UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS “Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA ”
Facultad de Ciencias Biológicas E.A.P Genética y Biotecnología
INFORME DE PRÁCTICA DE LABORATORIO DE BIOLOGÍA DEL DESARROLLO
PRÁCTICA: FERTILIZACIÓN Y DESARROLLO TEMPRANO DEL ERIZO DE MAR, EXOGASTRULACIÓN
PROFESOR:
Fernando Retuerto Prieto
ALUMNO:
Erick Figueroa Ildefonso
Código: 11100021
HORARIO de PRÁCTICAS:
DIA: miércoles HORA: 1:00
pm – 3:00 pm
LIMA-PERÚ
2014
FERTILIZACIÓN Y DESARROLLO TEMPRANO DEL ERIZO DE MAR, EXOGASTRULACIÓN
INTRODUCCIÓN
El presente trabajo se centra en el análisis y seguimiento realizado de los estadios de desarrollo embrionario del erizo de mar Tetrapygus niger desde la fecundación del gameto femenino hasta la formación de la larva pluteus. En una prueba en paralelo se analizó el efecto que produce una infusión de uña de gato ( Uncaria tomentosa) en el proceso de desarrollo del embrión; y la posible ocurrencia del fenómeno de exogastrulación del embrión de la especie en estudio. La técnica aplicada implica básicamente el encuentro del ovocito con el espermatozoide fuera del organismo femenino, realizándose este encuentro en el laboratorio. A diferencia de las técnicas de fecundación in vitro que se realizan en la especie humana, en los animales estos procedimientos están dirigidos principalmente a poder desarrollar nuevas tecnologías a fin de ampliar los conocimientos sobre los procesos involucrados en el complejo fenómeno de la reproducción, como también por otro lado implementar certeramente biotecnologías en los animales domésticos, especialmente aquellos de importancia comercial, mejorando así la eficiencia reproductiva y genética de las especies. En concreto, el erizo de mar es muy utilizado en estudios reproductivos ya que es fácil obtener sus gametos y realizar fecundaciones, además las etapas de desarrollo pueden ser identificadas claramente.
MARCO TEÓRICO
FECUNDACIÓN Y DESARROLLO TEMPRANO DEL ERIZO DE MAR La liberación de espermatozoides y los huevos al ambiente, conocido como desove libre, es un mecanismo común de reproducción en organismos marinos. En la mayoría de los animales de desove libre, la fertilización ocurre en una columna de agua, seguida por el desarrollo de la blástula, hacia blástula y finalmente a larva pluteus (1). El proceso de la fecundación comienza con la interacción del espermatozoide con el ovocito maduro. La primera interacción consiste en el contacto del espermatozoide con la cubierta más externa del ovocito, lo que desencadena una serie de reacciones, entre ellas la reacción del espermatozoide, lo que permite finalmente la incorporación y dispersión del material genético al interior del ovocito.
En el caso de los erizos, la primera interacción de los gametos ocurre en la cubierta de gelatina externa del ovocito. Esta cubierta posee receptores especie – específicos, que interactúan con los receptores de la membrana celular de los espermatozoides, gatillando la reacción del acrosoma. Con esto se desencadena una serie de eventos que llevan a la fusión de membrana plasmática del ovocito con la membrana interna del acrosoma. Luego se forma una capa de fecundación, la que evita la polispermia. Posteriormente el espermatozoide penetra hacia el interior del ovocito para terminar en la fusión de ambos pronúcleos. Luego de la fecundación, la fusión de ambos gametos se da la formación del cigoto, con lo que se recupera el número original de cromosomas de la especie. Ocurrido esto se gatilla la
segmentación, proceso mediante el cual, a partir de una célula única se suceden una serie de divisiones mitóticas hasta llegar al estado de blástula. La segmentación se inicia con la división del núcleo quedando la célula huevo dividida en dos células hijas denominadas blastómeros; cada uno de los cuales se dividirá y dará lugar a 4 células, de este modo el número de blastómeros aumenta de forma geométrica. En esta etapa los blastómeros permanecen unidos dando un aspecto al cigoto de una mora (estado de mórula) (2).
Conforme las divisiones van transcurriendo, los blastómeros son más pequeños. La blástula, el ultimo estado de segmentación, en el cual pueden encontrarse 64 blastómeros formando una capa externa de células compactas entre sí (blastodermo) y con una gran cavidad interna (blastocele); el embrión toma la apariencia de una esfera hueca. La siguiente fase es la gastrulación, en la cual el blastodermo da origen a las capas germinales, el estado resultante se llama gástrula. Posteriormente la gástrula forma la larva, denominada “larva pluteus”; la que posee boca, ano y tubo digestivo, su forma es cónica y se caracteriza por la presencia de 4 brazos o espinas (3).
EXOGASTRULACIÓN Existen sustancias químicas que inducen a la exogastrulación del embrión cuando se encuentra en estadio de blástula; la exogastrulación es un proceso anormal en el cual el mesodermo de la gástrula y el endodermo no son internalizados; como resultado se forma una exogástrula. En 1893 Cut Herbst descubrió que los embriones de erizos de mar pueden formar exogástrulas si en el agua de mar en la cual se están desarrollando, se adiciona sales de litio, y de esto modo introdujo el fenómeno de exogastrulación a la embriología experimental. El tratamiento con iones de litio también provoca la exogastrulación en embriones de anfibios (4).
MATERIALES Y MÉTODOS Del alumno
Erizos de mar (Tetrapygus niger )
Agua de mar
Láminas portaobjetos y cubreobjetos
Del laboratorio
Beakers
Pipetas Pasteur
Lámina excavada
Papel filtro
Embudos de vidrio
Microscopio
A. OBTENCIÓN DE GAMETOS En los erizos de mar, como en otros equinodermos, los sexos se encuentran separados. En la naturaleza; los gametos se descargan en el agua y de este modo el espermatozoide nada hasta el ovulo. No es posible distinguir externamente los sexos del erizo de mar. Un método que permite obtener los gametos es inyectando pequeñas cantidades de KCl en el celoma del erizo. Las gónadas de los erizos se encuentran ubicados en la superficie aboral interna; y se distinguen entre sí por el color. Los huevos de Tetrapygus niger son granates y el esperma de color cremoso.
Para obtener las gónadas, se coloco los erizos adultos en placas Petri y se procedió a cortar la región aboral que contiene las gónadas; obtenidas las gónadas de cada se les coloco en placas Petri. Previamente se debe contar con agua de mar, la cual se filtra con ayuda de un embudo de vidrio y papel filtro.
En un beaker con agua de mar filtrada se introducen las gónadas femeninas de erizo; para que se liberen los gametos femeninos se realiza una agitación dentro del agua; se considera que los gametos se liberaron cuando la solución se torna de color rojizo. Para la obtención de los gametos masculinos, a las gónadas del erizo de mar macho, se le aplico una pequeña cantidad de agua de mar; para que los espermatozoides estén en movimiento en esta. Estos espermatozoides, que están activos, a diferencia de los huevos, son viables solo por un tiempo limitado en agua de mar.
B. FERTILIZACIÓN Para que ocurra la fecundación del huevo por parte del espermatozoide, ambos gametos debe entrar en contacto en el agua de mar filtrada; para esto se necesita una pequeña cantidad de la suspensión de espermatozoides y de la suspensión de huevos. La mezcla resultante se coloca en una lámina portaobjetos excavada, y se llevo a observar. Al ser la fecundación un proceso rápido, al microscopio podrá observarse al huevo ya fecundado, y rodeado por el halo de fecundación característico.
Gónada femenina
Gónada masculina
Erizo de mar
Gameto femenino antes de la fecundación
C. EXOGASTRULACIÓN Se han encontrado diferentes agentes químico que conducen a la “animalización” o “vegetalización” del embrión de erizo de mar. En esta práctica embriones en desarrollo
temprano, en etapa de blástula; fueron sometidos a dos concentraciones de esencia de uña de gato y dos de té.
Tubo 1a: 20 uL de Esencia de uña de gato.
Tubo 1b: 40 uL de Esencia de uña de gato.
Tubo 3a: 20 uL de Esencia de té.
Tubo 3b: 40 uL de Esencia de té.
A estas soluciones se les adiciono 3ml de la suspensión de embriones que se encontraban en estadío de blástula. Se realizaron monitoreos del desarrollo embrionario, así mismo se hizo un monitoreo de las muestras sometidas a los agentes químicos que producirían una exogastrulación del embrión.
Soluciones de té y uña de gato
Suspensión de embriones de erizo de mar
Embriones en estadio de blástula
RESULTADOS Luego de ocurrida la fecundación, se llevaron a cabo conteos del número de células encontradas; diferenciándolas en estadios de desarrollo embrionario; esto fue según como sigue: La fecundación se llevo a cabo el día miércoles 23 de abril alrededor de la 1:48pm.
El primero conteo se llevo a cabo el mismo día a las 3:45pm. El segundo conteo se realizó el segundo día cerca de las 5:30 pm.
En el primero se llego a visualizar embriones de hasta 4 blastómeros; en cambio en el segundo ya pudo contabilizarse 8 blastómeros.
En el tercer conteo, que se llevo el día jueves 24 de abril alrededor de las 9:00 am, ya se visualizaban embriones en estadio de blástula y gástrula.
En los conteos posteriores; los cuales fueron llevados a cabo a intervalos de cerca de 2 hora, hasta las 3pm de la tarde de ese día fue evidente la variación del número de blástulas con respecto al número de gástrulas, las segundas iban en aumento gradualmente y las blástulas su porcentaje iba disminuyendo en los campos analizados conforme transcurría el tiempo. En los últimos 2 conteos llevados a cabo el día viernes 24 de abril; se observo que casi el total de embriones a considerar en el conteo se encontraban en estado de gástrula; así mismo pudieron encontrarse algunos embriones en estado de prisma.
Embriones en estado de blástula y gástrula
Embriones en estado de gástrula
Embriones en estado de prisma
Tabla de conteo de embriones en diferentes días y horas Tiempo
Células sin dividir (1 célula) 44.55% 16.67% -
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
2 células 53.47% 3.33% -
4 células
8 células
blástula
gástrula
prisma
1.98% 26.67% 53.33% 70.59% 32.00% 14.04% 28.00% Se visualizó presencia de gástrula
29.41% 68.00% 85.96% 72.00% 57.14%
42.86%
Variación de estadio de embrión vs Tiempo 100% 90% 80% SD
70%
2
60%
4 50%
8
40%
blástula
30%
gástrula
20%
prisma
10% 0% 1
2
3
4
5
6
7
SD: embrión sin dividirse Se indica con números el número de blastómeros en los embriones. *Entre los embriones contados se encontraron algunos que tenían números impares de blastómeros.
En lo que respecta a la prueba de exogastrulación, esta no fue observada. El efecto visualizado en las suspensiones de embriones tratados con mayor concentración de esencia de uña de gato, fue daño a nivel embrionario en estadio de blástula.
Embriones de erizo de mar en estado de blástula que sufrieron daño por la exposición a la solución de uña de gato
DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS Inmediatamente después de estimulada la fecundación del erizo de mar; se observó al microscopio, los cambios instantáneos que sufría el gameto femenino; como fue la formación del halo de fecundación; ocurrido este evento se tiene en consideración que el ovulo está desarrollando los procesos involucrados para la prevención de la polispermia; al microscopio se pude verificar debido a que se observaron espermatozoides adheridos a la superficie de este gameto (5). Estos procesos involucrados incluyen la activación de los gránulos corticales, este es un bloqueo mecánico para la polispermia más lento que llega a ser activo cerca de un minuto después de la primera fusión exitosa entre el espermatozoide y el gameto femenino. Debajo de la membrana celular del óvulo del erizo de mar se encuentran cerca de 15.000 gránulos corticales, cada uno de aproximadamente 1 µm de diámetro. Al producirse el ingreso del contenido del espermatozoide, estos gránulos corticales se fusionan con la membrana celular del gameto femenino recién fecundado y liberan sus contenidos en el espacio entre la membrana celular y el material fibroso de las proteínas de la membrana vitelina. Conforme las horas fueron avanzando y se realizaban los monitoreos a intervalos de tiempo, se observaron las células realizando clivajes; las células de 2, 4 y 8 blastómeros observadas se observaron dentro de las siguientes primeras 4 horas del mismo día de la fecundación; conforme el tiempo transcurrió la proporción de embriones en distintos estadio variaba; disminuyendo los de estadios iniciales (1 , 2 blastómeros) y los de estadios siguientes (4, 8 ó 16 blastómeros) , productos del clivaje de los anteriores, iba incrementándose en proporción en la suspensión analizada. Dentro de la suspensión analizada s encontraron embriones que tenían número impar de blastómeros; esto se debería a que estos embriones murieron antes de completar su clivaje dejando el embrión con el número de blastómeros incompletos. En los estadios más avanzados que se analizaron también pudo encontrarse una variación proporcional entre las blástulas y gástrulas presentes en la suspensión de embriones, el número de blástulas en un inicio fue mayor al de gástrulas lo que se explicaba con el hecho de que estas provendrían de los embriones que continuaron con su desarrollo que estuvieron clivando el día anterior, y que finalmente se diferenciaron en el blastodermo y blastocele; este tipo de embriones se les reconocía por el movimiento de rotación sobre su eje; al ser estas de forma casi esférica; a diferencia de las gástrulas su movimiento es en “tirabuzón”. El número de gástrulas conforme avanzaba el tiempo iba en aumento y el de blástulas en decrecimiento, esto nos indica que las blástulas están diferenciándose a gástrulas. Esto se observó en los últimos monitoreos; en uno de estos últimos monitoreos pudo distinguirse que algunos embriones empezaban a adquirir la forma de prisma. En revisiones posteriores se hubiera esperado encontrar larva pluteus producto de la diferenciación del embrión en prisma, lo que no se pudo realizar en esta práctica. Los efectos observados en las blástulas sometidas a soluciones de uña de gato (altas concentraciones), sufrieron daño; no ocurrió exogastrulación.
CUESTIONARIO
1. Explique el fenómeno de la aglutinación La aglutinación de los óvulos sin capa gelatinosa es mediada por la bindina, esta es una proteína acrosómica que se encarga del reconocimiento en los erizos de mar. Esta es capaz de unirse a los óvulos sin capa gelatinosa de la misma especie; esta interacción es relativamente específica de especie. La bindina está localizada específicamente sobre el proceso acrosómico; lugar donde estaría para el reconocimiento entre óvulo y espermatozoide. Existen estudios que demostraron que las bindinas de especies de erizo de mar estrechamente relacionadas son en efecto diferentes.
2. ¿Existen cambios fisiológicos internos en el huevo luego de la fecundación? Luego de la fusión entre el espermatozoide y el ovulo del erizo de mar se activa los bloqueos de la polispermia: el rápido, iniciado por el ingreso de sodio a la célula; y el bloqueo lento, iniciado por la liberación de Ca2+ intracelular; esta activación interna del cigoto es dependiente de la concentración de Ca 2+ dentro del cigoto; esta liberación que es causante de la liberación de los gránulos corticales es también responsable del reingreso del cigoto al ciclo celular y de la reactivación de la síntesis de proteínas en el cigoto. Los niveles de Ca 2+ en el cigoto se incrementan desde 0.1 a 1 μM, en la mayoría de las especies se produce como una onda o
sucesiones de ondas que se mueven a través del cigoto comenzando en el sitio de fusión del espermatozoide con el gameto femenino.
3. Si desearíamos estudiar la acción de una sustancia animalizante. ¿Qué sustancia propondría? ¿Cómo realizaría el experimento? Se podría utilizar sulfocianuro de sodio tiene efecto animalizante, es decir, cuando un huevo de erizo de mar se pone en presencia de esta sustancia, se obtendrá un sistema que estará “muy animalizado”; esto se verificara por al presencia de una blástula hiperciliada; estos e
explicaría porque esta sustancia química inhibe el gradiente vegetativo y potencia el gradiente animal, se puede decir que se potencia el metabolismo glucídico, que predominaría en el hemisferio animal, en contraste en el hemisferio vegetativo predomina el metabolismo de las proteínas. Para realizar el experimento se tomarían embriones recién fecundados, y se le cambiaría el medio a uno que contenga esta sustancia (sulfocianuro de sodio) y seguir un monitoreo en búsqueda de cambios en la formación de la blástula.
4. ¿Qué sucedería si tratamos huevos de erizo de mar con actinomicina D? ¿Esto influiría en la organización del huevo? Se conoce que las fases iniciales del desarrollo embrionario de organismos como el erizo de mar está regido casi por completo por información presente en el óvulo antes de ser fecundado. Es por ello que si embriones de erizo de mar expuestos durante tiempo suficiente a actinomicina D, para inhibir la síntesis de RNA sin bloquear la de la DNA, se desarrollan normalmente durante las fases iniciales , sin cambiar su programa de síntesis proteica. Esto se debe a que un ovulo no fecundado contiene una gran cantidad de mRNAs “enmascarados” por proteínas, de forma que se impide su asociación con los ribosomas que también están presentes. Tras la fecundación, de alguna manera este mRNA es “desenmascarado” de forma
controlada, y comienza a dirigir la síntesis proteica. El desarrollo del embrión puede, por tanto, comenzar inmediatamente después de la fecundación, sin tener que esperar a la producción de mRNAs de origen paterno (9).
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
(1) Ivan Fuentes y Claudio Barros, Larval development and metamorphosis of cultured Tetrapygus niger (Echinodermata Echinoidea): an uncommon form of echinoplutei (2) http://valoraciencia.ucn.cl/guia/10-profe-erizo.pdf (3) Scott F. Gilbert, Biología del desarrollo (4) Frank J. Dye, Dictionary of Developmental Biology and Embryology (5) http://cursosvirtuales.cfe.edu.uy/semipresencial/file.php/1/01/Primero/8113Organiza cion%20celular%20y%20tisular/paginas/unidades/unidad_3/temas/Unidad35/anexos/ anexo2.pdf (6) M. F. Barker, Echinoderms 2000: Proceedings of the 10th International Conference, Dunedin (7) T. Yanagisawa, Biology of Echinodermata (8) http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1440-169X.1956.tb00058.x/pdf (9) http://www.itescam.edu.mx/principal/sylabus/fpdb/recursos/r60761.PDF
