaciji i dijagnostici, ali POtpWlO neefikasni kada se prede na le~enje*. Do kasnih godina 19. veka, znanje 0 normal nom i poremecenom funkcionisanju organizma bilo je.suvi ~e nerazvijeno da bi obezbedilo ~ak i najosnovniju bazu za razumevanje delovanja lekova, a istovremeno su se bolest i
smrt smatrali polusvetim stvarima kojima se na odgovaraju 6i nacin bave osobe koje slede princip autoriteta, pre nego naucnedoktrine. Klinicka praksa cesto jepodrazumevala sIc pu poslusnost prema nekom autoritetu, a ignorisala je lako prepoznatljive cinjenice. Na primer, bilo je pOZllllto da kora kininovog drveta predstavlja specifican i efikasan Iek protiv malarije, a Lind je postavio ispravan protokol za njegovu primenu 1765. godine. Medutim, 1804. godine, Johnson je objavio da je njegova primena nesiguma sve dok se telesna temperatura ne smanji, pa je on, umesto toga, preporucivao . primenu velikih doza kalomela u ranim fazama bolesti - ubi stveni savet koji se slepo primenjivao punih 40 godina. Motivacija za fannakologiju proistekla _je iz klinicke prakse, ali ova nauka je mogla da se izgradi sarno oa osnovu pouzdanih temelja u fiziologiji, patologiji i hemiji. To nije bio slucaj sve do 1858. godine, kada je Vrrchowizneo svoju celijsku teoriju. Strukturna formula hemijskogjedinjenja pr vi putje prikazana 1868. godine. Bakterijekao uzrok bolesti otkrio je Paster 1878. god. Prethodno, fannakologija jedva da je imala ~ime da se podupre da bi se uspravila i mi moze mo sarno da se divimo smeloj viziji Rudolfa Buchheima, ko ji je osnovao prvi farmakolollki institut (u svojoj sopstvenoj . kuci) u Estoniji, 1847. godine. U svojim pocecima, pre pojave organske hemije koja se bavi sintezom, farmakologija se bavila iskljucivo proucava njem dejstva prirodnih supstanci, uglavnom biljnih ekstrak tao Rani period razvoja hemije obuhvatao je i izdvajanje ak tivnih sastojaka iz biljaka. Tako je Friedrich SertUmer, mladi nemacki apotekar, izolovao mortin iz opijttma 1805. godine. Zatim je usledilo otkrice niza novih hemijskih supstanci, i mada su njihove hemijske strukture bile nepoznate, te sup stance bile su dokaz da au za njihove efekte na zive organi zme odgovorne hemijske reakcije, a ne neke magijske iii vitalne sile. Prvi farmakolozi najvi~e su se baviU lekovima dobijenim iz biljaka, kao lito su: hinin, digitalis. atropin, efe drin, strihinin i dr. (mnoge se i danas koriste i sa njima cete se bolje upoznati kad zavrllite citanje ove knjige)" • '" Oliver Wendell Holmes, ug1edan lekar, pi~e 1860. godine: 'cvrsto verujem da ce1a Materia medica koja se danas koristi moZe biti ba cena na dno mora, ~to bi bilo najbolje za Cove~tvo, a najgore za ribe' (videti Porter, 1997). "'''' Velild broj sintetskih supstanci primenjivao se pre nego sto je pocela .era hemije koja se bavi sintezom. Etar je prvo pripremljen kao ((slatko uije vitriola» u 16. veku, azotni oksidul je napravio Humphrey Davy 1799. godine i koristio ga je za o1ivljavanje, a
FARMAKOLOGIJA·U 20. VEKU
perioda, ukljueen u trgovinu od 17. veka i koji je stekao uva Zavanje dobijanjem znamenja nauke, eim je to postalo mo guce, sredinom 19. veka. Farmakologija i dalje Una znake svoje pustolovne proslosti, posto je farmaceutska industrija postala veoma unosan posao i veci dec farmakoloskih istra zivanja odvija se u komercijalnim okvirima koji predstavlja ju grublji i pragmaticniji prostor od proplanaka akademskog istraZivanja*. Nijedna druga biomedicinska "ologija" nije ta ko sHena Mamonu (simbolizuje pohlepu - prim. prev.).
Po(\etkom 20. veka, povoljni vetrovi hemije, koja se bavila
sintezom, zapo(\eli su revoluciju u farmaceutskoj industriji,
a time i u farmakolo~koj nauci. Pojavili su se novi sintetski
, lekovi, barbiturati i lokalni anestetici. Nobelovac Paul Ehr
lich (1909. god.) otkrio je da se neka jedinjenja arsena mogu
primeniti u le(\enju sifilisa, (\ime je zapooela era antimikrob
ne terapije. Sledeci uspesi bili su otkrica sulfonamida, prvih
antibakterijskih lekova, koje je otkrio Gerhard Domagk
1935. god. i razvoj penicilina, za vreme Drugog svetskog
rata, kojem su doprineli Chain i Florey, ana bazi ranijih Fle
mingovih radova. Ovih nekoliko dobro poznatih primera pokazuju kako su razvoj sinteticke hemije i ponovno budenje hemije prirod nih proizvoda doveli do dramati(\nog ozivljavanja tempije u prvoj polovini 20. veka. Svaka nova grupa lekova koja se pojavila, pruulaje farmakolozima novi izazov. Moze se re ci da je tada farmakologija stvarno uspostavila svoj identitet i status medu biomedicinskim naukama. Hemija je uglavnom bila pokretac znacajnog pove6ava nja broja terapijskih molekula koji su farmakologe navodili na razmi~ljanje. Ist9vremeno, fiziologija je takode napmvila brz progres, narooito u vezi sa hemijskim medijatorima, 0 kojima ce se kasnije detaljnije govoriti u ovoj knjizi. Mnogi hormoni, neurotransmiteri i medijatori zapaljenja otkriveni su u ovom periodu. Tada je razja~njeno i da hemijska komu nikacija igra centralnu ulogu u skoro'svakom regulatomom mehanizmu koji poseduje na~e telo, ~to je stvorilo veliki pro stor zajednieke osnove izmedu fiziologije i farmakologije; upravo su intenikcije izmedu hemijskih supstanci i zivih si stema bile od pocetka preokupacija farmakologa. Koncept ,,receptora" za hemijske inedijatore uveo je Langley 1905. godine, a ubrzo su ga prihvatili farmakolozi Clark, Gaddum, Schild i ostali. Taj koncept je stalna tema i u savremenoj far makologiji (kao~to 6ete uskoro otkriti kada budete proucili sledeca dva poglavlja). Koncept »receptora« i tehnologije koje su se iz toga razvile, imali su ogroman uticaj na otkrice lekova i terapiju. Biohemija se takode pojavila kao posebna nauka poeetkom 20. veka, a otkrice enzima i skiciranje me tabolickih puteva obezbedili su jo~ jedan okvir za razume vanje dejstva lekova. Slika farmakologije koja se stvara na osnovu ovog kratkog istorijskog pregleda (slika 1.1) predsta vlja predmet koji je nastao od drevne terapije iz prenauenog
Mode.rna medicina se pre svega oslanja na lekove kao najva fuija terapijska sredstva. Ostale metode leeenja, kao sto su hirurgija, dijeta: veibe, itd., takode su vrlo vaZne, ali nijed na od njih nije toliko zastupljena kao terapija zasnovana na lekovima. Pre pojave nauenog pristupa., ueinjeno je vise pokusa ja da se formiraju sistemi leeenja, medutim, runogi od njih davali su gore rezultate nego obieno nadrilekarstvo. Jedna od tih metoda bila je i alopatija, za koju se zalagao James Gregory (1735-1821). Omiljene metode, kao sto je pustanje krvi, izazivanje povraeanja i eiscenje, koristile su se sve dok 'se dominantni simptomi bolesti ne bi povukli. Mnogi paci jenti su umirali zbog takvog tretmana. Zbog toga je Hahne mann,jo~ uranom 19. veku, uveopraksuhomeopatije.Glav ni principi homeopatije su: • sUeno se leei slienim, • dejstvo se moze pojaeati razblaZivanjem. Sistemje brzo skrenuo u apsurd: na primer, Hahnemann je preporucivao primenu lekova u razblaZenju od I: 1060, ~to je ekvivalentno jednom molekulu u oblasti vetiCine or bite Neptuna. Mnogi drugi terapijski sistemi dolazili su i odlazili, a razlieiti dogmatskiprincipi, koji su iz njih proiza~li, uspo ravali su, pre nego ubrzavali napredovanje nauke. Danasnji terapijski sistemi eija osnova lezi van domena naul(e nazi vaju se »altemativna« iii »holisticka« medicina. VeCina ovih sistema odbacuje »medicinski model«, prema kome u osnovi bolesti lezi poreme6aj normalnogfunkcionisanja organizma, koji se moze definisati u biohemijskom iii struk turnom smislu, otkriti objektivnim sredstvima, i promeniti nabolje odgovarajucim hemijskim iii fiziekim intervencija rna. Umesto toga, oni se usmeravaju na subjektivne tegobe
kao anestetik po~eo je da se koristi u 19. veku (Poglavlje 35). Ami!· nitrit je sintetisan 1859. godine, a koristio se u le~enju angine pekto ris (Poglavlje 17). Aspirin, najvise kori~cen lek u istoriji medicine, sintetisan je 1853. godine, ada mu jos nije bila nadena farmako lo§ka primena (Poglavlje 16). Ponovo ga je otkrila llema~ka firma Bayer 1897. godine, kojaje is~ivala manje toksicne derivate sa Iicilne kiseline. Bayer je komercijalizovao aspirin 1899. godine i obogatio se.
• Neki od pionira farmakologije napravili su karijere u fannaceut skoj industriji. Na primer, Henry Dale, kojije postavio osnove na ~eg manja iz neurohumoralne· transmisije i autonomnog nervnog sistema; George Hitchings i Gertrude Elion koji su prvi opisali dejstvo antimetabolita u tempiji karcinoma; James Black, koji je sintetisao prvi p-blokator i anta~onist Hz receptora i za to dobio No belovu nagradu. Nije slucajno da su u ovoj knjizi, kojaje usmerena ka nauenim pril1cipima farmakologije, vecina primera industrijski produkti, a ne prirodne ~upstance.
ALTERNATIVNI TERAPIJSKI PRINCIPI
3
Magicni napicl Biijnllekovl
Apotekari
Prirodni. produkti
r----------. . .
::r Heml)ska
Patol~iia
FormOkOI# FlzIoIogUo
hemi)a - - - - - - - - - .
7
~BIOhemija
Farmaceutska
'",","'j'
1
Sintetski .....' - - - - - - - - - - lakov; Molekularna ...-- blologija -...... °Cl • . I I '" Ii> o,armaceut c
Farmakologqa Bilka 1.1
Razvoj farmakologlje.
koje mogu, ali ne moraju biti u vezi sa bolescu. Napustanje objektivnosti u definisanju i procenjivanju bolesti odgovara slicnom odstupanju od nauc~i,h principa u proceni terapijske efikasnosti, sto ima za rezultat da principi i praksa mogu da dobiju saglasnost, a cia ne zadovolje bilo koji kriterijum va lidnosti koji bi uverio kritiCki nastrojenog naucnika, i koji se mora zadovoljiti po zakonu, pre nego sto se novi lek uvede u terapiju. Javno odobravanje, na zalost, ima malo zajednic kog sa efikasnoS6u koju je mogu6e dokazati.
POJAVA BIOTEHNOLOGIJE
4
Poslednjih godina, pojavila se biotehnologija, kao glavni iz vor novih terapijskih supstanci u obliku antitela, enzima i razlicitih regulatornih proteina, ukljucujuci tu hormone, fak tore rasta i citokine (videti Buckel, 1996). Mada su takvi proizvodi (poznati kao biofarmaceutici), uopste uzevsi, pre proizvodi genetskog inzenjeringa nego sinteticke hemije, farmakoloski principi su u sustini isti kao i za klasicne leko ve. Gledajuci u buducnost, terapije bazirane na genima i ce lijama, madajos u povoju, prenece terapiju u novo podrucje (Poglavlje 51). Principi koji upravljaju sintezom, doprema njem i kontrolom funkcije vestackih gena ubacenih u celije iii celija dobijenih bioinzenjeringom i unetih u organizam, vrlo su razliciti od principa terapije zasnovane na lekovima. Ti novi principi ce zahtevati drukciji konceptualni okvir, a tekstovi kao sto je ovaj, sve ce vise morad da ih obuhvate
ako zele da idu u korak sa modernom medicinskom terapi jom.
FARMAKOLOG1JA DANAS Kao i kod ostalih biomedicinskih disciplina, granice farma kologije nisu ostro odredene niti su nepromenljive. Njeni po bomid su, kao prikladni pragmatici, uvek spremni da zadu na tudu teritoriju iIi preuzmu tehnike drugih disciplina. Ako je farmakologija ikada imala· konceptualno i metodolosko jezgro koje bi mogla nazvati svojim, one je danas skoro sa svim nestalo i predmet se definise svojom namenom - razu meti sta lekovi cine zivim organizmima, i posebno kako se njihovi efekti mogu primeniti u terapiji -pre nego naucnom koherentnoscu. Na slid 1.2 pokazana je struktura farmakologije kao sto danas izgleda. U okviru glavnog predmeta nalaze se brojni odeljci (neurofarmakologija, imunofarmakologija, farmako kinetika itd.) koji predstavljaju pogodne, ako ne i neospome supspecijaInosti. Pomenute teme cine materiju glavnog pred meta ove knjige. Na obodima su neke granicne oblasti koje nisu obuhvacene ovom knjigom, a predstavljaju mostove ka drugim biomedicinskim oblastima. Farmakologija tezi da ima vise od ovih nego od drugih disciplina. Poslednji pred meti koji su se javili u granicnoj oblasti su fannakogenetika, farmakogenomika, farmakoepidemiologija i farmakoekono mija.
Slika 1.2 . Farmakologija danae i njene oblasti. TamnlJom nijansom predstavlJene su farmakologiju sa druglm glavnim biomedicinskim dlsciplinama (svetliJa n!jansa).
Biotehnologija Prvobitno, biotehnologija je bila pro izvodnja lekova iIi drugih korisnih proizvoda bioloskim putem (npr. proizvodnja antibiotika iz mikroorganizama iIi proizvodnja monoklonskih antitela). Sada, u biomedicinskoj sferi, biotehnologija se odnosi uglavnom na upotrebu rekom binantne DNK tehnologije za razlioite primene, ukljuoujuci tu i proizvodnju terapijskih proteina, dijagnostiku, odredi vanje gena, proizvodnju transgenih zivotinja itd. i mnoge nemedicinske primene, kao §to su: poljoprivreda, sudsko vestacenje, ekoloske nauke, itd. Farmakogenetika To je grana nauke koja se bavi utica jem gena na odgovor organizma na lekove. Prvobitno, farma kogenetika je bila usredsredena na idiosinkrazije, kada obo lele osobe pokazuju patoloski izmenjen obiono neteljen odgovor najednu grupu lekova (videti Nebert and Weber, 1990). Ona sada pokriva siroke varijacije u odgovoru na pri menu leka, gde je genetska osnova mnogo kompleksnija. Farmakogenomika Ovaj noviji izraz preklapa se sa fur makogenetikom, opisujuci koriscenje genetickih informaci ja da bi se usmerio izbor farmakoterapije na individualnoj osnovi. VaZna pretpostavkaje da razlike izmedu pojedinaca u njihovom odgovoru na primenu leka mogu da se predvide naosnovu njihovog genetskog sastava. Na osnovu ovogprin cipa, takvo otkrlce, koje specificne genetske varijacije pove zuje sa dobrim iii losim terapijskim odgovorom na odredeni lek, trebalo bi da odredi individualni izbor lecenja na bazi individualnog genotipa. Farmakogenomika je, ubiti, grana
granl~ne
oblasti koje povezuJu
farmakogenetike, sa prilicnom dozom »price«. Sve do sada, ona je predstavljala uglavnom teorijsku disciplinu, ali ako se pokate kao validna. njen uticaj na terapiju ce biti veliki. Farmakoepidemiologija Ovo je grana farmak910gije ko ja izucava delovanje leka na nivou populacije (videti Strom, 1994). Ona se bavi istrativanjem razlibi u dejstvu lekova izmedu pojedinaca u populaciji i izmeau populacija. To je sve vaZniji element za zakonodavnu vlast koja odlucuje da Ii se novi lekovi mogu odobriti za lecenje. Varijabilitet izmedu pojedinaca iIi populacija utice nepovoljno na upotrebu leka, cak i u slucaju da je njegov prosecan efekt zadovoljavajuci. Farmakoepidemioloske studije izucavaju koliko se pacijenti pridrZavaju uputstava za primenu lekova (engl. compliance - komplijansa), kao i neke druge faktore koji se javljaju ka da se lek nade u svakodnevnoj primeni, Farmakoekonomija Ova grana ekonomije u zdravstvu ima zadatak da odredi u ekonomskom smislu tro~kove i ko rist od lekova koji se koriste za lecenje. Nastala jeiz brige mnogih. vlada da obezbede zdravstvenu negu iz poreskog doprinosa, postavljajuCi pitanje koji postupci lecenja su naji splativiji. Taj problem, naravno, otvarajednu drugu, vrlo OS tru kontroverzu, po§to se ova oblast konacno spusta na nivo pitanja koUko kostaju zdravlje i dugoveenost. Kao i kod far makoepidemiologije, zdravstvene vlasti zahtevaju detaljnu ekonomsku analizu, kao i dokaz individualne koristi, kada se donosi odluka 0 davanju dozvole za stavljanje novog leka u promet (videti Drummond et aI., 1997).
5
Buckel P 1996 Recombinant proteins for therapy. Trends Pharmacal Sci 17: 450-456 (PromiSijen preg/ed statusa i perspektjl,la terapijske primene proleina) Drews J1998 In quest oftomorrow's medicines. Springer-Verlag. New York (Odlical1 prika: pros/osli, sada§njosfi i bllliucnosfi procesa otkriCa lekova, koji istice 11/01'1/ biotehn%gije) . Drmnmond M F, O'Brien B, Stoddart G 1, Torrance G W (1997) Methods fm the economic evaluation ofhealthcare programmes. Oxford University Press, Oxford (Reporta:a 0 op§tim principima evaJuacije ek.onom8kih troskova i koristi od zdravstva, uk/jllclljllci i terapiju lekovima) Evans W E, Reiling M V 1999 Pharmacogenomics: translating functional genomics into rational therapeutics. Science 286: 487-501 (Qpsti p~gledfGlmakogenomike) . ( I
6
Nebert D W, Weber W W 1990 Pharmacogenetics. In: Pratt W B. Taylor P (cds) Principles of drug action, 3rd edn. Churchill-Livingstone, New York (Detaljan prika: genelakih Jaktora /coji utjeu na odgovor no /e /cove) Porter R 1997 The greatest benefit to mankind. Harper-Collins, London (Od liean i zanimljiv prikaz istorije medicine, sa dobrim reporta:ama 0 ra nom razvojuJarmakologije ifarmaceutske industrije) Strom B L (ed) 1994 Pharinacoepiderniology. Wiley, Chichester (Knjiga sa viSe au/ora, koja pokriva .I've nove discipline, ukljucl!!uci i jarmakoe konamiju)
Kako lekovi deluju: opsfi principi
farmakologlja se kao nauka pojavila kada se sa opl slvanla efekata lekova. preslo na obJasnjavanje nJlho vog mehanlzma delovanja. U ovom poglavlju bloe prlkazanl opstl prlnclpl uzaJamnog delovanja lekovQ I zlvih organizama(u Poglavlju 3 opisane su molekul· ske osnove delovanja lekova sa vise pojedlnostl). Prj kazana je interakcija Izmectu lekova i 6elija. a zatim i detaljnlle Ispltivanje razlicHih tlpova Interakclja Izmedu lekova i receptora. Jos smo daleko od svetog grata - moguonostl da predvidlmo farmakoloSko dejstvo novlh hemljskih supstanci. III da dlzaJniramo ab initio hemljsko jedinjenJe koje oe imati speclflcno terapijsko delstvo. Ipak, u stanju smo da ustanovimo osnovne principe delovanja lekova, sto je I cllj ovog poglavija.
vetlvANJ'E'MpLEKULA·tEKA' ;, '. r
~';~~,tI4t·: /;:;:r'··ii ;.. .
,,'// ',.
Za pocetak, priznanje zasluZuje Paul Ehrlich, za tvrdl\iu da se delovanje lekova mora objasniti uobicajenim hemijskim interakcijama izmedu Iekova i tkiva, kao i za odbacivanje ideje da su izuzetna potentnost i specificnost dejstva, neke lekove postavile, na izvestan nacin, izvan dosega hemije i fi zike i zahtevale upliv magicnih »vitalnih sila«. Mada mnogi
Iekovi deluju u izuzetno malim dozama i koncentracijama, niska koncentracija i daije obuhvata 'vrlo veliki broj mole knla, Jedna kap rastvora nekog leka, pri samo 10-10 mol/I, sa4rZi oko 1010 molekula leka, pa nema misterije u cinjeni ci da ona moze izazvati jasan farmakolo~ki odgovor. Neki bakterijski toksiru (npr. toksin difterije) deluju sa takvom precizno~cu da je samo jedan molekul toksina dovoUan da ubije ciljnu celiju. Jedan od osnovnih stavova farmakologije glasi - da mo lekuli leka moraju da ispolje neke hemijske uticaje najednu iIi vi~e komponenti celije da bi se dobio farmakolo~ki odgo vor. Drugim recima, molekuli lekova moraju prici jako bli zu ovim komponentama celijskih molekula da bi se njihova funkcija promenila, Naravno, molekuli organizma su daleko brojniji od molekula leka, i ako se molekuli leka rasporede po principu sIueajnosti, ~nsa za medusobno delovanj e leka i neke odredene grupe eelijskih molekula je zanemarljiva. Zbog toga, farmakolosko delovanje zahteva, uopste uzevsL neuniformnu distribuciju molekula leka u telu iIi u tkivu, sto je isto kao da kazemo da se moleknli leka moraju l)vezati« za odreaene komponente ceHja i tkiva da bi dati odredeni efekt. Ehrlich je to ovako zakljucio: »Corpora non agunt nisiflXata« (lek nece delovati ako nije vezan)*, Razumevanje prirode mesta vezivanja lekova i meha nizma kojim kompleks lek-receptor prouzrokuje fizioloski odgovor, cini osnovu farmakoloskih istr~ivanja. Vecina lekova ostvaruje svoje efekte, na prvom mestu vezivanjem za proteinske molekule (cesto se nazivaju »mete«, sto je oci gledna aluzija na cuvenu Ehrilcihovu frazu »magicni meci«, koja opisuje potencijalne antimikrobne lekove). Danas je po znato dai op~ti anestetici (poglavlje 35), za koje se dugo verovalo da ostvaruju svoje delovanje intera!ccijom sa lipidi ma membrane, uglavnom stupaju u interakciju sa membran skim proteinima (Franks and Lieb, 1994). Naravno, pravDa imaju i svoje izuzetke, tako da mnogi antimikrobni i antitu morski lekovi (Poglavlja 44 i 50), kao i mutageni i kancero geni agensi (Poglavlje 51), deluju direktno na DNK, a ne na proteine. Bisfosfonati, koji se koriste za lecenje osteoporo
• Postoje, ako se paZljivo razmisli, izuzeci od Ebrlicb.ovog pravi lao To su lekovi koji deluju bez pretbodnog vezivanja za tkivne komponente (npr. osmotski diuretici, osmotski laksansi, antacidi, helirajuci agensi). Ipak, princip vaZi za ve6inu lekova.
7
ze, vezuju se za kalcijumove soli u kostanom matriksu, de lujuci toksieno na osteoklaste, vrio slieno otrovu za pacove (Poglavlje 30).
PROTEINI KAO CIUNA MESTA VEZIVANJA LEKA
SPECIFICNOST LEKA
.
Lekovi se najcesCe vezuju ~ ~etiri vrste regulatomih prote ina, a to su:
£.~.,~L!~~1'12 ~"~E!~~~)~.~~~sredstvo za le~enje. iii za naucno .istr~ivatlJel on mo1'a:~~. c!eluJe'sefe'fnvno"nao'are(!ene'cerUe'
enzimi, molekuli nosa6 (transporteri), jc,mski kanali, I receptori.· I
. Postoji jos nekoliko vrsta proteina (npr. struktumi pro teini, kao ~to je tubulin; koji specifieno vezuje kolhicin; Po glavlje 16) za koje se zna da deluju kil.o ciljna mesta za vezi vanje lekova. Takode, mora se imati u vidu da ima mnogo lekova cije mesto dejstva jo§ u~ek nije poznato. Osim toga, mnogi lekovi se vezuju za. proteine plazme, kao i za celijske komponente (oaim primamog mesta vezivanja), bez stvara njanekih o~iglednih fizibloskih efekata. Jpak, stay da ve6ina lekova deluje nil. jednu od 15etiri prikazane grope proteina, dobra je poiazna osnova. Detaljnija: diskusija 0 tome kako vezivanje lekova za re ceptore prouzrokuje celijski odgovor prikazana je u Pogla vljima 3-5.
NAPOMENA 0 TERMINOLQGIJI "Tennin receptor I!esto se upotrebljava nepravilno i izaziva kon fuziju. Kod nekih autora, ovaj tennin se koristi za bilo koji ciljni molekul sa kojim se kombinuju molekuli leka da bi ostvarili svoje specifil!no dejstvo, ~to moze ukljul!iti bilo koji od I!etiri pornenu ta tipa proteina. Tako, volta!no-zavisnil;n natrijumskirn kanalima nekada se pripisuje da su »receptori« za lokalne anestetike (Fogla vlje 43), iii enzimu dihidrofolat reduktazi da je »receptor« za me totreksat (foglavlje 16). U oba alul!aja, molekuli leb se vezuju za protein i menjaju njegovu funkciju izazivajuci dejstvo. Nasuprot tome, adrenalin deluje na srce, vezujuci se za specifil!an receptorni protein ~ija je jedina funkcija da prepozna kateholamine i veze lh. Kada se adrenalin veze za receptor, zapooinje niz reakcija (videti Poglavlje 3) koje vode pove6anju snage I frekvencije otkucaja srea. U odsustvu adrenalina, ovaj receptor je funkcionalno nem·. Ovo je slueaj sa svirn tipovima receptora za endogene medijatore (honno ne, neurotransmltere, citokine i dr.). Postojl razlika izmedu agoni sta koji »aktiviraju« receptor i antagonista koji se vezuju za Isto mesto na. receptoru, ali ga ne aktiviraju. Receptori ovog tipa I!ine kljooni dec he:mijske komunikaclje koju Bvl zivi organizmi koriste da koordiniraju aktivnost svojih organa i celija. Bez njih, mi blsmo bili kao puna vedra ameba. Razlika izmedu agonista i antagonista postoji same kod receptora sa ovim tipom fiziolo~e regulatome uloge; te~ko je govoriti 0 )}agonistirna« karla se radi 0 vezivanju za nosoo za noradrenalin, za volta!no-senzitivan natrijumski kanal iii enzim dihldrofolat reduktazu. U farmakologijije bolje·da se teri min »receptor« koristi samo kada se prikazuje interakcija regulator nog tipa, u kojoj mall molekul (ligand) moZe funkcionisati iii kao agonist iii antagonist; u praksi, ovo ogranicava koriscenje tennina na receptore koji imaju fiziolosku regulatomu funkciju, I ovu upo
8
trebu eete primet!t! u knjlzl koja je pred vama.'. U Poglavlju 3 dato je vj~e detelja 0 molekulskoj prirodi receptora j nal!ini na kaje ani uticu na funkciju celije.
• Neki receptori, kao ~to su benzodiazepin~ki, pokazuju aktivnost i u toku mirovanja, koja se smanjuje Hi pojal!ava u prisustvu liganda (poglavlje 36)
.. i.!!c.~y~·l)ru~,~,~~.:E.~~~~~~~daPQkate'Yi~~~~~ei{;pe: cifi~nosti za cil'no mesto v T"-"""~'Ob'~""""""""""-""'"lt'''' .w."'.'."" "~'''> ...L..,,'""', ...... J:~.. }:.\U1-.LIk"',~,~J:!l.J!!.Q.d?r~!.~t ?J 1 "delujukao,ciljeyi~. ve~anje leka, ispolJavaju Visok s!epen
",,mnle.kule..: Ovi principi specificnosti za vezno mesto i za ligand mo gu se lepo objasniti na primeru delovanja medijatora kao ~to je
angiotenzin. Ovaj peptid snmo deluje na vaskularue glatke misi6e i bubrefue tubule, ali ima vrlo slab efekt na ostale vrste glatkib miAiea i intestinalni epitel. Drugi medija tori deluju na sasvim razlicit spektar ceUja i tkiva, a model je u svakom pojedinom slueaju odreden specificnim mode 10m ekspresije proteinskih receptora za razlicite medijatore. Jedna mala hemijska promena, kil.O sto je konverzija jedne od aminokiselina u lancu angiotenzina iz L.- u D· oblik, iIi uklanjanje jedue aminokiseHne iz lanca, mo~e da inaktivira molekul u celini, jer ga receptor kao takvog ne prepozna- . je. Uzajamna (komplementama) specificnost liganda i me sta vezivanja, koja daje proteinima svojstvo vrio preciznog molekulskog prepoznavanja, centralna je za razumevanje mnogih fenomena u fannakologiji. Nije preterano reci da je sposobnost proteina da stupaju.u interakcije na visokose lektivan naNn sa drugim molekulima (uklju~ujuci tu i druge proteine), osnova fimkcionisanja Zivili sistema. Znacaj tog procesa za razumevanje mehanizama dejstva lekova bice ce sta tema u ovom udtbeniku.
•• Prekr~ili smo sopstveno pravilo u Poglavlju 19, upucujuci na »LDL receptor«, tennin u svakodnevnoj primeni za opis makro molekula (on, striktno govoreci, nije receptor u skladu sa naSom definicijom), koji igra kljucnu ulogu u metabolizmu lipoproteina.
Na kraju, treba naglasiti da nijedan lek ne deluje"potpu no specifitno. Tako, tricik:litni antidepresivi (Poglavlje 38) primarno blokiraju transportere monoamina, ali su poznati po ne~eljenim efektima (npr. suvoea usta) koji su u vezi sa njihovom sposobnoscu da blokiraju razlicite receptore. Uopste, 8to je jatina leka manja, a potrehna doza veca, vero vatnije je da ee, pored primarnog, postati znacajna i druga mesta vezivanja leka. U klinitkom smislu, ovo se cesto po vezuje sa pojavom nezeljenih efekata od kojib nijedan lek nije osloboden. Potev od 1970-tm godina, farmakologija je uspela da identiflkuje mnoge proteine kao ciljna mesta vezivanja razli citih lekova. Za lekove kao sto su opijatni analgetici (Pogla vlje 40), kanabinoidi (Poglavlje 42) i benzodiazepinski auk siolitici (Poglavlje 36), cija su dejstva bila iscrpno opisivana mnogo godina ranije, danas je poznato da se vezuju za dobro defmisane receptore, potpuno ispitane pomocu tehnika klo niranja gena (Poglavlje 3).
KiASIF.IKACIJA RECEPTORA 'f U slucajevima kada se dejstvo leka mo~ vezati u neld odredeni receptor, to je dragoceno u ldasifikaciju i pobolj§anje njegovog di zajna. Na primer, 'fannakolo~ke analize delovanja histamina (videti Poglavlje IS) pokazale su da se neki njegovi efekti (HI efekti, kao . §toje kontrakcija glatke muskulature) mogu potpuno antagonizova Ii primenom poznatih kompetitivnih antagonista histamina, Black i saradniei 8U 1970. nagovestili da su preostaJa dejstva histamina, pa i stimuJacija sekrecije zeludaCne kiseline, mozda povezani sa delovanjem histamina na drugi tip histaminskih receptora (H2). Te. . stiranjem jednog broja analoga histamina, ustanovili su da neki od njih deluju selekdvno na H2 receptore, dok je njihovo dejstvo na HI receptore bilo rninimalno. Analizirajuci koji je deo molekula histamina zasluZan u ovaj tip specificnosti, mogH su da razviju selektivne antagoniste za koje je dokazano da su potentni u blokadi . sekrecije I\eludacne kiseline, ~to je bilo otkrice od velikog terapij skog znacaja (Poglavlje 24), Kasnije su otkriveni i drugl histamin ski receptori, H3 I H4 •
Klasiftkacija receptora koja se zasniva na fannakoloskom odgo voru I dalje ima vrednost i slroko se primenjuje. Eksperimentalni pristupi nikad nisu pruZili neke druge kriterijume u klasiflkaciju ·receptora. Direktno merenje vezivanja liganda u receptor (videti str. 10) omogu6i10 je da se defrnlsu brojni novi podtlpovi receptora, koji ne bimogli da budu lako otkriveni sarno putem istraZivanja dejstva lekova. Molekulsko kloniranje (Poglavlje 3) pruZa potpu no nove osnove za klaslftkaciju receptora, I to na mnogo f1nijem nivou nego sto to omogu6uju farmakoloske analize. Konacno, ana liza biohemijskih puteva koji su povezani saaktivacijom receptora predstavljajo~ jednu oanovu u njlhovu klasiflkaciju (Poglavlje 3). Ova eksplozija podataka, prouzrokovala je da je ldasiflkacija recep tora postala izrazito detaljna, sa umnoZavanjem novih podtipova receptora u sve poznate ligande; one sto je jos vise brinulo, bila je cinjenica da se pojavila alternatlvna molekulska i biohemijska kla sifikacija koja nije bila kmnpatibilna sa prihva6enim farmakoloski definisanim klasama receptora. Kao odgovor na ovu Bve vecu kon fuziju, Internacionalna unija farmakoloskih nauka (International Union ofPharmacological Sciences - IUPHAR) sazvalaje ekspert ske grupe da urade prihvaeene ldaslflkacije za najvaZnije tipove receptora, nzimajuci u obzir dostupne farmakolo§ke, molekulsk;c i biohemijske informacije·. Ovi ulSeni ljudi imaju te!ak zadatak;
* Publikovano kao IuPHAR-ov priruCnik za karakterizaciju i k1a siftkaciju receptora, 1998. godine (IUPHAR Media, London).
njihovi zakljueci nece bid konaeni ni savr§eni, ali au su§tinski za stvaranje konzistentne termino10gije. Za studenta, ovo moze cia lici na misteriozne veZbe iz taksonornije, koje pruZaju mnogo detalja. ali malo razja§fijenja. Postoji opasnost da zamorno nabrajanje ime na, aktivnosti i ne!eljenih dejstava lekova koje opterecuje predmet, umenimo sa iscrpnim tabelama receptora, Iiganda i signalnih pu teva, U ovoj knjizi, smo pokusaH da izbegnemo pojedinost koja nicemu ne sluzi I da ukljucimo samo one informacije 0 receptor skoj klasifik:aciji koje bi bile zanimljive iii konsue u obja§njavanju mehaniuma dejstva vaZnih lekova. Koristan 8aZetak sa klasiftkaci jom receptora objavljuje se jednom godisnje u poznatom farmako loskom casopisu (Trends in Plwrmac%gical Sciences, Receptor Supplement).
INTERAKCIJA IZME£>U lEKA I RECEPTORA . Vezivanje leka za receptor more, ali ne mora da dovcde do af't.~lJacife receptora. Pod aktivacijom se podraz].lmeva takvo vezivanje leka za receptor koje~p()~\I£t:tIjtlt1ciYnLQdgQYQr, Molekulski mehanizam kojije u vezi sa aktivacijom recepto ra opisanje uPoglavlju 3. Vezivanje i aktivacija predstavlja ju dva odvojena koraka u nastanku farmakoloslrog odgovora preko receptora koji izaziva agoni$t (sHka 2.1). Antagonist je lek koji se vezuje za receptor, ne aktivira ga, ali7vojim pri " sustvom onemogucava vezivanjeagoniste za receptor. Afini tet je sposobnost leka da se veze za receptore, ,etikasnost je sposobnost leka da aktivira recs;ptpre ;z;a koie se nZe Ovi termini kasnije 6e.biti preciznije definisani (str. 15-17). Po tentniji lek obi~no ima visok afinitet za receptore, tako da zauzima zna~ajan broj receptora, cak i kada se primeni u maloj koncentraciji. Takode, agonisti poseduju visoku efi kasnost, dokje efikasnost antagonista, u najjednostavnijem slucaju, ravna nuli. !",arciiaf!!jJ1Kf!!WJj, su lekovi koii imaju 1JUlI
Lek
.···A ...: +
(a~()nl~t)
Zauzetost
Aktivacija
odredena afinltetom
odredena efikasnoicu
ODGOVOR
, , _ BEZ ODGOVORA
Stika 2.1 Razlike Izmedu vezivanja leka za receptor i aktlvaclJe receptora. Konstante k+1' k." ~ i a odnose se na vezivanje liganda za receptor i reakciju aktfvacije recepjora. sto Je opisano u tekstu. Ligand Aje agonist, jer aktlvira receptor. a ligand B je antagonist.
9
(PogIavlje 3), pruiaju korisnu osnovu za 'odredivanje efeka talekova. Sada detaljno razmatramo pojedine aspekte, a posebno vezivanje lekova, koncentracijski-zavisnu krivu agoniste, kompetitivni antagonizam, parcijalne agoniste, efikasnosl i pojam receptorske rezerve. Razumevanje avog koncepta na kvalitativnom nivou ponekadje dovoljno, ali za detaljniji pri stup neophodne su kvantitativneanalize (videti str. 15-17).
VEZIVANJE LEKOVA ZA RECEPTORE Vezivanje lekova za receptore oesto se moze direktno meriti primenom radioaktivnih molekula leka (obieno sa JR, 14C iIi 12S1). Glavni uslovi su da se radioaktivni ligand (koji moze biti ago1tist iIi antagonist) mora vezati sa visokim afinitetom, i specifiCno~6u, kao i da je obelezen sa dovoljno specificne radioaktivnosti da bi bilo moguce izmeriti i najmanje veziva nje. Uobicajeni postupakje da se 1ZvrS! inkubacija uzoraka tkiva (iIi fragmenata membrane) sa razlicitim koncentracija ma radioaktivnog leka dok se ne postigne ravnoteza. Tkivo ,se zatim uklanja, iii se membranski fragmenti odvajaju filtri ranj em iIi centrifugiranjem, pa se potom rastvaraju u scintila cionom rastvaraeu radi merenja radioaktivnog sadrzaja. U takvim eksperimentima uvek postoji izvesna kotiei na nespecificnog vezivanja liganda koja pokriva specificnu komponentu i potrebno je da se odrzava na minimumu. Ko lieina nespecifienog vezivanja izraouD.ava se na osnovu me renja radioaktivnosti koja se dobija u prisustvu saturacione koncentracije (neradioaktivnog) liganda, koja potpuno spre cava vezivanje radioaktivnog leka za receptore, ostavljajuci iza sebe same nespecificnu komponentu. Ova vrednost se za
~
rru 300
S
,'j,.
§
tim oduzima od vrednosti za ukupno vezivanje, da bi se do bilo specificno vezivanje (slika 2.2). Kriva vezivanja (slika 2.2B) definise odnos izmedu koncentracije i kolieine veza nog leka (B), au ve6ini slucajeva dobro se uklapa u teorijski predvidene odnose (siika 2.8, sledi). Ova kriva omogllcava procenu afiniteta leka za receptor, kao i kapaciteta vezivanja (Bmax), koji predstavljagustinu receptora u tkivu. Takode, za ispitivanje distribucije receptora u struktura ma, kao §to je, na primer, mozak, moze se koristiti autoradio grafija. Danas se koristi direktno obelezavanje sa ligallQima koji sadrze izotope koji emituju pozitrone, -g. tomografija sa emisijom pozitrona (positron-emission tomography PET), da bi se dobile slike distribucije receptora kod Ijudi. Ova tehnika primenjena je, npr., za merenje stepena blokade do paminergickih receptora koju prouzrokujuantipsihoticki le kovi u mozgu pacijenata obolelih od shizofrenije (Poglavlje 37). Kada se poveZu sa fiumakoloskim studijama, merenja vezivanja liganda za receptor pokazala su se vrlo korisllim. Potvrdeno je, na primer, da je ispravna hipoteza receptor ske rezerve za muskarinske rec~tore u glatkim misicima; nadeno je da se agonisti vezuju, uop~te uzev~i, sa malim afinitetom i da se maksilnalan biolo~ki efekt odigrava pri ma loj zauzetosti receptora. Isto tako, pokauno je u skeletnim misiCima i ostalim tkivima, da denervacija vodi povecanju broja receptora u ciljnoj celiji, cime se harem delimicno mo Ze objasniti fenomen denervacione preosetljivosti. DlIie od sustvo Hi male koliCine hormona iIi transmitera prouzrokuju povecar\ie broja receptora u toku nekoliko dana. Nasliprot tome, kontinuirana primena lekova iIi hormona dovodi do smanjenja broja receptora (videti str. 19).
~
~I
~
(5
g
0
g
;:"
2;
Q)
0
'1:'
Q)
'1:'
c
,~
.~
"0
.8
~ '0c
Q)
> 0 c 'u
Q)
> 0 c
~
!E
0
:::l
"U
:::>
0
~
Q)
""
Scatchardov dijagram
100
CI)
20 Koncentracija (nmolll)
20
100 Vezano (fmol/mg)
Slib 2.2 Merenje vezivanja za receptor (I~·adrenerglckl receptori u membrani ¢elija arca). Koriscen je ligand - PHl-cija nop/ndolol, derivat pindolola (videti Poglavlje 11). A Merenja ukupnog i nespecificnog vezivanja u stanju ravnotete. Nespeclfic no vezivanje je mereno u prisustvu saturacione koncentraciJe neradioaktivnog agonlste !l-adrenergiCkih receptora koji sprecava vezlvanje radioaktivnog liganda za !l-receptore. Razlika izmeau dYe krive predstavlja specificno vezivanje. II Speciflcno veziva nje je prikazano u odnosu na koncentraciju. Kriva je pravougla hiperbola ijednacina 2.5). C Scatchardov dijagram ijednacina 2.7), Dobijena]e prava linija Iz koJe se mogu prbceniti parametri vezivanja K i Bmax'
10
Mnogo je teze protumaCliti krive vezivanja agonista nego krive antagonista, po~to one cesto otkrivajujednu ociglednu heterogenost medu receptorima. Na primer, vezivanje ago~ niste za muskarinske receptore (Poglavlje 10), ali i za p. adrenergiClke receptore (Poglavlje ll), pokazuje da postoje barem dva mesta vezivanja sa razlicitim afinitetima. Ovo se moZda moze objasniti time da receptori mogu da opstanu Hi nevezani, iIi vezani unutar membrane sa makromolekulom, kao ~to je G-protein, koji predstavlja saatavni deo transduk cionog sistema, putem kojeg receptor ispoljava svoj regu latomi efekt. Vezivanje antagonista nije tako kompleksno, verovatno zato sto antagonisti, po svojoj prirodi, ne dovode do sekundamog dogadaja vezivanja za G-protein. Dokazano je daje koncept afiniteta agoniste teskodefmisati, a poku~a ji mnogih entuzijasta da nadu algebarsko resenje, moguse nact u farmakoloskoj literaturi.
KRIVE KOJE POKAZUJU ODNOS KONCENTRACIJE I EFEKTA AGONISTE Mada se vezivanje leka za receptore moze direktno meriti, obicno se prati bioloski odgovor, kao sto je povecanje krv nog pritiska, kontrakcija Hi relaksacija glatkog mi~ica u vo denom kupatilu, Hi aktivacija nekog enzima, i prikazuje kri yom odnosa koncentracije i efekta Hi doze i odgovora, kao sto je prikazano na slid 2.3. Takve krive narn omogucavaju da procenimo maksimalan odgovor koji lek moze da proiz vede (Ema,)' i koncentraciju Hi dozu potrebnu za postizanje 50% maksimalnog odgovora (ECso iii EDso)' kao parametre koji su korisni za uporedivanje jacina razlicitih lekova koji proizvode kvalitativno slicne efekte (poglavlje 4). Mada ove krive lice na krive vezivanja u receptorskim studijarna (slika 2.2), ne mogu se koristiti za merenje afiniteta agonista za svoje receptore, zato sto fiziolo~ki odgovor nije, po pravilu, direktno proporcionalan zauzetosti receptora. Jedan integra
tivni fIzioloski odgovor, kao ~to je povecanje pritiska prou zrokovano primenom adrenalina, rezultatje interakcije vise faktora. Adrenalin (videti Poglavlje 11) povecava minutni volumen, suzava neke krvne sudove, dok druge ~iri, a sarna promena arterijskog pritiska prouzrokuje refleksnu reakciju koja menja primarnu reakciju na lek. Velicina lcrajnjeg od govora na lek nije sarno mera zauzetosti receptora, sto je pravilo zavecinu lekova. Pri tumacenju krivih odnosa koncentracije i efekta, treba imati na umu da koncentracija leka vezanog za receptore moze da se razlikuje od finalne koncentracije u kupatilu za izolovane organe. Agonisti mogu biti predmet nzim ske razgradnje Hi preuzimanja od strane celija, moz, se po sti6i jedno stabilno stanje u kome je koncentracija agonista vezanog za receptore mnogo manja nego koncentracijau ku patilu. U slucaju acetillioIina, na primer, koji se hidrol'izuje pod uticajem enzima holinesteraze, koja se nalazi u vecini tkiva, koncentracija koja se moZe dostiei na nivou receptora moze biti sarno 1% od one u kupatilu. a ustanovljena je cak i ve6a razlika kod noradrenalina (norepinefrina), koji se brzo preuzima u presinapticke zav§etke simpatickih neurona (Po glavlje 11). Tako, iako kriva odnosa koncentracije i efekta moZe ponekad da Hci u pOtpun08ti na krivu vezivanja, sto je slucaj na slici 2.3, ona ne mo!e biti kori~ena direktno da bi se odredio afinitet agoniste za receptor.
brzet'
KOMPETITIVNI ANTAGONIZAM Kompetitiyni antagonizam Qpjsuje uobicajenu situaciju ka da se lek se1ektiynQ vezuJe za odredeni tip receptora, ne aktivira gal ali 8vojim pri~ustvomOnemQlUl¢IlVa vezivanje •iHlQPisw...Cesto postoji izvesna 811cnost u hemijskoj struktu ri molekula agonista i antagonista. Dva leka su u uzajamnqi ::::= kom eticiji,p()~t()j{l~~Xec{lptor u istommQmenttLlJlOZe vezati same Je an mo e a. n aatoj koncentraciji ago -niste, zauzetost receptoranjegovim molekulima bi6e smanje na u prisustvu antagoniste. Medutijn. ukoliko se koncentrac,iu_;;;m;e;;;;: l' ja agoniste povecaz iUlzetQst rece,ptora nj,!mvinlOlQJekn.l.i 'rna vratice se na preddnji nivo, po~to so agonist i antagonist u kompeticiji; tako se poJt1cava i tkivn! oggovor. Zato za ovaj tip antagonizmaKatemo da j.~)nasuprot dru gim tipovima antagonizma (videti dalje u tekstu) gde rastu6a koncentracija agoniste ne moze da savlada blok izazvan an tagonistom. Na osnovu jednostavne teorijske analize (videti Z:::;'"~"U~'
10-7
10,6
10-5
10-4
10-3
U~""_'UN__. .... ,~_,~ __
10-2
Koncentraclja (mol/l) Slika 2.3 Eksperlmentalno dobljene krlve odnosa koncentraclje Iefekta. Mada 5U linlje, dobljene na 05no vu jednaOine vezlvanja 2.5, dobro prllagodene taOkama.
takve krive ne daju taOnu procenu afiniteta leka za recep tor. Ovo je sto.ga sto odno5 Izmedu zauze6a receptora i odgovora nije uvek IInearan.
11
str. i7}, moze sepredvideti da ce se u prisustvu fiksne kon centracije antagoniste, kriva odnosa logaritma koncentracije i efekta pomeriti udesno, bez promena nagiba ili maksimal nog odgovora - obelezje kompetitivnog antagonizma. Ovo pomeranje se izrazava kao odnos doza (to je odnos za koji treba da se poveca koncentracija agoniste u prisus!:Y\! antago niste, da bi se uspostavio dati nivo odgovora): Teorij a p;~dvi da da se odnosdoza poveeava lineaJ:riosa koncentracijom an tagoniste (videti str. 17). Ova predvidanja cesto se potvrduju u praksi (videti sliku 2.4), a primeri kompetitivnog antagoni zma su veoma cesti u farinakologiji (slika 2.4). Savladivost bloka prouzrokovanog antagonistom, moze biti vrlo vaZna u p~aksi, posto to dozvoljava da funkcionalni efekt agonista 'i;JII!
Do sada, smo posmatrali lekove iIi kao agoniste, koji na ne ki nacin aktiviraju receptore kada ih zauzmu, iIi kao anta goniste koji ne aktiviraju receptore. Medutim, sposobnost molekula leka da aktivira neki receptor odigrava se stupnje vito, pre nego po principu sve iIi ni~ta. AIm se testira serija hemijski srodnih agonista koji deluju ria iste receptore u da tom biolo~kom sistemu, cesto se ustanovi da se njihovi mak simalni odgovori (najveci odgovor koji lek moze da izazove u visokoj koncentraciji) razlikuju. Neka jedinjenja (poznata kao puni iii kompletni agonisti) mogu da izazovu maksima Ian odgovor, dok druga (parcijalni agonisti) mogu da prou zrokuju sarno submaksimalni odgovor (slika 2.5). Razlika
Slika 2.4 Kompetltlvni antagonizam Izoprenalina propranololom, meren na izolovanoj pretkomorizamorca. A Krive odnosa koncentracije i efekta za raziic:ite koncentracije propranolola (naznac:ene uz krivu). Treba uoc:lti progresivno pomeranje udesno, bez promena nagiba iii makslmuma. B Schildov dijagram ijednac:ina 2.1 O)~ Konstanta ravnoteze (K) za propranolol od 2.2)( 10-9 molll odredena je prema odsec:ku na apscisl (Originalni rezultati iz rada: Potter L T 1967, J Pharmacol155: 91.)
12
/
PARCIJALNI AGONISTI I KONCEPT EFIKASNOSTI
,
,!PS~?y~;z:~,kICl~lnkaqljyr~p~ptora:
ponovo bude uspostavljen povecanjem njegove koncentraci je. Kod drugih tipova antagonizma ovaj blok nije mogu6e savladati (videti dalji tekst). Glavne karakteristike kompetitivnog antagonizma su: pomeranje krive odnosa logaritma koncentracije i efekta agoniste udesno, bez promene nagiba Hi maksimalnog odgovora, linearan odnos izmedu odnosa doza i koncentracije anta gonista, dokaz 0 kompeticiji iz receptorskih studija (na obeleze nim supstancama). Kompetitivni antagonizam je najneposredniji mehani zam kojimjedan lek inhibira efekt drugog leka (ili endoge nog medijatora). Nekoliko primera prikazano je u tabeli 3.1; drugi uobicajeni mehanizmi razmatraju se dalje u tekstu.
..c~~~~R~~~JiJ .()ggO,/()fll" ... Stika 2.6 prikazuje vezu izmedu okupiranosti receptora i koncentracije lekova sakonstantom ravnoreze od 1.0 mmolll. Lek a je pun agonist, koji prouzrokuje maksimalan odgovor sa 0.2 /Amol/I, a veza izmedu odgovora i okupiranosti je pri kazana krivom na slici B. Uporedni prikaz za parcijalnog agonistu (b) da~je na sliciA i B, a osnovna razlikaje ta, da je
80 X
~ 60
~r;g~,1?p~A~~.JJl~
-.g..
:$? co 0
0)
"C
f ... , ~ Wg!.eJ."~Q.¥iltAiR~~~~l!;I! ~ d .' .... _1M:_l.~/,, • ...nJlu;-,m~>. ..Jl¥,~,tl,.t nM
TPotomjepojathetikasnosti bli~ defmisan uzimajuci u obzir 080 bine tkiva (broj rec~ptora i priroda veze izmedu receptora i efekta; videti Poglavlje 3) i sarnog Jeo i uveden je koncept unutrasllie efIkasnosti (intrinsic efficacy) (videti Jenkinson, 1996, Kenakin, 1997). Odnos izmedu zauzetosti receptora i odgovora tkiva moze bid predstavijen sJedeCom formulom:
10-4
Koncentraolja (mol/J)
Slika 2.5 Parc:iJalnl agonlstl. Krive odnosa koncen traclJa i efekta supstltuisanih jedinjenja metonljuma na kontrakciju ml§jea ~abe (m. rectus abdominis). Ova je dinjenJa su clanovi serlje dekametonljuma (Poglavlje 7), RMe2N'(CHz)10N'Me2R. Maksimalan odgovor se znaes] no sman]uJe (t]. efikasnost opada) kako se velleJna R poveeava. Sa R == nPr iii ve6e, jedinJenja ne lzazivaju odgovor, ve6 su eistl antagonist!. (Rezultati su preuzeti Iz rada: Van Rossum J M 1958. Pharmacodynamics of oha linometic and cholinolytic drugs, St. Catherine's Press, Bruges),
SN x ) Odgovor=f ( ~ xA+KA
"'ot
U ovoj formuli,j(funkcija transdukcije) i (ukupan broj recep tora) su osobine tkiva; B (unutramja eflkasnost) i KA (konstanta ravnoteze) su osobine agoniste. Ova formula omogucava da 8hva timo kako jedan ist! agonist, delujuci ns lste receptore, moze biti puni agonist u jednom tkivu, a parcijalni agonist u drugom tkivu, u zavisnosti od funkcije transdukcije i gustine receptora. Takode, relativna potentnost dvaju agonista moze bid razlicita u razlicitim tldvima. lako su receptori isti.
lil 1.0
100 'Iii 0
c::
'a
iE
0
'#
!!!
~
0.5 m
.E m
§
'13
.:.t:
!!!
';:' 50 ~
g,
B
1.1.
1.0
Koncentracija (llmolll)
10.0
0.5
1.0
Okupiranost
Slika 2.6 TeoriJske krive okupiranostll odgovora za pune I parc:IJalne agonlste. A Kriva okuplranostl je za oba leka, a krlve odgovora za punog (a) i parcijalnog agonlstu (b), odvojeno, B Odnos IzmeBu ocjgovora I okupiranostl za punog i parcijal nog agonistu, u skladu sa krivama odgovora na sllei A. Treba uociti da kriva a postite maksimalan odgovor kada je okupiranost receptora svega oko 20%, dok kriva b izaliva samo submaksimalni odgovor, esk I kada je okupiranost receptora 100%.
13
Za detaijnije razmatranje interakcije leka i receptora, videti radove Jenkinson (1996) i Kenakin (1997).
sutan. Ovo se odnosi na receptore za benzodiazepine (Poglavlje 36), kanabinoide (Poglavlje 33), doparnin, i jo~ nekoliko drugih medijatora. Pored toga, ddavaju se mutacije receptora - spontano kodnekih oboljenja ill u eksperimentalnim uslovima (pog\avlje 4) - ~to dovodi do pojave zna1ne aktivnosti u odsustvu bilo kakvog liganda (konstitutiVrIa aktivacija). Pove6ana ekspresija p-adrcner gil!kih rcceptora u linijarna kloniranih eeUja rezultira qiihovom konstitutivnom aktivacijom (Bond et at, 1995), 5to je nlzultat za koji se mo~e dokazati da ima znal!ajne patofizioloske implikacije. Pod ovim uslovima, postoji moguenost da ligand smanji nivo kon stitutivne aktivnosti; takvi lekovi poznati su pod nazivom inverzni agQnisti, koje treba razlikovati od obicnih kompetitivnih antagoni sta koji sarni po sebi ne util!u na nivo aktivnosti (slika 2.7; vidcti de Ligt et aI., 2000). Inverzni agonisti mogu se smatrati lekovima sa negativnom eftkasnoiCu, 8to ih razlikuje od agonista (pozitivna efikasnost) i kompetitivnih antagonista (efikasnost jednaka nuli). Sve je vise novih primera receptora sa konstitutivnom aktivnos6u i invertnih agonista (uglavnom kod receptora vezanih za G-prote ine; videti Daefiler and LlIndry. 2000; Seifert and Wenzel-Scifcl\ 2002) i verovatno je da ce se u budu¢nosti razviti inverzni agonisti zaklinil!kuprimenu. Model dva stanja, koji je prikazan u nastavku teki>ta, obj~njava razliku izmedu pojma relativnog afmiteta razli ~itih liganda za receptor u stanju aktivacije iii mirovanja. Mnogi receptori (kao i ma~ke 1) te~e da budu u stanju inaktivacije, a ta da nema praklil!ne razlike izmedu kompetitivnog antagoniste i in verznog agoIDste. Postojanje konstitutivne aktivnosti je nedavno otkriveno; medutim, qien li\nal!aj za razvoj farmakologije bite i veei nego ~to to danas izgleda (videti Milligan et a!., 1995).
Bilo bi dobro da objasnimo ~ta to znaci efikasnost u fizickom smislu i da razumemo za~to jedan lek moze biti agonist, dok je drugi, mada hemijski vrlo sliean, antagonist. Poeinjemo da razumemo molekularna de~avanja koja se nalaze u osno vi aktivacije receptora (poglavije 3), ali jo~ uvek nemamo jasan odgovor na pitimje za~to su neki ligandi agonisti, a ne ki antagonisti, madajednostavan teorijski model dva stanja, opisan dalje u tekstu, predstavlja korisnu polazriu osnovu. Uprko~ teorijskoj neodredenosti, koncept efikasnosti je od velikog prakticnog znacaja. Adrena:lin i propanolol imaju sliene afihitete za ~adrenergieke receptore, ali se razlikuju u efikasnosti. Jadni doktori i studenti - efikasnost je pojam koji ih najvi§e zbunjuje! .
KONSTITUTIVNA AKTIVACIJA RECEPTORA I INVERZNI AGONISTI ... Mada smo navikli da mislimo da 5e receptori aktiviraju sarno kada je vezan molekul agonista, ima primera (videti de Ligt et al.; 2000) da postoji znatan nivo aktivnosti, Cak i karla ligand nije pri•
.- 100 ?f..
.-. 100
-
~ !!!
!!!
~
.9 c..
~
~
!!:! (l)
:= tJ
50
(l)
'8' CG
~
50
.2:
~
:!
III :::l
CG ::;J
c::
c::
(l)
(l)
c..
~ 100
c.. (l) 1ii 100
;:I
::;J
III
III
(l)
(l)
c::
c::
E
~
e
0..
0..
-50~~~~~~~~~~~~~~pJ,
10-8
Koncentracija liganda (M)
10-4
Koncentracije antagoniste (M)
Slika 2.7 InterakclJa kompetltlvnog antagonlste sa normalnlm I Inverznlm agonistima u slstemu koJi pokazuje aktl· vaclJu receptora u odsustvu IIganda (konstHutivna aktivacUa). A 'Stepen aktivaciJe receptora (vertlkalna skala) poveC!;lva se u prisustvu agoniste (prazan kvadrat), a smanjuje u prlsustvu /nverznog agoniste (prazan krug). Dodavanje kompetitivnog antagoniste pomera obe krive udesno (pun! simboli). B Antagonist, sam po sebi, ne menja nivo konstitutivne aktlvnosti (pram! simboli), jer poseduje jednak afinitet za aklivno Iinaktivno stanje receptora. U prisustvu agoniste (pun kvadrat) ill Inverznog agoniste (pun krug), antagonil!!t vra6a. s/stem prema konstitutivnom nivou aktivnosti. Ovl podaci (reprodukovano sa dozvolom Newman~Tancredi et al. 1997 Br J Ph~rml;lcoI120:737-739) dobljenl su kloniranjem humanih receptora za 5-hidroksitriptamin (5-HT) na celijskim kulturama. (Agonist, 5-karboksimidotriptamin; inverzni agonist, spiperon; antagonist, WAY 100635; koncen tracija IIganda (M = molll); videti Pegiavlje 9 za informacije 0 farmakologlji 5-HT.)
14
REZERVNI RECEPTORI ,. Stephenson (1956) je proueavajuCi del6varijeanaloga acetilholi na u izolovanitn tlcivima, ustanovio da su moogi puni agonisti spo sobni da izazovu maksitnalan odgovor pri veomaniskoj okupirano stl receptora, testo manjoj od 1%. Ovo znaCi da mehanizam koji po vezuje odgovor sa okupirano§eu (zauzetoStu) receptora 1ma znatan rezervni kapacitet. Mo!e se reCi da takvi sistemi poseduju rezervne receptore ili receptorsku rezervu. Ovo je uobieBjeno !rod lekova koji dovode do kontrakcije glatkih misiea, ali je manje uobi(jajeno za ostale tipove reakcija !roje se odvijaju preko receptora, kao Sto su sekreeija, relaksacija glatkib mi5ica iii kardiostimulacija, gde je efekt skoro proporciona\an okupiranosti reeeptora. Postojal\ie reo zervnih receptora ne znafi dodatnu funkcionalnu podelu pula recep tora, vee jedino da je taj pul vepi od broja koji je neophodan za po stizanje maksimalnog odgovQ\-a. Ovaj vihl reeeptora, preko broja koji je stvamo potreban, mo~ de izgleda kao beskoristan biolo!ki raspored. To, medutim, zna(ji, da broj kompleksa agonist-receptor, koji odgovara datom ~vou biolo§kog odgovora, moze da lie ostvari sa niZom koncentracijom hormona iIi neurotransmitera nego ~to bi to bio slul5aj da je broj receptora m'!llji. Hormoni i neurotransmiteri se ekonomi(jnije trose karla je broj reeeptora veei.
KVANTITATIVNI ASPEKTI INTERAKCIJA IZMEDU LEKA I RECEPTORA Ovde cemo predstaviti neke aspekte takozvane teorije recep~ tora koja so zasniva na primeni zakona 0 dejstvu masa na interakciju lekhreceptor i koja sluZi kao okvir za tuma~enje velikog broja kvantitavnih eksperimentalnih podataka.
"Prvi korak u delovanju leka na speeifi~e receptore jeste formi ranje jednog reverzibilnog kompleksa lek-receptor, ~to predstavlja reakciju koja se odigrava u skladu sa zakonom 0 dejstvu masa. Pretpostavimo da jedno par~e tlciva, kao sto je sr~anj mi~ic iii ne ki g1atki mi~ic, sadrZi ukupan broj receptora N"" za agonist, kao §to je adrenalin. Kada se tkivo izlozi delov~nju adrenalina u kon centraciji XA i kada se ostvari ekvilibrijum, izvestan broj NA recep tora postaje zauzet, a broj slobodnih receptora ee se smanjiti na N"" - NA• Obi~no. broj molekula adrenalina koji su dodati u rastvor sa tkivom, u velikoj meri prelazi N.." tako da reakcija vezivanja ne smanjuje znatno vrednostxl\' Intenzitet odgovora prouzrokovanog adrenalinom bice povezan «(jak i ako mi ne znamo tal5no kako) sa brojem zauzetih receptora, tako da je korisno znati koja se kvantita tivna veza ostvaruje izmedu NA i xA' Reakcija se moZe predstaviti jedna(jinom:
Lek (XII)
+
(2.5)
Ovaj vazan rezultat poznat je kao HiI1-Langmuirova jednafina*.
Konstanta disocijacijc*" K",ie karakteristika leka i receptora. Ona 1ma dimenzije koncentracije i broj(jano je jednaka koncentraciji Ie ka koja je po)rebna da zauzme 50oz;, mesta u stanju ekvilibrijuma. (Proveriti u jedna15ini 2.5 da kada je xA "" KA'P A = 0,5). Sto je veei afinitet leka za receptore, to Ce biti manja vrednost KA • lednacina 2.5 opisuje vezu izmedu zauzetosti receptora i koncentracije leka i definme krivu koja je poznata kao pravouglil hiperbola, prikazana naslici 2.8A. U fannakologijije uobi15ajeno dase koristi logaritam· aka skala za prikazivanje koncentracija, i u tom slueaju se hiperbo la pretvara u simetri(jnu sigmoidnu krivu (sllka 2.8B).
~c:: .~ .;] o III
0.5
1
R slobodni receptor
--"" ..,.....--
AR
k.l
kompleks
(N..,-NII)
5 Konceritracija (linearna skala)
10
o 0.1
1.0
10.0
Koncentracija (Iogarltamska skala) SUka 2.8 Teorljska veza izmedu zauzetostl (okupj
ranoatl) receptora I koncentraclJe IIganda. Ova veza
graftOkl je prlkazana u skladu sa jednaOlnom (2.5). A Gra
fik sa lineamom konCl:U'ltracljskom skalom; ova kriva je
pravougaona hiperbola. B Graflk sa logarltamskom kon
centracionom skalom; u pitanju je simetriOna slgmoidna
kriva.
k+1
A
Defini!luci konstantn disocijacije za reakciju vezivanja, KA "" kjk~" jednooina 2.4 moZe da se napi~e ovako:
~ u..
ReakciJa vezivanja
(2.4)
PA"" xA+ k)ktt
(NA)
Zakon 0 dejstvu masa (koji ka2e daje brzinahernijskereakcije pro porcionalna proizvodu koncentracija reaktanata) moze se primeniti na ovu reakciju. .
• A. V. Hill je 1909. godine prvi pUblikovao ovu jednacinu, a tada je bio same student medicine. Langmuir, fiziOki hemicar Brzina donje reakcije k.lNIl koji je istraZivao apsorpciju gasova, nezavisno je 1916. godine (2.2) do§ao na istu ideju. Oba nauenika su potom dobila Nobe1ovu U stanju ekvilibrijuma, dye brzine su jednake. nagradu. Do skora se ovajednamna zvala Langmuirova jednaci k+,xl\(N"" -NJ =k.tNA (2.3) na, iako je Hill prvi objavio.
•• Ekvilibrljumska konstanta zove se i konstanta disocijacije.
Proporcija zauzetih receptora iii »zauzetost« receptora (»occu Neki autorl ville korlste reciprocnu vrednost KA, iIi konstantu
pancy«), (PA) je NiN.." ~to je nezavisno od Nco, i dato je formu 10m: c¢initeta. 15
Brzina gamje reakcije = k+h(N.., - NA)
(2.1)
1st! pristup korlstl se u analizi podataka dobijenih iz eksperimenata u kojima se vezivanje leka meri direktno (videt! str, 10). U tom slu6aju, oOOos izme4u 'Vezane kolicine Uganda (B) ! koncentracije liganda (x A ) prikazanjejednacinom:
B=Bm"xAxA+KA)
(2.6)
gde je Bm" ukupan broj vezivnih mesta u preparatu (obicno izraZen u pikomolima po miligramu proteina). Da bi se rezultati prikazaJi u lineamom obliku, jednacina 2.6 mo~e se preurediti: '
BlxA =B"",/KA-BIKA
(2.7)
Grank BlxAU odnosu na B (poznat kao Scatchardov dijagram; slika 2.2C) daje jeOOu pravu Iinlju iz koje se mogu odrediti iBm" i K A , Statistillki, ova proceduraje problematillna, i uobieajeno je da se ovi parametri izra/lunaju iz netransformisanih vrednosti vezivanja kori§6enjem metoda nelineame regresije.. Do sada, naSa analiza je podrazurneva\a vezivanje jednog Uganda za homogenu populaciju receptora. Da bismo se pribliZili realnoj farmakologiji, moramo da razmotrimo ~ta se desava kada je pri
[!J
sutno vi~e od jednog liganda I kako je odgovor tkiva povczan sa zauzeto§Cu receptora.
Vezivanje u prisustvu vise lekova 'f Pretpostavimo da BU dva leka, A i B, koji se vezuju za Isti recep tor, sa konstantama disocljacije K. i Ky., primtni u odgovarajucim koncentracijamaxA i xg • Ako su ova dva leka u kompeticiji za isto mesto vezivanja (tj. receptor se moze prilagoditi sarno jednom od lekova), ollda, primenom istog rezona kao za prethodno opisanu si tuaciju za jedan lek, okupiranost lekom A data je formulom 2.8. (i8)
Poredenje ovog rezultata sa jednacinom 2.5 pokazuje da dodavanje H:ka B, kao sto se i ocekivalo, smanjuje zauzetost lekom A. Slika 2.9A pokazuje krive vezivanja za lekA u prisustvu rastu6ihkoncen traeija leka B, demonstrirajuci pomeranje bez promene nagiba iii maksimalnog odgovom, sto karakterise kompetitivni antagoruzam
Reverzibilni kompetltivni antagonlzam 1.0
g c:
.~ a. ::l
.:.t::
0
«l
c: 1\i
0.5
.§ .:.t::
r:!
u.
0 10-2
10.1 Koncentracija agonista
~ Ireverzlbilni kompetltivni antagonizam
10
Koncentracfja agonlsJa
Slika 2.9 Hlpotetlcke krive odnosa koncentraclje agonlsta I zauzetostl (okupiranostl) receptora u prisustvu reverzi· bllnlh Ilreverzlbllnih antagonlsta. KoncentraciJe su normalizovane prama konstanti disodjacije (K. npr. 1,0 odgovara koncen traclJi jednakoj K i okupiranosti od 50%. A Reverzibllni kompetitivnl aritagoniZam; B Ireverzibilni kompetitivnl antagonizam.
16
veei afinitet za R, on pomera ravnoteZu prema R i to je inverzni agonist (negativna efikasnost). Prema tome, efikasnost je svojstvo leka determinisano relalivnim afinitetom w za R i R"': def'micija pozuata kao hipoteza 0 dva stanja, koja nam bJiZe definise pojarn eftkasnosti. U ovom pogJavlju izbegJi smo detaljna objaSnjenja i prllieno smo pojednoiltavili teoriju efikasnosti leka. Kako budemo viSe ucHii 0 molekulamoj furmakologiji receptora. koja objamjava kako se ak tivacija receptora prevodi u bioloSki odgovor (Poglavlje 3), mane ovogpojednostavljenog objdnjenja postate vidljivije. Komplikaci je ce 5e pojaviti kada budemo ukljuCili i G-proteine (pogJavlje 3), gde nij~ mogu6e objasniti "'aktivaciju" receptora kao jednostavan prelazak iz jednog u drngo stanje. MoZe se reei da zavisno 0 kom agonisti govorimo, isti receptor mol!e da se pall i gasi kilo sijalica. Teoreticari u farmakologiji poku§avaju da u ove teorije ukljuiSe dru ge matematH~ke modele, ali nekako su molekulski fenomeni uvek zajedan korak dalje od teorije. Ipak, model dva stanja pruZa korl sua obja~njenja u pogledu kvantifikacije dejstva leb. Kao uvod, preporucuje se Kenakinova knjiga (1997).
(sliks 2.4). Stepen pomeranja udesno, nalogaritamskoj skali, pred stavlja odno.~ (rA' definisan jednaiSinom X;IxA' gde je XA' rasruca koncentracija leka A) koUka puta se koncentracija leka A mora po veeat! da bi se savladao antagollizam l~a B. Ovo maze biti pred stavljeno i na drug! naiSin: (2.9) Tako, rA zavisi sam~ od koncentracije i konstante disocijacije leka B, a ne od koncentracije i konstante disocijacije leka A.
Ako je lek A agonist, a lek B kompetitivni antagonist, i pretpoata
vimo da ce odgovor tkiva biti funkcija od pA (nije neophodno da
bude lineama funkcija), tada se vrednost rA' odredena pomeranjem
krive odnosa koncentracije i efekta agoniste pri razlicitim koncen
tracijama antagonism, moze koristiti za procenu konstante ravnote
Ze KB antagoniste. Takve farmllkoloske procene rA obiiSno se naziva
ju odn08i doza agonisla. Ovajednostavna i vrlo korisna jednacina
2.9 poznata je pod nazivom Schildova jednacina, po farmakologu koji ju je prvi upotrebio da analizira antagonizam leka. Jednacina 2.9 rnoZe ae izraziti logaritamski u obliku: log (r-l) '" Jog xB - log KB
(2.10)
ANTAGONIZAM LEKOVA
Tako dijagram log (r-l) naspram log xB • obiiSno poznat kao Schil dov dijagram (eng\. plot, slika2.4), daje jednu pravu linlju sa nagi Delovanje jednog leka cesto je smanjeno iIi potpuno bloki born 1, a njen presek sa apscisom jedanak je log Kg. Slede6i pH i rano u prisustvu nekog drugog leka. 0 jednom mehanizmu, pK obeleZavanje, potentnost antagonista moZe se izrazitl kao pAz vrednost, au uslovima kompetitivno~ antagonizma p~ == - log KB• Brojcano, pA~ se defini~e kao negativni logaritam molame koncen tracije antagonista koja je potrebna da se proizvede odnos doze ago niste (rA) jednak 2. Kao §to se pH vrednost izraZava sarno prostim brojevima, tako je i pAz od 6.5 jednaka KII od 3.2 x 10.1 moV!. Ova analiza kompetitivnog antagonizma pokazuj e sledece karakte ristike odnosa doza r: • on zavisi sarno od koncentracije i konstante ravnoteZe antagoni ste, a ne od velicine odgovora koji je izabran kao referentna tacka zamerenje,
Inverzni agonist
• on ne zavisi od konstante ravnoteZe agoniste,
~><~
• on se lineamo pove6ava sa xB ' a nagib dijagrama (r-l) u odnosu naxBjednakje kolicniku lIKB• Ova veza, zavisno od karakteristi ka agoniste, treba da bude ista za sve agoniste kqji deluju na istu populaciju receptora. Ove tvrdnje proverene su na mnogirn primerima kompetitivnog an tagonizma (sllka 2.4).
Agonist
-gill
Stanje " mirovanja ' "
Aktivacija receptora i efikasnost leka
ODGOVOR
/ . Stanje aktlvaaije
Antagonist
"Kao ~to prikazuje slika 2.1, agonist i antagonist se vezuju za isti receptor, ali samo agonist aktivira receptor. Kako mozemo ovu razliku da izrazimo teorijski? Jednostavno objaSnjenje (slika 2.1) je da okupirani receptor preiazi iz stanja »mirovanjai~ (R) u stanje »aktivacije« (R *) sarno posle vezivanja agoniste. Tendencija zauzetog receptora AR da prede u aktivno stanje AR'" zaviai od konstante disocijacije ove reakcije, tj. ~/a.
0;
Cist antagonist ima kolicnik Wa. '" zatosto nema konverzije re ceptora u aktivno stanje, dok za agonist, Wa lma konacnu vrednost, koja je razlicita za razlicite agoniste. Pretpostavimo da je za lek X, Wa. maio, ~to znaei da je sarno mali dec populacije receptora aktlviran, iako je okuplranost lOO%, dok je za lek Y, ~/(l veliko, ~to maci da je veeina okupiranih' receptora aktivirana. Prema to me, ~/(l je mera eflkasnosti. Kao sto vee mamo, receptori mogu da imaju konstitutivnu aktivaciju (tj. R* konformacija moZe da po stojl i bez vezivanja liganda, tako da dodati lek nailazi na stanje ravnoteZe izmedu R i R*, slika 2.10). Ukoliko je aflnitet leka veei za R* nego za R, lek prouzrokuje pomeranje ravnoteZe prema R* (lek potencira aktivaciju I biva proglaSen za agonistu). Ukoliko je njegov afinitet za R* vrlo visok, lek se vezuje za skoro svc R"', pa se ovaj leknaziva punim agonistom (pozitivna eftkasnost); ukolik6 lek nema pove6an afinitet za R"', ravnoteZa R: R'" ne6e bit! poreme cena i taj lek je kompetitivni antagonist (eflkasnost 0); ako lek ima
Slika 2.10 ModeJ dva stanja. Receptor je prikazan u dva konformaciona stanja, stanju mirovanja (R) i staniu aktivaaije (R*) koji su u ravnotezi. U odsustvu liganda, stanie ravnoteze je pomereno ulevo, a samo nekollko re
ceptora se nalazi u R* stanju. Za konstitutivno aktivne
receptore, znatan broj receptora nalazi se u R* konlorma
aiii u odsustvu liganda. Agonisti imaju veei afinltet za R'
nego za R stanje, tako da se ravnoteza pomera prama
R*. Ukoliko je veei reiativni afinitet za R* nego za R. veta
je efikasnost agoniste. Inverzn! agonist! imaju veei afini
tet za R nego za R* stanje i pomeraju ravnotezu ulavo.
»Neutralni« antagonlsti imaju jednak aflnitet za R I RO,
tako da ne utieu na stanie ravnote!e, ali redukuju veziva
nje ostaUh liganda.
\.
~
17
Altemativno, velicifia apsorpcije aktivnog leka iz gastroin testinalnog trakta moze se smanjiti iIi se velicina bubrefue ekskrecije moze povecati. Interakcije ove vrste mogu biti vazne u klinickim uslovima i bice detaljno opisane u Pogla vlju 51.
ANTAGONIZAM PROUZROKOVAN BLOKADOM RECEPTORA Ovaj tip antagonizma obuhvata dva vama mehanizma:
kompetitivnom antagonizmu, vee je ranije bilo rec~ ja klasifikacija obuhvata sledeee mehanizme: y... hemijski antagonizam;
""f".
farmakokinetski antagonizam;
"-f. antagonizam prouzrokovan blokadom receptora;
~ • nekompetitivni antagonizam, npr. blok veze receptor-efek tor; fiziolo§ki antagonizam. . f
:t.
Reverzibilni kompetitivni antagonizam veeJe ranije opi san. Njegova kljucna karakteristika je paralelno pomeranje krive odnosa koncentracije i efekta agoniste, bez~manjenja maksimalnogodgovora, kao i Hneami Schildov dijagram.· Ove karakteristike odraZavaju cinjenicu daje brzina disod jacije molekula antagoniste dovoljno velika da se sa dodat kom agoniste brzo uspostavlja novo ravnotefno stanje.U stv.ari,a.,g()nistje sp()soban da.. istisne molekule antagonista ~Sa receptora, m~ ne mole, naravno,daTstisne vezane mo Iei(uh.~ antagonista. Istiskivanje se de&ava zato sto, zauzinia njem odredenog dela slobodnih receptora, agonist smanjuje brzinu asocijacije molekula antagonista; stoga, brzina diso cijacije privremeno prevBzilazi brzinu asocija~ije i ukupna okupiranost receptora antagonistom opada. Ireverzibilni kompetitivni antagonizam se desava kada antagonist disosuje veoma sporo iii nikako, tako da dodava nje agoniste ne prouzrokuje nikakve promene u okupirano sti receptora antagonistom*, Ako antagonist okupira Pa frakciju receptora, onda, bez obzira na velicinu koncentracij e agoniste, okupiranost reeep tora agonistom ne mote da prede (1 - PB), tako da kazemo da je karakteristika ovog tipa antagonizma nesavladivost. Efekti reverzibilnih i ireverzibilnih kompetitivnih antagoni sta uporedeni su na slid 2.9.
HEMIJSKI ANTAGONIZAM Hemijski antagonizam se odnosi na neuobicajnu situaciju u kojoj dye supstance stupaju u reakciju u nekom rastvoru. Kao rezultat toga, izostaje efekt aktivnog leka. Primer za to su upotreba helirajueih agenasa (npr. dimerkaprol) koji vezuju teske metale i tako smanjuju njihovu toksicnost, za tim primena antitela protiv proteinskih medijatora, kao sto su citokini i faktori rasta, sto je strategija koja se od skoro primenjuje u terapijske svrhe (poglavlje 13).
FARMAKOKINETSKI ANTAGONIZAM
18
Farmakokinetski antagonizam opisuje situaciju u kojoj »antagonist« efikasno smanjuje koncentraciju aktivnog leka na mestu njegovog delovanja. Ovaj tip antagonizma moze se odigrati na razlicite naeine. Stepen metabolicke degradaci je aktivnog leka moze se povecati (npr. smanjenje antikoagu lacijskog efekta varfarina u prisustvu fenobarbitona, koji ubrzava njegov hepaticki metaboHzam (poglavlja 6 i 50).
'IV nekim slucajevima (slika 2.lIA), tesko je napraviti razliku izmedu reverzibilnog i ireverzibilnog kompetitivnog antagonizma i nekompetitivnog antagonizma. Ovo je posledica postojanja rezer vnih receptora: ako je za nastanak maksimalnog biolo~kog odgo vora potrebna mala zauzetost receptora agonistom (recimo, 1% od ukupnog broja), onda je moguce blokirati ireverzibilno skoro 99% receptora, bez inhibicije maksimalnog odgovora. Kriva odnosa koncentracije i efekta pomera se udesno i daje stiku reverzibilnog kompetitivnog antagonizma (stika 2.118). Cinjenicaje daje irever zibilni kompetitivni antagonist histaminsldh receptora sposoban da redukuje osetljivost glatkih misica na histamin skoro 100 puta, bez redukcije mai
.!r~YI~.~i~J1!li!<:()~ti~h'lliJm~gQ~J~~ak~Ij_~t!c.~n za lekove koji se vezuju za receptore kovalentnim vezarna. Onfse uglaviiom"'k~ri;t;~~k~perlmeniaIne-sVrlie:-udaleko
• Ovaj tip antagonizma ponekad se naziva nekompetitlvan, ali je bolje taj tennin korlstiti za antagoniste koji ne zauzimaju isti re ceptor.
100
>
>
E
C ... ~
*-...
50
0 > 0 OJ '0
0
OJ '0
0
0
O~+'='-iiI"I
10-10
10-9
10.8
10-1
10-6
10-5 Koncentraclja,~arbahola
Koncentracija 5-hidroksitriptamina (molll)
(mol/I)
Slika 2.11 Efektl ireverzlbllnih kompetltivnih antagonlsta na krlve odnosa koncentraclje i efekta agonista. A Glatki mlsl6i zeluca pacova odgovaraju na primenu 5-hidroksitriptamina u razlicito vreme, posle dodavanja metlzerglda (:10-8 mol/l). B Glatki misl61 zeluca zeca odgovaraju na primenu karbahola u razllcito vreme, posle dodavanja dibenamlna (10~ moll1).' (Iz: (A) Frankhujisen A L, Bonta I L 1974 Eur J Pharmacol26: 220:(B) Furchgott R F 1965 Mv Drug Res 3:21.)
slici 2.llB, mada je sasvim mogu6e da se dogodi izvesno pomeranje udesno.
manjoj meri i u klinicke svrhe. lreverzibilni enzimski inhibi tori kojideluju slieno, imaju klinicku primenu. Primeri en zimskih inhibitora su: aspirin (Poglavlje 16), omeprazol (Po glavlje 24) i inhibitori monoaminooksidaze (Poglavlje 38).
FIZIOLOSKI ANTAGONIZAM Fizioloski antagonizam je izraz koji se koristi da bi se opisalo medusobno delovanje dva leka koji u organizmu deluju u suprotnom smislu. Na primer,.h.i~p!lll!n deluje na receptore parijetalnih 6elija zeludaene mukoze i tako stimU" lise sekrecijl.l_lcis~Iine, dok o~~2.Lblokira ovaj efekt, in hibiraju6i protonsku pumpu;' Moze se reci, da ova dva Ieka deluju kao fizioloski antagonisti.
NEKOMPETITIVNI ANTAGONIZAM Nekompetitivni antagonizam opisuje situaciju kada anta gonist blokira u nekoj taeki lanac dogadaja koji dovodi do nastanka odgovora na primenu agoniste. Na primer, lekovi kao sto su verapamil i nifedipin spreeavaju influks jona ka cijuma kroz membranu celije i tako nespecificno blokiraju kontrakciju glatkih misi6a prouzrokovanu nekim drugim lekovima (Poglavlje 18). Po pravilu, kod ovog tipa antago nizma nagib i maksimalan odgovor krive odnosa koncentra cije i efekta agoniste smanjeni su, kao sto je prikazano na
Cesto se pri kontinuiranoj iii ponovljenofprimeni leka poste peno smanjuje njegov efekt. Desenzitizacija i tahifilaksija su termini koji se koriste za opisivanje ovog fenomena, koji se vrlo eesto razvija tokom nekoliko minuta: J.:z.raz:taJeran~.-: )f!.;tc~~~.~J1,Q~AA-Qll~nta efekta ~ek1b .toji..ae.xaz.~ilLCak.nedeJj~~ rtdJ:4kJt;iJ:1Wll!, ,,!~Is~.~_§~_poJlek&tkoristi.JJ.glam~Ql.!lY~~L~!tgulilikomW&
1?jj§,k~.'i?tlkasl1~:. ~r:!~~iioJlalel~.J~i2II!~/~aeJmruJj p
da,.de.gubitak~eBti,antiInil
~ogIavlje 44 i 50). Mnogo razlieitih mehanizama je
PROMENA U RECEPTORIMA Kod receptora koji su direktno vezani za jonske kana1e, desenzitizacija je cesto brza i nagla. U nemomusku1amoj spojnici, desenzitizacija je prouzrokovana sporim konforma cijskim promenama receptora, koje dovode do cvdceg ve zivanja mo1eku1a agoniste, ali bez otvaranja jonskih kana1a
5s
. ]10mV
~,...,
'l'l~JIIII.llllJl
J,
II III j I!
] 5mV
I
! I! I! I! I!! !
I
I I II ! III!
(videti Changeux et a1., 1987). Fosforilacija intracelu1amih regiona proteinskih receptora je sekundaran, sporiji meha nizam desenzitizacije jonskih kana1a (videti Swope et al., 1999). Receptori povezani sa sekundamim glasnicima (Po glavlje 3), takode pokazuju desenzitizaciju, a to je prikazano za p.receptore na slici 2.12B. Fosfori1acija receptora interfe rira sa njihovom sposobno~cu da aktiviraju kaskadu drugih glasnika, iako jos uvekmogu da veZu mo1eku1e agoniste. Mo1ekulski mehanizam .ove pojave opisali su Lefkowitz i saradnici (1998) i bice razmatran u Poglav1ju 3.
GUBITAK RI1'CEPTORA Dugotrajno iz1aganje receptora de10vanju agoniste moze da dovede do\ postepenog smanjivanja broja receptora na povrsini celije i naziva se nishodnom regulacijom recepto ra. To je prikazan~ na primeru p-adrenergickih receptora na slici 2.12B i sporiji je proces nego nemogucnost aktivaci je drugih glasnika (»uncoupling«). Ispitivanja na ce1ijskim ku1turama pokazala su da se broj p-adrenergickih receptora smanjio za oko 10% tokom 8 easova, u prisustvu niske kon centracije izoprena1ina, a za oporavak bilo je potrebno neko liko dana. S1i~ne promene opisane su i kod ostalih tipova receptora. Receptori nestaju u procesu el1docitoze delova me brane, koji takode zavisi od fosfori1acije receptora. Ovaj tip adaptacije je uobieajen za honnonske receptore i ima znacaj kada se 1ek primenjuje duze. Oesenzitizacijaje obicno neze 1jena komplikacija u tokti klinicke primene 1eka, ali se na neki naCin moze i iskoristiti. Tako, na primer, oslobadaju6i hormon za gonadotropine (videti Pog1avlJe 29) koristi se za 1ecenje endometrioze i raka prostate; kontinuirana primena ovog hormona paradoksalno inhibira oslobadanje gonadotro pina (suprotno norma1nom stimu1atomom efektu fizio10ske sekrecije).
ISCRPLJIVANJE MEDIJATORA 4
8 24
56
88
Vreme (h)
Slika 2.12 Dve vrste desenzitizaclje receptora. AAcetilholin (Ach) na zavrsnoj motomoj ploei zabe. Krat ka depolarizacija (skok potencijala) proizvedena je doda vanjem ACh iz pipete u kratkim vremenskim intervalima. Dugotrajnl period primene ACh (prava linija) prouzrokuje pad potencijala u toku 20 s, zbog desenzitizacije, a opora yak nastupa za isto vreme. B Beta-adrenergicki recepto ri u kulturi 6elija glioma pacova. Izoprenalin (1 mmol/l) je dodat u vremenu oznaeenom sa nula, a aktivacija adeni lat-clklaze i gustina j3-receptora merena je u prikazanim vremenskim intervalima. Za vreme rane faze (kada nije bilo veze sa drugim glasnicima), odgovor (plava Unija) opadao je bez promene u gustini receptora (crvena lini ja). Kasnije je odgovor opadao uporedo sa sm'anjenjem gustine receptora zbog njlhove intemalizacije. Zelena i narandiasta /inlja pokazuju oporavak odgovora I gustine receptora, posle ispiranja Izoprenalina, za vreme rane i kasne faze. (Iz: (A) - Katz B, Thesleff S 1957 J Physiol 138:63; (B)- Perkins J P Trends Pharmacol Sci 2:326.)
20
U nekim slucajevima, desenzitizacija je udruzena sa praZnj e njem depoa osnovnih supstanci. Lekovi, kao sto je amfeta
min, koji oslobadaju amine iz nervnih zavrnetaka, pokazuju znaeajnu tahifilaksiju, jer prazne depoe amina(poglavlja ] 1 i 31).
POVECANJE METABOLICKE DEGRADACIJE Tolerancija na izvesne lekove, barbiturate i etanol, delimio no se desava zbog ponovlj ene prirnene iste doze, soo prouzro kuje progresivno smanjenje koncentracije u plazmi. Stepen oo~~rancije obiono je umeren, a kod oba pomenuta primera u razvoj OOlerancije ukljueeni su i drugi mehanizmi.
( I
I
'
Bond R-A, LeffP, Johnson T-D et aI. 1995 Physiological effects of inverse agonists in transgenic mice with myocardial overexpression of the p( adrenoceptor. Nature 374: 270-276 (Studlla sa vainlm klinickim,lmpH kaclJama kaja pokazuje da povecana ekspresija {J-adrenergickih recep tora prouzrokuje konstitutiV1/U aktivaclJu receptora) Changeux J.p, Giraudat J, Dennis M 1987 The nicotinic acetylcholine recep tor: molecular architecture of a ligand-regulated ion channel. Trends Pharmacol Sci 8: 459-465 (Jedan ad prvih opisafimkcije receptora na molekulskam nlvou) Daeffler L, Landry Y 2000 Inverse agonism at heptaheJical receptors: concept, experimental approach and therapeutic potential. Fundam Clin PharmacoI14:73-87 De Ligt R·A-F, Kourounakis A-P, Ijzerman A-P 2000 Inverse agonism'at G protein-coupled receptors: (patho)physiologicaI relevance and implica tions for drug discovery. Br J PharmacoI130: 1-12 (Korlstan revijski clanak, koji daje puno primera recep/ora sa kanstitutivnom aktivacijom I Inverznih agonista, uz raspravu 0 znacaju toga za mehanizam bolesti i otkriCe novih lekava) . Franks N-P, Lieb W~R 1994 Molecular and cellular mechanisms of general anaesthesia. Nature 367: 607-614 (Pregled promena shvatanja 0 dej stvu anesle/lka) Jenkinson D·H 1996 Classical approaches to the study of drug-receptor interactions. In: Foreman J-C, Johansen T (eds) Textbook of receptor
FIZIOLOSKA'ADAPTAC1JA Smanjivanje efekta leka mo~e nastati usled njegovog ponis tavauja homeostatskim mehanizmima. Na primer, efekt sni tenja krvnog pritiska tiazidnim diureticima je ogramcen po stepenorn aktivacijom sistema renin-angiotenzin (poglavlje 15). Takvi homeostatski mehanizmi vdo su uobiatjeni, i ako se odigravaju sporo, dovode do postepenog razvoja toleranci je. Iskustvo pokazuje, da se i mnogi nez~ljeni efekti lekova, kao sOO su muenina i pospanost, mogu smanjiti, cak i ukoliko se primena leka nastavi. Mi mozerno pretpostaviti da se neke vrste fizioloske adaptac.ije javljaju udruZene za izmenjenom ekspresijom gena, rezultirajuci u promeni nivoa regulatomih molekula, ali malo se zna 0 mehanizmima ove pojave.
pharmacology. eRe Press, Boca Raton, FL (Dobro objalnjlJ1lje farma kolo§ke analtze efekata kajl se ostvaruju pmka reL'£ptora) Kenakin T 1997 Pharmacologic analysis of dmg-recepror interactions, 3rd edn. Lipincott-Raven, New York (Koristan I detaljan ud£benik koji po krlva svu materiju imetu u ovom pogiavlju) Lefkowitz R-J, Pitcher], Krueger K, Daaka Y1998 Mechanisms ofp'adrenergic receptor desensitization and rescnsitization. Adv Phannacol42: 416-420 Milligan G, Bond R·A, Lee M 1995 Illverse agonism: pharmacological curi osity or potential therapeutic strategy? Trends Pharmacol Sci 16: 10--13 (Odlican pregled konstitutivne aktivacije receptora i efekata inverznih agonista) Seifert R, Wenzel-Seifert K 2002 Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause ofdisease and common properties of wild-type recep tors. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Phannaco1366: 381-416 (Detaljan revijski Clanak koji islice da se kanstitutivna akfivaclJa receptora javlja ceata I daje vezana za nekoliko vainih oboijenja) Stephenson R-P 1956 A modification of receptor theory. Br J Pharmacal 11: 379-393 (Klaslcna analiza receptorskog dejstva koji llvodi pqjam ejlkasnostl) Swope SoL, Moss S-I, Raymond I-A, Huganir R·L 1999 Regulation of li gand-gated ion channels by protein phosphorylation. Adv Second Mes senger Phosphoprot Res 33: 49-78 (Sveobuhvatan pregledni (Jianak . e u desenzitlzaclji)
21
l2
Kako lekovi deluju:
molekulski aspekti
izmedu molekulske strukture receptora i njegove funk clonalne veze sa odredenlm tlpom efektorskog slste "1a. U sledeoo dve poglavlja blce prlkazano kako ovi molekulski dogadajl utlcu na vama Cell/ske funkcije - Do je korlsna bazo za razumevanje deJstva lekova na zlve organlzme u cellnl. Blcemo detallnlj' vise nego sto je potrebno. da bl sa razumela baztcna farmako loglja, sa namerom da studentl, ako iele, preskoee' . III brzo proeltaJu ovo poglavl/e bez gubltka osnovne nltl; medutlm, slgurni smo da ce buduoo farmakologl ja bltl utemelJena na napretku cellJske I molekulame blologlje.
Proteini, kao ciljna mesta delovanja lekova na 6elije sisara (slika3.1), koji su opisani u ovom poglavlju, mogu se pode . liti na: • receptore, U ovom poglavlju, prelazimo sa osnovnlh prlnclpa dej stva lekova. kojt su objasnjenl u Poglavlju 2, na moleku Ie koji su ukljucenl u prepoznavanje i prenos hemljskog slgnala u eel/jski odgovor. Molekularna farmakotoglla je poslednJlh godlna brzo napredovala. Ova nova zna· nja Izgledaju nedokucivo kada se formullsu termlnoto giJom I stllom moderne molekularne biologlJe, all ona sada pruzaju jednostavnlju i koherentniju podlogu za razumevanje dejstva lekova nego sto to bllo ranije. Ovaj aspekt, a ne molekularni detal/I, blce predmet naseg teksta. Napredak molekuiarne farmakologl/e nl· je promenJo samo nase razumevanje dejstva l&kova; on je otvorlo i mnoge terapijske mogucnostl, kole se diskutuJu u druglm pogJavljlma. . Prvo cemo razmatrati tlpove ell/nih protelna na ko Ie lekovi deluju. Potom cemo oplsatl glavne famllije re ceptora I Jonsklh kanala kole su otkrlvene klonlran/em I IstrazivanJima strukture. Na kra/u, razmatramo razllclte forme veza Izmedu receptora 1 efektora (mehanlzme prenosa slgnala) preko koJlh su receptorl povezanl sa regulaciJom Celljske runkel/e. Glavna tema je odnos
Je
• jonske kanale, • enzime, • nosaee (transportni molekuli). Ve6ma najv~nijih lekova deluje na jedan od pomenutih tipova proteina, ali postoje i izuzeci. Tako, na primer, kol hiein (Poglavlje 16) stupa u interakciju sa·strukturnim pro teinom tubulinom, dok se nekoliko imunosupresivnih leko va (npr. ciklosporin) vezuje za citosolne proteine, poznate kao imunofilini. Takode se koriste i terapijska antitela koja otklanjaju citokine (proteinski medijatori ukljuceni u infla maciju). Ciljna mesta za hemioterapijske lekove obuhvataju DNK i delove ceUjskog zida, kao i ostale proteine.
Receptorl
.£eceptori (slika 3.1Atsu elem~nti u sis~ml!1!.emijs~~~=~ munikacije,"~~J.U5&Qt~i!lj!!LfiJl1kdjs\'J:W"gitihm~.Jtl~!H·
~Mnogrter;Pijski korisni lekovi deluju kao agonisti iii kao antagonisti receptora za poznate endogene medijatore. Neki
Jonsklkanali I
~ RECEPTORI
o
I I
Agonlstl
.0...
AntagonIstl
I
~
...
¥-
Bez efekta Bloklrani endoganl medljator!
---0...
JONSKI KANALt Bloklrana propuslljivosl
Blokalor!
l
MOd.". tori
d
_~"'~11;1. ~o:~~~ana otvaranja
1
\I~rovatno6a
~==~===========.-------~ @] ENZIMI
III
Inhibitor
Lainl
.
-1IIIIIIIi1ll1l>
""_!III III
0-::::-, &;;; •
lIupstrat
lit
1JIii!I!III! III
Inhlbirana normalna reakclja
.. Stvoren neodger varajuCl matabollt
L"'·""'"!M·~ "...
-)
-~-.
[Q] TRANSPORTERI Normalsn transport
Neki jonski kanali (poznati kao ligaud-Zl1J!.isni. odnosno re:. Jd§J11!!!lilsiionskL~lJOJ:l1Jlmt~rP.2TJ!.~ ...ill ~lLH r££mtor i ptv1;1JJ!jJU~-iamQ...kada·~ist~.~~~ Utj ~s:£eR.t,,!~~!~l\D!lW.e..oDl~,:aju.pW~tllL mS.t . . . ne 'onskekan~(voltaZnijon ski kanali)~.!~~Q.,pos.e1lM_~,JJeneralno, lekovi utieu na funkciju jonskog kanala tako ~to stupaju u interakciju iii sa receptorskim mestom ligand-zavisnih kana la Hi sa ostalim delovima molekula kanala. Interakcija moze biti indirektna, tj. da ukljueuje G~I!0tein i ostale posrednike, iIi direktna, kada se lek vezur~ zaj'onski kanal imenja nje govu funkciju. Najjednostavniji slueaj je dejstvo lokalnog anestetika na voltaZno-zavisni natrijumski kanal (Poglavlje 43), kada molekulleka fizieki blokira protokjona kroz ka nal (slika 3.1B). Primeri lekova koji se vezuju za pomoena mesta na jon skim kanalima, i tako utieu na funkciju kanala su sledeci:
• vazodilatatorni lekovi dibidropiridinskog tipa (Poglavlje 36): inbibiraju otvaranje kalcijumskih kanala L-tipa. • benzodiazepinski anksiolitici (Poglavlje 36): vezuju se za deo kompleksa koji Cine receptor gama-aminobuterne ki seline (OABA) i hloridni kanal (ligand-zavisni kanal) i koji se razlikuje .ad mesta vezivanja same GABA-e; ve eina benzodiazepina olakSava otvaranje kanala posle dej stva GABA-e, ali neki inverzni agonisti imaju suprotan efekt, prouzrokuju anksioznost pre nego smirenje.' • derivati sulfonilureje (Poglavlja 45 i 25): koriste se za
leeenje diabetes mellitus a i deluju na ATp·zavisne kali
jumske kanale u B-celijama pankreasa i tako pojaeavaju
sekreciju insulina.
Pregled razlieitih familija jonskih kanala i njihova funk
primeri dati su u tabeli 3.1. U veeini slueajeva, endogeni me dijator je otkriven vise godina pre fannakolo~ke i biohemij skekaraktepzacije receptora, ali postoje primeri receptora za sintetske lekove (npr. za benzodiazepine, videti Pogla vlje 36, i derivate sulfonllureje, Poglavlje 25) za koje jos uvek nisu identifikovani endogeni medijatori.
u tabeli 3.1. ~~~.u:~~t.,Is~?~_ko~E~!itiY~IlL. ~inPiM2L~~!!!~J-i2. ~J:!Ey:~~!!?jluiJp.pr. neostigmin, de luje na acetilholinesterazu; Poglavlje lO)llLrr.~~~til2ill1ij!t .. .,bibjlQ.tS~.i!ulUnpr. aspirin, koji deluje na ciklooksigenazu; Poglavlje 16). Imunofilin koji vezuje ciklosporin, poseduje enzimsku aktivnost izomeraze koja katalizuje cis-trans izo merizaciju ostataka prolina u proteinima, ~to predstavlja va Znu reakciju koja omogueava ispravan raspored proteina. In bibicija enzima je jedan od mehanizama kojim ciklosP'orin prouzr'okuje imunosupresiju. Lekovi takode mogu da deluju kao faini supstrati, gde molekuIi lekova podlem hemijskoj transformaciji s ciljem da formiranju neodgovarajuci proiz vod koji ulazi i unistava normalan metabolieki put. Primer za t,O je antikancerogeni lek, fluorouracil, koji zamenjuje uracil kao intermedijer u biosintezi purina, ali ne mote da se konvertuje u timidilat, pa na tajnaein blokira sintezu DNA i spreeava deobu eelija (poglavlje 50).. 23
Treba pomenuti da neki lekovi zahtevaju enzimsku degra~
daciju, da bi iz inaktivnog oblika (lek-prekursor, pro..drug);
pre§li u aktivan oblik (Poglavlje 8): Primeri su dati u tabeli
8.3. Stavise, kao sto se razmatra u Poglavlju 52, toksicnost 'lekova je cesto posledica enzimske konverzije leka u njego~ ve reaktivne metabolite.
Postoji mnogo primera takvih nosaea (slika 3.1D), uJdjucu ju6i i one odgovome za transport glukoze i aminokiselina u celije, transport jona i mnogih organskih molekula kroz bubrewe tubule, transport Na+ i Ca2+ iz celija i preuzimanje prekursora neurotransmitera (kao sto je holin) Hi samih neu... rotransmitera (kao sto su noradrenalin, 5-hidrQksitriptamin (5-HT), glutamat i peptidi) od strane nervnih zavl'setaka. Ovi transporteri pripadaju dobro poznatoj strukturnoj famili No 1........."' ....... 0+ ... 1 ........ Ia..... ln
ji, koja se razlikuje od odgovarajucih receptora (videti Giros .!!2IiI ~~~1 __, and Caron, 1993). Transportni mol/!ku1i predstavljaju mesto ~~£r.t iOtyLLJru.iJilLQr.g~~~~~~ke ~~i,"su¥oteinskinosaCi,"s".obzimnu,Y!I~~:"· prepoznavanja za odredene supstance koje prodiru ,u celiju i mogu biti cHjna mesta za lekove koji ~lokiraJu transportne rlas:u,timo1~eb,i0n@,+Su¥is&polarni,,(.nedovoljno rastvor~ . Ijivi u lipidima) dll..Jlj .sami ~Ji, ktokJjp~,,* sisteme. Neki primeri dati su u tabeli 3{L
RECEP.TO.RSKIPRort:INI····· . IZOLACIJA I KLONIRANJE RECEPTORA Sedamdesetih godina proslog veka, fannakologija je uMa u no vu fazu leada su receptori, koji su do tada sarno postojali kao
teorijski pojmovi, postali biobemijska realnost. Tomeje pretho dio razvoj tehnike obelezavanja receptora (poglavlje 2), sto je omogueilo da se radiokativno obele.z:el1 receptorski materijal ekstrahuje i preCisti. Ovaj pristup prvi put je UBpeSno primenjen na nikotinskim holinergickim receptorima (Poglavlje 10), kada su iskoriscena dva prirodna kurioziteta. PM kuriozitet bili su elektrieni organi mnogih riba, leao sto su rata (Torpedo sp.) i elektriene jegulje (Electrophorus sp.), koji se sasroje od mo~i fikovanog misicnog tldva sa obiljem membrana osetljivih na acetilholin, pri ~emu ti organi sadrZe veCu kolicinu receptora za acetilholin nego bilo koje poznato tkivo. Drugi kuriozitet je otrov kobre, koji sadrZi polipeptide koji se vezuju za nikotinske holinergiCke receptore sa visokom specificno~ Ove supstan ce, poznate leao a-toksini, mogu biti obeleiene i koristiti se za odredivanje sadd.aja receptora u tldvima itkivnim ekstraktima. Najpoznatiji toksin je a-bungarotoksin, a predstavlja glavnu komponentu otrova malajske trakaste zmije (Bungarus multi cinctus)'. Tretman misienog iii elekrtric:nog tkiva nejonskim deterdZentima <:ini rastvorljivim proteinske receptore vezane za membranu. Oni se zatim mogu preeistiti tehnikom afinitet ne hromatografije, u kojoj se ligand za receptor, kovalentno vezan za matriks hrorna1ografske kolone, koristi za apsorpciju receptora i njegovo odvajanje od drugih supstanci iz ekstrakta. Receptori zatim mogu da se uklone iz kolone ispiranjem ras tvorom koji sadrzi neki antagonist, kao sto je galamin. Sli~ni pristupi danas se koriste za preei~cavanje velikog dela recepto ra za hormone i neurotransmitere. ka.o i j onskih kanala, protein skih nosaea i ostalih vrsta ciljnih molekula. Kada su receptorski proteini jednom izolovani i prec:is . ceni, bilo je t\ioguce analizirati kratke sekvence aminokiseli na, a zatim izvesti i odgovarajuce sekvence ba~a iRNK. Ta da su sintetisani oligonukleotidi (test-uzorci) i kori~ceni za ekstrahovanje cele DNK sekvence, primenom standardnih metoda klohiranja komplementame DNK (cDNK), polazeci od cDNK biblioteke dobijene iz tkiva bogatih receptorima koji se proueavaju. Prvi klonirani receptor dobijen je na ovaj naein, ali danas postoje altema.tivne strategije za ekspresio no kloniranje, koje ne zahtevtiju prethodnu izolaciju i pr~is cavanje proteinskog receptora. Mnoge informacije dobijene su uvodenjem klonirane DNK koja kodira odredeni receptor, u celijsku liniju putem transfekcije, produkujuci tako celije koje poseduju strane receptore u funkcionalnoj formi. Tako dizajnirane celije do zvoljavaju mnogo precizniju kontrolu ekspresije receptora nego 810 je slueaj sa prirodnim celijarna iIi intaktnim tkivi rna, i ova tehika se siroko primenjuje u ispitivanju vezivanja i farmakoloskih karakteristika kloniranih receptora.
26
• Priroda dobro 6ini §to dni ove te~ko naoruzane ribe i zmije poda lje od nas. lronija je §to je B. mult/cinetus sada zvanieno na spisku ugrozenih zivotinjskih vrsta, i to zbog potrebe nau6nika za njenim otrovom. Evolucija ume da ode predaleko.
'f' Kako su informacije 0 sekvencama pristupaCnije, stmtegija klo niranja bez primene puriflkacije proteina iii pravijenja ekspresio nih sistema sve $e viSe koristi. Ovo se zasniva na prcdvil'lanju ho mologih sekvenci medu receptorima. Region homologih sekvenci dozvoljava, upotrebom peR (polymerase ehainreaetion) i RACE (rapid amplijieatwn ofeDNA ends), replikaciju DNA molelrula ko ji se nalaze u sekvencama. Ako je izabrana sekvenca, na primer, prisutna kod nekoliko tipova dopaminskih receptora, njenim am pliftkovanjem moze se dobiti novi dopaminski receptor ili nesto sasvim drugo. NeOOckivani receptori (npr. kanabinoidni rcecptori; videti Poglavlje S3) bili su slullajuo otkriveni, a ima jol mnogo mera receptora »siroQCa« (»orphan receptors«)" - strukture nalik na receptore za koje jos Disu poznati funkcionalni ligandi..
kroniranje receptora eesto otkriva molekulske varijante !(podtipove) poznatih receptora koji jos nisu evidentirani u\farmakoloskim studijarna. Ovo ima tendenciju da izazo ve\
TIPOVI RECEPTORA Receptori pobu4uju razlicite vrste celijskih odgovora. Neki od njih su vrlo brzi, kao sto su oni ukljuceni u sinapticku transmisiju, koji se ostvaruju tokom nekoliko milisekundi. Drugi receptorski efekti, kao sto so oni koje prouzrokuju tireoidni iIi razli~iti steroidni hormoni, traju vise sati, eak i dana. Postoji mnogo primera vezanih za vreme delovanja; npr., vreme potrebno za delovanje kateholamina meri se se kundama, dok je za delovanje peptida potrebno dlde vreme. Nije iznenad~nje da postoje razUciti tipovi povezanosti izme du okupiranosti receptora i sledstvenog celijskog odgovora. Na osnovu molekulske strukture i transdukcionog mehani zma, mozemo razlikovati 4 tipa receptora iIi superfamilija (slike 3.2 i 3.3 i tabela 3.2).
Tip 1: Receptorskl (ligand-zavlsnl) jonskl kanali IJgand-.~islil:i.,.~r-eooptotski)AJot:lskLl
jgJJl2.IJP.J111i;J:,~£i!J11llI.t:. Ovi membranski proteini poseduju
strukturu sHenu stukturi jonskih kanala, ali za razliku od njih, poseduju mesto za vezivanje liganda (receptor), obicno u ekstracelularnom delu. To su receptori na koje deluju brzi neurotransmiteri. Primer su nikotinski holinergicki receptor (Poglavlje 10), GABAA receptor (Poglavlje 32) i NMDA
•• Neobicon izraz u stilu Dickensa koji deluje neadekvatno snisho
dljivo, po§to mo~o pretpostaviti da ovi receptori igraju defmis~
nu ulogu u fiziolo§koj razmeni signa~ to §to smo ih okaraktetl
sali kao }}sirocice« govori pre 0 uaSem neznanju nego 0 njihovom
statusu.
••• Ovde, kada je rell 0 receptorima, ligond-zavisne jonske konale
smatramo primerom receptorske familije. Drugi tipovi jonskih ka
naia su kasnije opisoni (str. 45); mnogi od njih su takode mete za
lekove, mada nisu receptori u pravom smislu rooL
Slike 3.2
Tipovl veze receptor-efektor. (R, receptor; G, G-proteln; E, enzim; Ach, acatilholin.)
Tip 1
Tip 2
TIp 3
Tip 4
_Beileptor.skL(Ugand,za¥isnf). ReceptorlvePni
--.jOjl!!~L~.a.!!a.!I.
·~,~~~P!~~~'!1.~ ..,.
Lokalizacija Membrana
Membrana
Membrana
Intracalularno
Efektor
Jonski kanal
Kanailli enzim
Enzim
Transkripcija gena
Veza
Direktna
G-protein
Direktna
Preko DNK
Primer!
Nikotinski holinergicki Muskarlnski holinergickl recaptor (nAChR), recaptor za receptor (mAChR), gama-aminobuternu kiselinu adrenoceptori tipa A (GABAA)
Receptori za insulin, faktor rasta, citoklne
Receptorl za steroldne i tiroidne hormone
Struktura
Oligomemi skup subjedlnica koje okruzuju centralnu poru.
Jedna transmembranska splrala povezuJe ekstrace lulEjrnl receptorskl dec sa intracelularnim kinaznim delom
Monomerna struktura sa odvojenim receptorskim i delom koji vezuje DNK
Monomerna (obleno dimerna) struktura kOJu cine sedam transmembransklh splrala
27
Sllke 3.3 Opsta struktura c8tirl famllije receptora. Pravougli segment! predstavljaju hidrofobne cx-spiralne delove proteins kojl se sastoje iz 20 aminokiselina, koJI formiraju transmembranskl dec receptora. Receptori dir~ktno vezanl za jonske kanale sadlte cetlri iii pet subJedinica koje su prikazane na slicl, a ceo kompleks sadrZ116-20 transmembransklh segmenata koji okru zuju centraln! jonski kanal. A Tip 1: ligand-zavlsni (receptorski) jonski kana Ii; B Tip 2: Receptori vezanl za G-proteine; C Tip 3: Receptori vezani za kinaze; D Tip 4: Nuklearnl receptori koji kontrolisu transkripciJu gena.
28
(N-metil-D-aspartat), AMPA (a-amino-3-hidroksi-5-metil 4-izooksazolpropionat) i kainatski receptori (Poglavlje 32).
vezani sa intracelulamim efektomim sistemima preko O-pro teina. Oni obrazuju najve6u familiju receptora· koja obuhva
Tip 2: Receptorl vezani za G~protelne Receptori vezani za O-proteine (OpeR) poznati su i kao me tabotropni receptori iIi heptaheliCni (7 transmembranskih petlji) receptori. To su transmembranski receptori koji su po
• Kod nematode Caenorhabditis eiegans, oko 5% od 19.000 gena kodira receptore vezane za O-proteine (OPCR), a90% njih 8U "siro oi6i", odnosno receptori bez poznatog Uganda (Bergmman, 1998). Verovatno da humani genom ima vi§e od 1.000 GPCR, §to predsta vlja veliki posao za farmakologe.
ta receptore za mnoge hormone i spore transmitere, npr. muskarinski receptori (Poglavlje 10), adrenergicke recepto re (Poglavlje 11) i receptore za hemokine (Poglavlje 15).
Tip 3: Receptori vezani za klnaze i njima slleni receptori Ovaj tip receptora obuhvata veliku i heterogenu grupu mem branskih receptora za koje se vezuju proteinski medijato rio Sastoje se iz ekstracelulamog dela (domena) za koji se vezuje ligand, a koji je jednostrukom transmembranskom spiralom povezan sa intracelularnim delom (domenom). U mnogim slucajeyima, intracelulami deo je po svojoj pri rodi enzim (posedbje aktivnost protein kinaze iIi gvanilat ciklaze). Ovaj tip receptora ukljucuje receptore za insulin, razlicite citokine i faktore rasta (Poglavlja 15 i 25); recep tor za atrijalni natriuretski peptid (poglavlja 17 i)8) glavni je primer receptora veianog za gvanilat ciklazu. Obe vrste veoma su slicne po strukturi, mada se njihovi transdukcioni mehanizmi razlikuju.
Tip 4: Receptori smesteni u jedru - nuklearnl receptori Receptori sme~teni u jedru reguli~u gensku transkripciju. Termin nukleami receptori ponekad ne odgovara zato ~to se neki od njih nalaze u citoplazmi, ali u prisustvu liganda migriraju u jedro. U ovu grupu spadaju receptori za steroid ne hormone (Poglavlje 27), tiroidni hormon (Poglavlje 30) i ostale agense, kao ~to su retinoinska kiselina i vitamin D.
MOLEKULSKA STRUKTURA RECEPTORA Molekulska organizacija tipicnih predstavnika cetiri pome nute superfamilije receptora prikazanaje na slici 3.3. lako se pojedinacni receptori razlikuju H odredenim sekvencama i u duzini intracelulamih i ekstracelulamih delova, cak i u okvi ru iste familije, ipak, dominantna struktura i prenos signala ostaju isti. Jedno od najzaniniljivijih dostignU(~a moderne farmakologije je to ~to je modernu farmakologiju u velikoj meri je osavremenilo saznanje da sarno cetiri superfamilije receptora obezbeduju solidan okvir Za obja~njenje obilja slo zenih informacija 0 efektima veCine ispitivanih lekova.
Heterogenost receptora i podtipovi, Kako su se nizali podaci, postalo je jasno da u okviru iste familije receptori postoje u nekoliko molekulskih varijanti, iii podtipova, koji poseduju slicnu arhitekturu, ali i znacajne razlike u sekvencama, a cesto i u farmakoloskim osobina rna'. Nikotinski holinergicki receptori su tipicni u tom po gledu; posebni podtipovi ovih receptora nalaze se u razlici tim delovima mozga, i razlikuju se od nikotinskih receptora u misicima. Neke od poznatih farmakolo~kih razlika (npr. osetljivost na blokatore), koje postoje izmedu holinergickih receptora u misiCima i mozgu, vezane su za razlike u speci ficnim sekvencama; medutim, koHko nam je poznato, svi
, Receptori za S-RT (videti Poglavlje 12) trenutno zauzimaju vode eu poziciju po raznovrsnosti - sa 14 kloniranih podtipova.
nikotinski holin'ergicki receptor! odgovaraju na isti fizio loski medijator i izuzivaju istu vrstu sinaptickog odgovora, Prema tome, razlog za postojanje brojnih poddpova ostaje zagonetka. .... Veei deo razlika u sekvencama koje Ide u osnovi razlicitosti
receptora po1:iva na genskom nivou, tj. odredeni geni kodiraju po
sebne podtipove receptora. Dodatne razlike potieu od razliCitog
povezivanja delova iRNK
izazvati nastanak viAe receptorskih izoJormi. Posle translacije sa
DNK, iRNK norma1no sadrZi nekodirajuCe regione (lntrone) koji
se odvajaju pomenutim procesom (splicing) pre nego Mo se poruka
prevede u protein. U zavisnosti od mesta povezivanja, ovaj proces
dovodi do umetanja iii izdvajanjajednog iii vise kodirajutih regio
na iRNK, izazivajuci nastanak dugih iii kratkih formi proteina, To
je vaZan izvor varijacija, narocito za GPCR (videti Kilpatrick et a1.,
1999), koji stvara receptOre koji se razlikuju u vezivanju liganda i
prenosu signala (transdukcioni mehanizmi). Ipak, ostaje da se raz
jasni njegov farmakolo~ki znaeaj, Drugi proces koji mo~e stvorhi
razli1:ite receptore od istog gena je revizija iRNK (mRNA editing),
~to uklju1:uje pogrelluu zamenu jedne iRNK baze za drugu i prou
zrokuje malu varijaciju u redosledu receptorskih aminokiselina,
Molekulska heterogenost ove vrste karakteristicna je za sve receptore - odnosno funkcionalne proteine uopste. Nepre kidno se otkrivaju nove izoforme i podtipovi receptora i do stupne su nove verzije kataloga (Trends in Pharmacological
Sciences Receptor and Ion Channel Nomencla/ure Supple ment). Problemi klasifikacije, nomenklature i taksonomije rezultat su pomenutog obilja podataka. Sa fannakoloske tacke gledi~ta, kacla nameravamo da razumemo pojedine le kove i njihovo dejstvo na zivim organizmima, kao i da prona demo bolje lekove, vaZno je da imamo u vidu molekularnu farmakologiju, Pokazalo se na vise nacina da )moviji obred« moze dovesti do otkriea, ali potpuna slozenost ponasanja molekula znaci cia mommo preCi jo~ dug put pre nego sto dostignemo redukcionisticku utopiju koju molekularna far makologija obecava. Kada u tome uspemo, ova knjiga ce bi ti znatno kraca. U meduvremenu, pokusavarno cia izdvojimo opste principe, ada ne potonemo previse u detalje. Sada ce mo opisati karakteristike sve eetiri superfamilije receptora.
TIP 1: RECEPTORSKI (LiGAND-ZAVISNI) JONSKI KANALI MOLEKULSKA STRUKTURA Receptorski (ligand-zavisni) jonski kanali poseduju struktur ne karakteristike koje su zajednicke za sve jonske kanale (opisano na str. 46; videti Ascl'lroft, 2000). Prvo su klonirani i detaljno prouceni nikotinski holinergicki receptori (slika 3.3A; Karlin, 1993). Sastoje se iz cetiri razlicite subjedinice a, ~, y i 0, ptDcemu svaka subjedinica ima maS!) od 40-58 kDa. Cetiri subjednice pokazuju znacajnu homologiju se kvenci, a analiza profila hidrofobnosti, koji odreduje koji seginent lanca formira transmembranski a-heliks, sugerise da je on umetnut u membranu kao ~to se vidi na slici 3.4. Oligomerna struktura (a2, ~, y, 0) poseduje dva mesta za ve zivanje acetilholina, koja se nalaze na povrsini izmedujedne od dye a-subjedinice i susednih struktura. Da bi se receptor
29
aktivirao, potrebno je da se vew dva molekula acetiIholifia. Ovaj receptor je dovoljno veliki da bi se video elektronskom mikrografijom,aslika3.4pokazujenjegovustrukturudobije nu visokorezolucionom elektronskom difrakcijom (Unwin, 1993, 1995). Svaka subjedinica prolazi kroz membranu ceti ri puta, tako da se kanal sastoji od oko 20 spirala koje prola ze kroz membranu i okruZuju centralnu poru. ., Dva mesta za vezivanje acetilholina nalaze se na N-tenninalnim regionima dYe a-subjedinice. Po jedna od transmembnmskih spira la {M2) svake od pet subjedinica ulazi u sastav unutramjeg sloja jonskog kanala (slika 3.4). Pet M2 spirala koje fonnira.ju poru su u predelu membrane oltro savijene na pola, put unutra, formirajuci sUZenje; posle vezivanja acetilholina, ove strukture se rotiraju tako da dovedu do otvaranja kanala.
"
Primenom cHjane mutageneze, koja omogufuje da se izmeni ma li dec Hi jedan aminokiselinski ostatak, dokazano je da mutacija kriticne rezidue M2 spirale menja selektivnost kanala, iz katjon selektivne (dakle, ekscitatome u kontekstu sinapticke funkcije) do anjon-selektivne (tipitno, receptora za inhibitome transmitere, kao §to je GABA) (Galzi & Changeux, 1994). Druge mutacije utieu na otvaranje j desenzitizaciju kanala. Receptori za neke brze neurotransmitere, kao ~to su GABAA recep tor (Poglavije 32), 5.HT)-receptor (poglavlje 12) i glicinski recep tor (Poglavlje 32) slicne su strukture i neld poseduju znilajnu homo logiju sekvenci sa nikotinskim receptorom; broj subjedinica koji je potteban za nastanak funkcionalnog receptora varira, ali je obicno cetiri ili pet. Medutim, drugi ligand-zavisni jonski kanali imaju dru
gaciju arhitekturu, gde poru ce§ce cine petlje nego ttansmembran ske spirale (slika 3.16), §to je zajednicko sa drugim jonskim kana lima. ATP receptor P2x tipa (Poglavlje 12) i glutamatni receptor (PoglavUe 32), koji BU pokazani na slid 3.16 ovog su tipa.
MEHANIZAM OTVARANJA KANALA Receptori ovog tipa kontroIisu najbrze sinapticke dogadaje u nervnom sistemu, u kome neurotransmiteri deluju na posts i napticku membranu nerva iIi misicne ceIije i prolazno pove cavaju permeabilitet za odredene jone. Vecina ekscitatornih neurotransmitera, kao sto su acetilholin u neuromuskularnoj sinapsi (Poglavlje 10) iIi glutamat u centralnom nervnom si stemu (CNS, Poglavlje 32) povecava propustljivost za Na+ i K+. To rezultuje ulaznom strujom, uglavnom jona Na~, koja depolarizuje teliju i. povecava moguenost generisanja akci onog potencijala. Dejstvo neurotransmitera nastaje u toku nekoliko milisekundi i obicno prestaje za isto vreme. Velika brzina ovog odgovora ukazuje daje veza izmedu receptora i jonskog kanala direktna, a molekulska struktura kompleksa receptora i kanala ovo potvrduje (videti dalji tekst). Poznato je da preeiMen holinergicki receptor moze da funkcionise kao jonska kapija (prolaz) na potpuno ve~tackim membrana rna, ~to iskljucuje ucestvovanje biohemijskih medijatora (u celiji iIi membrani) u procesu prenosa signala.
Pora -0,7 nm u precniku
6nm
SpoljMmost
Membrana
3nm
I,• • •,. Citosol
--1
u-heliksi formiraju kapiju (prolaz)
Slika 3.4 Struktura nikotlnskog receptora za acetllholin (tiplcni receptorskl, odnosno ligand-zavlsnl Jonski kanal), unutrainji presek(levo) i pogled odozgo (desno), Pet receptorskih subjedinica (a2, 13, y, 0) formiraju skup koji okruzuje cen
tralnu transmembransku p~ru, ciju unutrasnjost cine M2 spiralni segmenti svake subjedinice. Na njima dominiraju negativno naelektrisane aminokiseline koje cine poru selektivnom za katjone. Postoje dva mesta vezivanja za acetilholin (ACh) u ekstra celularnom delu receptora, izmeCJu a i susedne subjedinice. Kada se acetilholin veze, a-spira Ie se izvijaju u stranu i na taj nacin se pora kanala otvara (prema radovima: Unwin 1993, 1995).
30
" Katz i Miledi (1972) napravili BU ma~jan prodor, omogucivgi, po prvi put, izucavanje o80bina pojedinacnih receptorsIdh jonsIdh kanala. primenom cmalize luma (noise). Studirajuci dejstvo aceti! holina na zaml'loj motomoj plo~i> oni su primetili male, nasumic ne fluktuacije membrallskog potencijala koje su bile Buperponira ne na stabilnu depolanzaciju prouzrokovanu acetilholinom (slika 3.5A). 0ve fluktuacije nastaju zato ~to u prisustvu agoniste postoji dinamicki ekvilibrijum izmedu otvorenog i zatvorellog stanja jon skih kanala. U stanju ravnoteze, brzina otvaranja je uravD(lteZena sa br:iinom zatvaranja, ali Ce broj otvorenih kanabl nasumice fiuk tuirati oko sred)1je vrednosti, od trenutka do trenutka. Merenjem amplitude ovih fluktuacija moZe se izraCunati provodljivostjednog jonskog kanala, a merenjem njihove frekvencije (obicno u obliku spektra kod kojeg je snaga mtma signala prikazana u funkciji fre kvencije; slika 3.5B) moZe se izracunati prosellan period .otvore
rID 10-21
nosti kanala (srednje weme otvorenosti). U slu~ju dejstva acetil holina na zaVIinoj motomoj ploei. provodljivost kanala je ako 20 pikosimensa (PS), sto je ekvivalent intlukJu oko 107 jonlIiiekundi kroz jedan kanal, pri normalnim fiziololikim uslovima. Ii srednje vreme otvorcllosti je od I do 2 milisekunde. VeliCina provodijivosti pojedinacnog kanala potvrduje da se protok jona odvija k:ru% fizic ku porn na membrani. zato llto je protok jona suvile veliki dEl bi bio posledicadejstva nckog nosaea. ProvodljivostkanaJa )'lWIIl!lI'Okova na raziillitim agooistima slietlim acetilholinu je ista, dok snldnje vreme otvorenosti kltuala varira. Jednostavna shema na slici 2.1 koristan je model otvaranja jonskog kanala. Konformacija R"', predstavlja stanje kada je kanal otvoren i isto je za sve agoniste, ~to objdnjava za~o provodljivost kanala ne vanta. Kineticki, srednje vreme otvorenosti determinisano je konstantom brzine zatvaranja, Il, i ona varira ad feka do leka. Kao §to je objdnjeno u Poglavlju 2, jedan agonist visoke efIkasnosti, koji aktivira veliki procenat receptora koje zauzima, odre4enje iz razom ~/a » l, dok za ageniste male efikasnosti ala ima manje Vl'ednosti. .Tehnika patch-clamp, koju BU uveli Neher i Salouan, omogueava dase vrlo mala struja izmeri direktno krozjedanjonski kanaI (sli ka 3.6). a rezultati u potpunosti potvrdl\iu interpretaciju 080bina kanala na OS1l0VU analize surna. Ova tehnika, uvedena 1976. godi ne, pruZa uvid, jedinstven u biolagiji, u fiziolo§ko pona§anje indi vidualnih proteinskih molekula u realnom vremenu i daj~ ntnogo novih saznanja 0 otvaranju i permeabilnosti Iigand-zavisnih (recep torskih) i voltaroo-zavisnihjonskih kanala. Merenje nil jednom ka nalu pokazuje da mnog! transmiteri prouzrokuju otvarailje kanala na bilo kom nivou provodljivosti, nalaz troji jasno name6e neop hodnost revizije jednostavne sheme prikazane na slid 2.1, na kojoj postoji sarno jedno stanje otvorenosti R*. Nije sigurno kako ce se ovo objasniti i u (!emu je fizioloski maCaj, ali ovo je primer kako realno ponManje receptora ne moze dEl se opi~e ovom zastarelim . modelom.
.-, If)
22 ~ 10-
co co c
OJ
(/)
10,23
10 100 Frekveneija (Hz)
Slika 3.5 Acetllhelin preuzrokuje sum na zavrs noj moternoj ploei isba. A Zapis membranske struJe zabeletane za vreme konstantnog napona (engl. volta ge-clamp). Na gomjoj sliei zabeleten je sum za vreme primene acetilholina (ACh) preko mikropipete. Donji za pis Je snimljen u OdSU6tvu ACh, a pad u srednjem delu zapisa je odraz spontanog osiobadanjaACh iz motornog neurona. Stabilna komponenta (DC)ACh signala uklonje na je elektronskim filterima, ostavljaju(;i signal sa sumom visoke frekveneije. B Spektar promene snage suma iza zvanog ACh zabeletenog u istom eksperimentu, kao ato . je prlkazano u gornjem delu slike. Spektar je izraeunat Fourlerovom analizom i uertana je naJbolje prilagodena teorijska kriva (Lorentzian curve), sto odgovara oeekiva nom ponasanju pojedlnacnih populacija kanala kod kojih vreme aktivaeije nasumicno varira. Frekveneija prekida (za koju je vrednost snage jednaka polovlnl njene ogranl Cavaju{:e niskofrekventne vrednostl) omogucava izracu navanje vremena otvorenosti kanala. (Iz: A Andreson C R, Stevens C F 1973 J PhysioI235:655;B Ogden D C i sar. 1981 Nature 289;596).
SUka 3.6 POJedinaeni acetllholin·zavisni jenaki kanali na zavrinoj motornoj ploei Zabe, zabeleieni patch-clamp tehnlkom. Pipeta koja .dodiruJe povr~inu membrane sadrfl 10 mmol!1 acetilhollna (ACh). otklon nadole predstavlja struju kOja tece kroz jedan Jonski ka nal u malom parcetu membrane ispod vrha pipete. Do kraja zapisa dva kanala au se slmultano otvorila. Pro vodljlvost I srednje IIreme otvorenostl ovih kana\a slatu se sa Indirektnom racunicom dobljenom iz anallze suma (vidi sliku 3.5). (Silka je preuzeta cd D Colquhoun iDe Ogden.)
31
·_~cta Ii nmvaJu.jRtlQlt:QJmtQ:JJ;e~)jroa,. • Ugleynom Sij UkUUC!mi U b~y ~llal2tiCls!J trallsmj§iju .. .-Po,@lgJLn$/JkO struJdumlh f~mllijaj me"u.!iqjillluILoai vluzatWPuenisku,eOVi od 1-5su!?,iftdiniga~
•Veii~e!jganda I~ranjflM,ll8fa~di9t:avaj!:!.~ u l~kU nei(ollko mllisekundl.
~!!Q1.!rr Sl£!!il
DP 2: RECEPTORI VEZANI ZA G-PROTEINE (GPCR) Velika GPCR familija obuhvata mnoge receptore bliske far makolozima, kao ~to su muskarinski holinergicki receptori, adrenergiCki receptori, dopaminergiai receptori, 5-HT re ceptori, opioidni receptori, receptori za brojne peptide, pu rinergi~ki receptori i nmogi drugi, kao §to su hefuoreceptori ukljureni u olfaktome funkeije (vided Dryer and Be!ghard, 1999) i detekciju feromona, a takode i mnogi »sirocici« (re ceptori bez poznatog liganda) (Marchese et al., 1999). Kvan titativna farmakolo~ka ispitivanja sa razlicitim agonistima i antagonistima otkrila su razlicite podtipove ovih receptora. Mnogi GPCR su klonirani, ~to je otkrilo neuobicajeno ko herentan model njihove molekulske strukture. Kao i grcki amfiteatri, svi oni su vrlo sHeni u svojoj osnovnoj gradi. Veeina neurotransmitera, izuzimaju6i peptide, mogu da stupe u interakciju i sa GPCR i sa receptorskim (ligand-zavi snim) kanalima, sto omogu6uje da isti molekul prouzrokuje sirok spektai- razlicitih efekata. Pojedini peptidni hormoni, medutim, deluju iii na GPCR Hi na receptore vezane za kina ze (videti dalji tekst), ali retko na oba tipa receptora; sliena probirljivost postoji i kod mnogih liganda koji deluju na nu klearne receptore·,
MOLEKULSKA STRUKTURA Prvi potpuno opisan GPCRje ~-adrenergicki receptor (pogla vlje 11), koji je kloniran 1986. godine. Potom je molekular na biologUa veoma brzo pristigla farmakologiju i klonirana je veCina receptora koji su ranije identiflkovani na osnovu farmakoloskih svojstava; one sto je izgledalo revolucionar no 1986. godine, sada je uobicajena stvar. Danas svaki recep tor mora biti kloniran pre nego sto se uvrsti u klasiflkaciju.
32
• Medutim, brojni su, primeri promiskuiteta. Steroidni hormoni, normalno verni nukleamim receptorima, povremeno se okre6u jon skim kanalima i drugim metama (Falkenstein i sar., 2000), a neki eikosanoidi deluju na nukleame receptore i GPCR. Priroda je sa svim bez predrasuda, mada su takvi primeri pogodni da uc::ine far makologe namrntenim, a studente obeshrabrenim.
GPCR se sastoje od jednog polipeptidnog lanca koji ima do 1100 aminokiselina: nj ihova opsta grada prikazana j e na slid 3.3B. Karakteristiclla struktura ovih receptora sadni se· dam transmembranskih a-spirala, sHenih onima na jonskim kanalima, sa ekstracelulamim N-terminaJ.nim delom razlici te duZine i intracelulamim C-terminalnim delom. GPCR su podeljeni u tri razliCite familije (videti Schwarz, 1996). Po stoji znacajna homologija medu sekvenearna clanova jedne familije, ali ne i izmedu clanova razlicitih familija. Oni dele istu heptaspiralnu strukturu, ali se razlikuju u diugim aspek tima, uglavnom u du!ini N-terminalnog dela i lokalizaciji mesta za vezivanje agoniste (tabela 3.3). Familija A, srodna rodopsinu, daleko je najveca i obuhvata ve6inu monoamin skih i neuropeptidnih receptora. Familija C je najmanja, i njeni glavni clanovi su metabotropni receptor za glutamat i Ca2+-senzitivni receptori" (vided Poglavlje 30). Razumevanju funkdje receptora ovog tipa, znacajno su doprinela ispitivanja bliskog proteina, rodopsina, koji je od govoran za transdukciju u stapi6ima mrefnja~. OVaj pro tein je u velikoj meri prisutan u mremjaci i mnogo ga je lak~e ispitivati nego proteinske receptore (koji su sve sarno ne bogato zastupljeni); onje napravljen po istom planu koji je prikazan na slici 3.3. (videti Stryer, 1986) i takodc proiz vodi odgovor u §iapicu (biperpolarizaciju, udruZenu sa gu bitkom provodljivosti za Na+) putem mehanizma koji uklju cuje G-protein (videti dalji tekst). Najuocljivija razlika je sto foton, a ne molekul agoniste, proizvodi odgovor. Moze se smatrati darodopsin sadrZi svog unutrruinjeg agonistu-re tinal, koji se izomerizuje iz trans (neaktivan) i cis (aktivan) oblik prilikom apsorpeije fotona. Eksperimenti sa ciljanom mutagenezom pokazuju da se mesto za vezivanje G-proteina nalazi na dugoj trecoj eitopia zmatskoj petlji, jer uklanjanje iIi modiflkacija ovog dela, do vodi do toga da receptor jos uvek moze da veze ligande, ali ne i G-proteine niti da izazove odgovor. Obicno, odredeni podtip reeeptora seiektivno se spaja sa odredenim G-protei nom; izmena delova citoplazmatske petlje izmedu raz!icitih receptora menja njihovu selektivnost za G-proteine. Za male molekule, kao sto je noradrenalin, deo za vezi· vanje liganda verovatno se ne nalazi na ekstracelulamom N~terminalnom kraju, kao sto je to kod reeeptora vezanih za jonske kanale, vee je umetnut u 1"dSCep izmedu a-spiralnih segmenata unutar membrane (slika 3.3B), slieno udubljenju u moiekulu rodopsina koje zauzima retinal. Peptidni Iigandi, kao sto je supstanea P (Poglavlje 13), vezuju se mnogo speci flcnije za ekstracelulame petlje, kao sto je prikazano na siic! 3.3B (videti Schwartz and Rosenkilde, 1996). Eksperilnenti ma sa tackastim mutaeijama moguce je oznaciti domen za
•• Ca2+-senzitivan receptor (videti Conigrave'et aI., 2001) neuobi c::ajen je GPCR koji se ne aktivira uobic::ajenim medijatorima, vee ekstracelulamim Ca2+ u koncentracijama od 1 do 10 mmoVl: izuzet no nizak afmitet u pore4enju sa drugim GPCR agonistima. On se nalazi na 6elijama paratireoidne zlezde i slliZi da ~eguli§e koncentra ciju ekstracelulamog Ca2+ kontrolom sekrecije parathormona. Ovaj homeostatski mehanizam potpuno je razli6t od mehanizma za kon trolu mtercelularnog Ca2+o kome se govori u Poglavlju 4.
Tabala 3.3 Familije receptors koje kontrolisu G-protelni
Familija
Receptorl a
A. Familija rodopsina
Najve6a grupa; receptor! za ve6inu aminskih neurotransmitera, mnoge neuropeptide, purine, prostanoide. kanabinoide, i dr.
B.Familija receptora za sekretin/glukagon.
Receptor! za peptidne hormone, ukljucuju6i sekretln, glukagon, kalcitonin.
Strukturne karkteristlke
Kratak ekstracelularni (N-termlnalni) , nastavak; ligand se vezuje z.a transmembranske spirale (amin!), iii za ekstracelularne petlje (peptidi). Intermedijaran ekstracelulami nastavak koji sadrfi dec za vezivanje liganda.
C. FamiliJa metabotropnih Mala grupa; metabotropni glutamatni re- ,bUgaCak ekstracelularni nastavak kojl glutamatnlh receptora/senzora ceptori, GABAB receptori. receptori koji Isadr!i dec za vezivanJe Iiganda. za kalcijum. su osetljivi na kalciJum (Ca 2+-senzitivni). aZa celokupan spisak vldeti Wess ( 1 9 9 8 ) . .
Napomena: Cetvrta, posebna famillja ukljucuje mnoge receptore feromone, ali ne I farmakoloske receptore.
vezivanje liganda na ovim receptorima, a nadamo se da ee uskoro biti moguce napraviti sintetski ligand na bazi pozna te strukture receptorskog mesta - vazan kamen temeljac za razvoj farmaceutske industrije koja je do sada bUa inspirisa na uglavnom strukturom endogenih medijatora (kao sto je histamin) iii biljnih alkaloid a (kao sto je morfin)'. Za sada, ne postoji kristaina forma GPCR, tako da moena X-krista lografija ne moze biti koriseena u definisanju molekulske strukture ovog receptora. Zato je dizajniranje novih GPCR liganda rizican posao.
ALTERNATIVNI MEHAI\IIZMI AKTIVACI,JE RECEPTORA lako je aktivacija GPCR obicno posledica vezivanja agoni sta, moze se odigrati i putem drugih mehanizama. Rodopsin, pomenut ranije, aktivira se cis-trans izomerizacijom inkor poriranog retinala koja se odvija pod uticajem svetlosti. Jos jedan primer su receptori koji se aktiviraju proteazama, od kojihje do sada identifikovano cetiri tipa (videti Vergonolle et aI., 2001). Dugo se vee zna da trombin, proteaza uklju cena u kaskadu koagulacije krvi (videti Poglavlje 20), tako de inicira razlicite eelijske odgovore vezivanjem za GPCR (PogIavlje 20). Njegova proteazna aktivnost je osnova njego vog dejstva i ona odseca deo ekstracelulamog N-terminala deo koji cini 41 aminokiselina (slika 3.7; Hollenberg, 1996; Dery et aI., 1998). N-terminalni ostaci se zatim vezuju za domene receptora u ekstracelularnim petljama i funkcioni flU kao «vezani agonisti». Receptori ovog tipa nalaze se u mnogim tkivima, i verovatno da i ostale proteaze funkcio nisu kao agonistt'o Jedna od posledica ovog tipa aktivacije je ta, da receptor moze biti aktiviran sarno jednom, tako da je neophodna kontinuirana resinteza proteinskog receptora . • Danas fannaceutska ind:ustrija sve vise pronalazi pocetne struktu re pretra~ivanjem ogromnih hemijskih biblioteka (videti PogJavlje 54). Nije potrebna inspiracija, vee sarno robusni testovi i efikasna robotika.
Inaktivacija se odigrava desenzitizacijom, ukljucujuci fosfo rilaciju (vidi dalje), posle koje se receptor internalizuje i raz graduje, da hi hio zamenjen ~lOvosintetisanitn proteinom. GPCR takode mogu biti konstitutivno aktivni, u odsutvu bilo kakvog agoniste (videti Poglavlje 2). To je prvo bilo pokazano na ~-adrenoceptoru (videti Poglavlje 11), gde mu tacije u trecoj intracelularnoj petIji, iIi jednostavna preko merna ekspresija receptora, rezultuju pojavom konstitutivne aktivnosti receptora. Nekoliko humanih bolesti je udruzeno (videti dalje), iIi sa spontanom mutacijom receptora koja re zuItuje konstitutivnom aktivacijom receptora iIi stvaranjem antitela protiv ekstracelularnog domena receptora, koji imi tiraju efekt agonista.
PRENOS (TRANSOUKCIJA) SIGNALA 00 STRA!\IE GPCR GPCR kontrolisu mnogo razlicitih aspekata celijske funkci je, 0 cemu se detaljnije govori u Poglavljima 4 i 5, delujuCi na razlicite signalne transdukcione mehanizme. Veza izme du membranskih receptora i prvog stupnja signalne transduk cione kaskade ostvaruje se preko G-proteina.
G-proteinl i njihove uloge G-proteini prectstavljaju srednji upravljacki sloj u organizaci onoj hijerarhiji, posredujuci izmedu receptora - probirljivih mandarina osetljivih na najblaii dasak njihovih sopstvenih, odredenih hormona - i efektorskih enzima iIi jonskih kanaia brigade radnika koji primaju zadati posao ne' traze6i da znaju koji je hormon u pitanju. Ovi proteini su posrednici (»go-between«), ali im sloyo G u nazivu potice od toga sto stupaju u interakciju sa gvaninskim nukleotidima u sastavu GTP i GDP. Oni su danas predmet velikog interesovanja •• Jedan iz farnilije receptora koji se aktiviraju proteazarna, PAR-2, aktivira se proteazom oslobodenom iz mastocita.i nalazi se u senzor nim neuronima. Izgleda da igra ulogu u genezi inflamatomog bola (videti Poglavlje 40).
33
Vezan agonist
rN
I\...r-N Oslobodeni fragment
---N
Fosforilacija . )0
I
INAKTIVAN
AKTIVAN
DESENZITISAN
Slika 3.7 Aktlvaclja tromblnskog I:eceptora proteollti~kim odvaJanjem N·terminalnog ekstracelularnog dela (domena). Inaktivacija se odigrava fosforilacijom. Oporavak zahteva resintezu receptora.
(videti revijske (~:lanke. Dolphin, 1996; ·Gudennann et at, 1996; Schoenberg et al., 1999). G-proteini se sastoje iz tri subjedinice, a, p i y (slika 3.8). Gvaninski nukleotidi vezani su za a-subjedinicu, koja je enzimski aktivna i katalizuje konverziju GTP u GDP. Pi y subjedinice ostaju zajedno i fonniraju py-kompleks. Sve tri subjedinice su u~vr~cene za membranu preko lanca masnib kiselina, koji se vezuje za G-protein reakcijom poznatom kao prenilacija. G-proteini slobodno difunduju u nivou mem brane; zbog toga, jedan skup (pul) G-proteina u celiji moze da stupi u interakciju sa nekoliko razli~iti~ receptora i efek tora, na jedan, u osnovi raznorodan nacin (»promiskuitet«). U stanju »mirovSlnja« (slika 3.8), G-protein egzistirakao ne vezan aPr-trimer, a GDP je vezan za a-subjedinicu. Kada se molekul agoniste veze za GPCR, dolazi do konfonnacionih promena, ukljueuju6i i citoplazmatski dec receptora (slika 3.3B), uz sticanje visokog afiniteta za aPr-trimer. Udruziva nje ovog aPr-trimera sa receptorom izaziva disocijaciju GDP ion biva zamenjen sa GTP (GDP/GTP razmella), sto, za uz vrat, dovodi do disocijacije G-protein trimera, oslobadaju6i a-GTP i Pr-subjedinice; ovo je »aktivna« fonna G-proteina, koji difunduje u membranu i moze da se udruzi sa razli6itim enzimima i jonskim kanalima, prouzrokuju6i aktivaciju i1i inaktivaciju (slika 3.8)*. Proces se zavrsava hldrolizom GTP
34
"Do nedavno, smatralo se da se G-proteinski signali prenose sarno preko n-subjedinice, a da ~1-kompleks simi iskljucivo kao pratilac koji drZi lakomislenu n-subjedinicu van doma§aja razlicitih efektor nih proteina uz koje bi se inace priljubila. Medutim, l3r-kompleks ima sopstveni zadatak i u
u GDP pod dejstvom GTPazne aktivnosti a-subjedinice. Na staH a-GDP zatim disosuje od efektora i ponovo se spaja sa py-kompleksom, zatvarajuci ktug. Vezivanje a-subjedinice za efektomi molekul poveeava njenu GTPaznu aktivnosf, a intenzitet povecanja je razlieit za raz}j(:ite tipove efektora. S obzirom na to da je hidroliza korak koji okoncava spo sobnost u-subjedinice da prouzrokuje efekt, reguIacija njene GTPazne aktivnosti od strane efektomog proteina znaci da aktivacija efektora tezi da bude samoogranicavaju6a. Ovaj mehanizam rezultuje amplijikacijom, zato sto kompleks ago nist-receptor moze da aktivira nekoliko molekula G-protei na za uzvrat, a svaki od njih ostaje udruzen sa efektomim enzimom dovoljno dugo da prouztokuje brojne molekule proizvoda. Taj proizvod je cesto sekundami glasnik (videti dalji tekst) i dalja amplifikacija se odvija prenego sto se pro izvede finalni celijski odgovor. Kako se postize takva specificnost da svaka vrsta recep tora prouzrokuje poseban ceIijski odgovor? Sa zajednickim pulom G-proteina, koji povezuju razlicite receptore i efek tome sisteme, izgIeda da specifi~nost ne postoji, ali to nije slu~aj. Tako, na primer, muskarinski holinergi6ki receptori i p-adrenergicki receptori, koji se nalaze u sr6anim mi~icnim celijama, prouzrokuju suprotue funkcionalne efekte (videti Pogiavija 10 i 11). Glavni razlog je molekulska varijacija u okviru G-proteinske familije (videti Wess, 1998)"". Ove va
•• Do danas je poznato 20 podtipova n-subjedinica, 6 p-subjedini ca i 12 y-subjedinica G-proteina 8to teorijski daje priblifuo 1.500 varijanti trimera. Koliko za sada znamo, specificnost uglavnom za visi od a-subjedinice. Cak i da je tako, 20 podtipova pruu siroke mogu6nosti za specificno vezivanje receptora i njihovih efektora (a mi svakako ne treba da pretpostavimo da su varijacije ~1-komplek sa nevaZne). Medutim, ne6ete se iznenaditi (Cak i da ste u izvesnoj med zbunjeni) ovim prikazom molekulske heterogenosti, posto je u pitanju tok evolucije.
StanJa mlrovanJa
®
Slika 3.8 Funkclja G.protelna. G·protein se sastoji od trl subjedlnloe (a, ~ I V) koje su vezane za membranu preko lipldnlh ostataka. Vezivanje a-subjedlnioe za receptor zeuzet agonlstom prouzrokuJe da se vezani GTP pretvort u.lntraoelulaml GOP: kompleks a-GTP dlsosuje sa receptora j ad Pv·kompleksa I reaguJe sa olijnlm protelnom (cllj 1, mote bltl enzim kao Ato je ada nllat olklaza iii jonskl kanal). Pv-kompleks mole takode da aktivlra oll)nl protein (olij 2). GTPazna aktivnost a-subjedlnlCE! raste kads je cilinl protein vezan, prouzrokuJu6i hidrolizu vezanog GTP u GOP, a potom sa a-subjedinloa relntegri§e sa f3v-komplek som. Stanje aktlvsclje ciljnog proteins prlkazano je u nlJansama sive.
\j l/ '-! 1
• Qyi regegtgr! ,QQnekJl9 sa n!!~~!!!l_ r~BtQ!;lWa.
~" Frf!MtL.ukljl.l~1.I-/IU.l3lfui~§.JJs!llO,WIL~~_~.m,' .!
rijacije su razlog za postojanje tri glavne gruqe G-proteina (G S, GiG ), koje pokazuju selektivnost u od';riosu na recepI q " tore i efektore sa kojima su povezani i koji imaju specificne struktume delove (domene)za prepoznavanje koji su kom plementami specificnim domenima za vezivanje G-proteina u molekulu receptora i efektora. G, izaziva stimulaciju, a Gj dovodi do inhibiicije enzima adenilat ciklaze (slika 3.9), a slicna dvosmerna kontrola funkcioni§e i kod drugih efekto ra, kao sto je fosfolipaza C (PLC; videti Gudermann et al., 1996). G-proteini su kao krtica koja rije u membrani izmedu receptora i efektora, koptroliSuci ove strukture, bez kontakta sa ostalim prostorima. Alfa-subjedinice ovih G-proteina razlikuju se po svojoj strukturi. Jedna funkcionalna razlika, koja moze bid korisna kao eksperimentalna alatka za razlikovanje tipa G-proteina uk:ljucenog u razlicite situacije, odnosi se na delovaI\je dva bakterijska toksina, toksina kolere i pertusisnog toksina. Ovi toksini, koji su u stvari enzimi, katalizuju konjugaciju (ADP-ribozilacija) na a-subjedinici G-proteina. Toksin ko lere deluje samo na G. i prouzrokuje konstantnu aktivaciju. Mnogi simptomi kolere, kao sto su snarna sekrecija tecnosti iz gastrointestinalnog epitela, rezultat su nekontrolisane ak tivacije adenilat ciklaze. Pertusisni toksln deluje na Gi, na Isti nacin.
35
Slika 3.9 Dvo.merna kontrola cnjnlh enzlma putem razli/;itlh G-proteina. Heterogenost G·pro teina omoguCava razlicitim recep torima da ispolje suprotne efekte na ciljne enzime, npr. G. i G1 ns adenllat ciklazu.
CIWEVI ZA G·PROTEINE , Glavni ciljevi za G-proteine, preko kojih GPCR kontrolisu razliCite aspekte 6elijske funkcije su s1ede6i (videti Miligan, 1995; Gudennann et a1., 1996);
Sistem adenllat clklaza/cAMP Otkriee Sutherlanda i njegovih saradnika uloge cAMP . (ciklicni 3,5-adenozin monofosfat) kao intracelulamog me dijatora srogno je barijere izmedu biohemije i farmakologije i stvorilo koncept sekundarnih (drugih) gJasnika u prenosu signala. cAMP je nukleotid sintetisan unutar eelije iz ATP, . pod uticajem enzima vezanog za membranu, tj. adenilat ci klaz,e. cAMP se kontinuirano stvara, a inakiivira se hidro lizom do 5'-AMP" pod uticajem familije enzima poznatih kao JosJodiesteraze. Mnogi razlieiti lekovi, hormoni i neu rotransmiteri deluju na GPCR i produkuju svoje efekte, poveeavajuci i1i smanjujuci kataliticku aktivnost adenilat ciklaze, i na taj nacin pove6avaju iIi snizavaju koncentraciju cAMP unutar celije. Postoji nekoliko molekulskih izoformi enzima, neki od njih selektivno reaguju na G, iIi Gi (videti Simonds, 1999). cAMP regulise mnoge aspekte eelijske funkcije ukljucu juci, na primer, enzime ukljucene u energetski metabolizam, deobu i diferencijaciju celija, zatim transport jona,jonske ka nale i kontraktilne proteine u glatkim misieima. Ovi razliciti efekti posledica su zajednickog mehanizma, aktivacije pro tein kinaze putem cAMP. Protein kinaze regulisu funkciju brojnih eeIijskih proteina, katalizujuci fosforilaciju ostataka serina i treonina, a koristeei ATP kao izvor fosfatnih grupa. Fosforilacija moze da aktivira iIi inhibira ciljne enzime iIi jonske kanale. Slika 3.10 pokazuje puteve u kojima poveea nje cAMP u odgovoru na aktivaciju ~-adrenergickih recep tora utice na enzime ukljucene u metabolizam glikogena i masti, masnih i misienih eelija. Ovo rezultira koordiniranim 36 odgovorom kojim se deponovana energija u formi glikoge-
na i masti oslobada u formi gluk6ze i omogucuje misicnu kontrakciju. Drugi primed regulacije putem cAMP-zavisnih protein kinaza ukljucuju poveeanu aktivnost voltaznih kalcijumskih kanala u misiCnim eelijama srca (videti Poglavlje 17); fos forilacija ovih kanala poveCava kolicinu Ca2+ koji ulazi u eeliju za vreme akcionog potencijala i tako poveeava snagu kontrakcije srca. U glatkom misi6u, cAMP-zavisne protein kinaze fosfo .rilisu (i na taj..filWin inaktiviraju) drugi enzim, kinazu lakih Ianaca miozina, kojaje neophodna za kontrakciju. Relaksaci ju glatkih misi6a prouzrokuje povecanje produkcije cAMP u glatkim misi{:ima (videti Poglavlje 18). Kao sto je vee pomenuto, receptori vezani za G1 a ne za Gs, inhibiraju adenilat ciklazu i tako smanjilju stvaranje cAMP. Primeri ukljueuju izvesne tipove muskarinskih holi nergickih receptora (npr., ~-receptor srcanog mi~ica, videti Poglavlje 10), u 2-adrenergieke receptore u glatkom misicu (poglavlje 11) i opioidne receptore (Poglavlje 40). Adenilat ciklaza se moze direktno aktivirati izvesnim agensima, uklju cujuci forskolin i jone fiuora; ovi agensi se koriste eksperi mentalno u ispitivanjima uloge cAMP sistema. cAMP se hidrolizuje unutar celija pod uticajem fosfom esteraza, familije enzima koje inhibiraju lekovi kao sto su metilksantini (npr. teotiUn, kofein; Poglavlja 22 i 41) i sllde natil (poznat kao Viagra). Slicnost ovih lekova u delovanju sa kateholaminima, odraZavaju njihovu osobinu da poveea vaju intracelularnu koncentraciju cAMP. Postoje razlicite tkivno-specificne izoforme fosfodiesteraze, a selektivni in hibitori ovog enzima imaju primenu u kardiovaskularnim i respiratornim oboljenjima (Poglavlja 18,22).
Sistem fosfolipaza Cllnozltol fosfat Fosfoinozitidni sistem,jedan vaZan intracelularni sistem se kundarnih glasnika, otkrili su Hokin i Hokin pedesetih godi na proslog veka, a njihov naueni interes bio je povezan sa
• Alternativne skracenice za ove medijatore su: Ptdlns za PI; PtdIns(4,5).Pz za PIPz; Ins(1,4,5),P3 -za IP1; Ins(1.3,4,5).P4 za IP4
ATP
cAMP----+1
gonist
e-
.Slika 3.10 Regulaclja energetskog metabollzma putem cAMP. (AC. adeniJat ciklaza)
izucavanjem sek.recije soli iz nazainih zIezda galebova. Oni su nasli da je sekrecija povezana sa povecanjem prometa manje klase membranskih fosfolipida poznatih kaofosfoino zitidi (Pt. slika 3.11). Potom su Michell i Berridge naSH da mnogi hormoni, koji prouzrokuju povecanje koncentradje slobodnog intracelulamog Ca2+ (npr. muskarinski agonisti i agonisti a-adrenergickih receptora pri dejstvu na glatke mi sice i pljuvaene zlezde, kao i antidiuretski hormon (vazopre sin) pri dejstvu na 6elije jetre), takode povecavaju promet (turnover) PI. Nadeno je i da jedan odredeni clan PI famili je, fosfatidilinozito14,S·bisfosfat (PIPz)' koji poseduje dodat ne fosfatne grupe vezane za inozitolski prsten, igra kljucnu ulogu. PIPzje supstrat za enzim vezan za membranu, PLCp, koji ga cepa na diacilglicerol (DAG) i inozitol1 ,4,S-trifosfat (IP3; slika 3.12), koji funkcionisu kao drugi glasnici. Aktiva cija PLC~ razlicitim agonistima odvija se preko G-proteina, na potpuno isH naein kao i aktivacija adenilat ciklaze, iako
su raz!iciti podtipovi G-proteina ukljuceni. Posle cepanja PIP 2, kao sto je prikazano na slid 3.12, fosforiIacijom DAG nastaje fosfatidna kiselina, dok se IP3 defosforiHse, ponovo vezuje sa fosfatidnom kiselinom i ponovo formira PIP2' Liti jum, agens koji se koristi u psihijatriji (Poglavlje 38), bloki ra taj ciklus (videti sliku 3.12). Inoz/tol fosfati I intracelularnl ka/cijum IP 3 je medijator rastvorljiv u vodi, koji se oslobada u cito plazmi i deluje na specifieni receptor - IP 3 receptor koji predstavlja ligand-zavisni kalcijumski kanal na membrani endoplazmatskog retilruluma. Glavna uloga IP3 (opisana sa vise pojedinosti u Poglavlju 4) je kontrola oslobadanja Ca2~ iz intracelulamih depoa. S obzirom na to daje za efekte broj nih lekova i hormona potreban intracelulami CaH , ovaj put je posebno znacajan i zaslufuje veliku paZnju. IP) se kon vertuje u celiji do 1,3,4,5-tetrarosfata, IP4' putem specifiene
37
DAG
PA
o
}
medijatorom, arahidonskom kiselinom (Poglavlje 15) koja se stvara dejstvom fosfolipaze A2 na membranske fosfoUpi de, tako da se aktivacija PKC takode deSava sa agonistima koji aktivimju enzime. Razlicite izoforme, kao ~to su tirozin kinaze (0 njima se govori kasnije, str. 42) deluju na razlicite funkcionalne proteine, kao sto su jonski kanali, receptori, enzimi (ukljucujuei ostale kinaze) i proteini citoskeleta. Ki Daze igraju centralnu ulogu u transdukciji signaJa i kontroli brojnih razlicitih aspekata 6elijske funkcije. DAG~PKC ve za obezbeduje mehanizam pomocu kojeg GPCR moze da mobilise armiju kontrolnih mehanizama.
C
I
o
Jonski kanali kao ciljevi za G-proteine
("*'>---'1»
trP'tI*,~-~/.+{~", HO .' 1 'ifOH Ye 2
15
31
1(1,4,5)P3
®~'OH
® Sliu 3.11 Struktura fosfatldilinozltof biafosfata (PIP,) na kojoj au prikazana mesta capanja raznim fosfolipazama u cllju stvaranJa aktivnfh medijatora. CepanJe fosfolipazom A2 (PLA) prolzvodi arahidonsku kiselinu. Cepanje fosfollpazom C (PLC) proizvodl inozi tal trifosfat (1(1,4,5)P z) idiacilglicerol (D~G). (PA, fosfa tidna kiselina; PLD, fosfolipaza D.) Obratite paznju da je praten inozltola heksozne strukture: supstitucione grupe koJe se prikazuju iznad iii 'spod povrsine prstena, na po zicijama 3 i 5, nisu ekvivalentne.
GPCR moze da kontrolise funkciju jonskih kanala direktno, putem mehanizama koji ne ukljucuju sekundame glasnike, kao sto su, cAMP i IP. Ovo je prvi put pokazano za sreane misi6e, ali sada izgleda da je direktna interakcija G-protein kana! opsta pojava (videti Wickham and Clapham. 1995). Prvi primeri su dobijeni ispitivanjimakalijurnskih kanaJa. U srcanom mi§icu, na primer, muskarinski holinergiW recep tori pojaeavaju permeabilitet za jon K+ (na taj naCin blper polarizuju celije i inhibiraju elektri~nu aktivnost, Poglavlje 17). Veruje se da su slicni mehanizmi aktivni i u neuronima, gde opijatni analgetic! smanjuju ekscitabilnost otvarajuci kalijumske kana1e. Ova dejstva posledica su direktne inter akcije izmedu G-proteinske subjedinice i kanala, bez uklju civanja drugih glasnika. Kao sto je prikazano na slici 3.8, slobodna a-subjedinica iIi kompleks py"subjedinice i G-pro tein mogu biti medijatori koji kontrolisu kanale. Uloge receptora vezanih za G-proteine u kontroli enzi ma i jonskih kanala prikazane su na slid 3.13.
Speclficnosf agon/ste kinaze, Konkretna uloga IP 4 jo~ uvek nije poznata (videti Irvine, 1999), ali postoje podaci da je ukljucen u prenosenje f signala preko Ca2t • ledna od mogucnosti je da IP4 ola~ava ulazak Ca2+ kroz plazmatsku membmnu, cime se sprecava praznjenje intracelulamih depoa pod uticajem IP 3'
Dlacllgliceroll proteIn klnaza C
38
DAG se stvara, kao i IP 3' kad god se preko receptora izazove hidroliza PI. Glavni efekt DAG je aktivacija protein kinaze vezane za oluembranu, protein kinaze C (PKC), koja katali zuje fosforilaciju razHcitih intracelulamih proteina (videti Nishizuka, 1988; Walaas and Greengard, 1991; Parker and Dekker, 1996). DAG je, za mzliku od IP, visoko lipofilan i zadrzava se unutar membrane. Vezuje se za specificno me sto na PKC molekulu, koji putuje od citoplazme do eelijske membrane u prisustvu DAG i na taj nacin postaje aktivira na. Postoji barem 12 razlicitih podtipova PKC (videti Toker, 1998) koji imaju razlicitu eelijsku distribuciju i fosforilisu razlicite proteine. Veeinu aktivira DAG i poveean nivo intm ce1ularnog Ca2+, a oba prouzrokuju aktivaciju GPCR. PKC takode aktivira forbol estar (veoma nadrazajna supstanca koju stvaraju neke biljke) kojije izuzetno koristan u ispitiva nju funkcije PKC. ledan od podtipova aktivim se Iipidnim
T Veta izmedu specificnog GPCR i odredenog signalnog puta za visi uglavnom od strukture receptora, posebno regiona ko.1i se na lazi na trecoj intracelu1arnoj petlji, a ko.1i posedu.1e specificnost za po.1edine G-proteine, od koga se dalje nastavlja specifi~ni signalni put. Mutacija ovog regiona ko.1a ne utice na vezivanje liganda za receptor, mozeprouzrokovati prebacivan.1e sa jednog (npr. cAMP) na drugi signalni put (npr. PI put), ko.1i se ne bi nonnalno aktivirao. Uglavnom, priroda agoniste ne utice na signaIni put, tako da razli6i· ti agonisti ko.1i deluju na isti receptor prouzrokuju isti 6eIi.1ski odgo vor. KompUkacije po~in.1u sa novim dokazima (Kenakin. 1995) da razliciti agonisti mogu da proizvedu razlicite aktivne fonne istog re ceptora i pokrenu razli6ite ceJijske odgovore - fenomen poznat kao usmeravanje agonista razliCitim putevima (agonist trafficking).
Primeri su retki, a ideja je kontroverzna i zvuci .1ereticki mnogim farmakolozima ko.1i su navikli da misle 0 agonistima iskljucivo u svetlu njihovog afiniteta i efikasnosti. Moguce je da cemo uskoro shvatiti novu dimenziju specificnosti lekova.
Desenzltlzaclja " Kao 8to je opisano u Poglavlju 2, desenzitizacija.1e osobina mno gib GPCR, a mehanizam ko.1i je osnova ovoga se istratuje. Dva glavna procesa ucestvuju u ovome (videti Koenig and Edwardson, 1997; Krupnik and Benovic, 1998; Ferguson, 2001): • fosforilacija receptora, • intemalizacija receptora (endocitoza).
PI
~o ( Fosfatidna kiselina
I
DAG
1-_. ~( AktlvaCI~a pro~.e.,:'1
~~f ' ___
kinaze C
0
Inozltol
I
.\
",j
OH
®
IP
0 .. ~~2 /J ®
•
a._nJ. _ ] 2 celularnog Ca +
-~
1(1,4,5)Pa
r
1
®
®c\
1(1,3.4)Pa
1(1 ,3,4,5)P4
~.
I
G
I
Ulozak Cs" kr~mbranu )
®
Slika 3.12 Ciklus fosfatidlllnozitoia (PI). Aktlvacija fosfolipaze C preko receptora rezultira cepanjem fosfatldilinozitol blsfos fata (P1P2)' formiranjem DAG. koji aktlvira protein kinazu C I Inozitol trisfosfata (lP3). koji oslobada intracelularni Ca 2+, Uloga inozitol tetrafosfata (IP4 ) koji se formlra iz IP3 iii drugih inozitol fosfata. nejasna je, ali on moze da pojaea ulaz Ca2+ preko 6elijske membrane. IPa se inaktivira defosforilacijom do Inozltola. DAG je konvertovan u fosfatidnu kiselinu, a ova dva produkta sluze za regeneraciju PI i PIP2 ,
Sekvence GCPR sadrZe odredene ostatke (serin i treonin), uglav nom na C citoplazmatskom krl\iu, koje mogu biti fosforilisane ki nazama, kao ~to su protein kinaza A (PKA) i PKC i specificnim kinazama vezanim za membranu,· Fosforilacija sa PKA i PKC, koju aktiviraju mnogi GPCR, uglav nom slabl vezu izmedu aktiviranog receptora i G-proteina i na taj naein slab! efekt agoniste. Ove kinaze nisu selektivne, tako da, po red desenzitisanih, mogu biti ukljueeni i drugi receptor! za odrede ni agonist. Ovaj efekt, da agonist specifican za jedan receptor moze desenzitisati drugi receptor, naziva se heterologa desenzitizaclja ko ja je slaba i kratkotrajna (videti slilm 3.14). Fosforilacija sa GRK (videti Krupnick and Benovic, 1998; slika 3.14) manje je iii viSe specifiena za receptor i utiee uglavnom na receptor koji je aktiviran (za koji je vezan agoI!ist), ~to dovodi do
homologe desetlzitizacye, Ostaci koje fosforili~e GRK razlikuju se od ostataka na koje deluju druge kinaze; fosforilisani receptor sluzi kao mesto vezivanja za arestine, intracelulame proteine koji blokiraju vezu izmedu receptora i G-proteina, a takode je i cilj za endocitozu. Desenzitizac!ja je duga i snama. Prva identifikovJ\na GRK je kinaza p-adrenergiekih receptora (fJ-adrenoceptor kinase - BARK), ali je posle nje otkriveno jo~ nekoliko drugih kinaza. Ovaj tip desenzitizacije je zajednicki za mnoge GPCR.
NAJNOVIJA IZNENA8UJUCA OTKRICA Ovde cerno opisati najnovija otkrica vezana za GPCR koja ce u buducnosti verovatno irnati znacaj u fannakologiji.
39
!O
G-proteini
-----~-,
~
J
Y Oslobadl;lju se kao lokalni hormonl
pl'()t~iri;r
;"I
Enzimi, transportni proteini, ltd.
Slika 3.13 Kontrola ceJijskih efektora preko G.protelna I druglh glasnlka. (IP3' inozitol trifosfat; DAG, diacilglicerol; AA, arahidonska kiselina.)
GPCR dimeri:i~~ija "'Konvencionalno shvatanje da je GPCR funkcionalni monomer (nasuprot jonskim kanalima koji su multimeri, videti str. 29) naru sene je istraZivanjima GABAE receptora, GPCR koji je prvi put kloniran 1997. (videti Marshall et aI., 1997). Postoje dva podtipa ovog receptqra koji su kodirani razlicitim genima, a funkcionalni receptor je heterodimer ova dva podtipa. Drugi primer GPCR oligo merizacije opisao je Bouvier (200 I). U okviru familije opioidnih receptora (Poglavlje 40), otkriven je stabilan i funkcionalan dimer K- i o-receptora, sa fmmakoloskim osobinama razlicitim od oba monomera pojedinacno. Otkrivene su i daleko raznovrsnije kombi nacije, kao sto je dimer dopaminskog (D 2) i somatostatinskog recep tora, na koji obaliganda deluju sa veeom snagom. Najnovija istra zivanja otkrila su da dopaminski D 5 receptori mogu direktno da se
• Nedavna istraZivanja (AbdAlla et aI., 200 I) pokazala su da postoji funkcionalni dimer izmedu angiotenzinskog AT! i bradikininskog (B 2) receptora na humanim trombocitima i da pokazuje veei afinitet za angiotenzin u poredenju sa obicnim AT receptorom. Kod trudni ca koje imaju hipertenziju(preeklampsija) broj ovih dimera raste zbog poveeane ekspresije B2 receptora i prouzrokujuei paradoksa Ian efekt - pove6anu osetljivost na vazokonstriktore kao ~to je angi otenzin. Ovo je prvi nagovestaj uloge dimerizacije kod Ijudi.
oligomerizuju sa receptorskimjonskim kanalom, GABAA recepto rom, inhibirajuci ga bez uticaja na G-protein (Liu et aI., 2000). Ova interakcija je studirana samo na kloniranim eelijama, a dokazi da je ova pojava znacajna kod eelija zivih organizama jos su parcijalni*. Jo~ je ranD da donesemo zakljucak kakav ovo moze da ima impakt na konvencionalnu farmakologiju i terapiju.
Proteini koji modlflkuju aktivnost receptora "'Proteini koji modifikuju aktivnost receptora (RAMP) su familija membranskih proteina koja je udruzena sa GPCR i utice na njiho ve funkcije. Otkrili su ih McLatchie i saradnici (1998) prilikom pokusaja da kloniraju receptor za neuropeptid: peptid vezan za kal citoninski gen (calcitonin gene-related peptide- CGRP, videti Po glavlje 13). Otkriveno je da je funkcionalno aktivna fonna CGRP receptora kompleks koji cine GPCR (nazvan »receptor nalik na kalcitoninski« - calcitonin receptor-like receptor - CRLR), koji nije aktivan i drugi membranski protein (RAMPl). Jos je velle izne nadenje da kada se CRLR poveze sa drugim RAMP (RAMP2) po kazuje potpuno razlicitu farmakologiju i aktivira ga drugi protein, adrenomedulin. Drugim reeima, specificnost agoniste zavisi vise od pridruzenog RAMP nego od samog GPCR. Drugi primeri u obla sti peptidnih receptora danas su brojni, ali ne zna se koliko je ovaj fenomen rasprostranjen. Ovo je jos jedan primer kako interakcija na molekulskom nivou utice na farmakoloske osobine receptora.
kinazom (GRK). Fosforilisani receptor (P·R) se zatim ve
zuje za areslin, sto Ima za posledleu gubltak sposobno
stl vezivanja receptora i G-proteina; ovaj receptor zaUm
podleze endocitozll nestaje sa membrane.
Heterologa (unakrsna) desenzitizaclja javlja se kao rezul·
tat fosforilacije jednog tipa receptora preko aktivacije kl
naze druglm tlpom receptora. (PKAI PKC, protein kinaza
AIC.) .
REZIME Prosta dogma na kojoj poCiva nase trenutno razumevanje GPCR: Prenos signala nezavisno od G-proteina ... Koristeci termin }}receptori vezani za G-proteine« da bismo opisali klasu receptora koje karakterise heptahelicna struktura, sledinlo klasicne dogme koje se koriste u ud~benicima, ali zane· marujemo da G-protein nije jedina veza izmedu GPCR i razlicitih efektornih sistema koje on reguli~e. Primer direktne veze izmedu GPCR i jonskih kanala opisanje u prethodnom tekstu. Postoje broj ni primeri da razliciti»proteinski adapteri« koji povezuju recepto re tirozin-kinaznog tlpa, sa njihovim efektorima, mogu takode da reaguju sa GPCR (Brzostowski and Kimmel, 2001), omogucujuci istim efektorskim sistemima da na njih uticu receptori razlicitih ti pova. U tom smislu, GRK. koji su ukljuceni u desenzitizadju (vide ti dalji tekst), mogu takode da doprinesu prenosu signala, zato Ito fosforilacija C-terminalnog dela GPCR stvara mesto za prepozna vanje molekula puleva za prenos signata, analogno funkcionisanju receptora vezanih za kinaze (videti datji tekst, pregledni clanak: Bockaert and Pin, (999).
Jedan gen za GPCR - jedan GPCR protein jedan funkcionalan GPCR - jedan G-protein pocinje da biva prevazidena. Posebno: • jedan gen kroz altemativno povezivanje (splicing) iii revi ziju RNK (editing) i dr. moze da kodira vise od jednog proteina, • jedan GPCR mou da se udruzi sa drugim u cilju nastanka vise tipova funkcionalnih receptora, • put za prenos signala ne zahteva uvek G-protein. Izgleda da je izucavanje GPCR prava avantura i za sada niko ne vidi kraj ove price.
.4 . ~~1~.~_
\":~ :"~";;'"":""
""
POGLAVWE, 1; TIP 3: RECEPTORI VEZANI ZA KINAZE I SUCNI RECEPTORI Receptori vezani za kinaze imaju potpuno razliCitu struk tum i funkciju od ligand-zavisnih (receptorskih) kanala iIi GPCR. Oni posreduju u delovanju razliCitih proteinskih me dijatora, ukljucujuCi faktore rasta, citokine (Poglavlje IS) i honnone kao Ato su insulin (Poglavlje 25) i leptin (Poglavlje 26). Za vise detalja, treba proCitati revije: Barbacid (1996), Ihle (1996) i Schenk and Snaar·Jakeleska (1999). S obzirom na njihove inherentne enzimske osobine, receptori za fakto re rasta cesto se predstavljaju kao receptori . zin . Receptori vezani za gvanilat ciklazu (videti Luckas et a.,. 2000) daleko su manje brojni i posreduju u delovanju izv~ snih peptida kao llto je atrijalni natriuretski peptid (Poglavlj~ , 17). Oni se mogu razmatrati kao posebna superfamilija, ali \ zbog slienosti u strukturi, svrsta6emo ih u grupu sa ~epto rima za faktore rasta. Osnovna struktura tri tipa receptora prikazanaje na slici 3.3C. Receptori vezani za kinaze sastoje se iz veoma velikog ekstracelulamog dela (domen za vezivanje Uganda) i intrace· lularnog (efektornog) dela. Svaki domen sadni oko 400-700 aminokiselinskih ostataka. Kod insulinskog receptora ekstra celulami domen se sastoji od jednog posebnog polipeptida koji je povezan sa ostatkom molekula disulfidnim vezama.
•
Re.~piijrl ~~ci:~,II~k~homiQlJe(nJr. in~UII~) i faktoren~·
•. 'fizliaitil1·lntrl:icelularfjlh. proteina I takoQl:/ezt.>e.d.UjU,kQlltroltjbrojnih6e\ijsklhfunkclja.·.·· . • qni supglalln9.ml.lkljuc~hi (jdqgaetaje kojl kbntroli!lu rast 6elijel.,.~lf~rEln9jja()iju.Deluju I Indlrektno, reg~lacljom gEinsketrahsl-: ,Ii§u, sillt~u ,I oslopl'ldanjemnogih, inflarnatQ,tt1lhrnedi ··Jatora;'?':·:',·i" ,., "',, .,'.',. I:ikcep~9.ri~~~;;:!,!?m.e,na
••• Nel
42
.
Za razliku od njih, receptori faktora rasta se sastoje saroo od jednog dugaekog lanca sa preko 1.000 a:tninokiselinskih. ostataka. Receptori za citokine au u principu slien~ ali se Ce sto nalaze u obliku dimera. U svim sIueajevima receptori po~ kreeu kaskadu kinaza (videti dalji tekst). Intracelularni dec receptora za faktoTe rasta i insulin poseduje aktivuost tirozin kinaze i mesta za vezivanje ATP i supstrata. Receptori ta citokine obieno nemaju aktivuost kinaza sruni po sebi, ali se posle aktivadje ligandom, udruZuju sa kinazama poznatim kao Jak (videti dalje u tekstu), ~to predstavlja prvi korak u kaskadi kinaza. Spoljamji deo receptora povezan je sarno jednim tran smembranskim heliksom sa unutraSnjim kinaznim delom, pa prosta alostericka modifikacija receptora nije objallnjenje mehanizma aktivacije kinaza posle vezivanja liganda. Ume 8to toga, vezivanje Uganda prouzrokuje dimerizaciju parova receptora. UdruZ:ivanje dva intracelularna kinazna domena omogueava autofosforilaciju tirozinsldh ostataka. Auto fosforilisani ostaci tirozina zatim sluZe kao mesta visokog afiniteta ZIl; vezivanje ostalih intracelularnih proteina, koji au odgovomi za sledeci korak u signainoj transdukcionoj kaskadi. Jedna vama grupa takvih »adapterskih« proteiDa je poznata kao proteini sa SH2-domenom (zato ~to saMe dobro oCuvan deo. poznat kao 8H2). Oni poseduju veome oCllvane sekvence, od oko 100 aminokiselinsldh ostataka, koje formiraju mesto prepoznavanja za fosfotirozinske ostat,. ke receptor~ Individualni proteini sa SH2-domenom, od ko jih su mnogi sada poznati, se.1ektivno se vezujuza odredene receptore, tako da je sled dogadaja pokrenutih pojedinim faktorima rasta veoma specifican. Mehanizam je prikazan na slici 3.15.
FOSFORILACIJA PROTEINA I MEHANIZMI KASKADE KINAZ.A 8ta ce se desiti kada se protein koji sadrti SH2-domen, veze za fosforiUsan receptor, pre svega zavisi od samog recepto ra; mnogi proteini sa SH2~domenom su enzimi, kao sto su protein kinaze iIi fosfolipaze. Neki faktori rasta aktiviraju specificne podtipove PLC, PLCy i na taj nacin prouzrokuju cepanje fosfolipida, formiranje IP 3 i oslobadanje Ca2+, Oatali proteini sa SH2-domenom povezuju proteine sa fosfotirozi nom sa razlWitim funkcionalnim proteinima koji su ukljuce ni u kontrolu deobe i diferencijacije 6elija, tako da je krajnji rezultat stimulacija transkripcije odredenih gena. ,. Dva dobro poznata signalna puta prikazana su na sHei 3.15. Ras! Raf put (slika 3.15A) ueestvuju u dejstvu mnogih faktora msta i mi togena. Ras, produkt proto-onkogena, funkeioniae kao G-protein (GIPIGDP razmena) i prenosi signal sa proteina sa SH2·domenom. Orb, koji je fosforilisan receptorom za tirozin kinazu. Akti\laeij~ Ras, s druge strane, aktivira Raf, koji je prvi u nizu serinltreonin kinaza od kojih svaka fosforili~e i aktivira sledecu. Poslednja od njih, 'MAP (mitogenoro aktiviran protein) kinaza, fosforili§e ~dan iii vi~e transkripcionih faktora koji pocinju ekspresiju gena. ito re· zultira raz!icitiro celijskim odgovoriroa, ukljucujuci i deobu celije. Mnogi klilreionomi su udru~ni sa mutacijoro gena koji ko~ra pro teine ukijucene u ovu kaskadu, prouzrokujuci aktivaeiju kaskade u odsustvu faktom rasta (Poglavlje 5; a za vi~e detalja videti revijske
Receptorskl deo a-hellks Tlrozln-klnaznl
dec
(
Ostatak tirozina
Vezlvanje proteina sa SH2·domenom (Grb2)
I
!
\
\
Promena konformaclje, vezivanje Jak
Vezlvanje i fosforllacija proteina sa SH2·domenom (Stat)
Fosforilacija receptora, + Jak
Dimerizacija Stat
JEDRO
Sllka 3.15 Transdukclonl mehanlzml receptora vezanlh za kinaze. Prvl korak koJi sledi nakon vezivanJa agonlste za receptor je dimerizacija, koja vodi autofosforllacljl intracelularnog domena (dela) svakog receptora. Protelnl koJi sadrte 8H2-do men zatim se vezuju za fosforitisane receptore I samI blvaJu fosforilisani. Prikazana su dva dobro poznata puta. A Put faktora rasta (Ras/Raf/MAP klnaze) (Poglavlje 5); B Put cltoklna (Jakl8tat) (PoglavlJe 15). Posto]1 Jos nekoliko drugih puteva i ove fos forilacione kaskade stupaJu u Interakciju sa komponentama G-protein sistema.
43
FosforilaciJa protelna u
pr,nosu slgrtllila
• Moogi dogad~jikoji sa odvijajuprf1koreceptora UkljueujUfoSfpril!lciju proteina, kojakontroliie funk ci()nlsanje iV~%iyanj~ intracelular'lih proteina. • Tirozin~jri8z$~yezane za receptore,zatimone ko je se aktIVjnaj~.i~kIi~nim nukl.~tidiJTl;:\i serin/tree
mehanj~al11~(Jjttlovodi do amplifjk~cije(jp9:at1aja kQJrsepdyijaJu.preko receptora. . •..... ••.. ......' . . • Po~ojl rnr'log6'~ln~a sa. razli~itom~peciflcnoS6u ZfI ~wpstr~t;:t~pl11()9\.l¢lije specincrtost u putevima koj~.;.tI
·i~P~t9j1"~~.rn.il'J~ fo$fataza koje prouzrokuju
~J(inaza. . •reve~ij '" ",;::,.~, '::'~T,'L)/,,;<
clanke Avruch et aJ. (1994) Marshall (1996) i Schnek and Snaar Jakeleska (1999)). Drugi put, JakiStat put (stika 3.15B), ukljuCell je u mehanizam dej stva mnogih aitokina. Kada se citokini vefu, desava se dimerizaci ja ovih ;rcceptora, privlacenje jedinice tirozin kinaze (Jak) koja se udrufuje sa dimerom i fosforilile ga. Jek pripada familiji proteina, a razliCiti clanovi su specifiCni za razlicile citokine. Jedan od cilje va za Jak je familija transkripcionih faktora (Stat). Ovo BU proteini sa SH2-domenom koji se vezuju za fosfotirozin na receptor-Jak kompleksu i bivaju fosforilisani. Potom aktivirani Stat migriraju u jedro i aktiviraju ekspresiju gena (videti Ihle, 1995).
Novija istraZivanja puteva prenosa signala proizvela su ne verovatno obilje molekulamih detalja i zato nema sumnje da be novi vazni lekovi, koji Ce se koristiti u inflamaciji, imunologiji i karcinomima, ostvarivati svoje dejstvo preko opisanih mehanizama (Levitzki, 1996)'. Membranski vezana gvanilna ciklaza, enzimodgovoran za formiranje drugog glasnika, cGMP-a, kao odgovora na ve zivanje peptida kao sto je natriuretski peptid (Pog!. 14 i 18), liei na familiju tirozin kinaza i aktivira se na isti nacHn, dime rizacijom kada se agonist veze (vidi Lucas et ai., 2000).
• Najnoviji prodor u lecenju hronicne mijeioidne leukemije postig nutje ukljucivanjem imatiniba, inhibitora specificne tirozin kinaze koja ucestvuje u patogenezi ove bolesti (videti Goldman i Melo,
l4
2001).
TIP 4: RECEPTORI SME§TENI UJEDRU (NUKLEARNI RECEPTORI) Steroidni i tiroidni hormon! !Ie vezuju za receptore sme&tene ujedru ina taj naein reguli~u transkripciju DNK, a toje pot puno drugaeiji mehanizam od prethodno opisanih (videti re vijske c1anke: Evans, 1988; Mangelsdorf et 81., 1995). Istra zivanja Jensena u Cikagu prvobitno su dovela do saznanja da se vrlo razliciti efekti raznih steroidnih lekova i hormona (ukljucuju6i dejstva na reproduktivni sistem, bubrege, inlU ni sistem i dr.) ostvaruju preko istih osnovnih mehlWizama, uglavnom preko sdmulacije transkripcije groa, §to izaziva sintezu odredenih proteina i 6elijski odgovpr (Poglavtja 27 i 29). Ve6ina ovih receptora nalazi se u jedru, a ligandi su lipofilne supstance koje lako pro laze 6eJijSku membranu . Osnovna struktura ove familije receptora prikazana je na sli ci 3.3D. Oni poseduju u sredini molekula veolna oi5uvanu strukturu od pribli:tno 60 aminokiselinskih ostataka koJa for mira dec receptora koji se vezuje za DNK. Taj dec receptora ima dYe petlje od kojih svaka sadrti prihli:tno po IS o~a (cinkovi prsti), vezanih zajedno sVeZnjem od 4 cistemska ostatka koja okruZuju atom cinka; ~ve strukture se nalaze 1.1 ml10gim proteinima koji l'eguliiu DNK transkripcija.. i za prste se veruje da okruZuju spira1u DNK. Nishodno ad ave centralne strukture nalazi se dec za vezivanje honnona, dok se ushodno od njega na1azi deo odgovoran za kontrolu gen ske transkripcije (videti Bourguet et al. 2000). Vezivanje steroidnog mo1ekula za receptor izaziva kon formaci one promene, §to omogucava fomriranje receptor skih dimera. Ovi dimeri se vezuju za specificne sekveilCe DNK, poznate kao elementi koji reaguju na hormone (hor mone-responsive elements - HRE) koj i se na1aze za 200 baza ushodno od mesta gde se nalazi gen koji regumu. Nekoliko minuta posle vezivanja steroida za receptor, pove6ava sc·ak tivnost RNK polimeraze i stvaranje specifiene iRNK, iako se fizio1oski odgovor razvija tek posle nekoliko sad iii calc dana. Razliciti steroidni honnoni su sposobni da indukuju iIi suzbiju transkripciju specificnih gena i cia na taj naCin prouzrokuju razlicite fizioloske efekte. Na primer, glukokor tikoidi inhibiraju transkripciju gena za ciklooksigenazu-2 (COX-2) i na taj nacin deluju antiinflamatomo (Poglavlje 16), dole mineralokortikoidi stimulisu stvaranje razlicitih transportnih proteina koji su ukljuceni u fUl1kciju renalnih tubu1a (Poglavlje 23). Specificnost na nivou DNK zavisi od N-tenninalnog regiona i dela receptora za vezivanje sa DNK, pre nego od mesta za vezivanje hormona; tako, hi merni receptori koji se sastoje od N-tenninalnog de1a1DNK vezivnog mesta jednog receptora (A) i de1a koji vezuje hor· mone drugog receptora (B), odgovaraju na hormon 8, ali proizvode efekt vezan za honnon A. Vi~e deta1ja dato je u prethodno pomenutim revijskim ~lancima. Nukleami recep tori fonniraju veliku familiju, sa vise od 150clanova, pri cemu mnogi od njih pripadaju receptorima "siroci6ima" (vi deti prethodni tekst) za koje fizioloski ligand jos nije identi fikovan (Laudet and Adelmant, 1995). Drugi ligandi koji deluju na nu1deame receptore u1djucu ju tireoidne honnone (Poglavlje 28), vitamin D i retinoinsku
kiselinu (poglavlje 30). Retinoinska kiselinaje vaf.an regula tor embrionalnog razvoja, a njen nivo raste za vreme razvoja ploda i igra kljucnu ulogu u razvoju organa i ekstretniteta. Mnogi lekovi i drugi strani molekuii prouzrokuju prome ne u aktivnosti enzima koji metabolim lekove i nosaee leko va, i na taj naein uticu na odgovor organizma na lekove koji se e1imini~u ovim putem (Poglavlja 8 i 50). Grupa receptora smestenih ujedru. poznata kao PXR (Hi SXR), odgovara oa ~irok spektar stranih molekula i regulise ekspresiju tih protei na koji se »bave lekovima« (videti Synold et al., 2001). PXR liei na sluZbenika bezbednosti na aerodromu, koji kada vidi sumnjiv prtljag, poziva telefonom specijalistu za bombe. Nedavno je veliku pa.fuju privukao PPAR (peroxisome proliferation-activatedreceptors - receptori koji se aktivira ju uz proliferaciju peroksizoma). Uprkos nespretnog imena, ova famUija receptora, otk:rivena ranih devedesetih godina pro~log veka, prerasla je u kljucnog igraca u kontroli meta bolizma lipida i u patogenezi razlicitih oblika metabolickih i kardiovaskularnih bolesti (videti Kersten et aL, 2000; Mur phy and Holder, 2000). PPARa. je ciljno mesto za lekove, kao 8to je klofibrat, koji se koristi za redukciju holesterola u plazmi, dok je PPARy cHjno mesto za nedavno otkrivenu tiazolidindionsku giupu lekova (npr. troglitazon) koja se koristi u lecenju dijabetesa. Svi PPAR reaguju na razlicite endogene lipide. Prostaglandini i leukotrieni spadaju u gru pu lipidnih medijatora koji deluju na receptore u jedru, a glavno dejstvo ostvaruju preko GPCR.
JONSKI KANAli KAO CILJEVI ZA
DElOVANJE lEKA
Govorili smo 0 ligand-zavisnim (receptorskim) jonskim ka natima, kao 0 jednom od eetiri glavna tipa receptora za l,eko
ve. Pored njih, postoji i vellki broj ostalih tipova jonskih ka nala, koji predstavljaju vazne mete za delovanje lekova, aak iako ne spadaju u »receptore«? jer nisu neposredni cUjevi br zih neurotransmitera". U ovom delu knjige, diskutova6emo o jonskim kanalima na molekulskom nivou; njihova uloga u regulisanju celijskih funkcija opisana je u PogJavlju 4. Joni mogu da produlipidni dvosloj eelijske membrane samo uz pomoc membranskih proteina koji f(lflniraju kanale iIi transportere. Koncept jonskih kanala se razvio pre vise od 50 godina, na osnovu elektrofiziolo~kih studija mehani zma membranske ekscitacije (videti dalji tekst); elektrofizi ologija, a posebno metoda merenja protokajon~ krol kan~- I Ie 6elijske membrane (voltage clamp) (PoglavlJe 4), ostaJe II . osnovno sredstvo za ispitivanje fiziolo~kih i farmakoloskih . osobinajonskih kanala. Od sredine osamdesetih gollina pros log veka, kada je prvi jonski kanal klonirao Numa u Japanu, visoko produktivna saradnja izmedu elektrofiziologa i mo lekularnih biologa objasnila je nmostvo detalja vezanih za strukturu i funkciju ovih kompleksnih molekula. KoriS6enje patch-clamp zapisa, koji omogucuje da se po~anje sarno jednog kanala ispita u realnom vremenu, bilo je posebno dra goceno u klasifikaciji jonskih kanala prema sprovodljivosti i aktivacionim osobinama. Doprinosi nekih istraZivaila (Hill (1992), Aschroft (2000) i Catterall (2000») pruZaju nam vise podataka. Jonski kanali se sastoje iz proteinskih molekula, napra vljenih tako da formiraju vodom ispunjene pore koje se pro stirn kroz membranu i mogu naizmenieno da se otvaraju i zatvaraju. Brzina i pravac kretanja jona kloz pore zavise od elektrohemijskog gradijentajona, kojije u funkciji njegove koncentracije sa obe strane membrane i od membranskog potencijala. K,axalc!SlJ:i~~..oo.~lQh!Jm,ruaJJJ,; • ~J:J.aS.t..z.a odred.e~..Y~Jm.m..za.;y~I.i~· ~~ ·.,gkt,illa~~r.
mehanizmi koji
kontroli~u
proJaz
~ID~1!9J},Qmnih.~t,y91f!tWhJ!~pjll-.kanala.),
•
1J19mlska~.~..
SELEKlNNOST Kanali su obiono selektivni za katjone iIi anjone. Kanali selektivni za kagone mogu biti selektivni za Na+, Ca2" iii K+, iii mogu biti neselektivni, tj. propustljivi za sva tri po menuta jona. Anjonski kanali su uglavnom propustljivi za Cl', mada mogu bid propustljivi i za ostale jone. 0 efektima modulacije jonskih kanala na celijsku funkciju diskutuje se u Poglavlju 4.
U stvari, razlika izmedu ligand-zavisnih (receptorskih) kanala i drugih jonskih kanal!~ nije jasna. Prilikom svrstavanja receptorskih kanala sa drugim tipovima receptora u ovoj knjizi, polltovali smo istorijsku tradiciju koju su postavili Langley i drugi koji su prvi defi nisali receptor u kontekstu dejstva acetilholina na neuromuskularnu spojnicu. Napredak: molekularne biologije mo~e nas u buducnosti naterati da ponovo razmotrimo ovo semanti~ko pitanje, ali za sada ne pruZamo izvinjenje zbog nepostovanja fannakolo§ke tradicije,
45
AKTIVACIJA Voltazni (voltazno-:zavisni) kanali Vecina voltaznih (voltaZno-zavisnih) kanala otvara se kada je ceUja depolarisana. ani formiraju vrlo znacajnu gmpu kanala, jer su u osnovi mehanizma membranske ekscitabil nosti (videti Poglavlje 4). NajvaZniji kanali iz ove gmpe su selektivni natrijumski, kalijumski iIi kalcijumski kanali. Uopste, otvaranje ovm kanala (akttvacija), izazvano de polarizacijom membrane, obieno kratko traje, cak i ako se depolarizacija odrtava. To je zato sto je inicijalna aktivacija kanala pracena sporijim procesom tnaktivacije (videti dalji tekst). Uloga voltazno-zavisnih kanala u stvaranju akcionog po tencijala i kontroli ostalih celijskih funkcija, opisana je u poglavlju 4.
Receptorski (ligand-zavisni) kanali Receptorski kanali (videti prethodni tekst) aktivirajll se vezivanjem liganda za odredeno mesto na molek:ulu kana lao Bni neurotransmiteri, kao §to su glutamat, .acetilholin, GABA i ATP (Poglavlja 10, 12 i 32) vezuju se za mesto koje se nalazi na spolja.snjoj strani membrane. Neki receptorski kanali u plazmatskoj membrani reaguju pre na intracelular ne nego na ekstracelulame signale, a najvaZniji od njih su:
Ca2+-zavisni kalijumski kanali, koji su prisutni u vecini celija i otvaraju se kada se povecaintracelulami nivo Ca2+i tako dovode do hiperpolarizacije celije. ATP-zavisni kalijumski kanali, koji se otvaraju kada se smanji intracelularna koncentracija ATP; ovi kanali se razlikuju od onih koji ucestvuju u ekscitatomom efek tu ekstracelulamog ATP, a nalaze se u mnogim nervnim i misicnim celijama, kao i u celijama koje luce insulin (Poglavlje 25), gde su deo mehanizma koji povezuje se kreciju insulina sa koncentracijom glukoze u krvi. Vaniloidni receptor, koji ima vezno mesto za kapsaicin (i verovatno za endogene medijatore; videti Piomelli, 2000) sa citoplazmatske strane membrane.
Kanali preko kojih se oslobada kalcijum Kanali preko kojih se oslobada kalcijum prisutni su u endo plazmatskom iii sarkoplazmatskom retikulumu, pre nego u plazmatskoj membrani. NajvllZniji od njih, IP 3 i rUan6dinski receptori (Poglavlje 4) posebna su grupa receptorskih kalci jumskih kanala, koji kontroli~u oslobadanje Caz+ iz intrace lulamih depoa.
46
Depo-zavisni kalclJumski kanall Kada se intracelulami depoi Ca2+ isprazne, otvaraju Se ka nali u plazmatskoj membrani, koji omogucavaju ulaz Ca2+. Mehanizam kojim se ovo odigrava i dalje nije jasan (Barritt, 1999), ali ovi depo-zavisni kanali (store-operated channels
- SOC) vazan Sll mehanizam delovanja GPCR, koji izaziva ju oslobadanje Ca2+. Otvaranje SOC omogucuje da intrace lulami nivo Ca2+ ostane visok cak i kada se intracelulami depoi prazne. Takode, ovi kanali obezbeduju ponovno popu njavanje depoa (Poglavlje 4).
MOLEKULSKA SmUKTURA ... Jonski kanali 8U velila i slohmi molekuli. Njihova karakWristic na stmkturna organizacija otkrivena je kako su saznanja 0 njihovoj gradi Jlostajala lIVe brojnija. Jloeev od ranm 1980-tih, kad:a su klo nirani pryi receptorski kanaJi (nikotinski bolinergifki receptor) i voltaZnihatrijumski kana!. GIavni struktu.rni podtipovi pobzani su na sHei ~.16. Svi oni sastoje se od nekoHko (obicno Cetiri) damena, koji iU id,!IDticni iii slimi, i organizovani u vidu oligomemog niza odvojenih\podjediniea ili jednog velikog proteina. Svaki domen sadrZi od d\la do scsi transmembranakih spiralnib segmenata. Ve6i na receptorskih kanala ima osnovnu struktum koja je prikazana na slid 3.16A i~stoji se od pentatnemog niza razlicitih subjedinica; svaka lIubjediniea &Utaji se od 4 transmembranske spirale, od koj ih jedna, M2 segment, fOnlura poru. Veliki ekstracelu1arniN-tenninal ni deo saddi mesto za vezivanje Uganda (videti str. 30). Nekoliko izuzet.aka od ovog jednostavlI:0g opisa strukture ligand-senzitivnih jonsldh kanala otkriveno je nedavno, upravo kada su se javile prve 8umnje. Qui obubvataju gJutamatne NMD4 receptore (videti sliku 3.16; Poglavlje 32), purinergiCke Pzxreceptore (PQglavije 32) i va nlloidne receptore (kanali koji au senzitivni za ligande, ali i za tern peratum i protone; videti PogJavlje 40). Kod njm, kao i kod drugih jonskih kanala. deo molekula koji formira poru cini pet1ja u obliku slova U (P-petlja) izmedu dye spirale. VoltaZnD-senzitivni (volta :fui) jonski kanaJi uglavnom sadrZe jednu transmembransku spiralu sa mnogo baznih (tj. pozitivno naelektrisanih) aminokiselina. Ka da je membrana depolarisana i kaela njen unutra§nji intracelularni deo postane manje negativan, ovaj region - vo!taZni senzor - blago se pomera prema spoJjasnjem delu membrane, §to rezultira otvara njem kanala. Vecina voltaZno-senzitivnih kanala se inaktivira kada jedan od intracelu1amih domena blokin kanallla unutrdnje strane, kao zapu&~ na cevi. VoltaZno~senzitivni natrijumski i kalcijumski kanali poseduju Cetiri ~estostruka spiralna domena u sastavu jed nog ogromnog molekula, adotneni IU povezani intracelularnirn petljama razlicite velicine. Kalijumski kanali IIU najbrojniji i najhe terogeniji'. VoIta:fuo-senzitivni kalijumski kanali au sUcni natrijum sldrn kanalima, scm §to se oni sastoje od eetiri subjedinice, a ne od jednog ve1ikog proteina kao natrijumski kanali. KIasa kalijurnskih kanala, poznatih kao »uiazno ispravljacki kanali« (I)inwani rectifi er channels«) zbog svojih fizi~kih svojstava, sastoje se ad dve spi rale prikazane na slid 3.16C, dok su drugi k1asifikovani u kanale sa dYe pore, jer sadrZe dve P-petlje. Razlicite strukture koje su pokazane na slici 3.16 predstavljaju sa mo mali dec u opisu molekulske strukture jonskih kanala. U svirn klasama pojedinaene subjediniee se udruluju u hetero.oligomer da bi fonnirale funkdonalni kanal (za razliku od homo-oligomera ko jeg cine iste subjedinice). Sta vi§e, strukture koje Cine kanal cesto su udru.zene sa drugim membranskirn proteinima koji sna:fuo uticu na njihove osobine. Na primer, ATP-senzitivan kaUjumski kanal je udru:!en sa receptorom za derivate sulfol1ilureje (sulfonylurea receptqr- SUR), preko kOjeg razliciti lekovi regulilu kanale (uklju i!ujuci derivate sulfonilureje; videti Poglavlje 25) (videti Aschroft and Gribble, 2000). Ucinjeni suveliki napori da bi 8e razumela molekulska struktura i funkcija jonskih kanala, ali i pored napret
• Genom erva Caenorhabdititis elegans kodira ne manje od 60 raz licitih podtipova kalijumskih kanala, a kod sisara sigurno postoji i vise. Pitanje je da li je ovo zlatni rudnik iii llo6na mora za fanna kologe.
Slika 3.16 Molekulska gradajonsklh kanala. Sivi pravougaonici predstavljaju membranske a-spirale. Sive petlje pripadaju pori (P), prisutnoj u mnogim kanalima, a sivi pravougaonici su delov! kojl formiraju p~ru. Prugasti pravougsonici predstavljaju voltazni senzor voltaznih kanala. (nAchR, nikotinski holinergicki receptor; GABAA , Up A receptora za gama-aminobuternu kise Jinu; 5-HT3, tip 3 receptora zs 5-hidroksitriptamin; IP3R, inozitol trifosfatni receptor; RyR, rianodinski receptor; NMDA, N-metil D-aspartat.
ka, nasa znanja u pogledu fizioloske uloge mnogih jonskih ,kanala samo su delimicna. Mnogi vawl lekovi ostvaruju svoju funkciju deluju6i na jonske kanale, direktno iii indirektno.
FARMAKOLOGIJA JONSKIH KANALA "'Veliki broj lekova i fizioloskih medijatora, koji su opisani u ovoj knjizi, ostvaruju svoje efekte, menjajuci ponasanje jonskih kanala. Sveobuhvatni revijski cianci suvise su dugi i komplikovani, tako da eemo ovde prikazati osnovne mehanizme predstavljene kroz model vo1t~no-senzitivnog (voJtawog) natrijumskog kanala (sli ka 3.17). Izgleda da su jonski kanali bogat izvor buduCih novih lekova (videti Triggle, 1999; Clare et aI., 2000). Otvaranje i permeabilnost voitaZnih I receptorskih (volt~1l0- i Iigand-senzitivnih) jonskih kanala moduliraju brojni faktori. • Ligandi koji se direktno vezuJu za razlicita mesta na proteinu ka nala. Oni obuvataju mnoge neurotransmitere, kao gto je vee na pomenuto (str. 30), a takode i mnoge lekove i toksine koj! deluju na razlicite 11acine, npr. blokiranjem kanala iii uticajem na proces aktivacije, pa na taj naein olaksavaju iii Inhibiraju otvaranje kana la. • Medijatori I lekovi koji deluju indirektno, uglavnom aktivacijom GPCR. Poslednjl pomenuti izazivaju svoje efekte uticajem na fos forilaciju pojedinih aminokiselina koje se nalaze na intracelular noj strani jonskih kanala. Kao ~to je vee reeeno, ova modulacija
ukljucuje stvaranje drugih glasnika i aktlvaciju protein kinaza. Otvaranje kanala mo~e bit! olakSano iii inhibirano, u zavisnosti od toga koji se aminokiseLinski ostaci fosforilisu. Lekovi kao sto su opioidi (Poglav\je 40) i agonisti f3-adrenergickih receptora (Po glavlje 11) uticu na kalcijumske i kalijumske kanale nataj naein, prouzrokujuei sirok spektar eeJijsklh dogadaja. • Intral'elulami signali, posebno Calf i nukleotidi, kao ~to su ATP i GTP (Poglavlje 4). Mnogi jonski kanali poseduju mesta za ve zivanje tlh intracelulamih medijatora. Poveeanje intl'aceiulamog nivoa Ca2+ otvara izvesne tipove kalijumskih kanala i inaktivira volta~llo-senzitivne kalcijumske kanale. Kao sto je opisano u Po glavlju 4, nn illtracelulami Ca2+ utieu funkcije jonskih kanala i GPCR. Derivati sulfonilureje (Poglavlje 25) de\uju selektivno na ATP-senzitivne kalijumove kanale .. Slika 3.17 sumira glavna mesta I mehanizme kojim lekovi uticu na vol~no-senzitivne natrijumske kanale, tipican primer za ovaj mehanizant dejstva lekova.
Receptorske proteine sinteti~u celije koje ih eksprimiraju, a nivo te ekspresije, opet, kontrolisu putevi 0 kojima smo
41 --~~'-'
IZMENJEN MEHANIZAM OTVARANJA
BLOK KANALA
u ekspresiji receptora, koje nastaju kao -sekundami odgovor na dejstvo leka vrsta »sekundame fannakologije« cija va most tek sad postaje jasrrija.
GPCRlIglndl
RECEPTORIIQBOL4ENJA GPCR
1
Drugl glasnici
BatrahQtok$ln OtrQv tkorplonl
DDT, oll'llitf'oi,dl
(
:
Bolje raznmevanje funkcije receptora u moleknlarnom smi slu, otkriva da lIU brojne bolesti povezane sa poretneeenom funkcijom receptora. Qsnovni ~tpe~Z!!li su~ ·_..!luttL~~lJl,·usmerena.pmthi.~c.epto~~.iltl?!~~i~, • m~.cjjU!m!lwii kodiraju receptore i Eroteine ukljucene .. ~
1
1 lj~'
PKA PKC
BlOI( .
KANAL(\ Lokllni anastatlcl Antleplleptlcl (npr. tanltoln) AntIarltmlcl (npr. dizoplramid)
Silk. 3.17 Mesto vezlvanja lekova na voltatnom natrlJumskom kanalu (Poglavlje 43). Brojnost razHcitih mesta vezlvanja j efekata je tlpiena za· mnoge jonske ka nale. (GPCR, receptor vezan ·za G-protein; PKA, protein kinaza A; PKC. protein klnaza C; DDT, dihlorodifenlltrihlo retan, dobro pozna1 insekticid).
govorili i dogadaji koji se ostvaruju preko receptora. Ne ta ko davno, 0 receptorima smo razmi~ljali kao 0 nekim fik snim elementima u sistemu celijske kontrole, koji odgova raju na promene u koncentraciji liganda i iniciraju promene preko signalnih transdukcionih puteva - olii su, sarni po sebi, predmet regulacije. Kratkotrajna regulacija funkcije receptora, u principu se desava putem desenzitizacije recep tora. Dugo'trajna regulacija se odigrava putem poveeanja iii smanjenja ekspresije receptora. Primeri ovog tipa kontrole (videti revijski i:Hanak: Donaldson et aI., 1997) ukJjueuju proliferaciju razlicitih postsinaptickih receptora posle dener vacije (Poglavlje 9), ushodnu regulaciju razlicitih GPCR i receptora za citokine u odgovoru na inflamaciju (Poglavlje 15) i indukciju receptora za faktor rasta izvesnim tumorskim virusima (Poglavlje 44). Adaptivni odgovori na dugotrajnu primel1u leka vrlo su uobicajeni, posebno kada se radi 0 le kovima koji deluju na eNS. Oni mogu da se ispolje kao veo ma spor pocetak terapijskog dejstva (npr. kod antidepresiva; Poglavlje 38) iIi kao razvoj zavisnosti na lek (Poglavlje 52). lako detalji nisujasni, verovatno je da su ukIjucene promene
Doza (mg) SI. 6.4 Testiranje morlina I kodelna kao analgetlka kod Ijudi. Svaki od ()etiri pacijenta (oznaceni 1-4) prlma Ii su, u razlicitim situacijama i proizvoljnim radom, cetiri razliCite terapije (visoke i niske doze mortina. "jsokei nlske doze kodeina) u obliku intramuskularnih Injekcija. Za svakog pacijenta Izracunavan Je subjektlvni u~nak u vldu ublaiavanja bola. Odnos jacina Qva dva leks Imar;> je vrednost 13, na osnovu izracunate lirilJe regreslJe. (Houde RW et aI., 1Q65 U: Analgesics. Academic Press, New York).
U praksi se javljaju mnoge poteskoce, a nedostaci zivotinj skih modela predstavljaju jednu od najvecih barijera na putu od fundamentalne medicinske nauke do unapredenja terapi je. Ove poteskoce odnose se na sledece:
* Ima
l4
mnogo primera kada su lekovi bili vrlo efikasni na eksperi mentalnim zivotinjama (npr. redukcija moZdanih ostecenja nakon cerebralne ishemije), ali nlsu imali efekta na Ijude (Zrtve moZdanog udara). Koliko ovakYih gresaka ima u suprotnom smeru - nikada ne cemo otkriti, jer ovakvi lekovi nikada ne6e bjti testirani na ljudima.
F,!!JJ!I1iJlYecinu oboljenja, narocito iz oblasti psihijatrije, karakteriSu fenomeni specifieni za ljude, koje je tesko iIi ne moguce posmatrati na zivotinjama. Koliko jenama poznato, manija iii deluzije nemaju odgovarajuei pancian kod labora torijskih zivotinja niti se kod njih moze prepoznati nesto ~to liei na napad migrene ili psihopatsko ponabnje. lfohicajeni uzrok ..Uzrok" mnogih oboljenja kod ljudije k~;pl;kS;;rirnq,omat. Kod velikog broja degenerativnih oboljenja (npr. Alzheimerova bolest, osteoartritis, Parklnso nova bolest) vafnije je odrediti model uzlaznih (uzrocnih) faktora, nego silaznih (simptomatskih) svojstava oboljenja, iako ova druga predstavljaju osnow za veeinu do sada koris cenih jednostavnih fizioloskih modela. Pato(I££lgjliL~tDvo takode nije primenljivo na stanri1;o !ito su depresija iii anksiozni poremecaji, bez ja sno defmisane moZdane patologije. ~."""~ilU,,.J:rilikom testiranja validnosti ovaj kriterijum nosi sa scbom rizik da ce lek koji deluje putem novog, do sada nepoznatogmehanizma, biti propu§ten u ispi tivanju, jer se model bim na osnow reakcij e na poznate leko ve. Na primer, kod sbizofrenije (poglavlje 37) poznato je da su antagonisti dopamina efikasni. VeCina do &ada koriMenih modela napravljena je pre svega tako da reflektuje funkeiju dopamina u mozgu, ali ne i ostale poteneijalne mehanizme koje tek treba identifikovati ukoliko zelimo da dalje razvija mo odgovarajuce lekove. • <
GENETSKI PRISTUP Danas se ovakav pristup !lve vise koristi za izradu modela bolesti umesto konvencionalnih fizioloskih i farmakoloskih metoda. Selektivno razmnozavanje prmilo je moguenost za dobi janje eistih zivotinjskih vrsta sa karakteristikama koje su vr 10 sliene odredenim oboljenjima kod Ijudi. Ovakvi genetski modeli ukIjueuju spontano hipertenzivne paeove, urodeno (genetski) gojazne miSeve, pse i miseve skione epilepsiji, paeove sa deficitom izlucivanja antidiuretskog hormona i brojne druge primere. U veCini slueajeva, odgovorni geni jos uvek nisu identifikovani. Odskora se sve cesce koristi planirana genetska manipu lacija da bi se dobile transgene tivotinje sa definisanim mu tacijama. Ovo je naCin cia se humana oboljenja replikuju kod • eksperimentalnih zivotinja i na taj nacin obezbede zivotinj ski modeli sa ve60m mogucnoscu predvidanja delovanja od redenog leka na ljude (videti radove Maerki i Heam, 1996; Polites, 1996; Rudolph i Moehler, 1999). Ova tehnologija, kojaje prvi put predstavljena 1980 godine, omogucuje inak tiviranje postojecih gena ("knock-out") iIi umetanje novih gena ("knock-in") u priplodne kolonije zivotinja. Primeri ovakvih modela ukljueuju trans gene miseve sa povecanom ekspresijom mutiranih formi proteina prekursora amiloida (APP) iii presenilina (videti Yamada i Nabeshima, 2000), 8to je znaeajno u patogenezi Alzheimerove bolesti (Pogla vlje 34). Kada dostignu starost od nekoliko meseei, ovi mi aevi razvijaju patoloske lezije i kognitivne promene sliene Alzheimerovoj bolesti, sto obezbeduje vrlo ko~stan model
za testiranje novih terapijskih metoda. Jos jedno neurodege nerativno stanje, Parkinsonova bolest (poglavtje 34), modeli ranoje na transgenim miSevima sa poveeanom ekspresijom sinukleina, proteina koji je naden u moZeianim inkluzijama koje su karakteristiene za ovo oboljenje (videti Beal.2001). Mi~evi kod kojih je inaktiviran gen za odredeni pooup ade nozinskog receptora pokazivali su odredene kardiovaskular ne abnormalnosti i poremetaje u ponManju, kao ito je po jaeana agresivnost, smanjen odgovor na toksicne stimuluse i poviSeni mni pritisak (Ledent et aL, 1997). Ovi nalazi doprineli su definisanju fizioloSke uloge ovog receptora, ei ja funkcija je za &ada ner~asnjena, i postavili smernjce za nove pravce terapijske primene agonista i antagoni+ ovih receptora (npr. za redukciju agresivnog ponManja Hi u tera piji hiperteuzije). \ , Primena transgenih Zivotinja u farmakoloskom ispitiva nju naglo se poveCava sa napretkom tehnologije. Pregll'Xi najnovijih dostignuca dali su Rudolph i Moehler (1999). Ipak, postoji nekoliko ogranicenja. Jedno od Jijih jc to sto prebacivanje gena mo:!e izazvati uginuee Zivotinje tokom gestacije Hi ubrzo nakon okota. Drugo je to Ito adaptivne promene mogu cia nadoknade nedostatak iIi poveCanu eks presiju odrei1enog gena ina taj natin otefaju inte1'pl'etaciju fenotipskih promena uoOOfiih kod transgenih :!ivotinja. Tre ce, inkorporiranje novog genetskog materijala me:!e uticati na kontrolu fuokcije drugih gena. Da bi se ovaj problem pre vazibo, razvijeni su metodi za postizanje uslovne mutagene ze (plueck, 1996; Rudolph i Moehler, 1999), gde se ubaeeni geni obraduju tako da do njihove ekspresije dolazi sarno u odredenim celijama (npe, neuronima) iIi se oni mogu ukljuci ti/iskljuciti iskljuCivo delovanjem eksternog signala, kao /lto je npr. aplilcacija intetferona, a zivotinji je omoguceno cia se do tog momenta normalno razvija. Trenutno se tehnologija uglavnom oslanja na miseve, koji se brzo razmnoZavaju, ali Jijihov nedostatakje to §tosu uglavnom suvise mali za veCi nu eksperimentalnih namena.
.
.
• Zivotinjski mod~1i bolesti znacaifli suza~$ri\l8nje n9~i9' . terapiJskih agansa. Zivotinjski modeli u principu reprodu~, kuju samo neke aspekte humal1lhboiesti.fy1od~1i pslhija~ trijsklh oboljenja sli naroclto probiematiOhC.. . • Transgene :!ivotil1je sestvaraj~ .iiaZlv~rtjetnJllutacija··i ujaJnlm 6elijama (1Ii6e!ijama spa' " ) ~VotinJe (uglavnom miseva), Sfo omoguci!je... ............ylt}gen;~: '.' ("knOCk inB) iii inaktlvif'Bl'lJem.mUb:l¢iju ve6po~to~e¢in.~~-'· na (.knoCk-out:) kodkolonlja priplodnihiiYQtirtja;. . . , . • Insercija ill deIElclj~odre«enlh gena moz~dalzaz0vtf~1'19" tipske promene ~IICnI3 h~manlm oboljenjimal$v~:ce§qe se primanjuje~ara~ij~nll;l modela. prlllko(T'~estiranja 'e~o~ va. DanasJa. na. raspolEi9Q11Ju vt;lUki brojQy~~Vlht:TI~d~I~. Hi • lzazvana mutacljad~luJetokolll.c.~og~lVpb:~ y()ja.i~lvotinja, arrto~e Pili i letalna. Novetehnl~e4 ." .rn~\a, .. ; geneze pi'edstavljajunapredakkojl6e omogu61ti d~~'i:lP~ . ,... 'normalnigen aktlviraldeaktlvlrau.teljenornmomentu:· .
85
KLINICKAISPITIVANJA··. Klinieko ispitivanje je metod za objektivno posmatranje i uporedivanje rezultata dYe iii vise terapijskih procedura. Za nove lekove ono se sprovodi u toku faza II i ill klinickog razvoja leka (poglavlje 54). Veomaje vafna einjenica da SU do sedamdesetih godina XX veka terapij ski metodi odrediva ni na osnovu klinickog utiska i lienog iskustva vise nego na osnovu objektivnog testiranja·. Ipa}(, s jedne strane, veliki broj lekova Cije dejstvo je neospomo, ostaju u upotrebi iako nikada nisu bili testirani u kliniekom ispitivanju; s druge stra ne, digitalis (Poglavlje 17) se koristio punih 200 godina u terapiji sreane insuficijencije, kada je kontrolisano klinieko ispitivanje pokazalo da je njegovo dejstvo vrlo ograniceno, osim kod odredene vrste pacijenata. Danas je ovaj vid te stiranja obavezan za svaki novi lek, pre nego sto se dobije dozvola za njegovu klinicku primenu". Friedman i sar. (1996) daju dobar pregled principa i orga nizacije kliniekih ispitivanja. Klinieko ispitivanje ima za cilj da uporedi odgovor ispitivane grupe pacijenata koja prima novu terapiju (A) sa kontrolnom grupom, koja prima postoje cu, "standardnu" rerapiju (B). Terapija A mofe biti novi lek iIi nova kombinacija postoje6ih lekova, iIi bilo koja druga vr sta terapijske intervencije kao sto je hirur§ki zahvat, dijeta, fizioterapija itd. Standard na osnovu kojeg se vr§i procena (terapija B) moZe biti terapija lekovima koji su u redovnoj upotrebi iIi placebo (ukoliko trenutno ne postoji efikasna te rapija lekovima) iIi terapija moze potpuno izostati. Primena kontrole je kljuCni momenat za klinieko ispiti vanje. Informacije 0 terapijskoj efikasnosti na osnovu izves taja pacijenata (na primer, da se 16 od 20 pacijenata koji primaju lek X osecaju bolje nakon 2 nedelje) nisu znaeajne ukoliko nemamo saznanja 0 tome kako se ose6a 20 pacijena ta koji ne primaju terapiju, iIi primaju neku drugu terapiju. Uglavnom se kontrole dobijaju od grupa pacijenata koji su odvojeni od onih koji primaju test-terapiju. Ipak, ponekad se primenjuje i unakrsni model, gde se isti pacijenti premeStaju iz ispitivane grupe u kontrolnu iIi obmuto, pa se zatim vrSi poredenje rezultata. Randomizacija je od kljuenog znaeaja, kako bi se izbegle greske prilikom svrstavanja pojedinih pacijenata u ispitivanu, odnosno kontrolnu grupu. Shodno tome, kontrolisano klinicko ispitivanje sa randomizacijom
86
• Ne uvek. James Lind je 1753.godine sproveo kontrolisano ispiti vanje na 12 mornara i pokazao da su limun i pomorandZa delovali kao za§tita od skorhuta. Ipak, proslo je 40 godina pre nego sto je Britanska mornarica poshiSala ovaj savet, a ameri6koj mornarici je trehalo vise odjednog veka. •• U nekim oblastima postoji tendencija da se osporava ovakav pri stup koji zahteva dokaze 0 eflkasnosti terapijskih procedura kroz kontrolisana klinicka ispitivanja, 6emu se suprotstavljaju stavovi i doktrine "holisti6ke" medicine. Ovo je u osnovi antinau6ni stay, jer nauka moZe da napreduje sarno razvojem prognoze iz hipoteze i podvrgavanjem prognoze eksperimentalnim testovima. Naul::ni pri stup ukljul::uje medicinu zasnovanu na dokazima (evidence-based medicine; videti Sackett et aI., 1996), koja postavlja stroge kriteriju me u proceni terapijske efIkasnosti na osnovu kontrolisanih klinil:: kih ispitivanja i koja podstil::e sumnju u pogledu terapijskih doktri na, kada efIkasnost date terapije nije dokazana.
trenutno se smatra kljuenim postupkom prilikom procene klinicke efikasnosti novih lekova. Ono 810 se ne mofe izbe6i u ovakvim situacijama jeste etieka dilema prilikom svrstavanja pacijenata u grope me todom slueajnog uzorka, kada ordinirajuci lekar veruje cia je ispitivana terapija efikasnija. lpak, razlog za pokretanje ovakvih ispitivanja je sumnja u eflkasnost terapije, koja je prisutna u svesti velikog broja lekara, pa tako ovi lekari prak tieno i nisu u etickoj dilemi. Ako su pojedini lekari liello uvereni daje terapija efikasna, trebalo bi da izbegavaju uces ce u ovakvim kontroli~anim ispitivanjima. U ispitivanju se prim~juje princip informisanosti i pristanka.", gde svakom pacij¢ntu mora biti objaSnjena priroda ispitivanja i on mo ra bitirglasan da ueestvuje u njemu, tako da bez znanja i metodom slucajnog uzorka bude svrstan u ispitivanu iii kon \ trolnu grupu. Za ~liku od ranije razmotrenih bioloSkih ogleda, klinie ko ispitivanje ne pruZa informaciju 0 potentnosti iIi formi krive doza-odgovor. Ono sarno uporeduje odgovore koje da ju dva odabrana terapij ska rezima. Mogu se postaviti i dodat na pitanja, kao sto je ucestalost i tetina nefeljenih dejstava, da Ii terapija deluje bolje iIi lo§ije kad odredenih grupa pa cijenata. Ve6ina ispitivanja sprovodi se. na §to jednostavniji naein. IstraZivae mora unapred da odredi koliku dozu ce ko ristiti, koliko cesto ce je davati, a ispitivanje ce pokazati da Ii je odabrani refim bolji Hi losiji nego kontrolna terapija. Ono ne6e pruZiti informaciju da Ii pove6anje iIi smanjenje doze ima za posledicu bolji odgovor; za ovo je neophodno dnl go klinicko ispitivanje. Osnovno pitanje koje se postavlja kliniekim ispitivanjemje, shodno tome, jednostavnije nego kod ve6ine konvencionalnih bioloskih ogleda. Ipak, organi zovanje klinickog ispitivanja, praceno problemom izbegava nja greSaka, neuporedivo je komplikovanije, dugotrajnije i skuplje nego bilo koji bioloski test u lahoratoriji.
IZBEGAVANJE GRESAKA
:"~~.!!~?!l?:~"l!~U~..
,~..J!YQ.~Q;:~.~paJ~b»jM"., Kada se mi uporedivanje dye terapije na serijama odabra nih pacijenata, najjednostavniji oblik randomizacije je raspo redivanje pacijenata u grupu A iIi B, tako sto im se brojevi dodele bezodredenog reda (nasumieno). Poteskoca koja se moze javiti kod ove jednostavne randomizacije, naroeito ako se radi 0 malim grupama, je to sto se moze dogoditi da se grupe razlikuju u pogledu starosti, pola iIi tezine same bo lesti.·.S1.1:atif1ktL~jl.g£ijp_eefl1«Ls..~.~~n~1:Lda..bLse
,EE~:'.~i~~_9~YjllJ?!.~.!.Q~~"~"~!~1?i~j.£LmQg!tp.o,~~~~!~.~ "~tarQsnekategQri.i~,Jl..1;.~!i>~,.~~_,!! okv~ svak~_ kategorij ~_'2'"~i .raspodela..u...grnplt.AJ!U!l.1n&QdQm~!!ll~nog uzorka. Na ovaj naein nioze se postupati kada su u pitan~Jediii1Tr2fve ••• Cak i ovo moze biti spomo, poAto pacijenti koji su hez svesti, mentalno zaostali iii mentalno poremeeeni, nisu u mogucnosti da daju takvu vrstu saglasnosti,ali niko ne hi zeleo da spreCi ispitiva nje koje hi ponudilo eflkasniju terapiju Za takve pacijente.
specificnosti, ali broj karakteristika koje se uzimaju u obzir brzo se povecava i proces gubi smisao ako je broj ispitani. ka u svakoj grupi suvise mall. Osim sto se izbegavaju gres ke usled disbalansa grupa A i B, stl'atifikacija omogueujc i izvodenje nekih kompleksllijih i dctaljnijih zakljuCaka. Na primer, B se moze pokazati efikasnijim od A kod odre<1ene grupe pacijenata, iako u ce1ini nije Zllaeajno boljL . Q.~g~slepertelmika:;~sto"ZDaei,.Qani.sijpj,~~jj§!m~ zi~aC ~.!T~tku~i~i!LY!!!i~.Il~_~J.~.~2j.I!J~ij!J£J?!Ll!1~ '-'nl~ie, imaza cilj da sved~subjektivne gre§kena mi~, Vi~e p~~'~ pobzaio~, uz~n~Jb~lju~~lju, ~t i istl'a zivae doprinose ovakvim gre~kama ukoliko su upoZllati sa tempijom, tako da ovakva dvostruko-slepa tehnika predsta vlja znacajnu zastitu. lpak, to nije uvek moguee. Odre<1eni rezim ishrane iIi hirorSka operaeija, na primer, retko se mo gu kamuflirati. Cak i kad su u pitanju lekovi, farmakololli efekti mogu paeijentu sugerisati ~ se koristi u terapiji i to moZe utieati na njegove izjave·. Ipak, primena dvostruko-sle pe procedure je vrlo vaWl princip, ali uz primenu odredenih mem predostroZnosti koje ce spreeiti ovakve uticaje, npr. ma skiranje ukusa iii izgleda lekova koji se primenjuju. Izvodenje ovakve "prevare" ponekad je i wlo problema tieno. U poku§aju da odredi da li je melatonin delotvomi. ji protiv tegoba koje prate brzu promenu wemenskih zona (jet-lag), jedan farmakolog je odahrao grupu svojih kolega farmakologa, koji su u¢estvovali na kongresu u Australiji. Dao im je neobeleZene kapsule koje su sadrZale melatonin i placebo i zamolio ih da popune upitnik 0 stanju nakon leta. Vecina njih su (kao ijedan od autora), uz pomoc jednostav ne analiticke dosetljivosti, otvorili kapsule i baeili ih u kantu za smeee kada bi ustanovili da sadr~e placebo. I farmakolozi su samo Ijudi!
VELICINA UZORKA Kako eticki, tako i finansijski razlozi diktiraju da ispiti vanje mora da obuhvati minimailli broj subjekata, a obimne statisticke procene se bave problemom prethodnog odre<1i vanja broja subjekata kojije neophodan da bi se dobio upo trebljiv rezultat. Rezultati ispitivanja, po svojoj prirodi, ne mogu pruZiti apsolutno konaean dokaz. Razlog za to je sto su oni zasllovani na uzorku pacijenata, a uvek postoji moguc nost da je uzorak atipican za populaciju iz koje je uzet. Mo guea su dva tipa pogresnih zakljucaka, pozllatih kao gre§ke tipa I i greSke tipa II. ~~ija"seJ~IKl!l,,~~.2~~.~.!~~~."V
terapija Ai B, a ona u~ari ne postoJL(_Q,1t~~j.!!~~
·~1L9i~~ij;;;,~;~r.;ustauQ,y,Jj~_f!Z_:v.
.. E~~.l~p!.~.ru,llt!l, .QY~.1~L~Qjj,~··§~.1!)!.ty!!j~r,!Z;~l!.!!~~"A" negativan rezultat). Glavni faktor koji odreduje velicinu po
'"ttebn~g"'~;;;bj~-~1eperi sigumosti koji istraZivac zahteva
tipa I izraZava se kao znaeajnost rezultata. Ako kaZemo da se A i B razlikuju sa stepenom znatajnosti 0,05, to znafi da je verovatnoca za dobi.ianje Imo pozitivnog rezultata (~. pojavu greske tipa I) manja od 1 u 20. U vecini slui!ajeva, ovaj nivo znatajnosti se smatra prihvatljivim kao osnova za donosenje zakljuCaka. Verovatnoea izbegavanja greSke tipa II (tj. propu!tanje uoCavanja stvame razlike izmedu A i B) ozna~va se kao snaga (power) ispitivanja. Gre§ke tipa II smatraju se blaZim nego greske tipa 1, a ispitivanja se cesto planiraju sa snagom 0.8 - 0.9. Da bi se poveeala ~ajnost i snaga ispitivanja, n~phodno je poveeati broj pacijenata. Drugi faktor koji od reituje velieinu uzorkaje stepen razlike izmeduAi B, koji se smatra klinicki znaeajnim. Na primer, da bi se ustanovilo'da primenjena terapija smanjuje stepen smrtnosti u odredeninl uslo\rima za najmanjelO proeenata, recimo sa 50% (kon trolna·grupa) na 40% (tretirana grupa), bilo bi potrebno 850 ispitanika, uz pretpostavku da ulimo da dostignemo Divo znatajnosti od 0.05 i snagu 0.9. Ako bismo bili zadovoljni da dok:atemo smanjenje za 20 procenata (i verovatno propu stimo smanjenje za to procenata), bilo bi Dam potrebno sa mo 210 subjekata. U ovom primeru. propustanje smanjenja smrtnosti od 10 procenata maZe imati za rezultai otiustajanje od terapije koja bi spasla 100 tivota na svakih 1000 pacije nata - sto je izuzetno ozbiljna gre§ka sa drustvene mcke gle dillta, Ovaj jednostavan primer naglaiava potrebu proeene klinicke koristi (koju je eesto vrlo te§ko odrediti) paralelno sa statistickim principima u planiranju ispitivanja (koji BU prilicno jednostavni). 'f' Primena sekver/eljalnih ispitivanja, koja je uveo Armitage 1975. godine, imazacilj da svede na minimum broj subjekatakoji sekon tinuirano korillte u toku istrafivanja i da zaustavi ispitivanje'
Projektovana su i raz!icita "hibridna" ispitivanja, koja imaju tu prednost da predstavljaju sekvencijalna ispitivanja u pogledu mi nimalnog broja pacijenata, ali koja striktno ne z.ahtevaju parove subjekata (videti Friedman et aI., 1996). Kao i konvencionalna is pitivanja, sukcesivlle preliminame (interim) auaHze sakupljenih po dataka (monitoring grupa neZllvisno od istralHvai5a) vr~e se u toku ispltivanja, 8tO omogueava da se ispitivanje prekine /lim se doblje jasan rezultat. U jednom ispltivanju velikog obima (Beta-blocker Heart Attack Trial Research Group, 1982) gde je ispitivana dugo trajna terapija propranololom - lek koji blokira p-adrenoceptor (poglavlje 11) nakon srcanog napada, preliminami rezultati su po kazali znaeajno smanjenje smrtnosti, sto je dovelo do brzog zavr selka ispitivanja.
da bi se izbegle ovakve greske. Verovatnoca pojave greske
MERENJE KLiNICKOG ISHODA • Nije lako napraviti jasnu razliku izmedu stvamog fannakoloskog odgovora i povoljnog klini(\kog dejstva koje je izazvano saznanjem (00 osnovu fannakoloskih efekata koje lek vrsi) da se dobija aktivni lek; stoga ne mozemo o(\~kivati da nam tako jednostavno klini(\ko ispitivanje razresi tako slozeno semanti(\ko pitanje.
Merenje kliniekog ishoda moze biti vrlo komplikovan po sao, a to u poslednje weme i jeste, posto se dmStvo sve in tenzivnije bavi procenom efikasnosti terapijskih proeedura vise u smislu pobolj~anja kvaliteta zivota, drustvene i eko-
87
POGLAVWE nomske koristi nego u smislu objektivnih klinickih efekata, kao ~to je npr. sniZenjekrvnog pritiska, bolja provodljivost disajnih puteva iii produzeni zivotni vek. Razvijene su broj ne skale za procenu "kvaliteta fivota u odnosu na zdravlje" (videti Drummond et aI., 1997; Walley and Haycocs, 1997) i postoje tendencije da se one kombinuju sa statistickim predvidanjima zivotnog veka kako bi se doslo do podatka o "dufini Zivota uskladenoj sa kvalitetom Zivota" (quality adjusted life-years - QALY) kao opstem merliu delotvomo sti terapije. Ovo predstavlja pok:u!aj da se prilikom procene uzmu u ohm i period preZivljavanja i ublaZavanje bola·. Pri planiranju kliniCkih ispitivanja, ,neophodno je unapred odre diti cilj ispitivanja i shodno tol/ne definisati i merila klinic kog ishoda.
PLACEBO l'Placebo je laZni lek koji ne sadrZi ~vne sastojke (iii la!ni hi· rurSki zahvat, dijetetski reZim iii drup terapijika intervencija). za koji pacijent veruje (iIi koji bi mopo bili. u ~kontekstu kontroli sanog ispitivanja) da je pmvi. RasprostranjenQ je verovanje da je ''placebo odgovor" m06no terapijsko sreditvo, koje pokazuje ZIlll eajno povoljno OOlovanje k<>d oko treCine pacijenata. Veliki broj k1ini/!kih ispitivanja ukijuwje placebo-grupu, kod koje lie moie 1.iOOiti pobolj5anje, ali sarno je u rnalom broju ovih ispitivanja ova grupa uporedivana sa kontrolnom grupol11, koJa nije primala tempi jU. Noviji pregled rezultata ovakvih ispitivanja (Hrobjartsson and Grotsohe. 2001) pokazao jedaje placebo efekat u principu bio bez zniWaja. osim u slueaju ublabvanja bola, goo je on bio slab, ali ipak znacajan. Ovi autori su zakljucili da popula.mo verovanje n snagu placebo efekta nije taeno i verovatno delimillno reflektuje tendenciju da kod velikog broja simploma dolazi do spontanog pobo1j§anja, a delimieno je i posledica pogreinih informacija koje pacijent daje da bi zadovo!jio svog lekara. Eti~ko pitanje primene placebakao tempije, ~toje bilo terna mnogihjavnib raspmva, sloga je verovatno manje znacajno nego lito se do sada mislilo. Ipak. ne treba potcenjivati rizike koje sa sobom nosi placebo terapija, kao Ato au: odlaganje upotrebe aktivnog leka, nepoverenje pacijenata u in/egritet lekara, a stanje "terapijske zavisnosti" mou se javiti kod !judi kojl nisu bolesni, posto nema mogu6nosti da se proceni da Ii pacijentu jos uvek "treba" placebo.
META-ANALIZA l' Primenom statistickib tehnika mogu se kombinovati podacl dobl jeni u nekoliko individualnih ispitivanja (uz pretpostavlru da je sva ko od njih sprovedeno u skladu sa principom randomizacije) da bi se postigao visi stepen znaeajnosti i snage, Ova procedure, poznata kao meta-analiza iii pregledna analiza, moze biti vrlo korisna za donosenje zakljucka na osnovu nekoliko objavljenih ispitivanja, gde se kod nekih testirana terapija pokazala boljom od kontrolne, a kod nekih ne. Kao objektivna procedura, u sVakom slu~l\iu je bolja od dono§enja zakljucaka po principu "odaberi sam", zakoji se odln cuje veeina !judi kada se suoci sa kontmdiktomim podacima. lpak, ona ima neke nedostatke (videti Naylor, 1997), a najveci ad I:\iih
predstavlja takozvana "greika pri publikovanju", jer negativna is pitivanja se u principu smatraju manje interesantnim i zbog toga je manja verovatnooa da ce ona biti objavljena, nego §to je to slucaj sa pozitivnim ispitivanjima. Sledeci problem je "dvostruko brojanje", jer se isti podaci pojavljuju u viSe od jednog izve§taja.
ORGANIZACIJA KLlNICKOG ISPITIVANJA Organizovanje klinickih ispitivanja velikog obima, u koja su ukljufene stotine ill hiljade pacijenata u razlicitim ldinifkim centrima veliki su i skupi poduhvati. Ona predstavljaju je dan od najznaeajnijih troskova prilikom razvoja novog leka, a velike su §anse da stvari krenu naopako. Jedno veliko klinicko ispitivanje (Anturane Reinfarction Trial Research Group, 1978) obuhvatilo je 1620 pacijenata iz 26 istra£vaekih centara u SAD i Kanadi, 98 istrativaca saradnika i impresivnu listu organizacionih komisija, uklju cujuci i dva nezavisna komiteta koji su proveravali da li se ispitivanje mi u skladu sa strogim protokolima. ZakljuCak