MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y AMBIENTAL
2014
Facultad de Agronomía Universidad de Buenos Aires
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CRONOGRAMA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y AMBIENTAL 2014 Turnos Miércoles 9-12h y 14 -17h Fecha Tema / Actividad 12/3 Temas teóricos: Los microorganismos y el ambiente. Características anatómicas de la célula (procariota y eucariota). Nutrición microbiana. 19/3
26/3
Temas teóricos: Efectos de las condiciones ambientales sobre el desarrollo de los microorganismos. Control del crecimiento. Resolución de Problemas de nutrición y control del crecimiento.
Comienzo del trabajo práctico (T.P.) microorganismos en el ambiente (LABORATORIO) Temas teóricos: Características de la multiplicación celular. Concepto de colonia. Cultivo puro y aislamiento. Resolución de Problemas de crecimiento. Finaliza TP microorganismos en el ambiente: Observación placas. (LABORATORIO).
9/4
Temas teóricos: Clasificación taxonómica y filogenia microbiana. El suelo como ambiente para los microorganismos. El agua como ambiente para los microorganismos. Resolución de problemas.
16/4
Comienza TP de aislamiento: Siembra en medios de cultivo y aislamiento a partir de una muestra de suelo. (LABORATORIO). Resolución de Problemas. Parcialito 1.
23/4
Temas teóricos: Ciclo del carbono. Continúa TP de aislamiento: siembra de la segunda placa de aislamiento (LABORATORIO)
30/4
Temas teóricos: Ciclo del nitrógeno. Mineralización. Nitrificación. Desnitrificación. Continúa TP de aislamiento: siembra de tubos pico de flauta. (LABORATORIO).
7/5
Temas teóricos: Continuación de ciclo del nitrógeno. Fijación biológica de nitrógeno. Finaliza TP de aislamiento: Coloración de Gram. (LABORATORIO).
14/5
Temas teóricos: Ciclo del fósforo. Bacterias solubilizadoras de fósforo. Micorrizas. Observación de preparados de micorrizas. (LABORATORIO) Parcialito 2.
21/5
Temas teóricos: Transformaciones microbianas del azufre y del hierro. Comienzo del T.P. de aislamiento de rizobios a partir de nódulos y observación de bacteroides. (LABORATORIO)
28/5
Temas teóricos: Otros nichos microbianos de importancia económica: ensilado de forrajes, compost, rumen y biogás. Continúa T.P. aislamiento de rizobios: observación de placa de aislamiento y siembra de una segunda placa. (LABORATORIO)
4/6
Temas teóricos: Biorremediación. Resolución de problemas. Continúa T.P. aislamiento de rizobios: siembra de tubos pico de flauta. (LABORATORIO)
11/6
Finaliza T.P. aislamiento de rizobios: coloración de Gram. Parcialito 3.
18/6
Elaboración de informes de los trabajos prácticos (duración 2 h). Repaso y consultas.
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PARCIAL INTEGRADOR
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RECUPERATORIOS
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CRONOGRAMA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y AMBIENTAL 2014 CURSADA Turnos Jueves 8:00 -11:00 h, 13 - 16 h y 18 – 21h Fecha Tema / Actividad 13/3 Temas teóricos: Los microorganismos y el ambiente. Características anatómicas de la célula (procariota y eucariota). Nutrición microbiana. 20/3
3/4
Temas teóricos: Efectos de las condiciones ambientales sobre el desarrollo de los microorganismos. Control del crecimiento. Resolución de Problemas de nutrición y control del crecimiento.
Comienzo del trabajo práctico (T.P.) microorganismos en el ambiente (LABORATORIO) Temas teóricos: Características de la multiplicación celular. Concepto de colonia. Cultivo puro y aislamiento. Resolución de Problemas de crecimiento. Finaliza TP microorganismos en el ambiente: Observación placas. (LABORATORIO).
10/4
Temas teóricos: Clasificación taxonómica y filogenia microbiana. El suelo como ambiente para los microorganismos. El agua como ambiente para los microorganismos. Resolución de problemas.
17/4
Comienza TP de aislamiento: Siembra en medios de cultivo y aislamiento a partir de una muestra de suelo. (LABORATORIO). Resolución de Problemas. Parcialito 1.
24/4
Temas teóricos: Ciclo del carbono. Continúa TP de aislamiento: siembra de la segunda placa de aislamiento (LABORATORIO)
8/5
Temas teóricos: Ciclo del nitrógeno. Mineralización. Nitrificación. Desnitrificación. Continúa TP de aislamiento: siembra de tubos pico de flauta. (LABORATORIO).
15/5
Temas teóricos: Continuación de ciclo del nitrógeno. Fijación biológica de nitrógeno. Finaliza TP de aislamiento: Coloración de Gram. (LABORATORIO).
22/5
Temas teóricos: Ciclo del fósforo. Bacterias solubilizadoras de fósforo. Micorrizas. Observación de preparados de micorrizas. (LABORATORIO) Parcialito 2.
29/5
Temas teóricos: Transformaciones microbianas del azufre y del hierro. Comienzo del T.P. de aislamiento de rizobios a partir de nódulos y observación de bacteroides. (LABORATORIO)
5/6
Temas teóricos: Otros nichos microbianos de importancia económica: ensilado de forrajes, compost, rumen y biogás. Finaliza T.P. aislamiento de rizobios: coloración de Gram. (LABORATORIO
12/6
Temas teóricos: Biorremediación. Resolución de problemas.
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Elaboración de informes de los trabajos prácticos (duración 2 h). Repaso y consultas. Parcialito 3.
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PARCIAL INTEGRADOR
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RECUPERATORIOS
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ÍNDICE Identificación de la asignatura………………………………………………………
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Temas de investigación de los integrantes de la cátedra y del INBA.…………...…
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MICROBIOLOGÍA GENERAL. Capítulo 1: La célula microbiana…………………………………………………...
15
Capítulo 2: Control del crecimiento………………………………………………...
23
Capítulo 3: Nutrición microbiana y aislamiento……………………………………
23
Observación de los microorganismos
32
Tipos de tinciones
32
Coloración de Gram……………………………………...
33
Capítulo 4: Características de la multiplicación celular de los microorganismos……………
36
Capítulo 5: Clasificación taxonómica y filogenética…………………………………………
51
Capítulo 6: Ecología microbiana……………………………………………………………..
62
Capítulo 7: Descomposición de la Materia Orgánica………………………………
102
Humificación………………………………………………………………
107
Deshumificación…………………………………………………………... Producción de Biogás……………………………………………………….
109 113
Capítulo 8: Nitrógeno…………………………………………………………………
118
Capítulo 9: Micorrizas………………………………………………………………
149
El fósforo: Importancia biológica, ciclo e interacción con micorrizas
159
Capítulo 10: Transformaciones microbianas del azufre y del hierro……………….
161
Capítulo 11: Nichos ecológicos especiales…………………………………………
171
Ensilado……………………………………………………………………
171
Compost…………………………………………………………………...
176
Capítulo 12: Biorremediación………………………………………………………
187
Bibliografía ……………………………………………………………………..….
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INFORMACIÓN GENERAL DE LA MATERIA. CONTENIDOS. RÉGIMEN DE APROBACIÓN.
1. IDENTIFICACIÓN DE LA ASIGNATURA. Nombre: MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y AMBIENTAL. Cátedra: Microbiología Agrícola. Departamento: Biología Aplicada y Alimentos. Carreras: Ingeniería Agronómica y Ciencias Ambientales. 2. CARACTERÍSTICAS DE LA ASIGNATURA. Ubicación en el Plan de Estudio: en el tercer año del Ciclo General de las carreras de Ingeniería Agronómica y Licenciatura en Ciencias Ambientales (plan 2008). Duración: cuatrimestral, 3 horas semanales. Profesor responsable: Profesora Asociada Ing. Agr. MSc. Olga S. Correa Profesores Adjuntos: Dra. Viviana Chiocchio (1) Ing. Agr. Ph. D. Inés García de Salamone Dr. Marcelo Soria Jefes de Trabajos Prácticos: Dra. Victoria Criado Ayudantes Primeros: Dra. Marcela S. Montecchia Ing. Agr. Oksana Sydorenko Ing. Agr. Micaela Tosi Ing. Agr. Luciana Di Salvo Dra. Irma Roberts Dra. Ester Simonetti
Lic. Federico Spagnoletti Lic. Jimena A. Vogrig Lic. Agustina Fernández Di Pardo Lic. Jhovana Escobar Ortega Ing. Agr. Eliana Wassermann
Ayudantes Segundos: Martina González Mateu Damián Ortiz Agustín Martinez Juan Orlowski Asistentes Alumnos: Jessica Edith Tarche Fernando Javier Ureta Suelgaray Sharon Leila Fingier (1) Coordinadora de la Cursada 2014-2015. Consultas
[email protected] o en la Cátedra de Microbiología Agrícola.
al
correo
electrónico
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Sede de la Cátedra Pabellón Microbiología, situado al final del camino paralelo a las vías del ferrocarril y enfrentado al andén de la estación Arata. Edificio 19 en el plano de la FAUBA http://www.agro.uba.ar/ubicacion/plano).
3. FUNDAMENTACIÓN Esta materia pretende otorgar al estudiante los conocimientos básicos sobre la biología y ecofisiología de los microorganismos. Para la formación de los futuros egresados es de fundamental importancia conocer el rol de los microorganismos en el ambiente que nos rodea, su participación en los ciclos biogeoquímicos, sus interacciones con otros microorganismos, animales o plantas, y su relación con los procesos agropecuarios y ambientales.
4. OBJETIVOS Introducir al alumno en el conocimiento del mundo microbiano y la participación de los microorganismos en ecosistemas naturales y antrópicos. Objetivos particulares: 1. Adquirir conocimientos básicos de microbiología: crecimiento, nutrición, esterilización, aislamiento, taxonomía y ecología microbiana. 2. Discutir la distribución de los microorganismos en la naturaleza, los nichos ecológicos que pueden ocupar y su diversidad metabólica. 3. Conocer la acción biotransformadora de los microorganismos sobre el ambiente y su rol en los ciclos biogeoquímicos del carbono, nitrógeno, azufre, fósforo, hierro, etc. 4. Adquirir conocimientos sobre las interacciones microorganismo-planta y su aplicación práctica en sistemas agrícolas. 5. Analizar el rol de los microorganismos en nichos ecológicos especiales con relevancia agronómica y ambiental, tales como suelos, aguas, el ensilado de forrajes, compostaje y rumen.
5. CONTENIDOS 1. Las características anatómicas de la célula procariótica (bacterias y arqueas) y sus diferencias fundamentales con las células eucarióticas (hongos y levaduras) y con los virus. Componentes de la célula procariótica: estructura y composición de la membrana, estructura de la pared en bacterias Gram positivas y Gram negativas. Estructuras de resistencia: formación de endosporas. Estructuras responsables de la movilidad: flagelos. quimiotaxis y fototaxis. Estructuras de la superficie bacteriana: fimbrias, pilis, cápsulas y capas mucosas. Componentes del citoplasma celular: nucleoide bacteriano, sustancias de reserva (poli-β-hidroxibutirato, glucógeno, polifosfatos, gránulos de azufre y magnetosomas). Transporte de sustancias a través de las membranas bacterianas y su importancia en la nutrición. Mecanismos de transporte: difusión simple y facilitada, transporte activo, traslocación de grupo. Mecanismos de recombinación genética en bacterias: conjugación, transformación y transducción. Regulación de la expresión de genes: el operón lactosa. Genes regulados por la densidad celular (“quorum sensing”). Hongos. Su biología. Metabolismo. Intervención en ciclos biogeoquímicos. Su importancia para la agricultura.
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2. Control del crecimiento microbiano: esterilización por calor, por radiación y por filtración. Diferentes métodos y su aplicación a distintos materiales. Control químico del crecimiento bacteriano: antibióticos, bactericidas, bacteriostáticos, desinfectantes y antisépticos. 3. Nutrición bacteriana. Elementos esenciales: macro y micronutrientes, y factores de crecimiento. Formas en que estos elementos se encuentran en la naturaleza y formas en que se proveen en los medios de cultivo. Medios de cultivo: clasificación en base a su composición y a la diversidad de microorganismos que pueden desarrollar en él. Categorías nutricionales de los microorganismos establecidas en base a: fuentes de energía, fuentes de carbono, y dadores de electrones. Cultivo puro de microorganismos. Técnicas de aislamiento: estría en superficie o diluciones sucesivas con o sin enriquecimiento previo. 4. Características de la multiplicación celular de los microorganismos. Métodos de determinación del crecimiento celular y parámetros que lo caracterizan. Cultivo diáuxico. Efecto de las condiciones ambientales sobre el desarrollo de los microorganismos: temperatura, concentración salina, pH, tensión de oxígeno, formas tóxicas del oxígeno y enzimas que las eliminan. 5. Clasificación taxonómica y filogenética. Dominios: Bacteria, Archaea y Eukarya, características diferenciales. Taxonomía convencional y molecular. Identificación y nomenclatura. Definición y concepto de especie. Taxonomía numérica y agrupamiento jerárquico. Taxonomía molecular: composición de bases e hibridización de ácidos nucleicos. 6. Ecología microbiana: los microorganismos y su microambiente, ecosistemas, hábitats, nichos ecológicos. Superficies y biofilms. Competencia y cooperación. El suelo como ambiente para los microorganismos. Importancia de la ocupación de diferentes nichos ecológicos naturales por parte de los microorganismos y la resultante modificación de los mismos. Nichos ecológicos de importancia agrícola. Microorganismos del suelo y factores que afectan su distribución. Rizosfera: microorganismos de la rizosfera y su interacción con la planta. Actividad microbiana y fertilidad del suelo. Microbiología de ambientes acuáticos. Ambientes de aguas dulces y saladas. Alteraciones de los ambientes acuáticos. Ejemplos. 7. Ciclo del Carbono. Importancia de la fotosíntesis en el ciclo del Carbono. Descomposición de la materia orgánica. Utilización de hexosas, pentosas y polisacáridos. Formación y degradación de la materia orgánica del suelo: humificación y deshumificación. Transformaciones de hidrocarburos. Metanogénesis y sintrofía. Hábitats metanogénicos. Metanogénesis en los océanos. El ecosistema microbiano del rumen. Las bacterias, protistas y hongos del rumen. Dinámica del ecosistema del rumen. Otros animales herbívoros. Producción de Biogás. 8. Ciclo del nitrógeno. Utilización del nitrógeno por los microorganismos: formas nitrogenadas e inorgánicas del suelo. Mineralización: aminización, amonificación.orgánicas Inmovilización. Nitrificación. Desnitrificación. Fijación biológica simbiótica de nitrógeno: métodos de medición. Biología de Rhizobium y Bradyrhizobium. Grupos de inoculación cruzada. Mecanismo de infección en la interacción rizobio-leguminosa. Regulación génica de la nodulación. Regulación de la fijación de nitrógeno. Producción de inoculantes para leguminosas. Otras asociaciones microbianas de importancia agrícola. Fijación simbiótica de nitrógeno: Frankia. Fijación no simbiótica de nitrógeno: Azospirillum, Azotobacter.
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9. Micorrizas. Clasificación de las micorrizas. Aspectos nutricionales. Efectos benéficos. Preparación de inoculantes. Ciclo del P. 10. Transformaciones microbianas del azufre. Ciclo biológico del S. Mineralización. Inmovilización. Oxidación del S mineral. Reducción del S orgánico. Transformaciones microbianas del hierro. Procesos de reducción- oxidación. Transformaciones directas del hierro de la forma orgánica a la forma inorgánica y viceversa. Procesos de reducción, solubilización y precipitación del Fe mediados por microorganismos en algunos tipos de suelo. 11. Nichos ecológicos especiales de utilidad agrícola. La fermentación láctica como método de conservación de forrajes en el ensilado. Biología y microorganismos del compost. 12. Biorremediación. Biorremediación in situ y ex situ de suelos. Biorremediación de aguas. Demanda biológica de oxígeno. Hidrocarburos. Residuos sólidos: su disposición en vertederos controlados. Pesticidas o xenobióticos.
6. METODOLOGÍA DIDÁCTICA La materia se imparte bajo la modalidad teórico-práctica, con clases de discusión de temas teóricos y de resolución de problemas que permiten aplicar los conocimientos teóricos adquiridos. Además, en el laboratorio se llevan a cabo distintos trabajos prácticos dirigidos a la observación macro- y microscópica de microorganismos y al aislamiento de los mismos a partir de fuentes naturales (suelo, aguas, vegetales, etc.) y de nódulos de leguminosas. Las clases teóricas son desarrolladas por los Profesores y Jefes de Trabajos Prácticos a cargo de los respectivos turnos, con la participación de ayudantes de primera debidamente formados. Las prácticas de laboratorio se desarrollan con la asistencia de los ayudantes de la Cátedra. Las estrategias didácticas utilizadas incluyen el uso de presentaciones en formato PowerPoint para ilustrar situaciones en las que el uso del pizarrón es insuficiente (estructuras celulares, coloraciones, etc.) y fundamentalmente para aquellos temas que por su complejidad o costo no se pueden desarrollar en los Trabajos Prácticos. Las clases de resolución de problemas se alternan con las actividades en el laboratorio y se resuelven fomentando la interacción de los alumnos en grupos reducidos con asistencia de los docentes.Se estimula la discusión entre docentes y alumnos para llegar a la resolución de los ejercicios planteados. En esta instancia son actores principales los ayudantes de primera y se prioriza el uso del pizarrón para presentar figuras, cuadros, esquemas, etc. En todas las instancias se pretende que los alumnos construyan y se apropien del conocimiento.
7. MÉTODO DE EVALUACIÓN El curso tiene 4 evaluaciones intermedias (tres parcialitos cortos más un informe de laboratorio) y un examen integrador. Es posible aprobar la materia por promoción sin examen final. • Para mantener las posibilidades de promocionar, el promedio de las cuatro evaluaciones
intermedias tiene que ser mayor o igual que 7, independientemente de las notas individuales en cada una.
Durante la cursada se realizarán trabajos prácticos de laboratorio. Una vez finalizados se deberá redactar un informe individual en clase, que a los efectos de la promoción o regularización contará como la cuarta evaluación intermedia.
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Al final del cuatrimestre se rendirá un examen integrador. Aquellos alumnos con una calificación igual o mayor que 7 en este integrador y un promedio igual o mayor que 7 en las evaluaciones intermedias, promocionan la materia.
Si la nota del integrador es igual o mayor que 4, pero menor que 7, la condición final es regular, y se pierde la posibilidad de promocionar.
Si la nota del integrador es menor que 4, se deberá rendir un examen recuperatorio para mantener la regularidad. Aun cuando la nota en este examen recuperatorio fuera mayor que 7, ya no es posible aprobar por promoción la materia. Una nota menor que 4 en el
examen recuperatorio implica perder la regularidad. Aquellos alumnos que no cumplan con una asistencia al 75% de las clases, o no alcancen un promedio 4 en las evaluaciones intermedias, quedarán en condición libre. Nota final de la materia en el caso que el alumno promocione.
Nota promoción = 0,3 x promedio de las evaluaciones intermedias + 0,7 x nota del parcial integrador Asistencia a las clases: Es obligatoria la asistencia al 75% de las clases. Alumnos con asistencia cumplida: aquellos alumnos cuya nota promedio de las 4 evaluaciones intermedias o en el examen integrador sea inferior a 4 ( cuatro) puntos pero hayan cumplido el 75% de asistencia a las clases de la materia. Alumnos libres: aquellos alumnos cuya nota promedio de las 4 evaluaciones intermedias o en el examen integrador sea inferior a 4 (cuatro) puntos y tengan menos del 75% de asistencia a las clases de la materia. Requisitos necesarios para rendir en condición de alumno Libre. El alumno deberá avisar, por nota dirigida al Profesor Responsable de la Cátedra de Microbiología Agrícola, su intención de rendir examen libre, 30 días antes de la fecha de exámen a la que aspira presentarse. En ese momento acordará con el profesor a cargo el día en que comenzará su examen, el cual constará de tres partes: a) Un cuestionario completo de los temas de trabajos prácticos, que deberá aprobar con una nota mínima de 6 (seis) puntos para poder continuar con el examen. b) Una práctica de laboratorio y respuestas a preguntas relacionadas con el tema en cuestión, que también deberá aprobar con una nota no inferior a 6 (seis) puntos. c) Un examen escrito en la fecha correspondiente, que se aprobará con 4 (cuatro) puntos. Si el alumno reprobara cualquiera de las tres partes, en el acta de examen llevará la calificación de insuficiente.
8. BIBLIOGRAFÍA Al final de la guía se encuentra el apartado de la bibliografía complete aconsejada para leer y estudiar los distintos capítulos del programa de la materia.
Aleff K, Nannipieri P. 1995. Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press Inc, NY.
Alexander M. 1980. Introducción a la Microbiología del Suelo. AGT, México.
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Haynes RJ. 1986. Mineral nitrogen in the plant soil system. Academic Press Inc, NY.
Lengerer JW, Drwes G, Schlegel H. 1999. Biology of the Prokaryotes. Thieme, NY.
Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biología de los Microorganismos, 8a edición. Prentice Hall.
Paul EA. 2007. Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press, NY. 3 rd Edition.
Singleton P, Sainsbury D. 1978. Dictionary of Microbiology. Wiley and Sons.
Tate R. 2000. Soil Microbiology, 2 nd Edition, Wiley.
Varmay A, Hock B. 1998. Mycorrhiza. Springer, NY.
CÓMO ESTÁ ORGANIZADO MATERIAL DIDÁCTICO DEESTA GUÍA Los contenidos TEÓRICOS están organizados en capítulos. Cada capítulo consta de: 1. Los títulos de los temas y la bibliografía de lectura OBLIGATORIA correspondiente. 2. Material didáctico preparado por los docentes de la cátedra para ALGUNOS de los temas. Los contenidos PRÁCTICOS: preguntas y problemas para resolver y los protocolos de trabajos prácticos, se encuentran en una entrega separada: “Guía de Actividades Prácticas de Microbiología Agrícola y Ambiental”.
La mayor parte de los temas teóricos de la materia deberán estudiarse del libro: Brock Biología de los microorganismos, mientras que algunos se complementan con material preparado por los docentes de la materia.
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TEMAS DE INVESTIGACIÓN DE LOS INTEGRANTES DE LA CÁTEDRA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y DEL INBA(1) (1)Instituto
de Investigaciones en Biociencias Agrícolas y Ambientales, CONICET/UBA.
Estudio de las comunidades microbianas y su contribución al diagnóstico de la calidad del suelo. Nuestro objetivo general es contribuir a un mayor conocimiento de la dinámica y biodiversidad microbiana de los suelos argentinos, analizando atributos microbiológicos, bioquímicos y fisicoquímicos de loslabranzas suelos en distintos agroecosistemas. Analizamos el efecto microbianas de distintos manejos (desmonte, y fertilizaciones) y cultivos sobre las comunidades del suelo en la región de las Yungas y del oeste de la Provincia de Buenos Aires. Asimismo, evaluamos la utilidad de diversas características de las comunidades microbianas como indicadores microbiológicos para el monitoreo de la calidad de los suelos en ambas regiones. Por último, seleccionamos un conjunto mínimo de variables para el desarrollo de un índice de calidad de suelos, para ambas regiones. Este estudio contribuirá a un mayor conocimiento del impacto del cambio de uso sobre la dinámica y biodiversidad microbiana de los suelos argentinos y permitirá profundizar en el conocimiento de cómo el recurso suelo se ve afectado por su uso agrícola.
Investigadores responsables:
Ing. Agr. MSc Olga S. Correa
[email protected] Dra. Marcela S. Montecchia
[email protected] Dr. Marcelo A. Soria
[email protected]
Integrantes del grupo: Dra. Viviana Chiocchio Ing. Agr. Micaela Tosi Ing. Agr. Oksana Sydorenko Lic. Jimena Vogrig Ing. Agr. Juan Orlowski
Estudiante Agustín Martinez Estudiante Damián Ortiz Lic. Martina Gonzalez Mateu Estudiante Jessica Edith Tarche Estudiante Fernando Javier Ureta Suelgaray
Control biológico de enfermedades fúngicas en plantas de interés agrícola. El control biológico de fitopatógenos permite, en esquemas de producción convencional, reducir la dosis de aplicación de productos de síntesis química y reemplazar a los mismos en sistemas de producción orgánica. El propósito general de este proyecto es el empleo de bacterias seleccionadas y sus productos para el control de enfermedades que perjudican el crecimiento y productividad de diferentes cultivos. Estudiamos los mecanismos responsables de la actividad bacteriana antifúngica, el impacto de los agentes de biocontrol sobre las comunidades microbianas del suelo y su efecto sobre el crecimiento vegetal. Asimismo, desarrollamos formulaciones y tecnologías de aplicación posibles.
Investigadores responsables:
Ing. Agr. MSc Olga S. Correa
[email protected] Dra. Marcela S. Montecchia
[email protected] Dr. Marcelo A. Soria
[email protected]
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Integrantes del grupo:
Ing. Agr. Oksana Sydorenko. Ing. Agr. Miriam Asselborn. Fitopatología. EEA Concepción del Uruguay-INTA. Dra. Virginia Pedraza. Fitopatología. EEA Concepción del Uruguay-INTA.
Bacterias promotoras del crecimiento vegetal para una agricultura sustentable. Uno de los desafíos de este milenio es la producción agrícola sustentable. Dentro de ese esquema la utilización de bacterias promotoras del crecimiento vegetal (BPCV) permite reducir o reemplazar la aplicación de fertilizantes químicos sin pérdidas en el el rendimiento. objetivo es seleccionar y evaluar bacterias que sean capaces de promover crecimientoNuestro vegetal y rendimiento de cultivos de interés agrícola. Además, estudiar los mecanismos responsables de tal actividad, determinar dosis y forma de aplicación, y evaluar el impacto sobre otros microorganismos del suelo y de la filosfera y sobre aspectos nutricionales de los cultivos tratados con dichas BPCV.
Investigadores responsables:
Ing. Agr. MSc Olga S. Correa
[email protected] Dra. Marcela S. Montecchia
[email protected]
Integrantes del grupo:
Estudiante Brenda Parolin Ing. Agr. MSc Esteban J. Rubio. EEA AMBA-INTA Ing. Agr. Alejandro Perticari. Lab. BPCV-IMYZA-INTA Castelar
Factores externos y mecanismos internos que regulan la removilización de nutrientes en cebada cervecera y su implicancia sobre la calidad de los granos. Se estudian los procesos fisiológicos, bioquímicos y moleculares que determinan las fluctuaciones en la removilización de nutrientes ante los estreses abióticos que más frecuentemente limitan el rendimiento del cultivo de cebada en la región Pampeana. Asimismo, se evalúa la capacidad de diferentes microorganismos simbióticos para mitigar dichos estreses. Se otorga especial énfasis al efecto de estos procesos sobre los parámetros que determinan la calidad de los granos.
Investigadoras responsables:
Dra. Victoria Criado Dra. Irma Roberts Dra. Carla Caputo
[email protected] [email protected]
Integrantes del grupo:
Dra. Mariela Echeverria Lic. Cintia Veliz
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Efecto de la rotación de cultivos en sistemas de siembra directa. El objetivo de este proyecto es establecer los efectos de los cultivos dentro de la rotación en sistemas de siembra sobre la actividad y diversidad biológica de la microbiota del suelo en distintas regiones de la región pampeana. Se busca establecer relaciones entre variables biológicas entre sí y con variables químicas y físicas a fin de obtener indicadores de calidad edáfica.
Biorremediación de suelos. Estudio de la dinámica de las poblaciones microbianas en suelos contaminados con petróleo y derivados.
Interacciones Bacteria-Planta: promoción del crecimiento vegetal producida por rizobacterias. Efectos sobre las comunidades microbianas rizosfericas. Aislamiento y caracterización fisiológica y genética de rizobacterias para su utilización como promotoras del crecimiento vegetal (PGPR). Estudio de mecanismos involucrados en la respuesta de plantas forrajeras y cereales tales como arroz, maíz y trigo a la inoculación con rizobacterias en condiciones de campo. Evaluación de inoculantes.
Investigadora responsable:
Ing. Agr., M.Sc., Ph.D. Inés E. García de Salamone
[email protected]
Integrantes del grupo: Ing. Agr. Luciana Di Salvo Lic. Jhovana Escobar Ortega Hongos saprobios de suelo y endófitos de raíz (micorrizas y hongos septados oscuros). Este grupo de trabajo se ocupa de investigar las relaciones que se establecen entre los hongos y los distintos grupos de plantas dentro del agroecosistema. Los estudios se encuentran focalizados en la utilización de estos microorganismos como biorremediadores, removilizadores y translocadores de nutrientes dentro de la planta (P, N) y en su rol frente a estreses abióticos.
Investigadores responsables:
Dra. Viviana M. Chiocchio
[email protected] Ing. Agr. Raúl Lavado
Integrantes del grupo:
Lic. Federico Spagnoletti Lic. Agustina Fernández di Pardo
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INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA
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CAPÍTULO 1 LA CÉLULA MICROBIANA
Características anatómicas de las células procarióticas (bacterias y arqueas) y sus diferencias fundamentales con las células eucarióticas (hongos y levaduras) y con los virus. Viroides y priones. Componentes de la célula procariótica: estructura y composición de la membrana celular. Estructura de la pared en bacterias Gram positivas y Gram negativas. Estructuras de resistencia y formación de endosporas. Estructuras responsables de la movilidad: flagelos. Quimiotaxis y fototaxis. Estructuras de la superficie bacteriana: fimbrias, pilis cápsulas y capas mucosas. Componentes del citoplasma celular: nucleoide bacteriano, sustancias de reserva poli-hidroxibutirato, glucógeno, polifosfatos, gránulos de azufre y magnetosomas. Transporte de sustancias a través de las membranas bacterianas y su importancia en la nutrición. Mecanismos de transporte: difusión simple y facilitada, transporte activo, translocación de grupo. Material de estudio: Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biología de los Microorganismos, 8a edición. Prentice Hall. Célula bacteriana: Capítulos: 1 (completo) y 3 (completo) Virus: Capítulo 8 (8.1 a 8.7 y 8.23) Hongos y levaduras: Capítulo 18 (18.2 y 18.3)
Biología de los hongos Hongos. Su biología. Metabolismo. Intervención en ciclos biogeoquímicos. Su importancia para la agricultura.
Introducción Los hongos son un grupo de microorganismos que cuenta con aproximadamente 69.000 especies descriptas, sobre aproximadamente 1.500.000 especies existentes. Se encuentran en la naturaleza cumpliendo múltiples funciones y establecen relaciones con el resto de los microorganismos. Son ubicuos, los podemos encontrar en el aire en forma de esporas, en la tierra o en ambientes acuáticos de agua dulce o salada. Los hongos tienen importancia económica para la industria debido a su utilización para la producción de enzimas. Éstas son utilizadas como bioblanqueadores, en panificación, en la extracción y purificación de jugos, en la elaboración de alimentos para animales, etc. También son productores de terpenos, ácidos grasos (ergosterol) y derivados de aminoácidos (penicilina, cefalosporina). Asimismo, las levaduras son utilizadas en procesos fermentativos involucrados en la producción de cervezas y vinos, producción comercial de ácido cítrico, de sustancias que le dan sabores a los quesos y también son utilizados en la cocina como un ingrediente selecto. Algunas especies de hongos pueden estar en la naturaleza como organismos patógenos invadiendo maderas, colonizando a otros hongos, a animales o humanos. Su principal función, junto con las bacterias, es la de descomposición. Intervienen en el ciclaje del C, N y O. Su ubicación taxonómica fue inicialmente dentro de las talófitas junto con las plantas y los animales. Actualmente se considera que pertenecen a un reino propio. ¿Por qué creemos que reúnen las características suficientes para conformar un reino propio? Son organismos
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eucariotas, inmóviles en su inmensa mayoría, tienen una pared celular formada principalmente por quitina junto con otros polisacáridos, lípidos y proteínas y carecen de clorofila. El reino de los hongos se encuentra dividido en cinco Phyla: a)
Phylum Chytridiomycota: el cual posee un micelio cenocítico y se puede reproducir sexual o asexualmente. Las esporas son flageladas (zoosporas).
b)
Phylum Zygomycota: el micelio es cenocítico y puede formar esporas sexuales (zigosporas) en el interior del zigosporangio y esporas asexuales dentro del esporangio. Phylum Glomeromycota: el micelio también es cenocítico. Establecen una simbiosis obligada con las raíces de las plantas (micorrizas arbusculares).
c) d)
Phylum Ascomycota: tienen micelio septado con formación de esporas sexuales llamadas ascosporas formadas dentro de ascos que se encuentran rodeados de una estructura derivada de hifas fúngicas llamadas ascocarpos (cleistotecio, peritecio, apotecio).
e)
Phylum Basidiomycota: tiene un micelio septado con formación de esporas sexuales llamadas basidiosporas las cuales se producen sobre basidios que se encuentran en una estructura llamada basidiocarpo.
f)
Grupo de Deuteromycota o de hongos mitospóricos también llamados hongos imperfectos por desconocerse de muchos de ellos la fase sexual. El micelio es septado y las esporas asexuales son llamadas comúnmente conidios. Estos conidios pueden formarse sobre hifas especializadas o dentro de una estructura derivada de hifas
fúngicas. ¿Cuáles son las estructuras vegetativas de los hongos? Dentro del reino de los hongos existe una diferencia cualitativa y cuantitativa en cuanto a la composición química de las células fúngicas respondiendo a las diferencias en morfología, hábitat y tamaños; llegando a observarse diferencias entre cepas de una misma especie. Para una misma cepa pueden a su vez registrarse diferencias en su composición química al comparar por ejemplo micelio vegetativo y esporas. El contenido celular tiene un 85 a 90% de agua, el carbono total es de 40 a 50% del peso seco, el contenido de nitrógeno puede variar entre 2,27 a 5,13%, siendo proteínas sólo el 60-70% del nitrógeno presente. Las otras formas de nitrógeno no-proteicas corresponden a la quitina de la pared celular, aminoácidos libres y ácidos nucleicos. De los componentes minerales, el fósforo y el potasio son los más abundantes. Los hongos de acuerdo a su morfología o estructura pueden clasificarse en dos grupos: los hongos unicelulares y los hongos filamentosos, siendo estos últimos los de mayor representatividad. hongos están formadoso por hifas siendo la hifa estructuramicelio. tubular. El El conjunto de hifas Los se encuentran fusionadas formando una red que una se denomina crecimiento de las hifas es apical, donde tiene lugar la formación de nueva pared celular junto con la membrana citoplasmática. ¿Cómo ocurre este crecimiento? Las vesículas, que se producen en el retículo endoplasmático y que derivan del aparato de Golgi, se encuentran en mayor proporción en la zona apical de la hifa y son las que llevan en su interior enzimas encargadas de romper las uniones de los monómeros de la pared celular convirtiéndola así en
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una estructura más plástica. Las vesículas se fusionan con la membrana plasmática y los precursores de la nueva pared se secretan a partir de la membrana plasmática hacia la pared. Las hifas cenocíticas son aquellas en las cuales la estructura tubular no está delimitada por septos. Sólo ocurre la aparición de septos en las zonas más viejas del micelio o cuando está formándose alguna estructura que cumple con alguna función en particular (formación de conidios, formación de esporangios). Contrariamente, las hifas septadas son aquellas en que se delimitan células por medio de un septo. Según el grupo de hongos, los septos pueden resultar de mayor o menor complejidad en su estructura, permitiendo una conexión citoplasmática entre las células y donde pueden migrar también algunas organelas y núcleos. La presencia de organelas como las mitocondrias se dan en lugares de activo crecimiento o metabolismo, ramificaciones de hifas o división nuclear. Cuenta, por ser un organismo eucariota, con núcleo y nucleolo. También podemos encontrar los peroxisomas que contienen enzimas relacionadas con la oxidación, rompiendo lípidos y produciendo acetil-CoA. Particularmente podemos mencionar los glioxisomas que no son más que los peroxisomas pero con una función adicional como es el ciclo del glioxilato. Finalmente, los cuerpos de Woronin cuya función es la de tapar el poro de los septos con el objetivo de evitar la pérdida de citoplasma en respuesta a daños en las hifas (Fig. 1C). Las vacuolas resultan conspicuas en la zona de mayor edad del micelio. Los hongos son capaces de crecer sobre sustratos con altas concentraciones de azúcares (hasta un 10%) por no ser sensibles a la presión osmótica elevada y resisten condiciones de acidez marcada (pH 2). La pared celular de los hongos, de acuerdo al grupo taxonómico involucrado, puede estar formada principalmente por quitina o por celulosa, acompañadas en todos los casos por glucanos (polisacáridos de unidades de glucosa unidas de diferentes manera, lo cual las hace resistentes a distintos pH). Este componente constituye entre el 80-90% de la pared y la glucosamina (quitina) entre el 5-10%, encontrándose en menor proporción lípidos y proteínas. (Fig.1 A y B). Recientemente, se han realizado estudios en donde se demostró que en un mismo hongo se pueden encontrar quitina y celulosa.
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Figura 1. Esquema de célula fúngica (A) de pared y membrana celular (B) y de los distintos tipos de septos (C). Fuente: http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx
Requerimientos nutricionales Los hongos son mayoritariamente aeróbicos, aunque pueden tener otro tipo de relación con respecto al oxígeno, como las levaduras que son ser aeróbicas facultativas. Crecen bien en un marco de pH entre 4 y 8. El carbono provee los requerimientos energéticos, nutricionales y estructurales para la célula fúngica. La mayoría de los hongos pueden utilizar distintas fuentes carbonadas como ácidos orgánicos, polisacáridos (como celulosa o quitina), monosacáridos, alcoholes, compuestos policíclicos, etc. Los polisacáridos son insolubles y los hongos usan como estrategia la excreción de enzimas que degradan esos polisacáridos a monosacáridos solubles que pueden ser incorporados a la célula fúngica. es tomado comopurinas amonio,y pirimidinas. ión orgánicoOtros y nitrato y es requeridos un componente esencialEl en nitrógeno la formación de proteínas, elementos en la nutrición, pero en pequeñas cantidades, son los sulfuros para la formación de ciertos aminoácidos y vitaminas como tiamina y biotina. Resulta de gran importancia la presencia de fósforo como fosfato de potasio para la formación de ATP, ácidos nucleicos y fosfolípidos de membrana. El potasio es el metal por excelencia ya que cumple la función de cofactor en algunas reacciones enzimáticas. Por su parte el magnesio activa muchas enzimas e interviene en el metabolismo del ATP. Dentro del grupo de los elementos trazas o microelementos está el hierro, constituyente de la enzima catalasa y de los citocromos; el zinc, que interviene en la actividad de muchas enzimas como alcohol dehidrogenasas; el manganeso que participa en la activación de enzimas y síntesis de ácidos nucleicos; y el cobre que es necesario para la enzima tirosinasa (polifenol oxidasa). El molibdeno resulta también necesario si se utiliza nitrato como fuente de nitrógeno, para la enzima flavoproteína nitrato reductasa que inerviene en la reacción de reducción del nitrato al ión amonio. El calcio, el cual es requerido por las plantas, no resulta indispensable para los hongos, sólamente en el caso de los ascomycetes para formar los cuerpos fructíferos (peritecios). Las vitaminas (compuestos orgánicos) no son utilizadas como fuente de energía ni en la formación de estructuras celulares, sino que cumplen funciones análogas a las coenzimas. Los hongos tienen requerimientos nutricionales que pueden hacer que necesite una o más vitaminas y este requerimiento es una medida indirecta de la incapacidad del hongo para producirla, siendo necesario incorporarla al medio de cultivo para suplementar lo que le falta para un correcto crecimiento. Las vitaminas más requeridas por los hongos son, en orden de importancia, la tiamina (para los basidiomycetes), la biotina, el ácido nicotínico, el ácido
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pantoténico y el ácido p-amino benzoico. Las dos primeras actúan como coenzimas en el metabolismo de los carbohidratos (cocarboxilasa).
Requerimientos físicos No sólo los requerimientos nutricionales son importantes a la hora de lograr un buen crecimiento fúngico, también son de igual importancia los requerimientos físicos como: luz, temperatura, humedad, aireación y gravedad. Dado que estos factores se manejan en un rango de valores, los mismos son descritos con tres parámetros cardinales: valor máximo, valor óptimo y valor mínimo. Estos valores pueden variar de acuerdo a la edad del micelio, la cepa utilizada y las condiciones de cultivo.
¿Cómo medimos el crecimiento de estos microorganismos? En el caso de hongos unicelulares se trabaja en medio líquido, con un cultivo en fase exponencial o logarítmica y podemos proceder del mismo modo que lo hacemos con un cultivo de bacterias. Los hongos filamentosos cuando crecen en cultivos líquidos sin agitación forman una película superficial, en cambio en cultivo líquido con agitación se dispersan o forma pellets de micelio agregado, según la especie, el tamaño del inóculo, la tasa de agitación o la aireación. Como resulta impracticable definir la zona apical de micelio que está creciendo y contabilizar con precisión la producción de conidios o esporas, se realizan cultivos líquidos, con agitación para permitir una correcta utilización de los nutrientes por parte del hongo y para airear correctamente el cultivo. Utilizando esta metodología el peso seco del micelio se considera un buen indicador de la biomasa producida en un período de tiempo determinado. Otra manera de medir el crecimiento de los hongos filamentosos es a partir de la colonia fúngica producida en cajas de Petri con medio agarizado, en este caso se considera una tasa de crecimiento lineal. Sin embargo, con esta metodología, no puede medirse el crecimiento en las tres dimensiones.
Curvas de crecimiento de los hongos Si colocamos un hongo filamentoso o una levadura en un medio de cultivo y se incuba en condiciones óptimas de crecimiento, en general, se obtiene una curva de crecimiento típica para un cultivo en batch, al igual que ocurre con las bacterias. Esta curva típica de crecimiento se inicia con un período lag, seguida de una fase exponencial y concluyendo con una fase estacionaria. La primera fase presenta un crecimiento nulo de la población ya que en ella ocurre la adaptación celular a las nuevas condiciones físicas y químicas de ese ambiente de crecimiento (síntesis de ribosomas y enzimas); en la fase logarítmica o exponencial hay un crecimiento neto o formación de biomasa miceliar donde las células desarrollan un metabolismo primario. Luego de este período, el cultivo ingresa en una fase de crecimiento nulo dando inicio a la fase estacionaria, la cual se debe a la producción de metabolitos tóxicos, bajo pH, alta concentración de CO 2, baja concentración de O2 y alta temperatura. Ya avanzada esta fase las células pueden producir metabolitos secundarios no esenciales para el crecimiento pero involucrados en la supervivencia del organismos, morir o sufrir autolisis.
¿Que tipo de reproducción tienen los hongos? 1.- Reproducción sexual
En la reproducción sexual se da la unión de dos núcleos de dos hifas de micelios compatibles. Se pueden resaltar tres eventos en esta unión sexual: 1) la plasmogamia que es la fusión de los protoplastos, 2) la cariogamia que consiste en la fusión de núcleos y 3) la meiosis que es la división reduccional de núcleos que dan como resultado la formación de núcleos haploides. Este tipo de reproducción permite la variación en la especie, por ejemplo, dando
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características de mayor adaptabilidad a una situación ambiental particular (Figs. 2 y 3). Esta tipo de reproducción asegura la continuación de la especie bajo condiciones cambiantes. 2.- Reproducción asexual
Los hongos pueden reproducirse asexualmente de 4 maneras diferentes: - Por fragmentación de un talo multicelular, técnica empleada frecuentemente en el laboratorio para mantener un cultivo. - Fisión de células somáticas para dar células hijas como es el caso de las levaduras. - Gemación de células somáticas o de esporas, también en las levaduras donde cada yema da lugar a un nuevo individuo. - Producción de esporas. A partir de la germinación de las mismas se genera un nuevo individuo. Las esporas asexuales pueden generarse de forma interna en la hifa, rodearse de una gruesa pared y luego desprenderse ( clamidiosporas) o pueden formarse en el interior de una estructura denominada esporangio que al madurar se rompe liberando las esporas (esporangiosporas). También pueden generarse de forma externa en una hifa diferenciada (conidióforos) en el extremo de la cual se desarrollan las esporas asexuales ( conidiosporas). Existe una gran variedad de las estructuras productoras de esporas, las cuales se utilizan como características en la clasificación del hongo. Pueden variar en color, tamaño, forma y medida. Pueden tener o no flagelos. La reproducción asexual permite una amplia distribución de las especies, tantas como condiciones adecuadas para la existencia del genotipo. Algunas esporas asexuales tienen características especiales para la supervivencia del hongo en ambientes extremos. Por ejemplo, las clamidosporas tienen paredes gruesas formadas asobrevivir partir de acélulas vegetativas quedeacumulan sustancias de reserva y porpresentarse ello son capaces de condiciones adversas desecación, temperatura, etc. Pueden solitarias o en cadena y su ubicación en la hifa puede ser intercalar o terminal. Existen hongos que producen esclerocios (no son esporas) que son estructuras muy duras formadas por “tejido” fúngico capaces de sobrevivir a condiciones de estrés y germinar bajo condiciones favorables. Muchas de las unidades reproductivas formadas son fácilmente diseminadas y germinan rápidamente dando así la posibilidad de ocupar una amplia área en un corto tiempo. Las condiciones ambientales pueden jugar un rol negativo en la germinación y diseminación de estas unidades. Con respecto a los ciclos de vida de los hongos, éstos pueden ser distinguidos en dos grupos (Fig. 3). • Las especies homotálicas, las cuales poseen en un mismo micelio núcleos complementarios
que pueden conjugarse, formándose un único tipo de esporas. • Las especies heterotálicas, las cuales requieren núcleos provenientes de micelios diferentes para completar el ciclo sexual, formándose diferente tipo de esporas.
El fenómeno de la parasexualidad comprende la fusión de las hifas y la formación de un heterocarion que contienen núcleos haploides provenientes de ambas hifas. A veces estos núcleos se funden y srcinan núcleos diploides heterocigóticos, cuyos cromosomas homólogos sufren recombinación durante la mitosis.
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Plasmogamia (fusión de citoplasma) Estado heterocariótico
Espora de reproducción asexuada
Micelio o levadura
Reproducción asexual
Germinación Haploide (n)
Germinación
Diploide (2n) Heterocariótico(n+n)
Reproducción sexual
Cariogamia
Fusión de núcleos Estado diploide
Espora de reproducción sexuada Meiosis (recombinación Genética) Mitosis •
•
Figura 2. Esquema de los ciclos de vida sexual y asexual de los hongos. Fuente: http://www.fq.edu.uy
Figura 3. Ciclos de vida de los hongos filamentosos. Fuente: http://agricolasonline.es
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Control hormonal El término hormona o feromona es usado en los hongos en su sentido clásico como un componente que se produce en un lugar del organismo para ser transferido a otra parte del mismo donde actúa. La actividad hormonal ha sido documentada en la formación de oogonios y anteridios en hongos acuáticos, ahora ubicados en el reino Protista (Oomycetes –Achlya), como así también en el acercamiento de los talos compatibles y la formación de los progametangios que van a dar srcen a la zigospora en los zygomycetes (Fig. 4). En el caso de los basidiomycetes no se ha demostrado el rol hormonal de algunas sustancias producidas sin embargo, han sido detectadas hormonas vegetales como auxinas, giberelinas y etileno dentro de representantes de este grupo.
Figura 4. Ciclo de vida de Rhi zopus stolon ifer (Zygomycetes). Fuente: http://www.aloj.us.es
Figura 5. Estructura de conidióforos y condios de algunos hongos imperfectos.
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Relaciones que establecen los hongos con otros organismos Tanto en el agua, suelo u otros hábitats terrestres, los hongos llevan adelante su existencia en presencia de otros organismos vivientes. El crecimiento microbiano en el suelo es transitorio y depende de la disponibilidad de nutrientes y condiciones físico-químicas adecuadas. Las relaciones que pueden establecer con otros organismos son: a.- Parasitismo. Los hongos obtienen sus nutrientes a partir de un hospedante vivo sobre el cual crecen. Algunas veces son parásitos obligados y no pueden vivir sin su hospedante y en otros casos el parasitismo es facultativo, obteniendo los nutrientes de hospedantes vivos o saprofíticamente. b.- Mutualismo. Ambos participantes de la relación se benefician. En los casos donde uno solo de los participantes se beneficia, mientras que para el otro la relación es indiferente, se denomina Comensalismo. Tanto los líquenes como las micorrizas son relaciones en las que ambos componentes de dicha relación se benefician. Los líquenes están compuestos por: un alga (ficobionte-cianobacteria) y un hongo (micobionte - asco o basidiomycete). En este caso el hongo provee agua y fijación al sustrato y el alga le provee al hongo los compuestos carbonados para su subsistencia. Las micorrizas es una asociación que tiene lugar entre las raíces de las plantas de la mayoría de las taxas de las plantas vasculares y los hongos glomeromycota (ver Cap. 9). c.- Saprofitismo: El hongo obtiene sus requerimientos nutricionales a través de fuentes orgánicas no vivas (por ejemplo, restos vegetales).
CAPÍTULO 2 CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO Control del crecimiento bacteriano: esterilización por calor, por radiación y por filtración. Diferentes métodos y su aplicación a distintos materiales. Control químico del crecimiento bacteriano: antibióticos, bactericidas, bacteriostáticos, desinfectantes y antisépticos. Material de estudio: Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biología de los Microorganismos, 8a edición. Prentice Hall. Capítulo 11 (11.1 a 11.10)
CAPÍTULO 3 NUTRICIÓN MICROBIANA Nutrición microbiana. Elementos esenciales: macro y microelementos y factores de crecimiento. Forma en que los elementos se encuentran en la naturaleza y formas en que se proveen en los medios de cultivo. Medios de cultivo: clasificación en base a su composición y a la diversidad de microorganismos que pueden desarrollar en ellos. Categorías nutricionales de los microorganismos establecidas en base a: fuentes de energía, fuentes de carbono y dadores
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de electrones. Cultivo puro de microorganismos. Técnicas de aislamiento: estría en superficie o diluciones sucesivas, con o sin enriquecimiento previo. Material de estudio: Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biología de los Microorganismos, 8ª edición, Prentice Hall.
Capítulo 4 (sección 4.1 a 4.3 inclusive), sección 4.6 y 4.7; sección 4.16 y 4.18; sección 13.1, 13.2, 13.4, 13.13, 13.14 y 13.20. Introducción Para la identificación y el estudio de cualquier especie bacteriana es necesario observar características a partir de poblaciones de microorganismos. Un requisito importante es que la población sea pura, es decir, que esté formada por solo un tipo de microorganismos. Esto es lo que se conoce como cultivo puro. Para obtener cultivos puros, independientemente de la clase de microorganismo que se desee cultivar, es necesario realizar dos clases de operaciones: el aislamiento, que consiste en la separación de un microorganismo particular a partir de las poblaciones mixtas que existen en la naturaleza, y el cultivo, es decir el crecimiento de poblaciones de microorganismos en ambientes artificiales (medios de cultivo), bajo condiciones de laboratorio. Las pequeñas dimensiones de los microorganismos obligan a estudiar poblaciones de 109 hasta 1010 células en un tubo de ensayo, un frasco o en una caja de Petri. Estos son los envases más comúnmente empleados para cultivar microorganismos y es fundamental que se encuentren estériles (libres de microorganismos). Para obtener una población abundante de microorganismos es necesario favorecer su desarrollo enlas un condiciones medio nutritivo . Comoadecuado hay microorganismos en medio puro de cultivo todas partes, paraadecuado, obtener unelcultivo en el medio son: a) Esterilizar el medio de cultivo, o sea, destruir o eliminar los microorganismos presentes en el medio, antes de sembrar en él las células de la especie que se quiere cultivar. b) Prevenir la entrada de microorganismos extraños en todas las operaciones posteriores.
1. Fundamentos de la nutrición microbiana Las células están constituidas por moléculas pequeñas y macromoléculas. Las macromoléculas son sintetizadas a partir de las moléculas pequeñas y éstas pueden ser obtenidas directamente del ambiente o bien ser sintetizadas a partir de moléculas más simples. Los medios de cultivo son soluciones acuosas que contienen los elementos químicos que componen la célula en forma de compuestos que puedan ser asimilados por las células que se desean cultivar.
1.1. Elementos esenciales El desarrollan crecimientoa partir de losdemicroorganismos depende la disponibilidad de agua. sólo Los hongos se un contenido de agua en el de sustrato del 12%, las bacterias cuando el contenido es superior al 20%. Deben estar en el medio todos los elementos que se requieren para la formación de sustancia celular. La materia sólida de las células contiene además de hidrógeno y oxígeno (obtenibles metabólicamente del agua), carbono, nitrógeno, fósforo y azufre en orden decreciente de abundancia. Estos elementos representan aproximadamente el 95% del peso celular.
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Los estudios nutricionales muestran que casi todos los microorganismos requieren magnesio, calcio, hierro, manganeso, cobalto, cobre, molibdeno y zinc. Potasio, magnesio, calcio y hierro se requieren en grandes cantidades, por eso se los llama macronutrientes, y son agregados en forma de sales en los medios de cultivo. Los demás, se necesitan en cantidades tan pequeñas que a menudo resulta difícil demostrar su esencialidad, porque podrían encontrarse presentes como contaminantes de los constituyentes del medio. A estos nutrientes se los llama micronutrientes o elementos traza. Algunos grupos biológicos tienen requerimientos minerales específicos. Las diatomeas y otras algas sintetizan paredes impregnadas de sílice y tienen requerimiento específico de sílice. Algunas bacterias marinas, las cianofíceas y algunas bacterias fotosintéticas requieren concentraciones relativamente altas de sodio.
1.2. Factores de crecimiento Algunas bacterias y hongos necesitan compuestos orgánicos que no son capaces de sintetizar a partir de una fuente de carbono más simple. Estos compuestos deben ser provistos al medio de cultivo además de la fuente de carbono correspondiente y reciben el nombre de factores de crecimiento. La mayoría de esos factores de crecimiento son aminoácidos, purinas o pirimidinas y vitaminas. Los microorganismos que requieren algún factor de crecimiento se denominan auxótrofos. Si la auxotrofía ha surgido por mutación, la cepa de tipo salvaje que no requiere suplementos se llama protótrofa. Al mutante auxótrofo se lo identifica con el nombre abreviado de la sustancia que es incapaz de sintetizar acompañado del signo menos, por ejemplo una bacteria trp-, es incapaz de sintetizar el aminoácido triptofano y necesita que este compuesto se encuentre presente en el medio de cultivo.
2. Forma química en que los elementos sirven como nutrientes Como se vio anteriormente los metales y también el fósforo pueden ser asimilados en forma de sales inorgánicas. Las necesidades de los organismos por C, N, S y O difieren en cuanto a la forma química en que pueden ser asimilados.
2.1. Requerimiento de carbono Los microorganismos fotosintéticos y las bacterias que obtienen su energía de la oxidación de compuestos inorgánicos usan generalmente la forma más oxidada del C (CO 2) como fuente principal o única de carbono. La conversión del CO2 para formar los constituyentes celulares involucra un proceso de reducción con gasto de energía proveniente de la luz o de la oxidación de compuestos inorgánicos reducidos. Todos los demás organismos obtienen el carbono de nutrientes orgánicos. Como la mayoría de las sustancias orgánicas tienen un nivel de oxidación igual o semejante al de la materia celular, no deben sufrir una reducción inicial. En general los sustratos orgánicos cumplen una doble función nutricional: sirven al mismo tiempo como fuente de carbono y como fuente de energía. Los organismos difieren en cuanto a la clase y al número de compuestos orgánicos que pueden usar como principal fuente de carbono y energía. Algunos de ellos están muy especializados y otros son muy versátiles, por ejemplo las bacterias metilótrofas sólo pueden usar como fuente de carbono, metano o metanol en cambio algunas especies de Pseudomonas pueden usar hasta 90 compuestos distintos como única fuente de carbono y energía. Además, dentro de una misma especie pueden existir cepas que por mutación hayan perdido la capacidad de metabolizar una determinada fuente de carbono y se identifican por el nombre del azúcar que no pueden metabolizar acompañado de un signo menos, por ejemplo una cepa lac - ha perdido la capacidad de utilizar lactosa como
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única fuente de carbono, porque no puede degradarla. En estos casos el agregado de lactosa al medio de cultivo resulta ineficaz para su crecimiento y es necesario reemplazar este azúcar por otra fuente de carbono para que la bacteria desarrolle. Sin embargo, la cepa salvaje de la cual proviene es lac+, es decir que esta cepa puede utilizar la lactosa como única fuente de carbono y energía. Probablemente, todos los organismos que utilizan fuentes de carbono orgánicas también requieren CO2 como nutriente en pequeñas cantidades. La remoción total de CO 2 a menudo demora o impide el crecimiento de los microorganismos en medios orgánicos.
2.2. Requerimiento de nitrógeno y azufre El nitrógeno y el azufre existen en los compuestos orgánicos de las células en forma reducida como grupos amino (-NH2) o sulfhidrilo (-SH2). La mayoría de los organismos fotosintéticos y muchas bacterias y hongos asimilan estos dos elementos como sales inorgánicas oxidadas, nitratos (NO 3-) y sulfatos (SO42-) y luego son reducidos por la célula. Los organismos que no pueden reducir estos compuestos, requieren estos elementos en su forma reducida. El nitrógeno debe ser provisto como sales de amonio (NH4+) y el azufre como sulfuro (S -) o cualquier compuesto orgánico que lleve un grupo sulfhidrilo (por ejemplo, cisteína). Este requerimiento es bastante frecuente para la fuente de N y mucho más raro para el S. Algunas bacterias son capaces de asimilar el N2 de la atmósfera, mediante el proceso denominado fijación biológica de nitrógeno.
2.3. Requerimiento de oxígeno La necesidad y la tolerancia a la concentración de oxígeno deben ser tenidas en cuenta cuando se desea cultivar una dada bacteria. A causa de su baja solubilidad en agua, la cantidad de O2 presente en una solución es usada rápidamente por las bacterias aeróbicas aún a bajas densidades de población. Para evitar esta limitación los cultivos aeróbicos se realizan en frascos erlenmeyers que para un dado volumen de solución presentan una mayor superficie de exposición al aire. En estos frascos el medio debe ocupar un volumen igual a 1/10 del volumen total y la cámara de aire los 9/10 restantes y la incubación debe, a su vez, ser realizada con agitación constante para favorecer el intercambio. Alternativamente, puede airearse otro tipo de recipientes, burbujeando oxígeno a través de un filtro de aire estéril, para ello generalmente se utiliza un dispositivo poroso. Si se desea cultivar bacterias aerobias en un medio sólido la muestra debe sembrarse sobre la superficie del medio en un recipiente con una alta relación superficie/volumen como las cajas de Petri. La exclusión del oxígeno atmosférico constituye una condición necesaria para el crecimiento de las bacterias anaerobias estrictas. Las técnicas anaeróbicas de cultivo presuponen el uso de soluciones nutritivas a las que se les ha hecho vacío en frascos cerrados sin burbujas de aire o la utilización de compuestos químicos que absorban el oxígeno (pirogalol alcalino, ditionito o cloruro cuproso). Se pueden adicionar medios reductores (ácido ascórbico, tioglicolato de sodio, cisteína) a las soluciones nutritivas. Alternativamente, puede reemplazarse la atmósfera del medio burbujeando algún gas inerte como nitrógeno, heliodel o argón. caso queo el cultivo seasolidifique en un medio sólido,Alaveces muestra se siembra en el interior medio En (porelpunción antes de que el agar). resulta útil, agregar una capa de aceite o parafina más agar semisólido sobre la superficie expuesta.
3. Categorías nutricionales La clasificación nutricional de los microorganismos se basa fundamentalmente en dos aspectos: la naturaleza de la fuente de energía y la naturaleza de la fuente principal de carbono.
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Teniendo en cuenta la naturaleza de la fuente de energía se distinguen dos tipos de organismos: los fotótrofos que obtienen energía de la luz y los quimiótrofos‚ que la obtienen de la oxidación de compuestos químicos. A su vez, entre los quimiótrofos pueden distinguirse los quimiolitótrofos‚ que obtienen la energía de compuestos inorgánicos y los quimiorganótrofos‚ que la obtienen de compuestos orgánicos. De acuerdo a la naturaleza de la sustancia que sirve como fuente principal del carbono, se distinguen dos tipos de organismos: aquellos que son capaces de usar CO 2 o carbonatos (es decir una fuente inorgánica de carbono) como fuente principal se llaman autótrofos y los que usan compuestos orgánicos para proveer carbono a sus células se llaman heterótrofos. De acuerdo a estos criterios, los organismos se pueden agrupar en cuatro categorías nutricionales principales: 1. Fotoautótrofos: usan luz como fuente de energía y CO 2 como fuente de carbono. Incluye a las plantas superiores, las algas y muchas bacterias fotosintéticas. 2. Fotoheterótrofos: usan luz como fuente de energía y un compuesto orgánico como fuente de carbono. Incluye a ciertas bacterias fotosintéticas. 3. Quimioautótrofos: usan un compuesto químico como fuente de energía y CO 2 o carbonato como fuente de carbono. La energía la obtienen de la oxidación de un compuesto inorgánico reducido como NH4+, NO2-, H2, H2S, S2O3- o Fe2+. Entre ellos se encuentran algunas de las bacterias (bacterias nitrificantes, bacterias del Fe, etc.). 4. Quimioheterótrofos: utilizan un compuesto químico como fuente de energía y un compuesto orgánico como fuente de carbono. Generalmente tanto la energía como el carbono provienen de un único compuesto orgánico. Entre ellos se encuentran los Metazoos, Protozoos, hongos y la mayor parte de las bacterias. Para la preparación de un medio de cultivo adecuado, es importante tener en cuenta la provisión de aquellas sustancias que funcionan como dadores y aceptores últimos de electrones durante los procesos de oxidorreducción que forman parte del metabolismo bacteriano. En los procesos de obtención de energía por las bacterias quimiótrofas, se produce una transferencia de electrones desde el compuesto reducido, que funciona como proveedor de energía y electrones, hasta un compuesto que funciona como aceptor de electrones. De acuerdo a la naturaleza del compuesto aceptor de electrones, el metabolismo oxidativo por el cual se obtiene la energía se denomina: fermentación, cuando el aceptor es un compuesto orgánico o respiración, cuando el aceptor es un compuesto inorgánico. A su vez, la respiración puede ser aerobia‚ cuando el aceptor es el O 2 o anaerobia‚ cuando el aceptor es un compuesto inorgánico distinto del O2. En este último caso, los aceptores pueden ser NO3- (bacterias desnitrificantes), SO42- (bacterias reductoras del sulfato) o CO2 (bacterias metanogénicas). En el caso de los organismos fotótrofos, la energía proviene de la luz, pero los electrones necesarios para obtener los componentes celulares a partir de la fuente de carbono; se obtienen de compuestos que funcionan como dadores de electrones. El dador de electrones puede ser un compuesto orgánico (bacterias verdes y púrpuras no sulfurosas), H2S (bacterias verdes y púrpuras sulfurosas) o H2O (algas y cianobacterias).
4. Clasificación de los medios de cultivo De acuerdo a su composición, los medios de cultivo pueden clasificarse en dos tipos: a) Sintéticos o definidos: la solución nutritiva se prepara a partir de compuestos químicos conocidos con concentración definida.
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b) Complejos: contienen productos naturales de composición no definida. Estos comprenden los medios que contienen extractos de levadura, de carne o de malta y/o peptonas o triptonas de levadura o de carne. Los extractos contienen componentes celulares solubles y son fuente de vitaminas y coenzimas. Las peptonas y triptonas contienen los productos solubles de la digestión proteolítica por pepsina o tripsina, respectivamente, de carne, pescado o levadura.
De acuerdo a la diversidad de los microorganismos que son capaces de desarrollar en ellos, los medios se pueden clasificar en: 1. Generales: permiten el desarrollo de la mayor parte de los microorganismos presentes en una muestra. Son medios ricos y en ellos, los organismos crecen de acuerdo a su abundancia en la muestra y a su velocidad de crecimiento y no por la exigencia de sus requirimientos nutricionales. 2. De enriquecimiento: la composición del medio favorece el crecimiento de determinados microorganismos. Se preparan teniendo en cuenta las características nutricionales y metabólicas del organismo que se quiere enriquecer. Son siempre líquidos. 3. Selectivos: la composición del medio es suficiente para el desarrollo de determinado microorganismo y se añaden sustancias que inhiban el crecimiento de otros, por ejemplo antibióticos, colorantes, sales, etc. Variando las sustancias añadidas, se varía el tipo y grado de selectividad. 4. Diferenciales: se usan para revelar características especiales de las bacterias que permitan su identificación. Estos medios de cultivo son siempre sólidos. Por ejemplo, el agar sangre que contiene 5% de sangre de caballo u oveja, se usa para evidenciar la producción de hemolisinas. Para evidenciar la capacidad de fermentar un azúcar determinado se emplean medios sólidos con colorantes indicadores, tales como la mezcla de eosina y azul de metileno (Medio EMB), el cual en presencia del ácido resultante de la fermentación, el colorante cambia de color y precipita de manera que sólo la colonia que fermenta queda teñida. Estas placas deben contener otros nutrientes además del azúcar fermentable para permitir el crecimiento de los organismos no fermentadores. El medio YMA para el crecimiento de rizobios contiene un colorante, el rojo Congo, el cual permite discriminar entre las colonias de los rizobios (rosadas y mucosas) y las de los contaminantes que se tiñen de color rojo. Cualquier medio de cultivo puede prepararse como medio líquido o sólido. Un medio sólido se obtiene agregando a la solución nutritiva un agente solidificante. Un solidificante ideal es el agar, un polisacárido reticular de composición compleja que comienza a fundir a 100°C pero al enfriarse se mantiene líquido hasta 42°C y solidifica a temperatura ambiente. Se le añade a las soluciones acuosas a una concentración de 1,5 a 2% y sólo es atacado por muy pocas bacterias. La mayoría de los microorganismos no atacan el agar. Cuando se requieren medios de cultivo sólidos sin componentes orgánicos, se usa gel de sílice como solidificante. Los medios sólidos se utilizan cuando es importante aislar colonias u observar la forma de las colonias. También son indispensables cuando es necesario hacer recuento de células viables. 5. Cultivo puro de microorganismos En general, el aspecto más difícil en la obtención de un cultivo puro es separar el microorganismo que nos interesa de otros con los cuales aparece mezclado en la naturaleza. El procedimiento por el que se logra esta separación se denomina aislamiento. No existe ningún medio de cultivo ni conjunto de condiciones que permita el crecimiento de todos los microorganismos que se encuentran en la naturaleza. Por este motivo
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cuando se inocula un cultivo mixto (cultivo en donde se encuentran representados más de un tipo de microorganismo) en un dado medio de cultivo sólo se reproducirán aquellos que sean capaces de crecer en ese medio mientras que los demás serán eliminados. Este principio permite utilizar ciertos medios y/o condiciones para obtener un determinado microorganismo en cultivo puro. Existen diversos métodos para el aislamiento microbiano. La elección del método adecuado depende del tipo de microorganismo que se desea obtener en cultivo puro y de su abundancia en la mezcla de la cual se parte. Algunos de los métodos más utilizados para la separación de un microorganismo determinado a partir de una población mixta son: - Aislamiento por diluciones sucesivas - Aislamiento por estría en superficie Dependiendo de la concentración del microorganismo que se desea aislar en la mezcla inicial, cualquiera de estos dos métodos de aislamiento se pueden utilizar con o sin un enriquecimiento previo. Si el microorganismo que se desea aislar se encuentra en muy pequeña proporción en la mezcla, debe hacerse un enriquecimiento previo para poder aislarlo. Cualquiera de los dos métodos de aislamiento se aplica cuando el organismo que se trata de aislar se encuentra representado en mayor número que los otros organismos presentes en la mezcla. Ambos métodos implican una dilución de la mezcla srcinal, donde las diluciones más altas, sólo contendrán la especie más abundante.
6. Técnicas de aislamiento 6.1 Aislamiento por diluciones sucesivas Para este procedimiento se toman varios tubos con un medio agarizado apropiado para el desarrollo del organismo que se pretende aislar. Se funde el medio contenido en los tubos, se deja enfriar hasta 42°C y se mantienen a esa temperatura en un baño termostático. Este procedimiento aprovecha la propiedad del agar de fundir a altas temperaturas y permanecer en estado líquido hasta los 42°C. Se toma con el ansa material de la muestra de partida, se siembra en el primer tubo y se mezcla. Se carga el ansa en el primer tubo y se siembra en el segundo tubo y se mezcla. Este procedimiento se repite un número de veces suficiente como para obtener en algunos de los últimos tubos un número de bacterias tan bajo que permita obtener colonias aisladas luego del crecimiento en placa. El contenido de cada tubo se vuelca en una placa de petri, luego de homogeneizar la mezcla. En las placas con las diluciones más altas las colonias estarán suficientemente separadas entre sí y alguna/s de ellas contendrán colonias provenientes sólo de la especie más abundante (Fig. 1). Una variación de este método consiste en realizar las diluciones en solución fisiológica o medio de cultivo líquido estéril y luego dispersar un volumen determinado de las últimas diluciones sobre una placa de Petri.
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Figura 1. Aislamiento por el método de las diluciones sucesivas.
6.2 Aislamiento por estría en superficie En este procedimiento el medio de cultivo agarizado fundido se vuelca asépticamente en una placa de Petri y, una vez solidificado, se inocula introduciendo el ansa en la suspensión microbiana de la cual se parte, distribuyendo este material sobre la superficie del medio sólido. Las células quedarán fijas en distintos puntos del medio sólido y luego de la incubación de la caja sembrada, se observarán las colonias. Si se parte de un cultivo mixto muy concentrado conviene descargar el inóculo realizando varias pasadas sucesivas ( estrías) sobre uno de los bordes de la placa, luego quemar el ansa, tomar material de una de las últimas estrías realizadas y continuar la siembra sobre el resto de la superficie del medio teniendo cuidado de no pasar dos veces el ansa por el mismo lugar (Fig. 2). Luego se procede a la incubación a una temperatura adecuada para la especie que se quiere aislar. Con esta metodología se obtendrán zonas en la placa donde las colonias estén bien separadas. Se toma material de una de estas colonias y se repite todo el procedimiento hasta obtener una placa que contenga sólo colonias de igual aspecto. Muchas de las colonias que aparecen en la primera placa son colonias mixtas formadas por dos o más tipos de bacterias que crecen juntas. Por este motivo resulta fundamental repetir el proceso de aislamiento.
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Figura 2. Aislamiento por el método de estriado en superficie. A. Se flamea el ansa. B. Se obtiene el inóculo. C. Se siembra el inóculo. D. Se incuba y se observan las colonias aisladas.
Aislamiento con enriquecimiento previo Cuando el organismo que se quiere obtener en cultivo puro está presente en el cultivo mixto del cual se parte en muy baja proporción, la probabilidad de obtener colonias que provengan de estas células por los métodos anteriores es muy baja. Por este motivo es imprescindible enriquecer la muestra en el organismo de interés antes de proseguir con el aislamiento. Esta operación se denomina enriquecimiento. Consiste en cultivar la muestra en condiciones que favorezcan el crecimiento del organismo deseado. Estas condiciones pueden quedar establecidas por la composición del medio (en cuanto a fuente de carbono, nitrógeno, etc.) u otras condiciones del medio o la incubación (pH, contenido de oxígeno, luz, temperatura, etc.). Se eligen condiciones adecuadas para el crecimiento del organismo de interés y/o aquellas que desfavorezcan el crecimiento de otros organismos acompañantes. De esta forma, en ese cultivo, el organismo tiene menos o ningún competidor y aumenta su abundancia relativa de manera que es posible proseguir con el procedimiento de aislamiento siguiendo alguno de los métodos descriptos.
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7. Observación de los microorganismos Introducción Los microorganismos poseen un índice de refracción muy cercano al del agua y en su mayoría no poseen color. Por lo tanto, la principal dificultad para observarlos con un microscopio óptico es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea. El método más sencillo para aumentar el contraste es teñirlos utilizando colorantes. Los colorantes son compuestos orgánicos que tienen una afinidad particular por componentes celulares específicos. Los colorantes pueden clasificarse en:
Básicos. Muchos de los colorantes utilizados comúnmente están cargados positivamente (son catiónicos) y se combinan fuertemente con los componentes celulares cargados negativamente como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. El azul de metileno, el cristal violeta y la safranina son ejemplo de colorantes catiónicos. Ácidos. Están cargados negativamente y se combinan con constituyentes celulares cargados positivamente como las proteínas básicas. Ejemplos: rojo Congo, eosina, fucsina ácida. Liposoluble. Se combinan con las sustancias de carácter lipídico mostrando así su presencia y localización. Ejemplo: Negro Sudán. Mordientes. Algunos colorantes son más efectivos cuando las células han sido tratadas con otro compuesto químico que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se llama mordiente. Los mordientes forman un complejo insoluble con el colorante llamado laca, que fija el colorante a la estructura celular. Ejemplos: ácido tánico, fenol, lugol, sulfato de amonio. 7.1 Tipos de tinciones. Se las puede clasificar en dos grupos: 1. Por el número de colorantes utilizados
Simple. Consiste en la utilización de un solo colorante. Ejemplos: azul de metileno y fucsina fenicada. Se utiliza para aumentar el contraste y detectar la presencia bacteriana, la morfología, etc. Las células se tiñen uniformemente. Si los microorganismos se tiñen, por ejemplo, con azul de metileno, muestran en el interior de las células algunos gránulos metacromáticos, más intensamente teñidos que el resto de la célula, lo que indica la presencia de entidades químicas activas que tienen mayor afinidad por el colorante que el resto de la célula en conjunto. Ejemplos: tinción de la flora del yoghurt con azul de metileno y tinción de bacteroides con fucsina fenicada. Compuesta. Consiste en la utilización de más de un colorante. Ejemplo: tinción de Gram, tinción de esporas. 2. Por alguna particularidad determinada, independientemente del número de colorantes utilizados.
Tinción diferencial. Son los procedimientos que utilizan más de un colorante y que ponen de manifiesto diferencias entre las células bacterianas. Ejemplo: tinción de Gram. Tinción especial. Pueden ser simples o compuestas. Se caracterizan por ser coloraciones que manifiestan estructuras celulares determinadas y específicas. Ejemplos: tinción de pared celular, de polisacáridos bacterianos, de flagelos y cilias, de esporas, de núcleo, etc. Tinción negativa. Este procedimiento es la inversa de la tinción usual. Las células quedan sin teñir pero se colorea el medio que las rodea. Se ve por lo tanto el perfil de las células.
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Los microorganismos quedan transparentes delimitados por un fondo oscuro. Los materiales que se utilizan en este tipo de tinción suelen ser materiales opacos que no tienen afinidad por los componentes celulares. Ejemplo: tinta china para teñir cápsulas.
7.2 Pasos esenciales en una coloración. 1. Preparación del extendido Colocar con ayuda de un ansa, una gota de agua, preferentemente estéril sobre un portaobjetos limpio. Transferir unaobtener pequeña deldébilmente cultivo a opalescente. analizar proveniente de una colonia y mezclar hasta unacantidad suspensión Dejar secar al aire. 2. Fijación de un extendido Pasar dos o tres veces el portaobjetos con el extendido hacia arriba por la llama del mechero. Dejar enfriar. La fijación por calor que se acaba de describir, es la más comúnmente utilizada aunque también puede llevarse a cabo con sustancias químicas como formaldehído, alcohol metílico o etílico, etc. La fijación provoca habitualmente un achicamiento de las células, la tinción por el contrario, hace aparecer las células de mayor tamaño que el real, de manera que la medición de las células que han sido fijadas y/o teñidas no se puede hacer con exactitud. El desarrollo de los pasos 1 y 2 da como resultado la obtención de un frotis. 3. Tinción propiamente dicha Consiste en la aplicación de uno o más colorantes sobre el frotis.
7.3. COLORACIÓN DE GRAM Además de permitir la observación de morfologías y agrupamiento, esta coloración tiene valor taxonómico ya que permite distinguir dos grandes grupos de microorganismos que difieren en la composición de su pared celular. Soluciones que se utilizan: Solución de cristal violeta Lugol Alcohol 96% Safranina Procedimiento:
1. Preparar frotis de los microorganismos. 2. Cubrir con el colorante cristal violeta. Dejar 1 min en contacto y luego lavar con agua. En este paso, tanto las células Gram+ como las Gram– se tiñen de violeta.
3. Cubrir con Lugol. Dejar en contacto 1 min.
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El Lugol es una solución acuosa de I2/IK que tiene la función de hacer de mordiente. El principio activo es el I2, que solubilizado en agua por la presencia de IK, penetra en la célula y forma una laca con el colorante. Esta laca es insoluble en agua y soluble en alcohol y acetona. Todas las células mantienen el color violeta.
4. Lavar con alcohol 96% durante 15-30 segundos. Lavar con agua. El lavado con alcohol solubiliza la laca y decolora a las células que son Gram– y no a las que son Gram+. La diferencia fundamental entonces entre estos dos tipos de células es su resistencia a la decoloración; esta resistencia radica en la naturaleza diferente de la pared celular de ambos tipos de bacterias. Las bacterias Gram+ tienen paredes celulares muy gruesas que se deshidratan con el alcohol. Esto lleva al cierre de los poros de la pared evitando que el alcohol penetre en las células y por los tanto los complejos insolubles cristal violeta/yodo no salen de las células. En las bacterias Gram – la delgada capa de peptidoglucano de la pared no evita el paso del solvente y en consecuencia la laca se lava de las células.
5. Cubrir con safranina. Esta etapa, coloración de contraste, se utiliza para poner de manifiesto las células Gram – que fueron decoloradas en el paso anterior y no serían visibles sin esta coloración. Se puede utilizar también fucsina. Las células Gram – adoptan una coloración rosada y las Gram+ permanecen violeta.
6. Lavar con agua. Secar al aire. 7. Observar en microscopio con objetivo de inmersión.
Características del cultivo bacteriano cuyas células van a ser sometidas a tinción de Gram. Se deben tener presentes las siguientes precauciones: Estado fisiológico del cultivo bacteriano. La tinción se debe realizar sobre células procedentes
de un cultivo joven, es decir de 24 h o menos de desarrollo ya que ciertas bacterias son sólo Gram+ durante el curso de su crecimiento activo y pierden la capacidad de retener el complejo cristal violeta-iodo cuando el crecimiento cesa. Desarrollo del cultivo en medio agarizado. La coloración se debe realizar sobre células
provenientes de un cultivo realizado en medio agarizado. Si los microorganismos se han desarrollado en medio líquido al tomar la muestra se arrastran componentes del mismo que pueden reaccionar con los colorantes y dificultar la observación.
COMPOSICIÓN DE LAS SOLUCIONES UTILIZADAS EN LA COLORACIÓN DE GRAM Solución de cristal violeta Cristal violeta....................................10 g Oxalato de amonio..............................4 g Etanol..............................................100 ml Agua destilada................................400 ml
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Solución de lugol Iodo......................................................1 g Ioduro de potasio................................ 2 g Etanol.................................................25 ml Agua destilada.................................300 ml Solución de safranina Safranina 2,5% en etanol....................10 ml Agua destilada................................. 100 ml
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CAPÍTULO 4 CARACTERÍSTICAS DE LA MULTIPLICACIÓN CELULAR DE LOS MICROORGANISMOS. Características de la multiplicación celular de los microorganismos. Métodos de determinación del número de células o la masa de una población bacteriana y parámetros que lo caracterizan. Velocidad específica de crecimiento. Tiempo de duplicación. Número de generaciones en un dado tiempo. Existencia o no de una fase de latencia. Número de células en fase estacionaria. Rendimiento del crecimiento. Coeficiente de rendimiento. Efecto de la concentración de nutrientes sobre la velocidad de crecimiento. Cultivo diáuxico. Efecto de las condiciones ambientales sobre el desarrollo de los microorganismos: temperatura, concentración salina, pH, tensión de oxígeno, formas tóxicas de oxígeno y enzimas que las eliminan. Regulación de la expresión de genes: el operón lactosa. Genes regulados por la densidad celular (“ quorum sensing”).
Material de estudio: Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biología de los Microorganismos, 8a edición. Prentice Hall. Capítulo 5, completo.
Definición de crecimiento bacteriano Es el aumento irreversible de materia viva que por lo general se efectúa mediante el incremento y la división de las células. En la mayoría de los microorganismos procarióticos, el aumento continúa hasta que las células se dividen en dos células hijas mediante un proceso llamado . Elhijas crecimiento comoque resultado el aumento delgeneral númerosede fisión las binaria células, donde células alcanzanbacteriano el mismo da tamaño la célula srcinal. En estudia el crecimiento de una población de células y no de una célula individual, por lo que las respuestas obtenidas reflejan una situación promedio de todas las células de la población. En un medio de cultivo adecuado al que las células de una población están completamente adaptadas (crecimiento balanceado), el aumento de la biomasa está acompañado por un incremento comparable de todas las otras propiedades medibles de la población (proteína, DNA, RNA, agua intracelular). En otras palabras, los cultivos que sufren un crecimiento balanceado, mantienen una composición química constante. El fenómeno de crecimiento balanceado simplifica la manera de medir la velocidad de crecimiento de un cultivo bacteriano, ya que la velocidad de incremento de todos los componentes de la población es la misma, la medida de cualquier componente es suficiente para determinar la velocidad de crecimiento. La cinética de crecimiento de una población bacteriana está determinada por factores genéticos y ambientales, que incluyen las condiciones y la modalidad del cultivo. Entre las condiciones se destacan: la composición del medio de cultivo, el pH, la temperatura de operación, etc. La modalidad del cultivo se refiere a la forma en la que se realiza. Así, se puede distinguir: 1. Cultivo en "batch" o cultivo por lote 2. Cultivo en "fed-batch" o cultivo por lote alimentado 3. Cultivo contínuo
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Medición del crecimiento bacteriano Existen diferentes métodos para seguir el crecimiento bacteriano.
A. Métodos de determinación del número de células o la masa de una población bacteriana 1. Determinación de peso húmedo. Se lleva a cabo separando las células del medio por centrifugación, se las lava y luego se las pesa. Tal determinación es relativamente poco sensible. 2. Determinación de peso seco. Se inicia de la misma manera que el método anterior, sólo que deben llevarse a peso seco constante. Esta determinación además de ser poco sensible, requiere mucho tiempo. En general, el peso seco es entre el 20 y el 25% del peso húmedo. 3. Determinación de la masa de un componente celular. La determinación de la cantidad de proteína bacteriana es un método de uso frecuente. Utilizando el método colorimétrico de Biuret es posible obtener buenos resultados. 4. Recuento microscópico directo. El pequeño tamaño de la mayoría de los microorganismos y su gran densidad de población hace necesario emplear cámaras especiales como la de PetroffHausser (Fig. 1) para contar el número de células de una muestra. Existen tres aspectos que son limitantes en el empleo de estas cámaras: a) Es un método que por sus características se hace poco práctico para una gran cantidad de muestras. b) Es poco sensible debido a que se requiere una concentración bacteriana de 1 millón de células bacterianas/ml para observar al menos una célula en el campo microscópico. c) Se cuentan tanto células vivas como muertas.
5. Determinación de la turbidez del cultivo. Es un método óptico y representa la técnica más rápida para medir la masa celular de los microorganismos unicelulares. Consiste en la determinación de la cantidad de luz difractada por una suspensión de células. Esta técnica se basa en el hecho de que las partículas pequeñas difractan la luz de manera proporcional a su concentración, dentro de ciertos límites. Cuando un haz luminoso pasa a través de una suspensión bacteriana, la reducción de la cantidad de luz transmitida como consecuencia de la difracción, es una medida de la densidad celular. Tales mediciones se hacen habitualmente con un espectrofotómetro. Este aparato es adecuado para estimar la densidad poblacional (número de células/unidad de volumen de la suspensión celular) y cuando se calibra con suspensiones bacterianas de densidad y peso seco conocido, resulta un método exacto y rápido para estimar el peso seco de bacterias por unidad de volumen de un cultivo (Fig. 2). B. Métodos para recuento viable de microorganismos. Método de recuento en placa. Este es el único método que permite contar sólo células viables de una puesta población. variantes, se basan en la posibilidad tiene unaDe célula viable, en unExisten medio dos agarizado, conambas nutrientes apropiados, de formar que una colonia. este modo, lo que se cuentan son colonias, cada una de ellas derivadas de una sola célula viable.
1. Por estría con espátula de Drigalski o distribución con perlas de vidrio , sobre la superficie de una placa conteniendo un medio sólido apropiado. Se coloca una muestra de volumen pequeño (0,1 ml) y se extiende lo mejor posible sobre toda la superficie de la placa, se incuba a temperatura adecuada y se cuentan las colonias. Para poder contar las colonias, éstas
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deben estar bien separadas, para ello se deben hacer diluciones apropiadas de la muestra srcinal. Se expresa como número de células viables por ml de cultivo.
Figura 1. Cámara de Petroff-Hauser
Figura 2. Curvas de absorbancia vs. peso seco/ml
2. Mezclando la suspensión bacteriana con el medio agarizado fundido. En este caso se mezcla la suspensión bacteriana (un volumen mayor que en 1.) con el medio agarizado fundido y enfriado a 42-45ºC y luego se lo vuelca en la placa. Se incuba a temperatura adecuada y se
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cuentan las colonias, que de este modo estarán distribuidas en el seno del agar y no sólo en la superficie como en 1. El primer método es mejor. En ambos casos la suposición que se hace es que cada colonia procede de una sola célula, por lo tanto es importante hacer diluciones adecuadas para contar un número de colonias también adecuado. Estos métodos son apropiados para seguir el crecimiento de un cultivo puro de un microorganismo.
CONDICIONES REQUERIDAS PARA EL CRECIMIENTO DE LA BIOMASA DE UN CULTIVO
1. 2. 3. 4. 5.
Inóculo viable Presencia de una fuente de energía Presencia de nutrientes que provean los elementos esenciales para sintetizar la biomasa Ausencia de inhibidores del crecimiento Condiciones físico-químicas adecuadas (temperatura, pH, tensión de oxígeno, etc.)
PARÁMETROS QUE CARACTERIZAN EL CRECIMIENTO DE UN CULTIVO 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Velocidad específica de crecimiento Tiempo de duplicación Número de generaciones/hora Existencia o no de una fase de latencia en el crecimiento Número de células en fase estacionaria. Biomasa máxima. Rendimiento del crecimiento
1. Velocidad específica de crecimiento Si se satisfacen todos los requerimientos mencionados arriba (1-5), entonces durante un intervalo de tiempo suficientemente pequeño (dt), se espera que el crecimiento de la biomasa (dx) sea proporcional a la masa (x) y al intervalo de tiempo (dt). (1)
dx = μ x dt
De aquí: x
dx/dt = μ
(2)
dx/dt es el aumento de masa por unidad de tiempo, expresa la velocidad de crecimiento de la población. El parámetro μ = dx/dt. 1/x representa, el cambio de masa por unidad de tiempo y por unidad de masa, o sea la velocidad específica de crecimiento y tiene unidades de tiempo -1 (hora-1). Reacomodando la ecuación (1): 1/x dx =dtμ
o
1/N dN =
μ dt
e integrando entre x y xo el primer término de la igualdad y entre t y t o el segundo término, donde xo es la masa al tiempo t o (inicio de la reacción) y x es la masa al tiempo t, resulta: ln x - ln xo = μ (t - to) = μ t Si se cuentan células: ln N - ln No = μ (t - to) = μ t Pasando ln xo o ln No a la derecha, resulta:
t0 = 0
40
ln x = ln xo + t
o
ln N = ln No + t
(3)
Si se representa ln x o ln N en función de t se obtiene una recta de pendiente μ y ordenada al srcen ln x 0 o ln N0.
Si se transforma ln en log, la ecuación (3) se convierte en:
log x = log x o + /2,303 t
(4)
ya que el logaritmo de 10 (log 10) es 1 y el logaritmo natural, en base de e, (ln 10) es 2,303. Para determinar la velocidad específica de crecimiento ( μ), cualquiera sea el parámetro que se utilice para seguir el desarrollo de la población bacteriana, siempre se debe representar el log del parámetro en función del tiempo. Si se utiliza un papel semilogarítmico, entonces se representa directamente el parámetro en la escala logarítmica, en función del tiempo en la escala lineal. La ecuación (3) puede ser escrita de la siguiente manera: ln (x/x t o) = μ
(5)
Tomando antilogaritmos resulta: x/xo = e μ t Pasando xo a la derecha queda:
x = xo e t
(6)
Si se representa x ó N (y no el log) en función de t, se obtiene una curva exponencial. Por esta razón se habla de crecimiento exponencial o logarítmico.
41
2. Tiempo de duplicación El tiempo de duplicación (tD), se define como el tiempo que tarda la masa x o o el número de células No, en duplicarse. Cuando x = 2 xo, entonces t = t D. Si en la ecuación (5) se reemplaza x por 2 x o y t por tD, resulta: ln (2 xo/xo) = μ tD ln 2 = μ tD Despejando tD:
tD = ln 2 / = 0,693 / Despejando μ:
= ln 2 / t D = 0.693 / tD
(7) (8)
Como se ve tD varía inversamente con μ y viceversa. Supongamos que la bacteria A tiene un t D = 1h, es decir que la población tarda 1 h en duplicarse, mientras que la bacteria B tiene un t D = 2h, es decir que la población de B tarda más en duplicarse (el doble del tiempo), si tratamos de deducir cómo son sus velocidades de crecimiento, fácilmente llegaremos a la conclusión que A crece más rápido que B, es decir que la velocidad de crecimiento de A es mayor que la de B.
3. Número de generaciones en un dado tiempo Se puede calcular el número de generaciones, es decir el número de veces que la población se duplica en un dado tiempo t.
Número de células
Número de células
Generación
(expresado como potencia de 2) 1
20
0
2
2
1
1
4 8
2 23
2 3
.
.
.
.
.
.
2
.
.
.
N
2n
n
42
N = No 2n
o
x=x
o
2n
Tomando logaritmos queda: log N = log N+o n log 2
o
log x = log x
o
+ n log 2
Despejando n, número de generaciones, queda:
n = (log N - log No) / log 2
n = (log x - log xo) / log 2
o
¿Cómo se calcula n en un determinado tiempo si se conoce el t D?
n = t / tD
(9)
Es decir que n es el número de veces que el t D cabe en el tiempo t. Si se despeja tD, resulta: = t t/Dn
(10)
Algunos autores expresan la velocidad de crecimiento como el número de generaciones por unidad de tiempo, por ejemplo por hora. A ese número se lo llama υ. De la ecuación (9) resulta: υ = n / t = 1 / tD
(11)
¿Qué diferencia existe entre μ y υ? 1 / υ = ln 2 / μ μ = ln 2. υ
(12)
= / ln 2
(13)
Las unidades de μ y υ son iguales (hora -1), el valor numérico es diferente. Se pueden usar las dos maneras de medir la velocidad con la que crece un cultivo, pero debe especificarse. Representación gráfica del crecimiento de un cultivo en batch log Nº células
C
D
viables/ml
A: Fase de latencia
B
B: Fase exponencial C: Fase estacionaria D: Fase de muerte
A
tiempo
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La fase exponencial o logarítmica de crecimiento se caracteriza por la constancia de la velocidad de división de las células del cultivo, que es una medida característica de cada especie y que depende del medio. Las enterobacterias se dividen cada 15-30 minutos, E. coli lo hace a 37ºC cada 20 minutos, en aerobiosis y en un medio con glucosa como fuente de carbono. En otras bacterias el tiempo de duplicación es notablemente superior, alcanzando algunas bacterias del suelo 60-150 min y 5-10 h en el caso de Nitrosomonas y Nitrobacter. El tamaño de la célula y su contenido en proteínas es constante durante la fase logarítmica de muchas bacterias. Cuando ésto sucede se dice que el cultivo está formado por células estándar. Si ésto es así y el incremento del número de células, de proteína, del peso seco, etc., presenta la misma velocidad, esy que fácilelimaginar el crecimiento puede Debido seguirseamidiendo cualquiera de estas magnitudes resultadoque obtenido será el mismo. la constancia de la velocidad de crecimiento durante la fase logarítmica, es en esta fase en la que debe determinarse la velocidad de crecimiento. Para estudiar el efecto de factores ambientales como pH, temperatura, potencial redox externo, aireación, etc., así como la utilización de diferentes sustratos, se sigue el incremento del número de células o la turbidez del cultivo durante la fase exponencial de crecimiento.
4. Existencia o no de una fase de latencia La fase de latencia comprende el intervalo entre la inoculación y el momento en que se alcanza la tasa de división máxima. La duración de la fase de latencia depende especialmente del cultivo previo y de la edad del inóculo así como de lo adecuado que sea el medio. Si el inóculo procede de un cultivo en fase estacionaria de crecimiento, antes de alcanzar las nuevas condiciones de crecimiento, la célula debe recuperarse de los daños sufridos en la fase estacionaria, seguramente deberá sintetizar RNA, ribosomas, enzimas, etc., y ésto le demanda cierto tiempo. También presentar de latencia la fuente de carbono ay energía del medio de cultivo nuevopueden es diferente defase la del cultivo siprevio, la adaptación las nuevas condiciones se halla a menudo ligada a una síntesis de novo de enzimas que no eran necesarias en el medio de cultivo anterior y que por lo tanto no habían sido sintetizadas. La síntesis de estas enzimas nuevas es inducida por la presencia del nuevo sustrato. Los cambios cuantitativos que se producen en la composición de la célula bacteriana durante la fase de latencia se reflejan sobre todo en el contenido de RNA, que se multiplica unas 10 veces. Este incremento en el contenido de RNA indica su participación así como la de los ribosomas en la síntesis de proteínas enzimáticas. Si en el inóculo hay células esporuladas, éstas deben germinar para poder dividirse. Si el inóculo posee algún inhibidor del crecimiento, las células no podrán dividirse hasta que no se inactive o metabolice de alguna manera dicha sustancia. Resumiendo, las causas de la aparición de una fase de latencia son: a) Cambio del medio de cultivo: síntesis de nuevas enzimas. b) Presencia de un inhibidor: inactivación del inhibidor. c) Presencia de esporas: germinación de las esporas. d) Estado del inóculo: edad del cultivo. Para acortar suficientemente la fase de latencia, el inóculo debe ser transferido de fase logarítmica y a un medio lo más semejante posible al del inóculo.
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5. Número de células en fase estacionaria La fase estacionaria es aquella en donde las células dejan de crecer. La velocidad de crecimiento depende de la concentración del sustrato, consecuentemente cuando disminuye la concentración del mismo, disminuye la velocidad de crecimiento. El paso de la fase exponencial a la fase estacionaria, se efectúa poco a poco. Además de la limitación que impone la concentración del sustrato, la alta densidad de la población, una presión parcial de oxígeno más baja y la concentración de productos del metabolismo de carácter tóxico pueden reducir la velocidad de crecimiento e iniciar la fase estacionaria. En la fase estacionaria aún pueden utilizarse los productos de reserva, también pueden degradarse una parte de los ribosomas y algunas enzimas. Todos estos factores dependen individualmente de la variable que esté limitando el crecimiento. Sólo las células muy sensibles mueren instantáneamente. Las células permanecerán viables en esta etapa sólo si pueden obtener la energía necesaria para su mantenimiento, que es muchísimo menor que la necesaria para dividirse. Resumiendo, las causas por las que un cultivo entra en fase estacionaria son: a) Agotamiento de algún nutriente (sólo si está en concentración limitante). b) Inhibición del crecimiento por liberación de toxinas. c) Estrés físico y/o químico: cambio de pH, temperatura, etc. En la fase estacionaria temprana el tamaño celular alcanza un mínimo; en la fase estacionaria tardía o fase de declive ocurren formas de involución (distorsionadas o hinchadas). Este hecho refleja daños de la pared o de la membrana por enzimas líticas o una regulación pobre de los componentes celulares. La pérdida de la condición de Gram positivas de las bacterias en la fase estacionaria es una prueba de ello. También la resistencia a estrés químico o físico, por ejemplo, medio hipotónico, enfriamiento, calentamiento, etc. es mayor en la fase estacionaria. Estas diferencias indican que la estructura de la célula cambia. En algunos grupos bacterianos la formación de endosporas o exosporas ocurre en esta fase. El conocimiento de la cinética de crecimiento y de la producción de metabolitos resulta fundamental en el tratamiento cuantitativo de los procesos biotecnológicos, ya que permite predecir el curso de una fermentación, evaluar las velocidades, el rendimiento y la productividad. El conocimiento de estos parámetros permite optimizar el proceso de producción.
6. Rendimiento del crecimiento. Coeficiente de rendimiento. La obtención de la masa máxima de una bacteria en un medio dado está determinada por varios factores: a) Agotamiento de un nutriente esencial. b) Desarrollo de un pH adverso. c) Acumulación de productos finales del metabolismo que al pH del medio pueden resultar tóxicos para el microorganismo e impedir su crecimiento. Si se considera que los factores 2 y 3 no son limitantes del crecimiento y que las concentraciones de todos los nutrientes potencialmente limitantes están en exceso, con excepción de uno de ellos, entonces se establece una relación lineal entre el crecimiento máximo (población en fase estacionaria) y la concentración de ese dado nutriente. Esta relación es constante hasta que otros factores diferentes de la concentración del nutriente en cuestión, limiten el crecimiento.
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La determinación del crecimiento máximo en función de la concentración de un dado nutriente tiene una extensa aplicación en la determinación cuantitativa de aminoácidos, vitaminas del grupo B, purinas y pirimidinas (bioensayos). Estos métodos de análisis microbiológicos son específicos y extremadamente sensibles. La relación lineal observada significa que:
peso de bacteria formada (g/l) / peso de nutriente limitante consumido (g/l) = Y
En donde Y es el coeficiente de rendimiento. Si la concentración del nutriente limitante se expresa en términos de molaridad, se obtiene Y m o rendimiento molar, es decir, peso de células por mol de sustrato consumido. Si el sustrato es utilizado como fuente de material celular y como fuente de energía, conociendo el rendimiento en ATP del camino metabólico se puede expresar el rendimiento como YATP, es decir gramos de células por ATP consumido. Si Xo y So representan respectivamente la biomasa y la concentración iniciales del sustrato limitante y X y S los correspondientes valores durante el crecimiento, se cumple que: X - Xo = Y (So – S) Para un sustrato que es limitante del crecimiento, cuando el cultivo alcance su biomasa máxima (Xm), S tenderá a cero y entonces se puede escribir: Xm - Xo = Y So Despejando Xm, queda:
Xm = Xo +Y So Esta ecuación nos muestra como varía la biomasa máxima con la concentración del nutriente limitante que se utilice en el cultivo. Si se grafica Xm (biomasa máxima) en función de So (concentración inicial del nutriente limitante), se obtendrá una recta de pendiente Y y ordenada de srcen X o. Xm
Xo
So (mg/ml)
Efecto de la concentración de nutrientes sobre la velocidad de crecimiento El crecimiento bacteriano puede compararse, en muchos aspectos, a una reacción química en la cual los componentes del medio de cultivo (sustratos) producen nuevas células (producto de la reacción), un proceso catalizado por la población bacteriana. Si bien la velocidad de las
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reacciones químicas viene determinada por la concentración de los sustratos, la velocidad de crecimiento bacteriano permanece constante hasta que en el medio prácticamente se haya agotado el nutriente limitante. Esta aparente paradoja se explica por la acción de las permeasas que son capaces de mantener concentraciones intracelulares saturantes de nutrientes con un amplio margen de concentraciones externas. No obstante, a concentraciones extremadamente bajas de nutrientes externos, los sistemas de las permeasas no son ya capaces de mantener las concentraciones intracelulares saturantes por lo que disminuyen las velocidades de crecimiento. Las curvas que relacionan la velocidad de crecimiento con la concentración de nutrientes son típicamente hiperbólicas y responden a la ecuación: = máx s / ks + s
en donde μ es la velocidad específica de crecimiento a la concentración de nutriente limitante s, μ máx es la velocidad de crecimiento a la concentración saturante y ks es una constante análoga a la constante de Michaelis-Menten en cinética enzimática; ks es la concentración de sustrato que produce la mitad de la velocidad máxima. Los valores de ks para la utilización de la glucosa y el triptofano por E. coli son de 1 x 10-6 y 2 x 10-7 respectivamente, es decir valores tan bajos como 0,18 y 0,03 μg/ml. Estos valores tan bajos se deben a las elevadas afinidades características de muchas permeasas bacterianas, lo que puede considerarse como una adaptación evolutiva al crecimiento bacteriano en medios naturales altamente diluidos. Si se grafica la velocidad de crecimiento μ en función de la concentración del nutriente se
µ
S ( mg/ml)
obtiene una hipérbola: En el gráfico siguiente se muestran varias curvas de crecimiento a diferentes concentraciones de sustrato limitante, donde puede verse que si bien la cosecha máxima cambia, la velocidad de crecimiento se mantiene constante y sólo decrece a concentraciones muy bajas del sustrato. log N°cel/ml
5 g/l 3 g/l 0.5 g/l 0.1 g/l 0.05 g/l 5 mg/l 0.1 mg/l 1.0
tiempo
/l
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REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GENES DEBIDO A LA PRESENCIA DE DIFERENTES FUENTES DE CARBONO EN EL MEDIO. EL CULTIVO DIAUXICO En ciertos casos se pueden encontrar curvas de crecimiento más complejas. El caso más conocido presenta dos fases de crecimiento exponencial separadas por una fase de latencia. Este fenómeno, denominado diauxia o doble crecimiento, se observa cuando ciertas bacterias son cultivadas en medios conteniendo cantidades limitantes de dos carbohidratos diferentes (en general una es químicamente más compleja que la otra), o de un carbohidrato y de un ácido orgánico, como fuentes carbonadas. También se observa diauxia cuando se trata de dos fuentes nitrogenadas diferentes. La primera fase de crecimiento corresponde a la utilización exclusiva de uno de los compuestos hasta su agotamiento seguida por un período de adaptación antes que el otro sustrato sea metabolizado y reinicie el crecimiento. Si se trata de glucosa y lactosa, la pregunta que surge es cual de los dos azúcares se utilizará primero. La respuesta a esta pregunta viene del conocimiento de la regulación del metabolismo de la degradación de la lactosa. Las enzimas necesarias para la degradación de la lactosa son inducibles, es decir sólo se expresan si el inductor (lactosa u otros galactósidos) está presente. La información genética para la síntesis de estas enzimas (las de la degradación de la lactosa) está presente, lo que determina la presencia del inductor es su expresión fenotípica. Toda la información genética para la degradación de la lactosa está en una unidad funcional que es el operón lactosa (Fig. 2). Este operón tiene tres genes estructurales ( z, y, a) que son correlativos y están regulados conjuntamente. Inmediatamente vecino al gen z se encuentra el gen operador O y el gen promotor P. El operador es la región del operón que actúa como receptor específico de la sustancia reguladora. Fuera del operón lactosa se encuentra el gen cI que determina que las enzimas de este operón sean inducibles. El gen cI, gen regulador, codifica para una sustancia que es un represor interno, que se sintetiza constitutivamente, en general a poca velocidad, y que impide la transcripción del operón en ausencia del inductor. El represor es una proteína (proteína alostérica reguladora) con dos sitios de interacción. Por uno de ellos se une al inductor y se transforma, por modificación alostérica, en una sustancia inactiva. El segundo centro es activo en ausencia del inductor y reacciona con el operador inhibiendo la transcripción. La acción que ejerce el represor se denomina control negativo. También existen efectores positivos que incrementan la velocidad a la cual la RNA polimerasa se une al promotor y transcribe la información del gen. La base de la regulación positiva del fenómeno de diauxia es una represión por catabolito (Fig. 3). La glucosa reprime la síntesis de las enzimas de la degradación de la lactosa. Esta regulación se ejerce a través de un control positivo. Una sola proteína llamada proteína activadora del catabolito (CAP) es la responsable de la regulación de varios sistemas enzimáticos, entre ellos el operón lactosa. El efector de la proteína CAP es el c-AMP, cuya concentración en la célula varía inversamente al suministro de ATP. El c-AMP se une a la proteína CAP y hace que ésta experimente una transición alostérica que le permite unirse al promotor y estimular la transcripción. Cuando la bacteria está consumiendo glucosa para crecer, se forma mucho ATP, el nivel de c-AMP es bajo y la proteína CAP está inactiva, entonces no se sintetizan las enzimas para la degradación de la lactosa. Cuando se consumió toda la glucosa, aumenta el nivel de cAMP, éste se une a la proteína CAP, el complejo CAP-cAMP se une al promotor y se activa la
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transcripción de los tres genes estructurales del operón lactosa, sintetizándose las enzimas correspondientes.
Figura 2. Mapa genético del operon lactosa. Modelo de Jacob y Monod de la regulación transcripcional del operón lac por el represor lac. Tomado de Lodish et al., (2000).
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Figura 3. Regulación a través del complejo CAP-cAMP. Control transcripcional positivo del operón lac por el complejo cAMP-CAP. Tomado de Lodish et al., (2000).
Regulación de la expresión de genes mediada por la densidad poblacional. “Quorum sensing”
Las bacterias, a pesar de ser unicelulares, han evolucionado mecanismos sofisticados para regular la expresión de ciertos genes mediante la percepción de moléculas difusibles sintetizadas por individuos de la misma especie. Esta regulación de la expresión génica es dependiente de la densidad celular y permite coordinar la expresión de genes a nivel de la población y también de la comunidad. Este mecanismo regulatorio se denomina “quorum sensing” (QS), la palabra quórum en este contexto significa “suficiente en número”. De esta manera, un número suficiente de individuos estará presente antes de iniciarse una respuesta que depende de la densidad celular para tener un efecto. El caso más claro es el de una bacteria patógena que secreta una toxina que no tiene efecto cuando hay solamente una célula bacteriana. La producción de la toxina bajo esas condiciones significaría un derroche de recursos. En cambio, si hay un número suficiente de células bacterianas se acumulará una molécula señal, la cual regulará la expresión coordinada de la toxina para iniciar la enfermedad. Este es un fenómeno ampliamente distribuido entre bacterias Gram negativas y también Gram positivas. Cada especie sintetiza una molécula señal específica que se denomina autoinductor. Esta señal difunde al medio y alcanza altas concentraciones cuando hay muchas células cercanas produciendo la misma señal. En ese caso el autoinductor penetra las células y se une a una proteína activadora que dispara la transcripción de genes específicos. En la Figura 4 se
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presenta un esquema de este fenómeno para una bacteria Gram negativa cuya molécula señal es acil-homoserina-lactona (AHL).
Figura 4. Células bacterianas expresando acil-homoserina-lactona (AHL). Adaptado de Brock, Biología de los microorganismos, 12 va edición, 2009.
Existen diferentes clases de autoinductores. Loslasprimeros se identificaron fueron las ya nombradas acil-homoserina-lactonas (AHLs), cuales que presentan grupos acilo de longitud variable y son producidas por diferentes especies de bacterias Gram negativas. En cambio en bacterias Gram-positivas funcionan como autoinductores ciertos péptidos de cadena corta. El mecanismo de QS se describió por primera vez regulando la producción de bioluminiscencia por bacterias. La bacteria marina Aliivibrio fischeri puede emitir luz debido a la actividad de una enzima llamada luciferasa. Los operones lux que codifican para las proteínas necesarias para la bioluminiscencia están bajo el control de una proteína activadora LuxR y son inducidos cuando la concentración de una AHL producida por la bacteria es lo suficientemente elevada en el medio, y ello ocurre cuando la población celular es alta. Esta bacteria puede vivir de forma libre sobre materia orgánica en descomposición, pero además establece relaciones simbióticas con varios peces marinos y calamares. En el caso del calamar Euprymna scolopes, éste tiene un órgano emisor de luz con células ciliadas que atraen a las bacterias simbióticas. La bacteria coloniza ese órgano porque allí encuentra un ambiente rico en nutrientes. Al alcanzar un número elevado de células A. fischeri emite luz, esa luz determina que el calamar no produzca sombra en las noches de luna y así sus presas no se escapan cuando el calamar sale a alimentarse. La luminiscencia parece seguir un ritmo circadiano, siendo más brillante durante la noche que durante el día. A la mañana el calamar expulsa hasta un 90% de las bacterias simbióticas en un proceso conocido como "ventilación". Se cree que el objetivo de la ventilación es proporcionar la fuente de inóculo de vida libre para calamares recién nacidos. Luego, el proceso de multiplicación celular de la bacteria se repite. Otros organismos marinos que también contienen bacterias usan la bioluminiscencia para encontrar pareja, defenderse de los depredadores, atraer a sus presas, o comunicarse con otros organismos (Widder, 2010).
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Existen muchos genes regulados por QS, algunos tienen roles importantes en bacterias del suelo. Por ejemplo, el número de copias del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens se regula por señales de QS.También diferentes aspectos la nodulación de las plantas leguminosas por rizobios están regulados por este mecanismo. Entre otros, la eficiencia de la nodulación, el desarrollo del simbiosoma, la producción de polisacáridos y la fijación de nitrógeno han sido ligados a fenómenos de QS (González y Marketon, 2003). Existen estudios que han demostrado que células de mamíferos, plantas y algas secretan moléculas que pueden activar o inhibir mecanismos de QS. Por ejemplo, una molécula señal de defensa de las plantas, el ácido salicílico, activa la expresión de una enzima que degrada la AHL producida por A. tumefaciens (Williams, 2007).
CAPÍTULO 5 FILOGENIA Y CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA DE LOS MICROORGANISMOS Clasificación taxonómica y filogenética. Dominios: Bacteria, Archaea y Eukarya. Características diferenciales. Taxonomía convencional y molecular. Identificación y nomenclatura. Definición y concepto de especie. Taxonomía numérica y agrupamiento jerárquico. Taxonomía molecular: composición de bases e hibridación molecular. Material de consulta adicional: Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biología de los Microorganismos, 8a edición. Prentice Hall. Capítulo 6, pág. 188-194 y Capítulo 15 (15.5 a 15.9)
Definiciones Evolución: Es el proceso de cambio de los caracteres hereditarios en poblaciones de organismos a lo largo de las generaciones que se suceden en el tiempo. Filogenia: es el estudio de las relaciones evolutivas entre grupos de organismos. Sistemática: Es el estudio de la diversificación de los seres vivos a lo largo del tiempo, sus adaptaciones ambientales y sus relaciones evolutivas. Taxonomía: Es una rama de la sistemática que se ocupa de describir y clasificar organismos en grupos de acuerdo a similitudes en su srcen (genotípicas) o en sus estructuras (fenotípicas). La taxonomía incluye también el diseño de las reglas de nomenclatura que se usan para nombrar organismos. Homología: Se denomina así a la existencia de genes o caracteres codificados genéticamente en dos organismos diferentes y que se heredaron de un ancestro común. 1. Introducción En microbiología, tal como sucede en zoología odebotánica, los organismos en sistemas jerárquicos. Un objetivo importante la sistemática biológicase esclasifican establecer clasificaciones que reflejen la filogenia del grupo de organismos en estudio. De esta manera, dos especies que pertenezcan al mismo género serán genéticamente más similares entre sí y tendrán una historia evolutiva compartida más larga que dos especies de géneros diferentes y que sólo comparten la pertenencia a una categoría superior, como puede ser una familia. En una perspectiva más práctica, el desarrollo de sistemas taxonómicos y la correcta clasificación de los organismos son fundamentales por ejemplo al monitorear microorganismos patógenos en el campo y descubrir sus nuevas variantes, desarrollar marcadores biológicos en estudios
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ambientales o identificar con precisión los organismos que se usan en procesos biotecnológicos para cumplir con regulaciones legales. Comenzaremos este capítulo con una discusión sobre el srcen de la vida sobre el planeta y la posterior evolución de los grupos microbianos. Luego analizaremos algunas de las técnicas utilizadas para establecer relaciones fenotípicas y filogenéticas entre microorganismos, y cerraremos el capítulo con una introducción a las metodologías de la taxonomía microbiana.
2. El srcen de la vida sobre el planeta Nuestro planeta se formó hace unos 4.500 millones de años. Sin embargo, las muy altas temperaturas en la superficie, la ausencia de agua líquida y el bombardeo de gran cantidad de objetos provenientes del espacio, hicieron imposible el desarrollo de la vida durante los primeros cientos de millones de años que siguieron a la formación de la Tierra. Más tarde, las condiciones para el desarrollo la vida se volvieron más favorables. Existen dos hipótesis sobre las condiciones específicas que llevaron al surgimiento de los primeros seres vivos. La primera hipótesis plantea que el srcen de la vida fue en la superficie del planeta, al acumularse compuestos orgánicos e inorgánicos en medios acuosos que fueron reaccionando de manera compleja para formar estructuras químicas cada vez más sofisticadas, hasta llegar a vesículas separadas del medio externo por una membrana y con un metabolismo muy básico en su interior. La principal crítica de esta teoría es que las condiciones desfavorables debidas al impacto de meteoros, nubes de polvo, tormentas y reactividad química de la atmósfera se mantuvieron cientos de millones de años, dificultando los procesos de evolución química. Una hipótesis alternativa propone que el srcen de la vida ocurrió en el lecho de los océanos, cerca de fuentes surgentes hidrotermales. Este habría sido un ambiente menos hostil y mucho más constante, con una amplia disponibilidad de energía química. En este caso la formación de vesículas con un metabolismo primitivo se habría visto favorecida. También existen diferentes teorías con respecto al metabolismo primitivo presente en las vesículas. Una teoría sostiene que ese metabolismo estaba mediado por diferentes moléculas de ARN con funciones enzimáticas (función metabólica) y de almacenamiento y replicación de la información. Esta teoría se apoya en el hecho de que hay virus actuales que usan el ARN como material genético de almacenamiento, que en todos los seres vivos las variantes de ARN juegan un papel fundamental en la transcripción y traducción y que además existen moléculas de ARN con capacidad catalítica. La otra teoría sostiene que dentro de las vesículas podrían haber existido un alto número de moléculas, sobre todo polímeros y que debido a las condiciones físico-químicas del ambiente de la Tierra primitiva, esas moléculas podrían haber interactuado de manera cada más compleja, hasta desarrollar un metabolismo básico con capacidad de autoreplicación. Luego, en una etapa posterior se incorpora el ARN como material genético.
Evolución temprana En cualquier caso, estos complejos, llamados progenotes, no se consideran verdaderos seres vivos. Este progenote, o más probablemente, un conjunto de variantes de progenotes, continuó evolucionando y adquiriendo nuevas propiedades, hasta alcanzar un estado propio de un ser vivo, con un metabolismo organizado, controlado por un genoma compuesto por ADN o ARN, capacidad de autoreplicarse y responder a estímulos del ambiente. El genote o comunidades de genotes, probablemente prosperaron por decenas de millones de años, hasta que surge el “último ancestro universal común”, un microorganismo a partir del cual
evolucionaron los tres grandes dominios que abarcan la totalidad de los seres vivos que habitan
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la Tierra: Bacteria, que corresponde a las eubacterias de la actualidad, y un tronco que se separó rápidamente en Archaea, organismos unicelulares sin núcleo similares a bacterias y adaptados a ambientes extremos y Eukarya, que comprende a los animales, plantas, hongos y protistas. Los primeros seres vivos tienen que haber sido anaerobios y probablemente quimiolitotróficos explotando las fuentes abundantes presentes de H 2S (sulfuro de hidrógeno) y FeS (sulfuro de hierro). Las fermentaciones y la respiración aerobia aparecieron apenas más tarde junto con la fotosíntesis oxigénica y anoxigénica. Las primeras evidencias fósiles de vida tienen una antigüedad de 3.500 millones de años y corresponden a estromatolitos, unas estructuras macroscópicas similares a los tapetes microbianos que discutiremos en las clases de microbiología de ambientes acuáticos. Los microorganismos que formaron estos estromalitos fósiles eran bacterias filamentosas, probablemente fotosintéticas anoxigénicas. Una importante consecuencia de la aparición del O 2 generado por la fotosíntesis oxigénica fue la formación del O3 (ozono), una sustancia que hace de barrera para prevenir la intensa radiación ultravioleta del sol sobre la tierra. El ozono se forma por la acción de la luz UV sobre el O2. Hasta que apareció el ozono, se cree que la vida sobre la tierra sólo ocurrió en ambientes protegidos de la radiación UV, como por ejemplo debajo de las rocas o en los océanos.
Transferencia de material genético En la evolución de las bacterias y arquibacterias jugó un papel importante la transferencia lateral de material genético. Esto es, el movimiento de fragmentos de longitud variables de ADN desde un microorganismo procariótico a otro diferente. El resultado de este proceso es un organismo que combina material genético de especies que pueden estar muy distanciadas por su historia evolutiva. fenómenos de transferencia de material genético constituyen una forma muyLos efectiva de incorporar nuevaslateral funcionalidades. Aparentemente la transferencia lateral de genes fue muy frecuente en los inicios de la historia evolutiva, y luego su importancia fue disminuyendo. Hoy en día es un fenómeno detectable, pero sobre todo entre grupos de microorganismos con algún grado de parentesco filogenético. Por ejemplo, en la actualidad la transferencia lateral de genes es una de las causas que explican la rápida aparición de bacterias con resistencias a múltiples antibióticos.
Especialización de los organismos primitivos Respecto a la formación de organelas en los organismos eucariotas, existen evidencias para creer que el núcleo y el aparato mitótico surgieron como una necesidad de asegurar la replicación y la partición del ADN cuando el tamaño del genoma incrementó tanto que la replicación de una sola molécula (como en procariotas) ya no fue suficiente. El srcen del núcleo hace posible manipular el enorme genoma necesario para codificar todas las funciones de un organismo multicelular y también hace posible la recombinación del genoma a través de la reproducción sexual. Con respecto al srcen de las mitocondrias y los cloroplastos, la teoría de la endosimbiosis, que probablemente surgieron de la endosimbiosis de organismos procariotas dentro de sugiere los eucariotas.
3. Sistemática microbiana El estudio de la filogenia de los microorganismos, sus adaptaciones al ambiente y patrones de diversificación resulta más complicada que en botánica o zoología por la escasa presencia de registro fósil microbiano, la enorme diversidad y adaptabilidad de los microorganismos y la antigüedad de su srcen, que antecede al de plantas y animales en algunos
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miles de millones de años y coincide, como vimos en la sección anterior con el surgimiento de la vida sobre el planeta. Sin embargo, desde hace unas décadas, la sistemática microbiana está avanzando a grandes pasos, gracias a los avances en biología molecular, genómica y bioinformática. Actualmente existen diferentes métodos moleculares, éstos son los más modernos, y en general, los más confiables. Hoy en día, la mayoría de los trabajos que se realizan en el campo de la sistemática incluyen los análisis comparativos de genes o proteínas seleccionados que se conocen como relojes o cronómetros moleculares. Existen diferentes técnicas de laboratorio para determinar la secuencia de genes específicos. Mediante aplicaciones informáticas se puede determinar el grado de similitud de dos o más secuencias de nucleótidos o aminoácidos. La mayoría de estos métodos requieren un paso de amplificación del ADN, que se logra utilizando diversas variantes de la técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Aunque es menos frecuente, y más costoso, actualmente también es posible obtener la secuencia completa del genoma de un microorganismo. Por ejemplo, a mediados de febrero de 2011 existían 1.453 genomas microbianos completamente secuenciados, y la información se encuentra disponible en forma pública en bases de datos que se acceden vía Internet. La disponibilidad de estos datos generó un interés en desarrollar nuevos métodos de estimación filogenética que usan toda la secuencia del genoma, en lugar de algunos marcadores seleccionados.
Cronómetros para la evolución Las variaciones que se observan en la secuencia de aminoácidos de ciertas proteínas o en las secuencias de nucleótidos de algunos genes son buenos indicadores de los cambios que ocurrieron en el proceso evolutivo. El estudio comparativo de las secuencias mostró que la distancia evolutiva Esto entreesdos se número puede medir por la cantidad de cambiosdeque en dichas secuencias. asíespecies porque el de diferencias en la secuencia unaocurren molécula es proporcional al número de cambios mutacionales estables que ocurrieron en la secuencia de ADN desde que esas especies divergieron de un ancestro común.
Elección de los marcadores o cronómetros moleculares. Ejemplos. Para determinar la distancia en la evolución entre dos especies, es esencial elegir la molécula correcta para estudiar la secuencia. Esto es importante por varias razones: a) La molécula debe estar universalmente distribuida en el grupo elegido para el estudio. b) Debe ser homóloga funcionalmente para cada organismo, es decir, las comparaciones filogenéticas deben comenzar con moléculas de funciónes idénticas. No se puede comparar las secuencias de moléculas de enzimas que llevan a cabo funciones diferentes, ya que no se puede esperar que moléculas no relacionadas funcionalmente tengan secuencias semejantes. c) Es crucial en la comparación de las secuencias, poder alinear las dos moléculas que se están comparando para identificar regiones de secuencias homólogas y de secuencias heterólogas. d) La secuencia de la molécula elegida debe cambiar a una velocidad conmensurable con la distancia en la evolución que se quiere medir. Así cuanto más amplia sea la distancia a ser medida, tanto más pequeña debe ser la velocidad a la cual la secuencia cambia. Una molécula que sufre muchos cambios en su secuencia no sirve como herramienta para determinar las relaciones evolutivas porque podrían haberse perdido regiones de secuencia homóloga.
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Secuencia del ARN ribosomal 16S. Uno de los primeros marcadores que se usaron, y se continúan usando, para estudios filogenéticos, es la secuencia del gen que codifica para la subunidad 16S del ribosoma de los procariotas, o para la subunidad 18S en el caso de los eucariotas. Esto se debe a que esta molécula reúne prácticamente todas las condiciones que requiere un marcador filogenético: a) Distribución generalizada. b) El producto de este gen realiza la misma función en todos los organismos. c) Baja frecuencia de transferencia lateral. d) Estructuras con baja tasa de mutación, y otras con tasas más altas. e) Existen bases de datos que almacenan un número muy grande de secuencias diferentes para este gen. Es común determinar las relaciones filogenéticas entre microorganismos utilizando exclusivamente este marcador, pero en años recientes esta práctica ha recibido críticas y se observa una tendencia a complementar los trabajos de investigación con otros marcadores. Aunque es importante destacar que la base de estos estudios continúa siendo el análisis de la secuencia del rRNA 16S, motivado, entre otras razones por la enorme cantidad de secuencias depositadas en las bases de datos y disponibles para comparación.
BA C TE R IA
AR CHAE A EUCARIOTA
Bacterias verdes Entamoebas
Mitocondrias Bacterias púrpuras Cloroplastos Cianobacterias
Gram +
Methanosarcina Thermoproteus Methanobacterium Pyrodictium
Methanococcus
Mohos Animales
Halófilas extremas
Thermococcus
Flavobacterias
Thermoplasma Methanopirus
Hongos Plantas Ciliados Flagelados
Thermotoga Tricomonas Aquifex Progenote
Diplomonas
Microsporidia
Arbol filogenético universal determinado comparando las secuencias de los ARN ribosomales 16S y 18S. Adaptado de Madigan y col., 2000.
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Genes de función conservada. Los estudios comparativos de genomas procariotas permitieron descubrir un conjunto de alrededor de 40 genes conservados que también se pueden usar como marcadores filogenéticos. Estos genes codifican moléculas como otros rRNA, - y también la región intergénica entre genes para rRNAs-, y diversas proteínas tales como factores de iniciación y elongación de la traducción, proteínas ribosomales, sintetasas de aminoaciltRNAs, polimerasas de ARN, proteínas de resistencia al estrés calórico y enzimas involucradas en la recombinación del ADN. Este núcleo de genes no son blancos frecuentes de los procesos de transferencia lateral, y constituyen una alternativa válida para estudios filogenéticos.
Otros métodos moleculares Contenido genómico de G+C: Este fue uno de los primeros métodos para caracterizar el material genético de un microorganismo. Es relativamente fácil de determinar experimentalmente: se calienta suavemente ADN extraído de un cultivo microbiano y se mide la absorbancia de la muestra a 260 nm. Al alcanzar la temperatura en que las dobles cadenas se separan, se observa un aumento rápido de la absorbancia. Esta temperatura es el llamado punto de fusión del ADN; a partir del cual y mediante una fórmula matemática se estima el contenido relativo de G+C, expresado como un porcentaje (%G+C). A mayores puntos de fusión del ADN, les corresponden mayores valores de %G+C. La desventaja de este método es que tiene poco valor filogenético: dos especies con contenidos similares de G+C pueden estar emparentadas o no. Aunque en el caso contrario, sí se puede afirmar que dos especies con valores muy diferentes de %G+C tienen entre sí una relación filogenética distante. Actualmente sólo se utiliza como un dato adicional en la descripción de un organismo. Puede servir para confirmar la pertenencia de un microorganismo a una de las categorías taxonómicas superiores, comoeldivisión o clase. Para microorganismos cuyosinformáticos. genomas fueron completamente secuenciados, contenido de G+C se determina por métodos
Hibridación cuantitativa de ADN: Este método también existe desde hace muchos años. Sus variantes más modernas continúan utilizándose, aunque ya no ocupan el papel fundamental que tenían antes de que aparecieran los métodos de comparación directa de secuencias. El principio de la versión moderna de esta técnica es formar híbridos de ADN doble cadena utilizando muestras extraídas de los dos microorganismos que se quieren comparar. Una forma práctica de lograr ésto es obtener ADN de cadena simple de un cultivo puro de uno de los microorganismos e inmovilizarlo sobre una superficie plástica. Luego se extrae ADN del otro microorganismo y se preparan moléculas de ADN de cadena simple que se marcan químicamente con nucleótidos radiactivos o nucleótidos modificados que emiten fluorescencia (Fig. 1). Se enfrenta este segundo ADN al que previamente se había inmovilizado y tras una serie de pasos, esencialmente lavados, se determina cuanta marca -radiactiva o fluorescentequeda unida al ADN inmovilizado. Cuanto mayor es la marca, mayor es el grado de parentesco evolutivo entre las especies. Por ejemplo, un criterio común es que si el ADN de dos microorganismos muestra hibridaciones del 70% o más, pertenecen a la misma especie.
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Figura 1. Esquema de la hibridación de ADN de cuatro orígenes diferentes
4. Taxonomía microbiana El objetivo de la taxonomía es la identificación y descripción de las unidades taxonómicas básicas, las especies, y el desarrollo de métodos que permitan ordenar y catalogar las especies. La nomenclatura es una subdisciplina de la Taxonomía que contribuye a la identificación de los organismos.
Clasificación de los microorganismos Los organismos pueden clasificarse en grupos tales que los miembros de un grupo están más relacionados filogenéticamente entre sí que con los miembros de otro grupo. Para agrupar los organismos se emplea una sucesión ordenada de categorías taxonómicas: Especie: organismos de una y la misma clase.
Género: grupo de especies afines. Familia: grupo de géneros afines. Orden: grupo de familias afines. Clase: grupo de órdenes afines.
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Phylum o División: grupo de clases afines. Dominio: grupo de phyla afines. Esta ordenación jerárquica contiene los principales taxones de clasificación de los organismos. Cada categoría, en la serie ascendente, agrupa a un número cada vez mayor de unidades taxonómicas. Es importante notar que el género ocupa una posición de importancia especial, ya que de acuerdo a las reglas de la nomenclatura, una especie no puede designarse sin estar incluida en un género. En algunos casos, especialmente con grupos muy extensos, se emplean taxa complementarias, en las cuales se agregan prefijos sub o super a las taxa mencionadas, por ejemplo subfamilia, subgénero. En noel forma caso departe la especies, es común identificar también una variedad . También, aunque estrictamente de la categorización taxonómica, en microbiología es comú n trabajar con la categoría “cepa”, que es una población clonal -srcinada de un único individuo- dentro de una especie.
Las especies como unidades de clasificación El concepto de especie microbiana es complejo y no tiene definición objetiva. Aquí debemos tener en cuenta que en otros grupos biológicos, como las plantas o los animales, la definición de especie no es sólo un concepto operativo, sino que tiene un fundamento biológico, ya que la especie está formada por conjuntos de poblaciones cuyos individuos tienen la capacidad de cruzarse sexualmente entre sí, dando una descendencia fértil, y al mismo tiempo están sexualmente aislados de otras especies. Entre los procariotas la recombinación sexual es prácticamente inexistente, y para complicar el panorama también hay que considerar la existencia de fenómenos de transferencia lateral de material genético entre grupos con poco parentesco filogenético. Durante las primeras épocas de la microbiología el concepto de especie adoptado fue operativo y basado en caracteres fenotípicos, fundamentalmente morfología celular, tipo de tinción Gram, estilo de vida y caracteres metabólicos, como requerimientos nutricionales y capacidad de utilización de fuentes de C y N. Más tarde se agregaron los datos de contenido de G+C y las relaciones de homología de ADN. El resultado de este proceso es un sistema de clasificación que no siempre reflejó la filogenia de cada grupo. La incorporación de técnicas moleculares sofisticadas está conduciendo a una revisión extensiva de la clasificación de bacterias, arquibacterias, hongos y otras formas de vida microscópicas. Sin embargo, todavía no se alcanzó a redefinir el concepto de especie microbiana de forma que ésta se corresponda con la unidad de evolución e incluya consideraciones ecológicas.
Nomenclatura de los microorganismos La nomenclatura biológica está gobernada por un rígido y complejo conjunto de reglas diseñadas para mantener dicha nomenclatura lo más estable posible. Conforme al sistema binomial de nomenclatura se asigna a cada especie biológica un nombre compuesto por dos palabras. La primeraAmbas indicaconforman el género alel cual pertenece especiePor y laejemplo, segunda Bacillus palabra es epíteto específico. nombre de la laespecie. es un el género y Bacillus subtilis la especie (y no subtilis sólamente). La primera palabra se escribe con mayúscula y puede ser una palabra latina, griega o el nombre latinizado de una persona (ej.: Pasteurella, en honor de Luis Pasteur). La segunda palabra, la designación específica, se escribe con minúscula. En los casos en que hay variedades, ésta se indica a continuación del nombre de la especie, por ejemplo: Streptococcus lactis var. maltigenes.
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Existen varias formas en que se puede llevar a cabo la clasificación microbiana: taxonomía clásica, taxonomía numérica y taxonomía genética o molecular. Aunque los métodos moleculares son los más sofisticados y los que permiten mayor precisión los otros métodos todavía no han desaparecido. Hay varias causas para que ésto sea así. En muchos grupos biológicos todavía no se desarrollaron los sistemas de clasificación apropiados para reemplazar a los preexistentes. En otros grupos, ya existe una caracterización de su filogenia a nivel molecular, pero se mantienen otros sistemas paralelos. Un ejemplo típico es la clasificación de especies fitopatógenas, en donde las relaciones filogenéticas pueden ser bien conocidas, pero la clasificación fenotípica por tipos de virulencia es la que le resulta útil al fitopatólogo en el campo. Taxonomía clásica: Se basa en la determinación de una variedad de características de los distintos organismos y se los separa por grupos que comparten estas características. Un grupo de cepas que tienen todas o la mayoría de las características fenotípicas iguales se clasifican en especies únicas y las especies afines se clasifican en el mismo género. Las características de valor taxonómico que se evalúan en este tipo de estudio son la morfología, clasificación nutricional, química de la pared celular, presencia y tipo de inclusiones celulares y productos de almacenamiento, pigmentos, requerimientos nutricionales, productos de fermentación, requerimientos y tolerancia a la temperatura y al pH, sensibilidad a los antibióticos, patogenicidad, características inmunológicas y hábitat, etc.
Taxonomía numérica: Entre los años 60 y 70 del siglo pasado los taxónomos comenzaron a aprovechar la mayor capacidad de cómputo que ofrecían las computadoras de la época para desarrollar métodos más objetivos de clasificación. Los agrupamientos de organismos en categorías se construyeron a partir de la cuantificación de las semejanzas y diferencias entre los microorganismos. Se asume que, si a cada carácter estudiado se le asigna el mismo valor, es posible expresar numéricamente las distancias taxonómicas entre los organismos en función del número de caracteres que comparten dentro del total de caracteres estudiados. Obviamente la significación de este tipo de clasificación está directamente afectada por el número de caracteres analizados y en consecuencia éstos deberían ser tan numerosos y variados como sea posible para que el resultado sea reflejo significativo del fenotipo. La recomendación usual es que el número de caracteres analizados debería ser al menos 60 y que en lo posible sean independientes entre sí. Los caracteres analizados pueden ser de cualquier tipo: morfológicos, bioquímicos, fisiológicos o serológicos (inmunológicos). Los datos se organizan en una tabla llamada matriz de datos (Fig. 2), cuyas filas corresponden a las poblaciones, cepas, variedades, etc. -conocidas colectivamente como Unidades Taxonómicas Operativas, OTUs en inglés- y las columnas de la matriz a los caracteres. Existen diferentes coeficientes para comparar OTUs y obtener medidas de semejanza entre ellas. Los resultados se organizan en una nueva matriz conocida como matriz de distancia o similitud. Esta matriz contiene toda la información para analizar las relaciones entre OTUs, pero su uso no es práctico y la forma más usual para representarlo es mediante dendrogramas (Fig. 3). Taxonomía molecular: Las técnicas utilizadas para la clasificación de los microorganismos utilizando metodologías moleculares son adaptaciones, las cuales se mencionaron anteriormente en la sección de sistemática.
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MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Microbiología Y AMBIENTAL Agrícola y Ambiental
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CAPÍTULO 6
ECOLOGÍA MICROBIANA El suelo y el agua como ambiente para los microorganismos, factores que afectan su distribución. Los microorganismos y su microambiente, ecosistemas y nichos ecológicos. Interacción de los microorganismos entre sí y con su entorno (competencia, cooperación). Importancia de la ocupación de diferentes nichos ecológicos naturales por parte de los microorganismos y la modificación de los mismos. Microorganismos de la rizosfera y su interacción con la planta. Nichos ecológicos de importancia agrícola; actividad microbiana y fertilidad del suelo. Rol de los microorganismos en procesos de degradación de sistemas acuáticos con relevancia ambiental y agronómica. Metodología comúnmente utilizada para el estudio de los microorganismos en el suelo y en el agua.
I - INTRODUCCIÓN Ya en el año 1676 Antonius van Leeuwenhoek describió la presencia de pequeños “animáculos”
en la materia orgánica en descomposición. Sin embargo se considera como padre de la microbiología del suelo a Sergei Winogradsky (1856-1953) en reconocimiento a sus muchas contribuciones a esta emergente ciencia. Entre otras cosas descubrió las bacterias nitrificadoras, y su papel en el fenómeno de la nitrificación. En 1888 Beijerink aisló bacterias fijadoras de nitrógeno del género Rhizobium. En el comienzo del siglo XX, la microbiología del suelo ya estaba firmemente establecida como ciencia, dándose mayor énfasis a la fijación simbiótica del nitrógeno, la degradación de la materia orgánica y a las transformaciones del nitrógeno. Asimismo, en esa época se llevaban a cabo esfuerzos considerables haciendo censos y recuentos de los microorganismos del suelo, para utilizarlos como índices de la fertilidad del suelo. Estos esfuerzos fueron vanos, ya que no se tenía en cuenta que los “propágulos” capaces d e formar colonias en cultivo representan solo una pequeña fracción de los microorganismos del suelo, y que además existen otros factores que limitan la fertilidad del suelo. Durante el desarrollo del siglo XX se llegó al entendimiento de gran parte de los procesos microbiológicos que ocurren en el suelo. Hacia finales del mismo una serie de nuevos desarrollos y tecnologías han influenciado la microbiología del suelo. Entre los avances más relevantes podemos citar, por un lado, la introducción de la computación para el procesamiento de la información y, por otro lado, el reconocimiento de la participación de los microorganismos en una importante cantidad de procesos ambientales. Además, de la necesidad de técnicas de manejo agropecuario más eficientes surge la aplicación de nuevos métodos en la agricultura, como la labranza cero. El desarrollo de técnicas de ingeniería genética es el desafío más grande de este momento para producir y emplear organismos con sus genomas modificados artificialmente. La utilización de estos organismos en el mejoramiento del ambiente requiere un profundo conocimiento de las características básicas de los microorganismos del suelo. Los nuevos microorganismos podrían ser capaces no solo de realizar más eficientemente diferentes procesos, como la fijación biológica de nitrógeno y la degradación de la materia orgánica, sino que además podrían producirse organismos capaces de llevar a cabo el control de pestes, o de realizar procesos como la degradación de restos de pesticidas o insecticidas tóxicos (biorremediación).
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II - El SUELO COMO AMBIENTE PARA LOS MICROORGANISMOS II.1 – Introducción: el suelo como ecosistema La microbiología del suelo pone énfasis en las actividades metabólicas de los microorganismos, así como en su papel en el flujo de energía y en la biotransformación de nutrientes asociados con la productividad primaria del ecosistema. También se ocupa del impacto ambiental, favorable o desfavorable, de los organismos del suelo y de los procesos que ellos llevan a cabo. En gran parte, la microbiología del suelo está ligada a la bioquímica del suelo ( i.e., a las reacciones de índole biológica que ocurren en éste), sin embargo, se ha enfatizado cada vez más la importancia aspecto ecológico, el cual estudia las interacciones de los microorganismos entre sí y con eldel medio edáfico. El suelo es un ecosistema donde conviven organismos muy disímiles en estrecha dependencia. No es posible el desarrollo de un suelo sin la presencia de microorganismos, ya que los nutrientes quedarían retenidos en la materia orgánica sin descomponer, sin que las plantas pudieran utilizarlos. Tampoco puede haber desarrollo de microorganismos sin la presencia de plantas que fijan la energía solar en forma de energía química, haciéndola disponible para los organismos heterótrofos. El desarrollo de microorganismos en el suelo está determinado por las condiciones físicas del mismo, como porosidad, humedad, pH, disponibilidad de nutrientes y de O 2. Asimismo, los microorganismos interactúan con el medio físico, alterándolo mediante procesos como la meteorización (degradación de minerales), liberación de sustancias al medio, agregación de partículas, y transformación de la materia orgánica. Las principales limitaciones que sufren los organismos del suelo son: La dificultad para desplazarse en un medio tan compacto debido al pequeño tamaño de los poros. La ocurrencia de condiciones microclimáticas desfavorables, como estrés hídrico, anegamiento y anaerobiosis. La relativamente baja cantidad de nutrientes y sustratos orgánicos fácilmente digeribles. La actividad de la biomasa microbiana en condiciones de campo es 1.000 a 10.000 veces menor que en condiciones de laboratorio. Esto sugiere que en el suelo los microorganismos están activos solamente durante períodos cortos, en un número limitado de micrositios. La comunidad microbiana es una población mayoritariamente latente, con una enorme riqueza de especies, que se desarrolla solamente en condiciones favorables. Actualmente se conoce solo una pequeña fracción de los microorganismos del suelo, debido a que aún no se han desarrollado medios sintéticos en los que la fracción restante pueda ser cultivada.
II.2 –Microorganismos del suelo El suelo es un medio extremadamente complejo, que contiene una enorme cantidad de microorganismos. Un gramo de suelo seco contiene aproximadamente 10 7 bacterias, 106 actinomicetes, 105 hongos, 105 protozoos y 104 algas. Describimos los principales grupos microbianos:
Bacterias: procarióticos y unicelulares, las bacterias constituyen el grupo de organismos más numeroso del suelo. Pueden ser heterótrofas, quimioautótrofas o fotosintéticas. Llevan a
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cabo numerosas funciones en el suelo, tales como la degradación de la materia orgánica, fijación de nitrógeno y desnitrificación. Viven en forma libre o interactuando con los vegetales u otros organismos, pudiendo incluso ser patógenos. Entre las bacterias cultivables, el género Arthrobacter es el más abundante en los suelos agrícolas, constituyendo hasta el 40% del contenido total de microorganismos en el suelo. Otros géneros abundantes son Pseudomonas y Bacillus.
Actinomicetes: Son organismos procariontes, filamentosos, de vida libre ( Streptomyces) o simbiontes (Frankia). Participan en la degradación de la materia orgánica y la fijación de nitrógeno atmosférico. Hongos: Son organismos eucariontes, saprófitos o simbiontes. Tienen una estructura en forma de micelio filamentoso. Son importantes en la degradación de la materia orgánica. Algunos son patógenos de importancia y otros son benéficos. Entre estos últimos se encuentran aquellos que se asocian simbióticamente con las raíces y forman las micorrizas. Cianobacterias: Son organismos procariontes fotosintéticos. Pueden ser de crecimiento libre o en asociación simbiótica con hongos o helechos, formando líquenes. Son fijadoras de nitrógeno atmosférico. Estos microorganismos conviven en el suelo con numerosas especies de insectos, ácaros, vermes, entre otros.
II.3 - Distribución de los microorganismos en el suelo La distribución de los microorganismos en el suelo es extremadamente heterogénea. Está determinada por diversos factores, pero el factor preponderante es la presencia de materia orgánica, que actúa como fuente de energía, carbono y nutrientes. Debido a esto, la cantidad de microorganismos disminuye con la profundidad en el perfil del suelo igual que la disponibilidad de la materia orgánica. Esto no significa que las zonas sin aportes orgánicos no presenten microorganismos; en el suelo también existen microorganismos autótrofos, cuyo metabolismo es independiente de fuentes de carbono orgánicas. Por ende, al alejarnos de zonas con alto contenido de sustratos orgánicos, no sólo disminuirá el número de microorganismos sino que también aumentará la proporción de autótrofos. Para el estudio de la distribución de los microorganismos, el perfil de suelo puede dividirse teóricamente en dos sectores: aquel no influenciado directamente por las raíces vegetales y el suelo rizosférico, en el cual los microorganismos interactúan con las raíces vegetales. Esta última zona, en la proximidad de las raíces vegetales, es conocida como rizosfera. La rizosfera alberga la mayor densidad microbiana del suelo debido a que actúa como hot spot1, con un aporte continuo de fuentes carbonadas y de nutrientes preponderantemente de srcen vegetal (ver apartado correspondiente). En el resto del suelo, los microorganismos no están uniformemente distribuidos, sino que se encuentran congregados junto a los restos de materia orgánica en descomposición, o en los poros del suelo. En la matriz del suelo, la mayor biomasa de microorganismos corresponde a los hongos, que se encuentran ubicados preferentemente por fuera de los agregados del suelo, y en los poros mayores entre los agregados estabilizando los agregados de mayor tamaño (figura 1). Las bacterias son las dominantes en número. También se encuentran en los poros entre los agregados pero siempre adsorbidas a la superficie de las partículas minerales u orgánicas del suelo, por lo cual no son fácilmente separadas del suelo. Los poros pueden tener una o varias 1
El término hotspot en ecología microbiana de suelos se refiere a la zona de alta actividad microbiana, en general debida a un alto input de fuentes de carbono, energía y nutrientes.
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entradas, y pueden estar conectados por canales. Las bacterias se pueden encontrar como células aisladas, pero lo más frecuente es que se encuentren en pequeñas colonias de un solo tipo de células (especialmente, entre las cultivables, Bacillus y Arthrobacter sp.). Algunas veces las bacterias pueden estar completamente recubiertas por polisacáridos y por laminillas de arcilla, formando microagregados menores de 20 µm.
II.4 - Factores que determinan la distribución de los microorganismos en el suelo Además de la vegetación, son las características físicas y químicas del suelo las que determinan la distribución de los microorganismos en el perfil. Entre ellas podemos citar: La atmósfera del suelo: La composición de la atmósfera del suelo es un factor determinante para la actividad de los microorganismos. Los gases más abundantes en este ambiente son el N2, O2 y el CO2. Otros gases provenientes de la actividad microbiana, como los óxidos de nitrógeno, el H2, etc., pueden estar presentes, aunque desaparecen rápidamente por su reactividad con los componentes del suelo. En suelos bien aireados, la concentración de O 2 oscila entre 18-20%, y la de CO2 entre 1-2%. Sin embargo, en un suelo arcilloso con contenido alto de humedad la concentración de CO2 puede alcanzar al 10%. La difusión de los gases en el suelo sigue la ley de Fick: qi = Dsai .ci /zi Donde: qi es la velocidad de difusión (g cm-2seg-1) del gas, Dsai es la constante de difusión en el suelo (cm-2 seg-1), ci la concentración del gas en la atmósfera del suelo (g cm -3), y zi la profundidad (cm).
Figura 1. Modelo de un agregado de suelo. Adaptado de Paul y Clark (1989). Los parámetros que rigen la difusión de los gases en el suelo van a ser afectados por condiciones edáficas, como la textura, y la cantidad de macro y microporos, y especialmente por el contenido de agua. Los macroporos mayores a 10 µm en diámetro permiten la rápida difusión del aire y la infiltración y drenaje del agua. Se considera que para tener una buena aireación el suelo no debe tener menos del 10-15% de los macroporos ocupados por aire. Los microporos (<10 µm) son importantes para la retención del agua disponible para las plantas y para la provisión de un hábitat acuoso para los microorganismos. Los microporos menores a 5 µm, en
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general, no son hábitat para la mayoría de los microorganismos y pueden ser muy pequeños para sus exoenzimas. El O2 en el aire o en el agua del suelo puede ser consumido en pocas horas por los microorganismos pero al mismo tiempo, ser repuesto por difusión. Si la difusión del O 2 en el suelo se haya restringida debido a un anegamiento, a alta proporción de arcilla o compactación del mismo, las condiciones serán anaeróbicas. La actividad microbiana dependerá de la disponibilidad de otros aceptores de electrones, diferentes al O2. Este cambio en los aceptores de electrones promueve la reducción de varios elementos importantes en el suelo, entre ellos el nitrógeno, manganeso, hierro y azufre, en procesos conocidos como respiración anaeróbica y metanogénesis del CO2. El cambio de metabolismo aerobio a anaerobio se produce con concentraciones de O2 menores a 1%. La actividad de los organismos aeróbicos y facultativos es dominante en suelos bien drenados, mientras que al reducirse la concentración de O2 aumenta la actividad de los anaerobios obligados y fermentadores. La aireación total del suelo no es tan determinante como la aireación de los agregados individuales. La ocurrencia de procesos anaerobios como la desnitrificación y la reducción del sulfato (respiración anaerobia) en suelos bien aireados esta indicando que existen micrositios con condiciones anaeróbicas. Otra prueba de la existencia de micrositios anaerobios es la presencia de bacterias anaeróbicas como Clostridium en los estratos superiores del suelo.
Estructura del suelo: Es fundamental para la actividad de los microorganismos. La materia orgánica no se degrada si no hay contacto físico con los microorganismos. Ésta se acompleja con la arcilla formando agregados de diferentes tamaños, dejando poros entre ellos. La mayoría de los organismos del suelo se encuentran sobre el lado externo de los agregados, sólo unos pocos residen dentro de los agregados y corresponden a aquéllos que quedaron atrapados adentro cuando el agregado se formó. Fotografías de microscopia electrónica y cálculos de densidad microbiana indican que los microorganismos ocupan menos del 1% del espacio poroso total. Los poros de unos pocos micrones están llenos de agua y son colonizados por bacterias, ya que en estos hábitats van a encontrar suficiente humedad y materia orgánica para su desarrollo. Los hongos, por su tamaño y debido a la formación de micelios, invaden los poros mayores. Estos juegan un rol muy importante en la formación y mantenimiento de la estructura del suelo cementando agregados (figura 1). Similarmente, las bacterias secretan mucílagos y gomas bacterianas, a las cuales se unen las arcillas, formando y estabilizando los agregados. Características de las arcillas: La adhesión de los microorganismos a las arcillas modifica varios aspectos de sus funciones biológicas. Las arcillas al igual que las bacterias poseen cargas negativas en sus bordes. Sin embargo, debido a la presencia de mucigel y extensiones de las paredes celulares llamadas fibrillas ocurre la adsorción de las bacterias a las arcillas del suelo. Las cargas de las arcillas también pueden tener importancia en regular el pH en determinados microclimas, ya que les confieren capacidad buffer. Por otro lado, la materia orgánica también se cubre de laminillas de arcilla, haciéndola entonces inaccesible a los microorganismos, impidiendo su degradación (estabilización). Potencial agua: En general se encuentra una buena correlación entre el potencial agua y el número y actividad de los microorganismos. La actividad microbiana disminuye en forma lineal con la reducción del potencial agua, siendo extremadamente baja por debajo de -10 MPa y con un valor límite de -40 MPa. Sin embargo los valores de potencial agua de los suelos agrícolas se encuentran entre la saturación y los -4.5 MPa. Los niveles más altos de respiración microbiana, nitrificación y mineralización ocurren cuando el contenido de agua del suelo se mantiene en el máximo posible sin que disminuya la aireación. Esto ocurre cuando el suelo se encuentra
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aproximadamente 60% de la capacidad de retención de agua. En la mayoría de los suelos este valor oscila entre -0,01 a -0,03 MPa. El efecto del potencial agua es diferente según los diferentes tipos de microorganismos. Las bacterias son más sensibles a un potencial de agua bajo que los hongos y los actinomicetes. La mayoría de los hongos pueden crecer sin inconvenientes a tensiones mayores a -1.5 MPa. Por otro lado, cada especie de microorganismo tiene un potencial agua máximo y mínimo para su crecimiento.
Figura 2. Efecto del pH del suelo sobre la densidad de microor anismos. Adaptado de Frioni, 1990.
pH: El pH afecta en forma importante el desarrollo de los microorganismos. Los hongos se desarrollan preferentemente en hábitats de pH ácidos, en tanto que las bacterias y los actinomicetes se desarrollan mejor en pH alcalinos (figura 2). Sin embargo, esto no implica que no se encuentren bacterias en suelos ácidos, o que no se encuentren hongos en suelos alcalinos. El pH del suelo incide en numerosos factores que afectan a la actividad microbiana, por ejemplo, en la solubilidad e ionización de constituyentes orgánicos e inorgánicos presentes en la solución del suelo, afectando las actividades enzimáticas. A modo de ejemplo se puede citar a la nitrificación como una de las biotransformaciones más sensibles al pH. Sin embargo, en suelos de bosque con valores de pH menores a 4 se ha detectado nitrificación, a pesar de que in vitro este proceso no ocurre a valores de pH por debajo de 6. Esto se explica, en parte, por la existencia de micrositios, donde la descomposición de la materia orgánica podría liberar NH 3, el cual al formar NH4+alcaliniza el medio, desarrollándose un pH adecuado para la nitrificación. Otra explicación para la nitrificación a pH ácido, en ambientes acuáticos y suelos, es el descubrimiento de la presencia de arqueobacterias nitrificadoras con sistemas enzimáticos menos sensibles al pH (Lehninger, 1978).
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Temperatura: El aumento de la temperatura, dentro de ciertos límites, incrementa la mineralización o descomposición de la materia orgánica por acelerar las reacciones enzimáticas y la difusión de los sustratos solubles en el suelo. Sin embargo, mientras que la velocidad de difusión molecular aumenta con el aumento de la temperatura, la solubilidad de los gases en la solución del suelo no, y aún puede disminuir haciendo más lenta la actividad microbiana. Una temperatura baja reduce la velocidad de las reacciones enzimáticas y hasta las detiene, en tanto que una muy alta desnaturaliza las enzimas. Existen estudios que han demostrado que 10ºC de aumento de la temperatura de 15 a 25ºC puede aumentar tres veces la tasa de mineralización de C y N del suelo. El aumento en las actividades biológicas a mayores temperaturas probablemente se deba al cambio en la estructura de la comunidad microbiana En general, la mayor actividad microbiana en los suelos se verifica entre 20 y 40ºC, aunque existen microorganismos que toleran temperaturas extremadamente altas, entre 45 a 65ºC, y algunos termófilos obligados son incapaces de crecer por debajo de 40ºC. La actividad microbiana en los suelos es más lenta a temperaturas por debajo de 5ºC. Sin embargo, se ha registrado actividad microbiana incluso en suelos con temperaturas menores a 0ºC. Los organismos psicrófilos son capaces de crecer a bajas temperaturas porque ajustan la concentración osmótica de sus constituyentes citoplásmicos, manteniendo de este modo su citoplasma sin congelar. Muy pocos suelos mantienen una temperatura uniforme en sus estratos superficiales a lo largo del día y mucho menos del año. Los suelos con mayor contenido de humedad están menos sujetos a variaciones diurnas de la temperatura que los suelos secos debido al alto valor de calor específico del agua. La orientación de la pendiente (al sur versus al norte), el sombreado, la cobertura vegetal determinan la radiación solar efectiva que recibe el suelo y, consecuentemente, su calentamiento.
Potencial redox: Los organismos vivos obtienen su energía de la oxidación de materiales reducidos. El material más reducido la biosfera es la materia orgánica presentemetabólicas en la biomasa viva. Los microorganismos del suelodegeneran electrones durante las reacciones de oxidación de la materia orgánica, y esos electrones deben ser transferidos a un aceptor, siendo el O2 atmosférico el principal aceptor de electrones en suelos aeróbicos, bien drenados. El potencial redox ( EH) provee una medida del estado de aireación del suelo. Es una medida de la disponibilidad de electrones como resultado de una transferencia de los mismos entre un compuesto oxidado y uno reducido. Los valores de EH permiten predecir cuál será el producto más probable de una reacción biológica. Por ejemplo, el N 2O puede producirse de la nitrificación bajo condiciones aeróbicas y de la desnitrificación bajo condiciones moderadamente reductoras, donde la intensidad de la reducción no es lo suficientemente fuerte como para que el nitrato se reduzca completamente a N 2. A cada reacción de oxidación (remoción de uno o más electrones) corresponde una reacción de reducción (aceptación de electrones). Las sustancias involucradas o los pares de cada reacción redox pueden ser orgánicos o inorgánicos y varían en sus tendencias a transformarse en oxidadas o en reducidas. Los electrones se mueven a lo largo de una cadena de transportadores hacia aceptores como el O 2, que es el aceptor de electrones por excelencia. Sin embargo, otros aceptores pueden reducidos el organismo tienede el E sistema enzimático O 2 y el NO comoser aceptores de si electrones a valores a 400 mVapropiado. y mayores.ElCuando 3 sirven H de 350 2+ la concentración de ambos en la solución del suelo cae, a EH de 0 a 350 mV, el Mn y el Fe3+ sirven como aceptores de electrones, comenzando a 350 mV el Mn y a 250 mV el Fe, hasta aproximadamente 100 mV. La reducción del sulfato puede ocurrir a valores de EH tan altos como 350 a 100 mV. La producción de metano comienza cuando el EH alcanza valores de 100 mV. Las reducciones de Mn, Fe y SO42- ocurren en un rango más amplio de potenciales redox que las reducciones del O2 y NO3- y la producción de metano.
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De todas maneras los electrones de las sustancias reducidas son movidos a lo largo de la cadena de transporte respiratorio en una sucesión de pasos o reacciones intermediarias. Cuanto mayor sea la diferencia entre los potenciales de la sustancia donante y la aceptora, mayor será el potencial de producción de energía por los sistemas biológicos. En la tabla 1 se muestran las principales reacciones redox que ocurren en los suelos y los potenciales redox para esas transformaciones. Estas serán estimuladas o inhibidas de acuerdo con el potencial redox del suelo. Frecuentemente en el suelo ocurren dos o más reacciones redox simultáneamente, por lo tanto una medida del potencial redox reflejará una mezcla de potenciales. El monitoreo del potencial redox del suelo es una práctica común en campos de arroz. Estos campos constituyen un ambiente particular, el cual permite estudiar la relación entre el EH de los suelos y la emisión de gases con efecto invernadero, debido a las prácticas de riego y drenaje controladas que se realizan. Los campos de arroz inundados son una fuente importante de metano, durante el ciclo de inundación, y de N2O cuando son drenados. Las prácticas de manejo en producciones arroceras deben adecuarse para no producir cantidades importantes de esos dos gases. Existe una ventana de valores de EH en esos campos, entre 200 a -100 mV en la cual se verifica el potencial mínimo de contribución al calentamiento global de los arrozales. Tabla 1. Potenciales redox de algunos pares de oxido-reducción con importancia en los suelos (Paul, 2007) Forma oxidada Forma reducida EH aproximado (mV) O2
H2O
+600 a +400
Nitrógeno
NO3-
N2O, N2, NH4+
+250
Manganeso
Mn4+
Mn2+
+225
3+
2+
Oxígeno
Hierro
Fe
Azufre
SO42-
Fe
S2-
Carbono
CO2
CH4
+100 a -100 -100 a -200 < -200
Los pares redox están ordenados del oxidante más fuerte (potencial más positivo) al reductor más fuerte (potencial más negativo).
II.5 - La rizosfera Como ya se explicó, la rizosfera comprende la región de la interfase raíz-suelo. Es un ambiente extremadamente particular debido a los efectos que la raíz produce en el suelo adyacente. Debido a que las raíces son la principal fuente de energía, carbono y de otros nutrientes para los microorganismos, se dice que la región del suelo que rodea las raíces es un verdadero “oasis en el desierto” (Bertin et al. 2003). Las características químicas y biológicas de esa zona son muy
diferentes delno suelo. la de acidez en la(Bertin rizosfera puede ser hasta 10 veces mayor que al enresto el suelo sujetoPor a laejemplo, influencia las raíces 2003). et al. En la literatura se suelen distinguir tres regiones: el rizoplano, que comprende la superficie de la raíz; la endorrizosfera o interior de la raíz, y la rizosfera propiamente dicha. Este último término se usa para referirse a la zona de suelo próxima a la raíz y que se ve directamente afectada por ella. En general puede abarcar el suelo comprendido desde la superficie radical hasta aproximadamente 3 mm. Sin embargo, esto depende primordialmente de las características de la raíz y del ambiente creado por ella debido al aporte de fuentes carbonadas.
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En la práctica, una forma de separar el suelo rizosférico del no rizosférico es descalzar la planta y sacudir a mano el sistema radical. La fina capa de suelo que queda adherida a la raíz se define como rizosfera. Como ya se destacó, la rizosfera se caracteriza por la abundancia de compuestos orgánicos provenientes de los pelos radicales y las raíces primarias y secundarias en activo crecimiento. Estos compuestos son parte de diferentes sustancias: 1. Exudados: Son compuestos de bajo peso molecular, como aminoácidos, azúcares, ácidos orgánicos, o iones como HCO3- y H+. Estos compuestos difunden al suelo a través de la membrana celular de las células radicales en forma pasiva. 2. Secreciones: Están formadas por compuestos de alto y bajo peso molecular que resultan de procesos metabólicos específicos. Pueden ser enzimas de diferentes tipos, sustancias de acción antibiótica, nematicidas, fitohormonas, fitoalexinas, etc. A diferencia de los exudados, estos compuestos son liberados a la rizosfera por transporte activo. La secreción de sustancias específicas permite a la raíz tener un cierto control de la biota de la rizosfera, inhibiendo el desarrollo de organismos patógenos, y estimulando el desarrollo de organismos benéficos.
3. Mucílagos: Son polisacáridos secretados por la raíz o por los microorganismos que habitan la rizosfera. Pueden ser de varios tipos: a) Secretados por la caliptra: Sirven de lubricantes en la zona de crecimiento, donde la fricción entre el suelo y la raíz es máxima. Contienen restos de células muertas de la caliptra. En general, la vida media de estas células es de un día. b) Secretados por la epidermis: Las células epidérmicas componen la capa delgada ubicada por detrás de la caliptra. Estas secreciones contiene productos provenientes de hidrólisis de la pared celular. c) Lisados celulares. Todos estos materiales, mezclados con arcillas y colonizados por microorganismos constituyen el mucigel. Este tiene un rol relevante en el mantenimiento de la estructura del suelo pues su abundancia favorece la formación de los complejos entre la materia orgánica y las partículas minerales del suelo. Los mucílagos son polisacáridos muy hidratados, y poseen numerosos grupos carboxilos, con cargas negativas, uniéndose a las arcillas a través de cationes multivalentes (Ca 2+, Mg2+). La cantidad de compuestos carbonados secretados de esta manera por la raíz es muy abundante, pero es muy difícil de cuantificar, dado que se confunde rápidamente con el resto de los compuestos carbonados del suelo. Una forma de medirlo es suministrar a la planta 14CO2 para su fotosíntesis, y medir posteriormente la radioactividad en el suelo. Se estima que entre el 10-13% del C fijado por fotosíntesis pasa al suelo, incluyendo la respiración radical y bacteriana. Esto constituye aproximadamente un 2% de la materia orgánica del suelo. Además de secretar sustancias carbonadas, la raíz altera el suelo adyacente de diferentes maneras. respiración radical consume gran aparte del O 2 el suelo, un microclimaLadeactiva condiciones microaerofílicas. Debido la transpiración de laproduciendo planta, la raíz absorbe una gran cantidad de agua del suelo adyacente, por lo tanto en la rizosfera existe menor disponibilidad de agua que en el suelo libre. La absorción de nutrientes por la raíz también cambia la composición del suelo rizosférico con respecto al suelo libre. Asimismo, la excreción de H+ u OH- modifica el pH. Todo esto hace que, como ya se mencionó, la población microbiana de la rizosfera sea diferente a la del suelo libre.
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II.5.1 - Microbiología de la rizosfera Las interacciones planta-microorganismos que se verifican en la rizosfera pueden afectar de manera positiva el crecimiento vegetal a través de múltiples mecanismos. Entre ellos, la fijación de nitrógeno atmosférico, el aumento en la tolerancia a estrés biótico y abiótico, y los efectos directos o indirectos debidos a las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal. Las bacterias también producen biofilms que sirve de protección y actúan como controladores biológicos de potenciales patógenos, produciendo antibióticos. Además pueden degradar compuestos tóxicos producidos por plantas u otros microorganismos, los cuales de otro modo perjudicarían al crecimiento vegetal. Sin embargo, existen también microorganismos que pueden tener efectos perjudiciales sobre la salud y supervivencia de las plantas, tales como los patógenos o parásitos.
Raíz
Suelo
Células epiteliales y corticales lisadas e invadidas con microorganismos Pelo Radical Microorganismos con mucílagos vegetales y microbianos dispersos en el suelo
20 mm
Compuestos de bajo liberados de células vegetales intactas en peso formamolecular pasiva (Exudados) y activa (Secreciones) Células de la caliptra liberadas al medio OO O 000 0
Caliptra y ápice radical
Figura 3. Esquema del srcen de las distintas fuentes carbonadas (rizodeposición) encontradas en la rizosfera. Fuente: Maddonni et al., 2003.
La colonización de la raíz es el primer paso para una asociación benéfica o patogénica con los microorganismos. El “efecto rizosférico” descrit o por primera vez por Hiltner en 1907 (Sørensen 1997), asume que los microorganismos son atraídos por los nutrientes exudados por las raíces. Este autor observó que el número y la actividad de los microorganismos aumentan en la vecindad de las raíces de las plantas. Además de los compuestos carbonados, las raíces inician una comunicación con el entorno a través de señales químicas que son reconocidas por los microorganismos (fenómeno de quorum sensing). Si bien, la cantidad de bacterias cultivables sobre el rizoplano es muy elevada, solamente un 5 a 10% de la superficie de la raíz está cubierta por microorganismos. A medida que aumenta la
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distancia desde la superficie de la raíz, el número de microorganismos disminuye. La tabla 2 muestra datos de la rizosfera de lupino donde se destacan los principales grupos microbianos que podemos encontrar y su número en relación con la distancia desde la raíz. Las bacterias que habitan la rizosfera son de mayor tamaño que las del suelo libre y con un mayor contenido de carbohidratos de reserva. Estas bacterias son predominantemente Gram negativas, aunque también hay Gram positivas. Las colonias bacterianas están separadas unas de otras por sus propios polisacáridos extracelulares, o por capas de arcillas compactadas. La concentración de microorganismos en la rizosfera, así como su tipo, depende de numerosos factores. másdeimportante para la composición la rizosfera la especie vegetal de que se trate, que Es el tipo suelo. La tabla 3 muestra que elde efecto rizosférico es mucho mas marcado en especies nativas que en las cultivadas.
Tabla 2. Composición de la rizosfera de Lupinus sp. (Elliot et al., 1984)
Distancia desde la raíz (mm)
Número de microorganismos (103 g suelo seco-1) Bacterias Actinomicetes Hongos
0
159.000
46.700
355
0-3
49.000
15.500
176
3-6
38.000
11.400
170
9-12
37.400
11.800
130
15-18
34.170
10.100
117
>80
27.300
9.100
91
II.5.2 - Coeficiente rizosférico (R/S) Es el cociente entre el número de microorganismos en la rizosfera y el número de microorganismos en el suelo no rizosférico. Un R/S igual a 1 indica que la cantidad de microorganismos es igual en ambos ambientes. Si el R/S es mayor a 1, el número de microorganismos es mayor en la rizosfera que en el ambiente no rizosférico. Esta información aplicada a un grupo taxonómico o funcional en particular puede indicar la preferencia de éste grupo por el ambiente rizosférico. También se da el caso en el que el ambiente rizosférico resulta muy competitivo pese a sus condiciones ambientales propicias, por lo cual ciertos microorganismos puedena 1. presentar mayor crecimiento en el suelo no rizosférico, generando un coeficiente R/S inferior Tabla 3. Efecto de la e specie vegetal sobre la composición de la rizosfera (Elliot et al., 1984) ESPECIE
Nº colonias por gramo de suelo
R/S*
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Trifolium pratense vena sativa Linum usitatissimum Zea mays triplex babingtonii23,3 mmophila arenaria gropyron junceum
Rizosfera 3260 1090 1015 614 0,016 3,58 3,56
Suelo 34 84 185 184 1455 0,016 0,016
4 6 5 3 223 222
* Coeficiente rizosférico Las condiciones edáficas también influyen sobre la composición de la rizosfera, ya que la presencia de nutrientes es un determinante importante. Una deficiencia de Ca2+ o K+ desestabiliza las membranas de las células radicales, incrementando la exudación de azúcares y compuestos orgánicos y, en consecuencia, el número de microorganismos. Las condiciones de anaerobiosis y de exceso hídrico también alteran la capacidad de regular la permeabilidad de las membranas de las plantas, aumentando el flujo de sustancias carbonadas hacia la rizosfera. En general, esas condiciones favorecen el desarrollo de microorganismos patógenos para las plantas. La aplicación de fertilizantes nitrogenados tiene efectos poco predecibles sobre la exudación radical y su relación con la actividad y el crecimiento microbiano en la rizosfera. Se ha observado que el agregado de nitrógeno en plantas jóvenes de cebada aumentó la exudación radical y ello resultó en una mayor abundancia de bacterias en las raíces seminales, mientras que en cultivares de trigo no aumentó la producción de exudados pero sí se vio estimulado el crecimiento bacteriano debido, sobre todo, a una mayor utilización de los exudados existentes (Sørensen, 1997). Por otra parte, en suelos no fertilizados, la baja disponibilidad de nutrientes minerales (amonio, nitrato, fosfatos) puede limitar el uso que hagan los microorganismos de los compuestos carbonados liberados por las raíces. En esos casos las plantas pueden ejercer dos efectos contrapuestos sobre los microorganismos: la estimulación, debida a la liberación de sustratos orgánicos y la inhibición, debido a la utilización de los nutrientes minerales por las plantas. En este último caso, los nutrientes no podrán ser aprovechados para el crecimiento microbiano (Sørensen, 1997).
II.5.3 - Composición de la rizosfera En el pasado, el cultivo de los microorganismos del suelo en medios de laboratorio ha sido la base para los estudios de las poblaciones microbianas de la rizosfera. Sin embargo, por esta metodología, solamente se pone en evidencia menos de un 10% de la población bacteriana presente. La flora heterótrofa cultivable de la rizosfera está representada principalmente por bacterias Gram negativas de los géneros Pseudomonas y Achromobacter. Una menor proporción representan bacterias Gram positivas como Bacillus y Arthrobacter. También podemos encontrar microorganismos autótrofos, como las bacterias nitrificadoras, aunque éstas constituyen menos del 5% de los microorganismos del suelo. Otros habitantes de la rizosfera y endorizosfera son bacterias fijadoras de nitrógeno, como Rhizobium y Azospirillum. Además, podemos encontrar hongos micorríticos asociados a las
raíces. Los microorganismos que colonizan la rizosfera pueden provenir de la población que colonizaba la semilla y que sobrevivió al almacenaje y germinación de la misma y/o de la
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población presente en el suelo. En la tabla 4 se muestra la abundancia relativa de diferentes grupos de rizobacterias cultivadas a partir de las raíces de cebada y trigo. Varios estudios indican que la diversidad de especies de la población indígena del suelo determinará la composición de la microflora de la rizosfera. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que los grupos dominantes que cultivamos dependerán del medio de cultivo que usemos para hacer los aislamientos. También se observan variaciones estacionales, ya que la actividad de los microorganismos del suelo varía con la temperatura, el contenido de agua y de nutrientes.
Tabla 4. Abundancia relativa (porcentaje del recuento total) de diferentes grupos de rizobacterias en raíces de cebada ( Hordeum vulgare ) y trigo (Triticum aestivum )¹ (Sørensen, 1997) Cebada Trigo No tratada Esterilizada No tratada Esterilizada Pseudomonas 34 53 46 52 Enterobacterias 16 4 23 Otras Gram (-) 18 8 Coreniformes 61 13 50 16 Formadoras de esporas 5 2 ¹La población de las raíces no tratadas representa a las bacterias de la rizosfera y la de las raíces esterilizadas superficialmente a las de la endorrizosfera. Los datos se obtuvieron a partir de recuentos de UFC en placas con medio agarizado.
II.5.4 - Interacciones en la rizosfera Los microorganismos interactúan entre sí, con su entorno y con las plantas. Las interacciones entre las bacterias de la rizosfera y la planta pueden ser benéficas, dañinas o neutras para la planta. Las bacterias que producen beneficios a las plantas son de dos tipos: aquellas que son simbióticas, o aquellas que son de vida libre, aunque vivan sobre, o a veces dentro de la raíz. A las bacterias benéficas de vida libre se las conoce comúnmente como bacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGPR, de su sigla en inglés “Plant Growth Promoting Rhizobacteria”). Especies de varios géneros han sido incluídos en esta categoría, tales como Azotobacter, Azospirillum, Acetobacter, Bacillus, Burkholderia, Pseudomonas y también
rizobios, pero solamente cuando actúan sobre plantas diferentes a su simbionte específico. Las PGPR pueden afectar el crecimiento de dos maneras, directa o indirectamente. Uno de los mecanismos directos es el suministro de nutrientes a las plantas, como el nitrógeno fijado por Azospirillum (Cassan y García de Salamone, 2008) o hierro, por bacterias productoras de sideróforos (Pseudomonas). Este último mecanismo también involucra el secuestro del hierro del medio, evitando su consumo por parte de los patógenos (mecanismo indirecto). Otra manera, es estimular la absorción de nutrientes por la planta, por ejemplo, la secreción de ácidos por parte de las bacterias permite la solubilización de los fosfatos del suelo, haciéndolos disponible. Otra manera directa es secretando las hormonas reguladoras de crecimiento (auxinas, giberelinas y citoquininas) estimulando así el incremento de biomasa radical de la planta. Este mecanismo permite una mejor absorción de nutrientes y del agua del suelo.
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Entre los mecanismos indirectos de promoción de crecimiento el más efectivo es la liberación de sustancias antibióticas por parte de los PGPR, lo cual evita la proliferación de fitopatógenos. Un buen ejemplo es Bacillus amyloliquefaciens, una bacteria capaz de controlar un amplio espectro de patógenos secretando sustancias antifúngicas, como iturina y surfactina (Souto et al., 2004).
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III - EL AGUA COMO AMBIENTE PARA LOS MICROORGANISMOS III.1 - Introducción Un poco más del 70% de nuestro planeta está cubierto por agua. De su volumen total una enorme proporción forma parte de los océanos y sólo menos del 3% corresponde a aguas dulces, de mayor calidad y aptitud para el uso y consumo humano. El agua, además de ser fundamental en el funcionamiento vital de los organismos, posee propiedades químicas y físicas únicas: estado líquido en un amplio rango de temperaturas, alta capacidad calorífica, capacidad de humectación y alta tensión superficial. Estas propiedades le otorgan un rol esencial en procesos como regulación térmica, acción capilar, disolución y transporte de partículas, entre otros. Además, el agua actúa como hábitat para una gran diversidad de especies y, de hecho, es probable que haya sido el lugar de srcen de las primeras formas de vida. Así como el hábitat terrestre se divide en biomas, que a su vez están compuestos por distintos ecosistemas, los ambientes acuáticos se agrupan según su contenido de sales disueltas en dos grandes zonas de vida acuática: zonas de agua dulce y de agua salada o marinas. La salinidad del agua es el determinante principal del tipo de organismos presentes y, dentro de cada zona, es de fundamental importancia el movimiento del agua y la profundidad en la columna, la cual determina en última instancia otras características del ambiente, tales como la temperatura, el contenido de oxígeno disuelto, la cantidad y calidad de luz y la disponibilidad de nutrientes. Por estas características diferenciales surgen, dentro de cada zona, los ecosistemas acuáticos, los cuales poseen un funcionamiento análogo al de los terrestres, con productores primarios al inicio de la cadena trófica y diversos heterótrofos que conforman los sucesivos eslabones. Los microorganismos son componentes clave de las cadenas tróficas acuáticas.
III.2 – Microorganismos acuáticos En los cuerpos de agua habitan diversos microorganismos principalmente del grupo de las bacterias y algas, pero también protozoos, virus y hongos microscópicos. En un ambiente acuático pueden encontrarse microorganismos indígenas, característicos del cuerpo de agua; u otros provenientes del aire, suelo o efluentes, que habitan el agua en forma transitoria o intermitente. Como ya se mencionó y tal como ocurre en los hábitats terrestres, en los ambientes acuáticos los microorganismos son componentes clave. Por un lado, son los principales productores primarios; es decir, en la mayoría de los casos son los organismos fototróficos predominantes. En las zonas oxigenadas estos microorganismos fototróficos están representados principalmente por cianobacterias y algas, mientras que en las zonas anóxicas dominan las bacterias fototróficas anoxigénicas. Por otro lado, los microorganismos son los consumidores más importantes, lo cual los convierte, al igual que en el ecosistema edáfico, en la base de las cadenas tróficas acuáticas, actuando como recicladores de la materia orgánica y, en consecuencia, liberando nutrientes para la utilización por parte de otros organismos. En cuanto a los hongos, éstos raramente son planctónicos aunque sí pueden actuar como parásitos de algunas algas planctónicas, ejerciendo un control sobre su crecimiento y, por ende, regulando el nivel de turbidez que restringe la penetración de la luz. Algunos hongos poseen un estilo de vida simple, colonizando superficies y muchas veces formando céspedes fúngicos; otros, como Zoophagus insidians, habitan algas verdes filamentosas a la vez que ramifican y extienden sus hifas en la columna de agua con el objetivo de alimentarse de rotíferos 2. Los 2
Las hifas de este hongo, de gran longitud, detectan el tacto de las cilias de los rotíferos y responden secretando una sustancia que les permite adherirse a ellos. Luego, la hifa crece rápidamente dentro de la boca del rotífero formando un micelio que absorbe el contenido de su cuerpo.
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virus, por su parte, pueden ser muy abundantes en aguas dulces, pudiendo utilizar como hospedantes a bacterias, cianobacterias y microalgas. Tanto la dinámica poblacional como la composición del plancton están sometidos a la influencia de los virus (20-50% de la mortalidad del bacterioplancton se debe a lisis inducida por virus). La densidad de la población viral tiende a fluctuar con la población de sus hospedantes, y su abundancia puede exceder la del bacterioplancton. Los virus que afectan al bacterioplancton varían en su especificidad. Los protozoos también son importantes predadores de microorganismos acuáticos, principalmente de bacterias y algas. En consecuencia, su densidad poblacional responde a los cambios en abundancia de esos dos grupos microbianos. El número de protozoos es varias veces menor al de bacterias pero, dado que cada protozoo consume de algas y bacterias día,tanto son capaces de afectar su densidad poblacional. Por locientos antedicho, puede asumirseporque protozoos como virus son importantes en la regulación de la densidad de algas y bacterias, favoreciendo un balance poblacional en los ecosistemas de agua dulce.
III.3 – Distribución de los microorganismos en el agua Los microorganismos acuáticos se presentan comúnmente en suspensión, en sedimentos o formando films o capas, siendo mayor su densidad en las capas superiores y los sedimentos del fondo. Ocupan diferentes hábitats que se detallarán a continuación: perifiton, bentos, neuston y plancton. Los organismos del perifiton (del gr. peri: alrededor de, y fytón: vegetal) o aufwuchs (del alemán: crecimiento en superficie o sobrecrecimiento) crecen arraigados a rocas, vegetación y detritus sumergido. Los microorganismos se presentan generalmente en biofilms 3 mixtos de algas, bacterias y hongos, aunque sus representantes más comunes son diatomeas pinnadas, algas verde-azuladas y algas verdes filamentosas. Con excepción de las algas verdes filamentosas, el perifiton puede desplazarse activamente por el sustrato, ya sea por reptación o por deslizamiento. de vidacomo está el sujeto a la vida el cual viven, pudiendo entonces Su ser ciclo estacional, perifiton que del viveelemento sobre lassobre plantas, de rápido crecimiento y poco adherido (principalmente diatomeas y otras algas), o estable, en caso de habitar un sustrato como piedras o restos de madera. Conviven con protozoos y varios animales pequeños, algunos de los cuales, como caracoles y larvas de insectos, regulan su producción de biomasa mediante la predación. En el bentos (del gr. vénthos: fondo del mar) los organismos habitan el fondo del cuerpo de agua, ya sea superficialmente (epibentos) o penetrando en su interior (infauna). Esta zona de transición entre la columna de agua y la zona sub-superficial está constituida por una masa no consolidada de agua, materia orgánica y minerales particulados, resultado de la deposición de sedimentos. La alta concentración de nutrientes y materia orgánica en una alta población Figura 4. Algunas diatomeas bentónicas actividad deriva microbiana heterotrófica, siemprey Foto: Yoichi Kogure. que otras condiciones (principalmente temperatura y presión) lo permitan. Esto, sumado al eventual efecto de la profundidad, lleva a que generalmente existan limitantes de 3
Biofilm: asociación superficial de microorganismos fuertemente aferrados gracias a que producen una matriz extracelular de polímeros. En la mayoría de los casos los biofilms se forman en un entorno acuático o húmedo.
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oxígeno y se alternen ambientes aeróbicos y anaeróbicos, sosteniendo una importante diversidad metabólica. En el bentos predominan las diatomeas (figura 4), e invertebrados filtradores como esponjas y bivalvos. También se encuentran presentes algunas cianofitas y algunas algas verdes como las del orden Chroococcales. Al igual que en el perifiton, en el neuston conviven seres tanto macro- como microscópicos, estos últimos son principalmente algas unicelulares, bacterias y protozoos. Estos organismos habitan la superficie de cuerpos de agua dulce o salada, moviéndose o manteniéndose a flote sobre ella (epineuston) o inmediatamente por debajo (hiponeuston). Así, forman una capa en los primeros milímetros de la columna de agua (figura 5), conformando un hábitat Figura 5. Representación esquemática del neuston. muy variable que incluso ha sido Fuente: Sandrin et al., 2009 calificado como un ambiente extremo. Esto se debe a que la interfaz entre el agua y el aire está sujeta constantemente a fuerzas físicas ( e.g., microturbulencias4) que modifican su estabilidad y las reacciones químicas que allí ocurren. El neuston absorbe una importante fracción de la luz incidente, incluyendo gran parte del espectro visible activo y UV, con efectos directos sobre la temperatura y la actividad metabólica de sus habitantes. acuáticas ason asidero deproblemáticas, muchos contaminantes de alta srcendensidad terrestre yde atmosféricoLas quesuperficies podrían conducir situaciones como una neuston que altere el intercambio gaseoso del cuerpo de agua con la atmósfera, afectando su concentración de oxígeno. También puede encontrarse una importante presencia de microorganismos en el plancton (del griego planktón: lo que va errante) de aguas dulces y marinas. Se trata de organismos que se encuentran a la deriva, mantenidos en suspensión por la corriente del agua, flotando o nadando débilmente. Los microorganismos forman parte de lo que se conoce como fitoplancton, es decir, algas (eucariotas, figuras 6 y 7) y cianobacterias (procariotas) fotoautotróficas, y también del bacterioplancton, compuesto por bacterias heterotróficas. En el zooplancton pueden encontrarse protozoos y pequeños animales que quedan fuera del foco de este capítulo. En términos generales se dice que los organismos zooplanctívoros “pastorean” el fitoplancton pero
en realidad existe un complejo entramado dentro de la comunidad planctónica, donde el tamaño de los organismos resulta determinante.
4
Los propios organismos del neuston pueden alterar el hábitat, por ejemplo creando microturbulencias que enfrían el agua.
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a
b
Figura 6. Ejemplares de fitoplancton (a) Scenedesmus, un alga verde colonial; (b) Cryptomonas, una Cryptophyta unicelular Fuente: Moss, 1998.
El fitoplancton ha sido ampliamente estudiado por su importancia en el estado nutricional de muchos cuerpos de agua. En climas tropicales se desarrolla de un modo continuo, mientras que en regiones templadas crece en blooms o pulsos de crecimiento, que responden a las épocas de mayor temperatura e incidencia lumínica. Los miembros del fitoplancton cuentan con variadas estrategias que permiten su supervivencia ante condiciones desfavorables (formas de reposo, capacidad de nadar o de cambiar su densidad) o ante la acción predatoria del zooplancton (producción de toxinas, cubiertas gelatinosas, formación de colonias de gran tamaño, alta tasa de crecimiento). En aguas oligotróficas (escasa concentración de nutrientes) de lagos o del océano abierto, las algas muy pequeñas o picoplancton suelen ser dominantes.
Contenido de sales. La salinidad está dada por la presencia de elementos conservativos 5, principalmente sodio y cloro, que constituyen el 86% de la sal marina. El cloro es el elemento más abundante y, por ende, es el que se utiliza como indicador de la salinidad oceánica. Procesos físicos como evaporación y precipitaciones, formación de precipitados no solubles, y movimientos y mezcla de las masas de agua, afectan la salinidad del agua. En el mar abierto el contenido es mayor o igual al 24,7% y relativamente constante.
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Elementos conservativos son aquellos poco o no involucrados en procesos biológicos, siendo entonces los más afectados por procesos físicos. Los no conservativos, como el nitrógeno y el fósforo, están asociados a procesos biológicos y por eso son más variables en el mar.
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(c) (e) (i) (a) (g) (d) (j) (h)
(k)
(f) (l) (b)
Figura 7. Otras algas típicas del fitoplancton . Cianofíceas (Cyanophycota): (a) Oscilatoria, (b) Microcystis; Algas doradas (Chrysophyceae): (c) Dinobryon; Algas verdes (Chlorophycota): (d) Pediastrum, (e) Staurastrum, (f) Chlamidomonas; Diatomeas (Bacillariophyceae): (g) Cyclotella, (h) Asterionella; Euglenoides (Euglenophycota): (i) Phacus; Criptomonas (Cryptophyceae): (j) Rhodomonas; Dinoflagelados (Dinophyceae): (k) Ceratium; Haptophyceae: (l) Prymesium. [Nota: Microcystis (b) es un alga de gran tamaño, cuya colonia no cabe en los límites del diagrama.]. Fuente: Moss, 1998.
Tensión de oxígeno. Este gas, a pesar de ser abundante en la atmósfera, posee una solubilidad en agua limitada. El ingreso de oxígeno al sistema se da por el intercambio con la atmósfera, pero cuando se trata de grandes masas de agua la transferencia es muy baja en términos relativos. Otra vía de ingreso es mediante la producción fotosintética pero ésta se limita a las zonas superficiales, bien iluminadas. Por todo esto, el contenido de oxígeno disuelto está determinado principalmente el movimiento deldeagua (remolinos y agitación) acelera en el ingreso de este gas desde la por atmósfera. Las aguas ambientes lóticos, entonces,que presentan general un mayor contenido de oxígeno. En aguas quietas, por el contrario, las profundidades pueden llegar a volverse anóxicas y, en ese caso, la actividad biológica estará restringida a bacterias anaeróbicas y algunos animales microaerofílicos. En esta situación el metabolismo pasa de ser respiratorio a ser fermentativo, repercutiendo en el ciclo del carbono y otros nutrientes y generándose compuestos odoríferos ( e.g., aminas, H2S, mercaptanos y ácidos grasos), algunos de los cuales pueden resultar tóxicos para los organismos superiores.
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Temperatura. En general varía diaria- y estacionalmente, y depende del tamaño del cuerpo de agua y de la exposición al sol. Dentro del cuerpo de agua, la temperatura también es condicionada por la profundidad. Cuando se trata de ambientes lénticos las variaciones térmicas, tanto estacionales como en profundidad, son más acentuadas que en las aguas corrientes. Luz. Principal factor determinante de la productividad primaria del ecosistema acuático, la luz es muy variable en profundidad, siendo menor la cantidad y mayores las longitudes de onda a medida que se desciende en la columna de agua. Esto, a su vez, condiciona el tipo de organismos que habita cada sector. Por ejemplo, muchos microorganismos fotosintéticos acuáticos difieren en su espectro de absorción de la luz; hay bacterias, como Chlorobium y Rhodobacterium, capaces de absorber en la zona del infrarrojo, lo cual les permite vivir por debajo de la capa donde habitan las algas, dado que éstas no absorben esa región del espectro. pH. Se relaciona con el contenido de carbonatos, bicarbonatos y sales, y, por ende, con la cantidad de vida acuática ( i.e.: mayor pH -> mayor contenido de carbonatos -> mayor vida acuática). Profundidad. La profundidad es determinante de muchas otras características ambientales (e.g., cantidad y calidad de luz, temperatura, presión, entre otros) que determinan el tipo de organismo que puede habitar cada región de la columna de agua. La figura 8 muestra el efecto de la profundidad en la distribución de los microorganismos del agua.
Figura 8. Ejemplos de distribución de microorganismos en profundidad según metabolismo (a) y grupo taxonómico (b). Fuentes: a) Mardigan et al., 1998, y b) Rheinheimer, 1991. Además, los océanos poseen gran influencia de otros factores: Presión. El espectro de valores en los océanos es muy amplio, yendo desde 1 atm en la superficie hasta valores de 1.000 atm en las grandes profundidades. La biota se adapta a los
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distintos niveles de presión y, por ende, hay organismos que sólo se limitan a vivir a determinada profundidad. Olas y corrientes. Los océanos presentan oleaje interno y superficial, a la vez que existen corrientes internas y superficiales. El proceso de afloramiento puede generar zonas altamente productivas, dado que la alta carga de nutrientes de sus aguas, pese a ser frías, estimula el crecimiento del fitoplancton, atrayendo a su vez poblaciones de peces y aves. Mareas. La atracción gravitatoria del Sol y la Luna provoca ondas de gran longitud en los océanos, responsables de las mareas, es decir, del ascenso y descenso de las aguas del mar. Cada uno de estos astros es responsable de dos ondas.
Figura 9. Cadena trófica del plancton y microbial l oop . Fuente: Sandrine et al., 2000
Estas características condicionan la productividad primaria del ambiente acuático, la cual influirá asimismo en launproductividad total.como Comoproductores se mencionóprimarios anteriormente, los microorganismos juegan rol primordial y como consumidores. En términos generales, el fitoplancton se encarga del ingreso de energía al sistema, éste es luego consumido por el zooplancton, el cual puede ser consumido a su vez por otros organismos heterótrofos. Este esquema de cadena es conocido bajo el nombre de grazing food chain y simplifica las transferencias de carbono y energía entre niveles tróficos del ecosistema acuático.
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En realidad las interacciones son mucho más complejas; más de la mitad del carbono fijado en la fotosíntesis es liberado en la columna de agua como materia orgánica disuelta, la cual es rápidamente utilizada por bacterias heterotróficas del bacterioplancton, que incorporan parte de ese carbono y liberan otra parte como CO2 (figura 9). Este camino detrítico intermedio es llamado microbial loop y su producción de biomasa bacteriana se conoce como producción secundaria, constituyendo una de las principales vías de utilización del carbono proveniente de la producción primaria. También puede existir un estadio protozoario intermedio entre el pastoreo del fitoplancton y la alimentación del zooplancton. Los distintos niveles de la cadena trófica interactúan modificándose el uno al otro: cada cambio en la biomasa de un nivel tiene el efecto contrario en el siguiente. Por ejemplo, el zooplancton se alimenta del fitoplancton y en esta herbivoría existe una relación de tamaños, con lo cual el tamaño del zooplancton dominante afectará la estructura del fitoplancton.Todas las interacciones entre los distintos grupos de alimentación alterarán la productividad de cada nivel trófico pero en conjunto determinarán la productividad del ecosistema lacustre. La producción de toda la red será máxima a niveles medios de densidad en cada nivel trófico. De acuerdo a su productividad, los ambientes acuáticos se clasifican en diferentes estados tróficos. Existen ambientes oligotróficos, con un bajo contenido de nutrientes y una consecuente baja productividad primaria, en general de gran profundidad y aguas cristalinas. Los cuerpos eutróficos presentan una gran cantidad de nutrientes disponibles (principalmente nitratos y fosfatos) y por ende una alta productividad primaria neta. Estos últimos suelen ser de menor profundidad y se caracterizan por sus aguas más turbias de color verde o marrón, resultado principalmente del crecimiento de plancton microscópico. Los cuerpos de agua mesotróficos, como su nombre lo congénito: dice, poseen características tróficas intermedias. El estado trófico no es necesariamente un cuerpo oligotrófico puede acumular sedimentos y restos de productores primarios en su lecho, cuya descomposición puede derivar progresivamente en una eutrofización. Este proceso puede ocurrir naturalmente o merced algún tipo de inducción antrópica (ver Eutrofización). III.5 – Ambientes acuáticos III.5.1 – Ambientes de agua dulce: hábitats lóticos Los ambientes lóticos son cursos de agua (arroyos y ríos) que pueden surgir como descargas de estanques o lagos –como ser escurrimientos de las aguas de deshielo –, drenaje de áreas montañosas o manantiales. Se caracterizan por sus aguas en movimiento, que mantienen la concentración de O2 en niveles altos, cercanos a la saturación. Esta particularidad, sin embargo, no se mantiene constante en un mismo curso: el oxígeno disuelto disminuye en zonas profundas, donde la de mezcla consumo O2. es menor, y también en zonas contaminadas, ya que éstas presentan un alto Entre sus habitantes dominan los organismos bentónicos y perifitónicos, presentes en forma de sedimentos y biofilms, que están más adaptados a las veloces corrientes de agua veloces y poseen requerimientos de luz vinculados a aguas poco profundas. La presencia de algas en suspensión (fitoplancton) se encuentra sujeta a un equilibrio dinámico dado por la profundidad y la tasa de movimiento de agua, que determinarán la posibilidad de su establecimiento espacial. Por lo tanto, a medida que el curso de agua se hace más lento y/o profundo aumenta la
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proporción de plancton sobre la de bentos, pudiendo incluso superarlo como ocurre en aguas quietas.
III.5.2 – Ambientes de agua dulce: hábitats lénticos Los ambientes acuáticos lénticos son depresiones del terreno, naturales o artificiales, que se rellenan con agua dulce estancada proveniente de precipitación, escorrentía o filtración. Están típicamente dominados por algas planctónicas, que pueden establecerse debido a que las corrientes lentas no las arrastran y expulsan del sistema. Por esta razón, los lagos y lagunas en general contienen abundantes productores primarios, que interactúan dinámicamente con productores secundarios. La zonificación de estos ambientes (figura 10) es determinante en la distribución de los organismos. El lecho constituye la zona bentónica; luego, según la distancia a la orilla se distinguen la zona litoral o costera y la limnética; y, finalmente, esta última se subdivide verticalmente en las zonas fótica y afótica. Como su nombre lo dice, la zona fótica es la que absorbe casi la totalidad de la luz que penetra al cuerpo de agua. En la zona litoral la productividad primaria es alta como resultado de la actividad de algas del fitoplancton, algas epífitas, y cianobacterias. El hábitat limnético también está dominado por el fitoplancton, que forma un gradiente de comunidades en profundidad a medida que varía la longitud de onda y cantidad de luz penetrada. Esa variación en profundidad también se da con otros organismos como las bacterias: las poblaciones fotosintéticas (ciano- y clorobacteria) se concentran en la zona superior. En un lago eutrófico, donde la luz penetra hasta menores
Figura 10. Esquema de las zonas de un lago. Adaptado de kentsimmons.uwinnipeg.ca. profundidades, esta concentración es más acentuada. A su vez, al existir mayor disponibilidad de nutrientes, tanto la población de fotosintéticos como de heterótrofos es mayor en el lago eutrófico. La composición de microorganismos en un lago o laguna no sólo varía espacialmente, en sus distintas zonas y profundidades, sino que existe una variación estacional, la cual es mucho más marcada en climas templados. En estos casos, el crecimiento algal responderá a pulsos o blooms. Por lo tanto, en primavera suele ocurrir que se agotan nutrientes limitantes como nitrógeno (N) y fósforo (P) como consecuencia de las altas tasas de crecimiento del fitoplancton, y por el hundimiento de esa biomasa al morir, la precipitación química y la
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sedimentación. Pese a que la actividad descomponedora puede aportar P y N disuelto, parte de ese N se pierde por desnitrificación. Hacia el verano, la menor producción del fitoplancton y su menor tasa de sedimentación hacen que aumente la disponibilidad de nutrientes.
III.5.3 – Ambientes de agua salada A diferencia de los ambientes de agua dulce, el medio marino es amplio y muy profundo, haciendo que la fracción del volumen total iluminada por el sol sea muy pequeña. Este factor, sumado a la escasa concentración de nutrientes principalmente no conservativos, limita la productividad primaria de estos sistemas. En los océanos, como en los lagos y lagunas, la zonificación es determinante en la distribución de los microorganismos (figura 11). La región pelágica, correspondiente a la columna de agua en sí, se divide horizontalmente en dos partes: la nerítica, correspondiente a las aguas sobre la plataforma continental, y la oceánica. También se divide verticalmente, dando lugar a una zona fótica en la superficie y una zona afótica, que se subdivide en meso- y batipelágica, esta última de mayor oscuridad y presión, y menor temperatura. Finalmente, la zona abisal se refiere a las fosas marinas, a partir de los 6.000 metros de profundidad. En las costas, por la mayor proporción de luz interceptada y la mayor concentración de nutrientes, provenientes de la tierra y de las corrientes marinas permiten la existencia de ecosistemas altamente productivos en relación con el mar abierto, albergando el 90% de las especies marinas a pesar de ocupar sólo el 10% de la superficie oceánica. Arrecifes de coral, estuarios, marismas y manglares, son ejemplos de ecosistemas marinos costeros. En el mar abierto la productividad primaria se encuentra limitada por la entrada de nutrientes y, en las zonas más profundas, por la escasa luz penetrada. La concentración microbiana en esta región es relativamente muy alta en la fina capa del neuston y disminuye acentuadamente por debajo de ésta. Las especies fitoplanctónicas se limitarán a poblar aguas superficiales pero su abundancia y composición variará temporal y espacialmente de acuerdo a otros factores, como temperatura, concentración de nutrientes y herbivoría por parte del zooplancton. El picoplancton, que incluye a las cianobacterias o algas azules, constituye la mayor proporción de biomasa fitoplanctónica en aguas templadas y tropicales. Los dinoflagelados son abundantes en zonas de circulación descendente y adquieren su mayor abundancia en aguas cálidas, pudiendo concentrarse en la superficie y dando lugar a las mareas rojas (ver más adelante). Las diatomeas son dominantes en zonas de afloramiento y relativamente abundantes en zonas árticas, dado que su cápsula de sílice las protege. Donde la circulación de agua, ya sea vertical u horizontal, es rápida, prosperarán las especies que puedan adaptarse al ambiente cambiante, con arreglo a las condiciones locales. El fondo de los océanos también está habitado por algas, las cuales, junto con plantas y animales, conforman el bentos. Asimismo, los sedimentos albergan bacterias de gran importancia en la cadena alimentaria bentónica, ya que utilizan los nutrientes disueltos y se convierten en una fuente de proteínas y lípidos para los sedimentívoros. Bacterias y protistas constituyen la mitad de la biomasa marítima y algunos de ellos son iniciadores de una parte de la cadena alimentaria en reemplazo del fitoplancton, siendo también responsables de gran parte del flujo de energía en sistemas pelágicos.
III.6 – Alteración de los ambientes acuáticos El agua no se encuentra en estado puro en la naturaleza, sino que contiene otras sustancias orgánicas e inorgánicas en solución y suspensión. En muchos casos son depositados de forma natural pero muchos otros tienen un srcen antrópico (xenobióticos) y/o ingresan al sistema acuático por acción del hombre. En este último caso, el impacto que el agente que ingresa pueda
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tener sobre el funcionamiento del sistema dependerá tanto de sus características y abundancia, como de la capacidad de éste para procesarla. Sus efectos pueden ser, o bien efectos tóxicos directos, o bien efectos indirectos mediante interrupciones en la red trófica ( e.g.: si el fitoplancton ve afectado su crecimiento, el microzooplancton filtrador no podrá desarrollarse ni crecer normalmente). Otro fenómeno de importancia no menor lo constituye la acumulación de esa sustancia a lo largo de la cadena trófica por el proceso de biomagnificación 6. Además de los problemas asociados al ingreso de sustancias, son comunes los casos de ingreso de agentes patógenos, exceso de nutrientes, calor excesivo, isótopos radiactivos solubles e introducción de especies alóctonas.
Zona meso elá ic
Zona bati elá ica
Figura 11. Zonificación de los océ anos. Adaptado de k entsimmons.uwinnipeg.ca.
III.6.1 - Eutrofización El término proviene del griego eu (bien) y trophein (alimentar), y se refiere al fenómeno natural o antrópico de enriquecimiento en nutrientes que ocurre en algunos cuerpos de agua. La primera respuesta al enriquecimiento nutricional es un aumento de la productividad primaria y, cuando ese aumento es exacerbado, derivan de él numerosos efectos, relacionados tanto con el funcionamiento del ecosistema acuático como con la explotación de sus recursos y servicios. El impacto es, entonces, ambiental en un sentido amplio, abarcando desde lo ecológico hasta lo económico y lo social (tabla 5). Sea cual sea el cuerpo de agua altamente en cuestión,limitantes un aumento concentración (P) y/o nitrógeno (N), dos nutrientes paraenellacrecimiento de de la fósforo flora acuática, acarrea una serie de eventos que, en última instancia, modifican el ecosistema. A saber: 1.
6
Aumenta el crecimiento de algas: el P excedente es destinado a reservas y reproducción.
Biomagnificación: traspaso de un contaminante entre niveles tróficos, con tendencia a aumentar su concentración a medida que asciende de nivel.
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2.
De crearse una limitante en el contenido de N, aumenta la población de cianofíceas,
fijadoras de N (ver “ Blooms de cianofíceas”).
3. El exceso de nutrientes, en primera instancia, promueve la producción secundaria, aumentando la actividad respiratoria. 4. A su vez, cuando la gran masa de algas producidas muere y cae al fondo, es descompuesta por bacterias aeróbicas, que también aumentan la respiración total. 5. Los dos ítems anteriores llevan a una limitante en el contenido de O 2 que perjudica y puede llegar incluso a matar peces y otros organismos acuáticos aeróbicos. El input por parte de la fotosíntesis – que disminuye por la mayor turbidez del agua- y el intercambio gaseoso 7
con la atmósfera ya no son suficientes para reponer el oxígeno consumido . 6. Si el flujo de nutrientes hacia el agua continúa, las bacterias anaeróbicas toman el relevo y producen compuestos gaseosos de descomposición, como el sulfuro de hidrógeno, muy tóxico y maloliente, y el metano, inflamable. Este enriquecimiento nutricional puede srcinarse por diversas causas. En condiciones naturales pueden acontecer enriquecimientos estacionales, asociados a altas temperaturas estivales o sequías. Fuera de esta singularidad, la eutrofización natural se debe principalmente a la escorrentía, a la ocurrencia de procesos erosivos que arrastran partículas del suelo, y eventualmente a un aporte atmosférico. Sin embargo, las actividades humanas, principalmente agrícolas e industriales, en muchos casos aceleran este proceso dando lugar a la eutrofización cultural o antrópica. En el área agrícola los mayores perjuicios se srcinan por escorrentía de fertilizantes y desechos animales, y por una aceleración de la erosión debida a prácticas de manejo que no protegen el horizonte superficial. Muchas de las estrategias para combatir la eutrofización se centran en la dinámica del fósforo, el principal nutriente limitante, aunque también hay otras tantas basadas en el balance de N del sistema. La reducción de la densidad de algas ha sido un factor común entre los esfuerzos por recuperar aguas eutrofizadas (Smith et al., 1999). La eutrofización es un fenómeno que suele vincularse exclusivamente a los ambientes lénticos, pese a que puede ocurrir también en aguas corriente e incluso en ambientes salinos. Lo que las hace frecuentes en los primeros es que son cuerpos con poco flujo de agua, lo cual dificulta la oxigenación y la dilución de sustancias. El recambio de agua se demora entre uno y cien años, frente a los pocos días o semanas que puede durar en los cursos de agua. Esta característica hace que estos ambientes sean más sensibles al ingreso de sustancias extrañas y, por ende, a procesos de contaminación por sustancias tóxicas, ácidos provenientes de escorrentía o lluvia ácida y exceso de nutrientes. Durante mucho tiempo se creyó que los ambientes lóticos no eran sensibles a aumentos en la concentración de nutrientes. El efecto de las corrientes, los sólidos orgánicos en suspensión, el sombreado por la vegetación lindante y la herbivoría, según el caso, podrían actuar como limitantes de la productividad primaria y permitirían una rápida recuperación (mediante dilución y descomposición bacteriana) ante un inusitado ingreso de nutrientes o residuos degradables. De hecho, la producción algas porSin unidad de P cuando total es elfrecuentemente menor eno ambientes lóticos que en lagos odeestanques. embargo, sistema se sobrecarga cuando la velocidad del curso se reduce (por sequías, presas o desvío para su utilización agropecuaria o 7
La concentración de O2 en el agua es de por sí baja (alrededor del 5%), ya que es un componente de baja presión parcial en la atmósfera y, a su vez, posee baja solubilidad en agua. La mayor solubilidad del CO 2 hace que éste sea más abundante en ambientes acuáticos. Factores como temperatura, aireación, actividad biológica (fotosíntesis neta), presencia de otros gases y posibles eventos de oxidación química, modifican la concentración de estos gases.
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industrial) este mecanismo de depuración deja de ser funcional. Lo mismo ocurrirá si se introducen contaminantes poco o nada degradables. La eutrofización de aguas saladas por mucho tiempo se ha considerado un fenómeno poco probable debido a la alta capacidad de las aguas marinas para diluir, dispersar y degradar contaminantes, en parte gracias a los organismos que las habitan. No obstante, la vida de las profundidades oceánicas es todavía muy poco conocida por el hombre como para elaborar tales conjeturas. Por otro lado, es evidente que el ingreso de una elevada cantidad de sustancias foráneas tendrá un impacto sobre los organismos que habitan las aguas marinas y, por lo tanto sobre su funcionamiento. La concientización a este respecto aumentó con la creciente ocurrencia de blooms de fitoplancton tóxico en costas marinas, fenómeno de peligro potencial mayor dada la alta diversidad de especies tóxicas presente en aguas marinas. Otros fenómenos de eutrofización de aguas marinas registrados son los blooms de macroalgas en estuarios poco profundos, la aparición de zonas anóxicas con pérdidas comerciales de peces y mariscos. Por todo lo antedicho, los valores umbral para establecer el estado trófico son diferentes de acuerdo al cuerpo de agua en cuestión (tabla 6). Un indicador –y, por ende, herramienta de monitoreo- utilizado en lagos y ríos- es la concentración de oxígeno: mientras que las aguas oligotróficas se mantienen prácticamente saturadas, las eutróficas pueden ir desde una supersaturación en el epilimnion hasta una virtual anoxia en el hipolimnion (Boveri, 2005).
III.6.2 - Blooms de cianofíceas Los blooms o floraciones algales son eventos de multiplicación y acumulación de fitoplancton que se dan en una o unas pocas especies y que pueden tomar períodos de horas a días. La importancia del estudio de las floraciones de cianofíceas, y no de otro tipo de fitoplancton, surge en primer lugar porque muchas especies de este grupo producen toxinas (cianotoxinas) Tabla 5. Principales efectos de la eutrofización en los diferentes cuerpos de agua (adaptado de Smith et al., 1999).
Efectos Aumento en biomasa de: - Fitoplancton - Perifiton
Ambiente Léntico
Lótico
Marino
X
X
X
X
X
- Algas epifítas y zooplancton Variación en composición específica del fitoplancton, que puede volverse tóxico ( e.g. blooms de cianofíceas) Alteración en producción, biomasa y composición de: - Plantas vasculares
X X
X
X
X
- Macroalgas Mayor turbidez del agua Pérdida del valor estético/Restricción del uso recreativo pH elevado y disminución del O2 disuelto Mayor probabilidad de muerte de peces
X X X X
X X X X
X X X X X
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Mayor proporción de peces no deseables Mayor producción de peces y de cosecha Matas algales abundantes dificultan el desove de peces Perjuicios para el suministro de agua: sabor, olor, filtrado Posibles riesgos de salud asociados al consumo del agua Muerte y pérdida de comunidades de arrecifes de coral
X X
X X X
X X
X
perjudiciales para el hombre y para un gran número de macroalgas, invertebrados y peces. Éstas pueden desarrollarse tanto en aguas saladas como dulces, generando grandes perjuicios sobre el consumo y la comercialización de productos acuícolas. Microcystis, Anabaena, Nodularia, Cylindrospermopsis, Planktothrix y Aphanizomenon son géneros destacados por su gran distribución y toxicidad. Altas temperaturas y luminosidad, así como baja turbulencia, son factores naturales desencadenantes de estos blooms. El aumento en la cantidad de nutrientes también puede cumplir este rol en forma natural pero los crecientes eventos de eutrofización cultural han llevado a que la frecuencia y duración de las floraciones sea mayor. El “pastoreo” ex cesivo sobre otros grupos de algas también puede llegar a favorecer el desarrollo de cianobacterias, mediante la reducción de la competencia.
Tabla 6. Caracterización de lagos, cursos de agua y ambientes marinos de diferentes estados tróficos (adaptado de Smith et al., 1999). N total1
Translucidez2
Lagos
Oligotrófico
<350
<10
<3,5
>4
Mesotrófico
350-650
10-30
3,5-9
2-4
Eutrófico
Marinos
Clorofila a
1,3
Estado trófico
Cursos
P total
1
Hábitat
650-1200
30-100
9-25
1-2
Hipertrófico
>1200
>100
>25
<1
Oligotrófico
<700
<25
<20
Mesotrófico
700-1500
25-75
20-70
Eutrófico
>1500
>75
>70
Oligotrófico
<260
<10
<1
>6
Mesotrófico
260-350
10-30
1-3
3-6
Eutrófico
350-400
30-40
3-5
1,5-3
>400
>40
>5
<1,5
Hipertrófico
1 3 en mg m-3. 2 metros de profundidad alcanzados por el disco de Secchi. Para cursos de agua, contenido de clorofila “a” en el bentos.
Las cianotoxinas son metabolitos secundarios de las cianofíceas -bajo la forma química de péptidos, alcaloides o lipopolisacáridos- que varían en tipo y nivel de toxicidad, incluso dentro de la misma especie y dentro de la misma floración. Cada organismo puede generar una o más toxinas y los factores que desencadenan su síntesis no están claros, aunque la temperatura, la luz, la estabilidad de la columna de agua y el pH podrían llegar a estar involucrados. La intoxicación puede darse mediante varias vías: contacto directo, inhalación o ingestión de
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cianobacterias o de animales que hayan estado expuestos a éstas. Las toxinas pueden ser neurotoxinas, hepatotoxinas o dermotoxinas, y por ende, ocasionar distintos tipos de perjuicios. Lamentablemente, no existe tratamiento contra la intoxicación, por lo cual los controles preventivos deben estar bien planificados. La mala apariencia del agua favorece la distinción y rechazo del agua por parte del hombre, pero no ocurre lo mismo con los animales, los cuales terminan siendo las víctimas más frecuentes. La microcistina, sintetizada por el género microbiano del mismo nombre, es una hepatotoxina muy frecuente y de gran toxicidad, incluso mayor que la del cianuro. Un dato no menor es que su efecto no es necesariamente inmediato sino que puede ser acumulativo, acarreando malestares crónicos. En Argentina se encontró que las cianobacterias dominaban ambientes chaco-pampeanos, especialmente en ambientes someros (Quirós, 2004). El mismo autor enunciaba en 2004 que, a pesar de ser conocida la existencia de cianobacterias en varios cuerpos de agua dulce de Argentina, su distribución y abundancia no era del todo clara.
III.6.3 - Marea roja El fenómeno denominado “marea roja” es el resultado de los florecimientos masivos de ciertas
especies de microalgas planctónicas. Su nombre se debe a que la mayoría de estas floraciones colorean el agua, observándose franjas rojas sobre su superficie (Hernández-Orozco y GárateLizárraga, 2006). Actualmente, sin embargo, se sabe que su coloración también puede ser amarilla, naranja, marrón, verde o azul, dependiendo de los pigmentos presentes en las microalgas, su profundidad y concentración (Hernández-Orozco y Gárate-Lizárraga, 2006; FAO, 2005; SENASA, 2010). El particular interés en la formación de mareas rojas se debe a la producción de toxinas por parte de algunas de esas microalgas, muchas de las cuales son potencialmente letales para humanos. Muchos florecimientos o mareas rojas son causados por especies no tóxicas pero alrededor de 75 especies de microalgas producen potentes toxinas (Hernández-Orozco y GárateLizárraga, 2006). La intoxicación no ocurre por ingestión directa de microalgas, sino a través del consumo de otras especies marinas, en especial moluscos bivalvos, los cuales ingieren microalgas tóxicas por filtración y concentran las toxinas en su organismo, sin que tal acumulación los afecte (SENASA, 2010). Ello se debe a que los músculos y nervios de los moluscos trabajan con canales de calcio, cuando las toxinas involucradas bloquean sólo canales de sodio (Hernández-Orozco y Gárate-Lizárraga, 2006). El problema es que, al no tener efecto alguno sobre el molusco, no hay diferencias de aspecto o de color entre uno contaminado y uno no contaminado, como tampoco las hay de sabor ni de olor. La única forma de detectar la presencia de las biotoxinas es mediante pruebas de laboratorio (SENASA, 2010). Por otro lado, todas las toxinas son de naturaleza no proteica y extremadamente estables. Así, el cocinado, ahumado, secado o salado no las destruye. Por el momento no existe antídoto alguno para estas toxinas (Hernández-Orozco y Gárate-Lizárraga, 2006). La saxitoxina (y sus más de 26 análogos) pertenece a la familia de neurotoxinas solubles en agua y es la principal toxina paralizante, además de ser la toxina más potente conocida. Su dosis letal mínima es de 9 microgramos/kg, inferior incluso que la del cianuro de sodio (Hernández-Orozco y GárateLizárraga, 2006). La floración comienza como una pequeña población de células de dinoflagelados tóxicos en fase latente o como quistes de resistencia depositados en el sedimento del fondo. Una vez desencadenada la floración, se ingresa en una fase de crecimiento exponencial de la población. El mayor porcentaje de células tóxicas se registra generalmente en la mitad de esta fase de crecimiento exponencial. A medida que transcurre el tiempo, la floración causa una marcada disminución de nutrientes y del contenido del dióxido de carbono en el agua, limitando el crecimiento de la población. Ingresa, entonces, en una fase estacionaria, se estabiliza y el agua
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adquiere un color rojizo fluorescente. En esta etapa, muchas especies de dinoflagelados forman quistes de resistencia (hipnozigotes) que se hunden al fondo, a la espera de la próxima floración (FAO, 2005). No se conocen con exactitud las condiciones ambientales que desencadenan los crecimientos explosivos de las algas, en parte porque hay muchos organismos diferentes involucrados en el fenómeno (Hernández-Orozco y Gárate-Lizárraga, 2006; FAO, 2005). Muchas veces los crecimientos explosivos ocurren al cambiar las condiciones climáticas, pero pueden haber otras causas, como variaciones en las corrientes verticales, la temperatura, transparencia y la salinidad de las aguas, la concentración de nutrientes disueltos, los vientos o la iluminación superficial (FAO, 2005). Durante las dos últimas décadas, ha aumentado la frecuencia, intensidad y distribución geográfica de las floraciones de algas perjudiciales, así como la de los compuestos tóxicos presentes en la cadena alimentaria marina. Se han ofrecido diferentes explicaciones para esta tendencia: una mayor concientización e investigación, crecimiento de la acuicultura en aguas costeras, transferencia de mariscos de una zona a otra, eutrofización cultural, movilidad de sustancias húmicas y metales traza desde el suelo por deforestación y/o precipitaciones ácidas (lluvia ácida), y condiciones climáticas poco comunes. Otra posible explicación de la creciente tendencia de aparición de floraciones de algas perjudiciales es el traslado de quistes en reposo de dinoflagelados en las aguas de lastre de los barcos o por el movimiento de poblaciones de mariscos de una zona a otra (FAO, 2005). Hay suficientes evidencias de diferentes zonas (como el puerto de Hong Kong, el Mar Interior de Seto en Japón y aguas costeras del norte de Europa) de que la eutrofización cultural en el mar -proveniente de aguas domesticas, industriales y de desechos agrícolas- puede estimular floraciones perjudiciales de algas. Es incluso posible que estos regímenes nutricionales atípicos induzcan toxicidad en especiespueden de algas habitualmente no tóxicas. cambios endelos de la tierra, como la deforestación, también causar cambios en laLos composición lasusos especies del fitoplancton, aumentando las concentraciones de sustancias húmicas en los desplazamientos de tierras. Microorganismos en aguas de consumo humano
A pesar de que es de común cono cimiento que el agua está habitada por microorganismos de diversa índole, en algunos casos su presencia puede resultar perjudicial para el hombre, ya sea a la hora del consumo, uso recreativo o utilización con fines tecnológicos. En cuanto al aspecto sanitario, se sabe que el agua actúa como hábitat y/o medio de transporte de una gran cantidad de organismos perjudiciales para la salud del hombre. La mayoría de los patógenos en el agua de bebida son bacterias y virus, muchos de srcen entérico o fecal. Esto hace que el control de la calidad microbiológica del agua sea tan importante como el de su calidad química y organoléptica. Para evaluar la World calidad del agua, los gobiernos y las agencias reguladoras como la Health Organization (WHO) crearon estándares que proponen contenidos mínimos que no resultarían en perjuicios para la salud. En cuanto al agua de red, se ha encontrado que la calidad microbiológica del agua no ocurre sólo en la fuente sino también en el proceso de colecta-transporte-almacenamiento-extracción. El agua embotellada, por su parte, raramente está completamente libre de microorganismos y algunos de ellos pueden ser patógenos. A pesar de la existencia de un proceso de desinfección previo al embotellado, el contenido de bacterias aumenta dentro del envase, especialmente en aguas no gasificadas y en envases plásticos. Además, entre las bacterias que se han encontrado, muchas son resistentes a una variedad de agentes antibióticos. Los microorganismos también pueden interferir indirectamente con la utilización del agua. Por ejemplo, las bacterias oxidantes del azufre y el hierro pueden obstruir tuberías y conductos de agua al metabolizar compuestos solubles (H (e Leptothrix, Gallionella, 2S, FeCO3) para dar como producto precipitados.g.: Beggiatoa). Otros microorganismos pueden aportar sabor y olor indeseable al agua, ya sea por su propia presencia o su metabolismo, como las bacterias anaerobias que producen mercaptanos, sulfhídrico y otros productos. Los actinomicetes también afectan el olor y el sabor del agua, promoviendo la descomposición de plantas acuáticas y algas. Las actinobacterias del género Streptomyces por su parte, producen geosmina, un compuesto volátil causanteeldconocido “olor a tierra” no sólo en el suelo sino también en el agua.
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En Argentina, anualmente y por lo general entre la primera mitad de la primavera y la última del verano, la marisquería en el litoral atlántico es vedada total o parcialmente debido a la marea roja (Ciocco, 1995). Nuestro país cuenta con un programa de control de toxicidad en mejillones en cada una de las provincias de la costa. Por reglamentación, el límite para la STX en los moluscos es de 400 UR/ 100 g y el método de análisis es el bioensayo en ratón. (FAO, 2005). Los niveles de toxicidad habitualmente dicho valor entre septiembre y noviembre y permanecen por sobresuperan ese nivel hasta la segunda mitadlímite del verano o principios de otoño (Ciocco, 1995).
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IV. MÉTODOS UTILIZADOS EN ESTUDIOS DE ECOLOGÍA MICROBIANA 1. De enriquecimiento y aislamiento En un ambiente natural es muy difícil encontrar un solo tipo de microorganismo. Por ello es más acertado hablar de comunidad microbiana. De cualquier manera, las técnicas de enriquecimiento son las más utilizadas y apropiadas para el aislamiento y cultivo de microorganismos. Se debe poner énfasis en el empleo de un medio de cultivo y una serie de condiciones de incubación que favorezcan el crecimiento del microorganismo o grupo taxonómico que se desea multiplicar. De alguna manera, se busca reproducir en el laboratorio las condiciones que imperan en su nicho ecológico. En todos los casos se requiere de una fuente de inóculo apropiada. De todas maneras se debe tener en cuenta que la cantidad y tipos de microorganismos presentes en un determinado nicho ecológico es casi completamente imposible de determinar. Este tipo de métodos hacen posible estimar una proporción de la comunidad total posible de ser cultivada sobre un medio de cultivo y que en muy rara ocasión puede ser mas del 14%. La figura 12 representa un esquema de como los grupos de microorganismos no cultivables pueden pasar mediante específicos cambios fisiológicos a los tipos cultivables mientras la mayor proporción de microorganismos no cultivables permanecen como tales. La evaluación de un subgrupo de la comunidad debería ser suficiente para detectar cambios en la dinámica total de la comunidad, siempre y cuando haya interacciones entre el subgrupo medido y los otros miembros que integran la misma.
Figura 12. Tipos de microorganismos presentes en la comunidad microbiana del suelo (Fuente: Garland, 2004)
La columna de Winogradsky (figura 13) se utiliza para reproducir las condiciones de un ecosistema anaeróbico en una escala muy pequeña. Es un método muy útil para estudiar las poblaciones de procariontes involucradas en los ciclos de los nutrientes. En el seno de la columna se desarrollan diferentes microorganismos, por eso resulta apropiada para utilizarla como un medio de enriquecimiento de poblaciones aerobias y anaerobias. Recuentos utilizando medios selectivos permiten cuantificar los tipos presentes. En la columna de Winogradsky se pueden enriquecer y estudiar las especies involucradas en el ciclado de los nutrientes (por ej. ciclos del nitrógeno y azufre).
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Los microorganismos generan sulfuro en la parte de abajo de la columna. La fermentación de la celulosa libera lentamente azúcares que son usados por los organismos anaeróbicos. El sulfato sirve como un aceptor de electrones para los reductores de sulfato (por ej. Desulfovibrio), generando sulfuro. El carbonato está disponible para el crecimiento autotrófico y también como buffer de pH. Se usan sales de calcio insolubles de manera de no crear un medio ambiente muy salino. Los sulfuros de metales (por ej. de hierro) le proporcionan el color negro al fondo de la columna. Los sulfuros difunden hacia arriba en la columna y el oxígeno difunde hacia abajo desde la superficie. Los organismos oxidadores de sulfuro consumen ambos componentes en su metabolismo, resultando en un contrabalance estable de los gradientes de oxígeno y sulfuro. Esto permite el crecimiento de microorganismos con diferentes requerimientos de oxígeno.
2. De los enriquecimientos a los cultivos puros El objetivo de un cultivo de enriquecimiento es generalmente la obtención de un cultivo puro. Para los organismos que crecen bien sobre las placas con agar, la estría en placa es el método más conveniente para su aislamiento. A través de repetidos repiques y nuevas estrías de una colonia bien aislada, generalmente se obtiene un cultivo puro que se puede transferir a un medio líquido. Existen métodos que permiten cultivar una determinada comunidad microbiana sobre varios sustratos simultáneamente. Estos métodos brindan mayor información sobre su función, diversidad y potencial de actividad que los métodos tradicionales. Esta metodología representa una herramienta de gran potencial que permite comparar comunidades microbianas sin necesidad de conocer exactamente su composición en grupos taxonómicos y/o especies presentes (Garland y Mills 1991).
3. De identificación y cuantificación. En algunos de los casos los microorganismos de interés en un ecosistema pueden no ser cultivables (figura 12). Si este es el caso, son necesarios métodos que por lo menos detecten que están presentes. Varios métodos bastante específicos se han desarrollado para la identificación y enumeración, que incluyen los métodos basados en la especificidad de los anticuerpos y las secuencias de ácidos nucleicos. a) La tinción y los anticuerpos fluorescentes. Los microorganismos pueden ser identificados y enumerados por el examen microscópico directo del hábitat. Sin embargo, se hacen necesarios procedimientos especiales para hacer visibles los microorganismos en hábitat opacos. En el suelo, por ejemplo, los organismos pueden ser teñidos por una variedad de compuestos fluorescentes específicos para células vivas. Por ejemplo, el naranja de acridina se emplea para teñir el ADN y el ARN. Es una técnica de tinción directa y es ampliamente usada para conteo del número microbiano total en suelo y agua. La tinción con anticuerpos fluorescentes es un método para identificar una especie o incluso una cepa de una especie dada en muestras de suelo. En ciertas aplicaciones la técnica puede ser utilizada también como un método de cuantificación. La gran especificidad de los anticuerpos preparados contra los constituyentes de la superficie celular de un organismo particular, puede ser explotada para identificar ese organismo en un hábitat complejo como el suelo.
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Figura 13. Esquema de la Columna de Winogradsky con un detalle de las zonas microbianas y las principales reacciones.
b) Las sondas de ácidos nucleicos. Una aproximación poderosa para la identificación y cuantificación de microorganismos en la naturaleza es el uso de las sondas con ácidos nucleicos. Una sonda con ácidos nucleicos constituye un fragmento corto de ADN o ARN complementario a una región de un gen al cual la sonda puede hibridizar. Algunas sondas que han sido utilizadas emplean secuencias de ARN ribosomal 16S como herramientas para diferenciar microorganismos en ambientes naturales. Al utilizar una colección de tales sondas para analizar muestras naturales, es posible identificar diferentes especies en una muestra. En pruebas filogenéticas, se utilizan dos tipos de sistemas de marcado: radioisótopos y tinción fluorescente. El método de los radioisótopos emplea sondas marcadas con 35S y 32P que se agregan a células fijadas con formaldehído inmovilizadas con filtros de fibra de vidrio. Antes del tratamiento con una sonda, las células secas se someten a tratamientos de permeabilización, de manera que la sonda pueda penetrar y encontrar un ribosoma para unírsele. El marcado de células individuales es luego visualizado por autorradiografías: la exposición de una emulsión fotosensible a la radioactividad en los ribosomas a los que la sonda se ha unido. La tinción fluorescente es un sistema de detección alternativo . La tintura se adhiere químicamente a la sonda, y las células se visualizan a través de microscopía fluorescente. Si se
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usan sondas marcadas con varios colorantes que fluorescen en diferentes longitudes de onda, es posible tratar una muestra con diferentes sondas a la vez y luego identificar y cuantificar diferentes tipos de células en las muestras empleando un filtro de fluorescencia apropiado. El estudio de la biodiversidad de comunidades microbianas puede hacerse usando sondas de ARN ribosomal. El resultado obtenido es un cuadro filogenético de las especies presentes en la comunidad. En resumen, los métodos involucran extracción de ADN o ARN total de los representantes de la comunidad microbiana entera y luego, usando sondas de ácido nucleico específicas, se obtiene una colección de clones de ARN ribosomal. Esto último se genera por técnicas de amplificación por PCR (del inglés Polimerase Chain Reaction) de genes de ARN ribosomal ola indirectamente por ARN la producción al ARN ribosomal. Siguiendo secuenciación del ribosomal,desecADN puedencomplementario construir los árboles filogenéticos que muestran la composición de la comunidad microbiana. En casi todos los casos de análisis filogenéticos de comunidades microbianas se ha demostrado que contienen organismos filogenéticamente diferentes que no han sido cultivados hasta el momento. Esto apoya la hipótesis que la biodiversidad de las comunidades microbianas es mucho más grande que la de los organismos aislados hasta ahora. Esto significa que aún queda mucho trabajo para los microbiólogos que realizan trabajos de cultivo y enriquecimiento. Se puede utilizar la tecnología de sondas para propósitos de monitoreo (por ejemplo, monitorear el éxito de la colonización de un nuevo hábitat por microorganismos genéticamente modificados o para identificar genes particulares (por ejemplo, genes que codifican proteínas involucradas en la biodegradación de compuestos tóxicos) en organismos del ambiente. En cada caso, el aumento o la disminución de la "dosis" de un gen o genes específicos a los que una sonda reacciona, puede ser utilizados para monitorear el éxito del o los organismos que lo/s portan. Además, utilizando los métodos que emplean sondas se pueden evaluar los efectos de perturbaciones sobre el srcen o la declinación de poblaciones microbianas específicas (o dosis génicas específicas). El futuro de las sondas con ácidos nucleicos en ecología microbiana es muy auspicioso, especialmente para utilizarlas donde los métodos de cultivo no han sido exitosos o donde los organismos de interés están presentes en número inferior a la sensibilidad de las mediciones de actividad. De cualquier manera, la principal dificultad que presentan todos los métodos que han sido descriptos, es que la obtención de datos se 1imita exclusivamente a la detección, enumeración y posicionamiento filogenético de los organismos. Sin embargo, en la mayoría de los estudios de ecología microbiana, es muy importante conocer la actividad microbiana, a fin de asignarle significancia ecológica a la presencia de un organismo en un hábitat determinado. c) PCR cuantitativa para el análisis de comunidades microbianas. La PCR cuantitativa (qPCR o PCR en tiempo real) es una herramienta de gran utilidad en estudio de las comunidades microbianas, ya que permite la cuantificación de los misroorganismos presentes (Smith y Osborn, 2008). Consiste en una reacción de PCR con un marcador que se une a los fragmentos de DNA y emite señal fluorescente. Esta señal es leída por el equipo, el cual genera una curva logarítmica de amplificación, que representa la cantidad de copias de DNA en función del ciclo. Luego de un número de ciclos determinado, se obtiene un valor de la cantidad de copias de DNA a partir del cual se estima la cantidad inicial de copias, que es el número de copias que contenía la muestra. Qué grupo de microorganismo se estará cuantificando dependerá del cebador o primer utilizado en la reacción de PCR. Existen primers universales para bacterias, hongos y actinomicetes, que son seleccionados por el investigador dependiendo del organismo a estudiar. Sin embargo el alcance de esta herramienta no se limita solamente al número de miembros de cada grupo, sino también permite la cuantificación de microorganismos involucrados en los procesos microbianos específicos
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utilizando primers para genes funcionales. Por ejemplo, el empleo de primers para el gen nifH permitirá la cuantificación de microorganismos involucrados en la fijación de nitrógeno. De este modo, existen primers para cuantificar genes otros procesos que ocurren en el suelo, como la desnitrificación o degradación de determinadas sustancias agroquímicas. d) Perfiles de ésteres de fosfolípidos y ácidos grasos (PLFA). El análisis de marcadores PLFA ha sido usado para evaluar la dinámica de la estructura de comunidades microbianas en diversos ambientes. Es un análisis bioquímico de componentes de las celulares permite grupos disponermicrobianos de un biomarcador distintivohongos, que ha sido definidoy paramembranas una variedad de que diferentes (por ejemplo bacterias actinomicetes). El análisis de PLFA es un método útil para evaluar biomasa viable total y la proporción relativa de los diferentes grupos microbianos. Pero no siempre puede relacionarse directamente el perfil de PLFA con diversidad microbiana porque estos biomarcadores pueden ser comunes para diferentes especies. Esta metodología fue exitosamente empleada para el estudio de las comunidades bacterianas de suelos de la región de Las Yungas del noroeste argentino, estableciendo relación entre el uso de los suelos y la diversidad y biomasa viable de dichas comunidades (Montecchia et al, 2011). Las comunidades bacterianas de los suelos agrícolas resultaron menos diversas y abundantes que las de los suelos no cultivados, poniendo en evidencia el alto impacto que tienen el desmonte y el cultivo sobre la biología de estos suelos. e) Estimación del carbono de la biomasa microbiana por el método de fumigación – extracción El fundamento de esta técnica consiste en la muerte de la biomasa viva de muestras de suelo, previa remoción de raíces y restos de animales, a través de una fumigación con vapores de cloroformo. Posteriormente, el carbono de la biomasa microbiana es extraído del suelo con K2SO4 y se cuantifica por medio de una titulación. La diferencia entre la cantidad de carbono de las muestras fumigadas y las no fumigadas dividida por una constante (kc) dará como resultado el carbono de la biomasa. El factor kc se utiliza para expresar la fracción de carbono microbiano que se recupera en un proceso de fumigación y extracción. En general se recomienda usar 0,33, pero debería calcularse para cada tipo de suelo. A modo de resumen se presenta esta metodología en forma esquemática en la figura 14
4. Mediciones de actividad microbiana Las mediciones de actividad microbiana por lo general son estimaciones de los procesos microbianos en conjunto, donde se evalúan las actividades colectivas de varias poblaciones relacionadas metabólicamente a través de mediciones de un solo tipo de transformación. De ahí que la sensibilidad del método guarda una importancia crucial. a) La respiración microbiana del suelo. La respiración del suelo (consumo de O 2 o producción de CO2) es un componente importante en el balance de carbono de los ecosistemas terrestres y resulta indicadora de la actividad biológica del suelo, ya que ese flujo de CO2 es producido por la actividad metabólica de los organismos (meso, microfauna y microflora) y las raíces de las plantas. Se trata de una determinación que puede realizarse tanto a campo como en el laboratorio, donde se utilizan diferentes métodos para su medición. Cuando la medición se realiza a campo se instalan en el terreno cámaras de respiración como se muestra en la figura 15.
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no fumigadas (control)
fumigadas Muestras de suelo
vacío vapores de CHCl3 muestras de suelo
Incubar en oscuridad 24h
CHCl3
Extracción
extracción
+ fumigadas
K2SO4 0,5 M
no fum igadas
digestión del con dicromato de extracto K y titulación por retorno con sal de Mohr Cálculo del Carbono de la biomasa microbiana
A - B C-biomasa = g C-CO2 g-1 suelo =
kc
A
A: carbono de las muestras fumigadas B: carbono de las muestras sin fumigar B
C-b ioma sa
Figura 14. Esquema del método de Fumigación-Extracción para la estimación del carbono de la biomasa microbiana.
En el laboratorio el sistema más comúnmente utilizado consiste en frascos con tapas herméticas donde se coloca la muestra de suelo en condiciones adecuadas de humedad (50-70 % CR), y un recipiente menor con KOH o NaOH. También se incluyen frascos sin suelo que serán utilizados como controles de la concentración de CO2 en la atmósfera del frasco. Luego de un período variable de incubación, en oscuridad y a temperatura ambiente o controlada, se procede a
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precipitar el Na 2CO3 producido con una solución de BaCl 2 y por titulación, usando fenolftaleína como indicador, se determina la cantidad de NaOH que quedó sin reaccionar. Cuanto mayor sea la actividad respiratoria, menor será la cantidad de NaOH que queda sin reaccionar. En la figura 16 se muestra un esquema de esta metodología y el cálculo de la producción de CO 2 o respiración.
Figura 15. Cámara de respiración conectada a un equipo analizador de aire.
Figura 16. Esquema del método de respiración por titulación, utilizando frascos herméticos y trampas de un álcali fuerte .
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b) Actividades enzimáticas Existe una gran variedad de técnicas para estudiar la actividad de enzimas tanto in vitro como in situ. Determinadas reacciones enzimáticas, vinculadas a valores de recuento de distintos grupos funcionales, permiten obtener información comparativa de la actividad microbiana en distintas muestras ambientales. Uno de los principales problemas que enfrenta esta metodología al momento de interpretar los resultados es la interacción que de las enzimas con los minerales arcillosos del suelo. Dependiendo de la enzima y del contenido y tipo de arcilla, la actividad enzimática puede perderse por completo debido a la acción de proteasas o a cambios conformacionales que ocurran como resultado de la interacción, y también puede verse protegida por las arcillas, microorganismo que la produjo.conservando la actividad aún después de la muerte del Deshidrogenasa y ureasa Las enzimas comúnmente más usadas como indicadoras de actividad microbiana en suelos son la deshidrogenasa y la ureasa. Si existe actividad deshidrogenasa en suelo el 2,3,5 triphenytetrazolium (TTC), que es incoloro, se reduce a triphenylformazan (TPF) observándose el desarrollo de una coloración rojiza. 2,3,5 triphenytetrazolium + 2H+-------------------- triphenylformazan + HCl En el caso de actividad de ureasa, el amonio liberado como resultado de dicha actividad se cuantifica por el método de indofenol azul. Para cada situación y grupo de microorganismos de interés se recomienda recurrir a alguno de los métodos citados en la bibliografía. El libro editado por Alef y Nannipieri (1995) cuenta con una recopilación bastante completa de técnicas y aplicaciones prácticas. c) Perfiles fisiológicos de las comunidades microbianas Uno de los métodos para estudiar la diversidad microbiana de un ambiente es a través del consumo diferencial de sustratos carbonados por parte de las comunidades microbianas (Garland y Mills, 1997), que se pone de manifiesto por la reducción de un colorante. Esta técnica consiste en la inoculación de microplacas con una suspensión de microorganismos del suelo. Las microplacas contienen una solución buffer, colorante violeta tetrazolio y una variedad de fuentes carbonadas (hidratos de carbono, aminoácidos, ácidos carboxílicos, etc.). A medida que un sustrato está siendo respirado por los microorganismos, el colorante se reduce, tornándose la celda de color violeta. A mayor consumo la intensidad del color, y por ende, la absorbancia, son mayores. Las celdas con un sustrato no consumido permanecen incoloras. Las placas luego son leídas con un espectrofotómetro, obteniéndose de este modo los perfiles de consumo partir de los de datos obtenidos se pueden estimar tales comodiferencial. la riqueza yAequitatividad microorganismos presentes, entre índices otros. de diversidad, d) Los microelectrodos. El empleo de pequeños electrodos de vidrio, denominados microelectrodos, ha sido de gran utilidad para estudiar la actividad de los microorganismos en su ambiente. Los más difundidos permiten medir pH, oxígeno, N2O y SH-.
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Los microelectrodos se insertan cuidadosamente dentro del hábitat que se desea estudiar, empleando un dispositivo que permite movimientos precisos del electrodo a través de distancias muy pequeñas. Se emplean regularmente en los estudios de fotosíntesis y transformaciones químicas donde participan cianobacterias, bacterias fotosintéticas y quimioorganótrofas, entre otras. Mediante el empleo de diferentes microelectrodos, se pueden realizar a la vez mediciones de transformaciones microbianas para distintas especies químicas. e) Los isótopos estables. Los isótopos estables pueden utilizarse en estudios de transformaciones microbianas, debido a que la mayoría de las reacciones bioquímicas que involucran elementos como el carbono y el 12
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azufre, favorecen la incorporación del isótopo más liviano ( C, el S). fraccionamiento isotópico puede observarse en la naturaleza al analizar srcenEldefenómeno los isótoposde en los compuestos químicos. La composición isotópica de una muestra lleva consigo un registro de su actividad biológica anterior. Por ejemplo, en el caso del carbono, las bacterias metanogénicas discriminan entre las formas isotópicas del CO 2, favoreciendo ampliamente a las especies de 12C frente a las de 13C. Como consecuencia de las diferencias entre la proporción de 12 C y 13C, estrechamente relacionados con el srcen biológico y geológico del carbono, se ha utilizado la relación isotópica 12C/13C en varios estratos geológicos con el objeto de determinar los procesos que dieron srcen al comienzo de la vida en rocas antiguas. Se han utilizado los isótopos de azufre para distinguir entre depósitos de azufre mineral (sulfuro de hierro) y azufre elemental, de srcen biótico y abiótico. Por otra parte, los análisis de isótopos estables se pueden utilizar en el monitoreo de las cadenas alimenticias de microorganismos y organismos superiores. En la cadena trófica, la composición isotópica de un consumidor se aproximaría a la de un productor, su principal fuente de alimento. Esto permite delinear la corriente de carbono en un ecosistema dado. En el capítulo 8 del libro Brock Biología de los Microorganismos se analizan las formas de utilización del isótopo de 15N, para estimar fijación biológica de N 2 y otros procesos biológicos del ciclo de este elemento. f) Los radioisótopos. Los radioisótopos constituyen otra útil herramienta para la medición de procesos microbianos específicos con un alto grado de sensibilidad. Además permiten obtener información acerca de las velocidades de recambio entre las especies químicas que se encuentran presentes en la naturaleza. Siempre existe la posibilidad de que alguna transformación de un compuesto marcado se srcine estrictamente de un proceso químico más que de uno microbiano, por lo cual, resulta sumamente importante emplear los controles adecuados cuando se utilizan los isótopos. Se debe demostrar que la transformación que se está evaluando en la naturaleza, puede inhibirse por agentes microbicidas o tratamientos con calor que bloqueen la actividad microbiana o maten a los organismos.
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CAPÍTULO 7 CICLO DEL CARBONO. DEGRADACIÓN DE COMPUESTOS CARBONADOS EN EN DIFERENTES AMBIENTES. HUMIFICACIÓN Y DESHUMIFICACIÓN. Ciclo del Carbono. Importancia de la fotosíntesis en el ciclo del Carbono. Descomposición de la materia orgánica (Brock Biología de los Microorganismos: Capítulo 14, sección 14.11). Utilización de hexosas, pentosas y polisacáridos (Brock Biología de los Microorganismos: Capítulo 13, sección 13.21). Formación y degradación de la materia orgánica del suelo: humificación y deshumificación. Transformaciones de hidrocarburos (sección 13.25). Metanogénesis y sintrofía. Hábitats metanogénicos. Metanogénesis en los océanos (sección 14.12). El ecosistema microbiano del rumen. Las bacterias, protistas y hongos del rumen. Dinámica del ecosistema del rumen. Otros animales herbívoros (sesión 14.13). Producción de Biogás (esta guía). Repasar oxidaciones y reducciones (ver lectura sugerida en el capítulo 4 de esta guía).
La degradación de la materia orgánica y e l rol de los microorganismos. La principal fuente de energía para la microflora del suelo proviene de la materia orgánica (MO) aportada por la cobertura vegetal, la cual está formada por un 50-60% de C, y un 0,3-5,0% de N. El N se encuentra principalmente formando parte de las proteínas, las cuales son rápidamente degradadas por la microflora del suelo, en tanto que el C forma parte de los polímeros que constituyen la pared celular de las plantas, principalmente celulosa, hemicelulosas, lignina y sustancias pécticas. La descomposición microbiana de estos residuos en condiciones aerobias una gran carbono a lade atmósfera como CO 2. Durante el primer año seproduce pierde entre el 60pérdida y 70 %dedel carbono la MO recientemente incorporada al suelo. Otro 20% se perderá en los siguientes 6 a 9 años. El resto permanece en el suelo en forma más estable. La descomposición de la MO comienza aún antes de que los tejidos hayan sufrido senescencia. Las hojas antes de expandirse se cubren de bacterias del filoplano, y al envejecer son atacadas por diferentes patógenos –parásitos y saprofitos-. Sin embargo, la velocidad de descomposición mayor ocurre cuando los tejidos caen al suelo. La fauna del suelo tiene un importante papel en la descomposición de la materia orgánica del suelo, fragmentando y mezclando el material vegetal con el horizonte superficial del suelo. Cuando hay fauna presente la descomposición de la MO es entre 25 y 80 % más rápida que en su ausencia. Los grupos más importantes de la fauna del suelo que participan activamente en la descomposición de la MO son lombrices, artrópodos, nematodes y protozoos. La actividad enzimática de hongos y bacterias transforman la MO, dando srcen a compuestos más sencillos y humus. En casi todos los suelos la materia orgánica es inicialmente atacada por hongos, que gracias a sus hifas y micelios pueden penetrar y proliferar en los restos recién depositados. Géneros típicos de hongos que degradan a los polisacáridos de la pared celular vegetal son Rhizopus, Fusarium, Trichoderma, Penicillium, Aspergillus, Alternaria y Rhizoctonia. Las bacterias generalmente se desarrollan secundariamente, principalmente sobre detritos con una alta relación superficie/volumen. Entre los géneros más representativos, encontramos a Flavobacterium, Clostridium y Cellulomonas. Los actinomicetes también forman
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un grupo siempre presente en la microflora que ataca la materia orgánica, destacándose especies del género Streptomyces. Existen ciertas homologías en las etapas del proceso de descomposición de la celulosa, hemicelulosa y pectinas de la pared vegetal, y también del almidón, el cual no es un constituyente de la pared sino que es un polímero de reserva. En general, actúan complejos enzimáticos, unos son capaces de degradar los polímeros desde los extremos, otros que rompen las cadenas de polímeros en su interior y otros actúan sobre los puntos de ramificación. Un ejemplo de esto último es la degradación de la celulosa, la cual, dado su alto peso molecular y estructura en microfibrillas, solo puede ser degradada por aquellos organismos que son capaces de excretar enzimas extracelulares, rindiendo compuestos de menor peso molecular, solubles en agua. Estos compuestos (mono- y disacáridos) son transportados al interior de las células microbianas, donde son degradados por enzimas citoplasmáticas. En general, la complejidad estructural de los compuestos carbonados y su solubilidad en agua hacen que su facilidad de degradación responda al siguiente orden (de mayor a menor): Monosacáridos < oligosacáridos < almidón < pectinas < hemicelulosas< celulosa < ligninas La presencia y distribución relativa de estos compuestos en los residuos vegetales será variable en diferentes ambientes y por lo tanto también lo será la dinámica de su degradación. A modo de ejemplo, en un sistema forestal habrá mayormente presencia de lignina y menor cantidad de compuestos carbonados solubles, en contraposición con un pastizal en donde habrá predominantemente compuestos carbonados solubles (Metting, 1993). La tasa de descomposición de la MO está dada por el cambio de la concentración del sustrato (S) en el tiempo (t), y puede expresarse como una función de todos y cada uno de los sustratos que son degradados. El tipo de función que más se ajusta para la caracterización de este fenómeno es una ecuación de primer orden, en la cual la tasa de transformación del sustrato S es proporcional a la concentración del mismo.
Integrando tenemos que:
Cuando se descomponen sustratos complejos las tasas relativas de descomposición van disminuyendo con el tiempo, debido a que la composición del residuo remanente va cambiando. Los compuestos más lábiles se descomponen primero, mientras que los más resistentes y el material humificado se van acumulando. El material vegetal fresco, por ejemplo, tiene una tasa de descomposición elevada, de aproximadamente un 50% por semana, en tanto que la tasa de descomposición del humus puede ser de un 3% por año. En la figura 1 se graficó una curva típica de descomposición de materia orgánica en la naturaleza:
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Figura 1. Evolución de la descomposición de a materia orgánica expresada como el cambio en el porcentaje de sustrato remanente en función del tiempo. Además de la cantidad inicial de sustrato, la tasa de descomposición depende también del pH, contenido de sales, nutrientes, agua, oxígeno y temperatura. La descomposición se inhibe a valores de pH extremos (menores a 4,5 y mayores a 9), y del mismo modo la afectan la salinidad elevada y la deficiencia de nutrientes, especialmente nitrógeno.
Degradación de lignina La lignina se srcina a partir de la oxidación enzimática de tres precursores fenólicos: cumaril, coniferil y sinanpil, que difieren en el grado de metilación. Su formación resulta de una serie de uniones al azar y por lo tanto el tipo de uniones que tiene son muy variables (fig. 2).
Unión aril-glicerol-βaril-éter
Estructura Dibenzodioxocina
Grupos Metoxilos Grupos Hidroxilos
Grupo Hidroxi-fenólico
Figura 2. Esquema de la estructura de la lignina de una conífera del género Picea. Fuente: Kluczek-Turpeinen (2007).
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Debido a su estructura complicada, su asociación con celulosa y hemicelulosa (fig. 3), su insolubilidad en agua y la presencia de estructuras aromáticas y uniones no hidrolizables, la lignina es muy resistente a la degradación microbiana. Para complicar aún más su descomposición, las enzimas necesarias para la degradación completa solo se inducen en ausencia de nutrientes fácilmente disponibles, de lo contrario, la degradación se retarda o resulta muy lenta. Celulosa Lignina
Región amorfa
Región cristalina
Hemicelulosa Figura 3. Esquema de la estructura de lignocelulosa. Fuente: Kluczek-Turpeinen (2007)
La degradación biológica de la lignina representa una contribución muy importante al ciclo del carbono en la Tierra, y es también responsable de la destrucción de la madera y de la acción de los patógenos vegetales. Además, los microorganismos degradadores de lignina tienen un papel relevante en procesos industriales como la industria de papel a partir de pulpa de madera y el tratamiento de contaminantes orgánicos, tinturas y colorantes. En los estudios de degradación se utilizan preparaciones de lignina sintética marcada con 14C debido que la purificación de la nativa es muy complicada. Uno de esos compuestos es el polímero de deshidrogenación (DHP, es su sigla en inglés) que tiene propiedades parecidas a las de la lignina nativa.
Microorganismos degradadores de lignina A pesar de su riqueza en carbono, la mayoría de los microorganismos no pueden utilizar a la lignina como única fuente de carbono y energía. Se considera que, en general, su depolimerización tiene por objeto lograr el acceso a celulosa y hemicelulosa, sustratos de mayor labilidad frente a la acción microbiana. Los degradadores de lignina más eficientes son los dan todos los componentes hongos basidiomicetes de la denominada “pudrición blanca” Degra de la madera a CO2 y H2O y la misma toma un color blancuzco. Algunos de los hongos que realizan este proceso son Coriolus versicolor, Pleurotus ostreatus y Phanerochaete chrysosporium.
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Durante la utilización de los azúcares de la pared celular se produce H2O2 por acción de glucosa- y glioxil-oxidasas, iniciándose así la oxidación de la lignina. Es un proceso oxidativo no específico, donde se reduce el contenido de grupos metoxilos (grupo metilo unido al oxígeno), fenólicos y alifáticos de la lignina, abriendo los anillos aromáticos y formando nuevos grupos carbonilos (carbono unido al oxígeno por doble enlace), dando como resultado la depolimerización de la molécula y la liberación de CO 2. Los hongos nombrados en el párrafo anterior secretan enzimas extracelulares tales como lignina peroxidasas (LiP), manganeso peroxidasas (MnP) y lacasas (fenol oxidasas), realizando la degradación como parte de su metabolismo primario y en condiciones de limitación de nutrientes, sobre todo de nitrógeno. Es así que el agregado de nitrógeno orgánico al medio chrysosporium de crecimiento. Por reprime la actividad de degradación de la lignina por el hongo Phanerochaete otra parte, se observó que altos niveles de O2 (100%) aumentan la mineralización de la lignina cuando el hongo Phlebia radiata crece en madera de álamo. Los hongos de la “pudrición parda” que también son basidiomicetes alteran mínimamente a la lignina por reacciones de hidroxilación y demetilación que resultan de la pérdida de estructura de la madera y de celulosa y hemicelulosa, pero no su destrucción total. Se degradan los polisacáridos asociados a la lignina y los grupos CH 2 y R-O-R, pero quedan intactos los grupos fenólicos, los cuales se oxidan tomando un color marrón. El hongo comestible Agaricus bisporus degrada hasta el 35% de la lignina luego de 80 días de cultivo. Algunos hongos que forman ectomicorrizas ( Cenococcum, Amanita, Tricholoma y Rhizopogon) mineralizan lentamente la lignina sintética y la lignina de tallos de maíz. Sin embargo, la eficiencia de este proceso es mucho menor que la de los hongos de la pudrición blanca. También los hongos que habitan comúnmente el suelo realizan una degradación limitada de la lignina, fundamentalmente produciendo una demetilación. Penicillum chrysogenum, Fusarium oxysporum, F. solani y Pestalotia oxyanthi mineralizan del 2 al 9% del 14C de la lignina en 28 días. Lacasas, peroxidasas y la producción de radicales superóxido e hidroxilos participan en esta actividad. Las bacterias capaces de degradar lignina pertenecen a los actinomycetes filamentosos del género Streptomyces. Esta bacteria Gram positiva puede solubilizar hasta el 45% de la lignina presente en un precipitado soluble en agua, obtenido por tratamiento con ácido, y es capaz de mineralizar el 3% del 14C luego de 21 días. En ambientes acuáticos también son los hongos los más importantes degradadores de la lignina. Se ha informado que varias especies de hongos marinos son capaces de mineralizar entre el 4-5% de la lignina de especies de arce y abeto, luego de 30 días de cultivo. El ascomicete marino Sordaria fimicola mineralizó hasta el 10% de la lignina sintética cuando creció en un medio con poco nitrógeno y suplementado con sales marinas. Algunos de los compuestos simples producidos a partir de la descomposición de la lignina son la vainillina, el ácido vainillínico y el ácido ferúlico (fig. 4). Estos compuestos pueden ser utilizados como fuente de carbono por algunos hongos, transformándolos en ácido protocatéquico. Los compuestos fenólicos derivados de la descomposición de la lignina son los precursores de la formación del humus. La descomposición procede en aerobiosis, mientras que en ambientes anaeróbicos prácticamente no se detecta descomposición de lignina. También puede ocurrir la degradación o transformación abiótica bajo condiciones y ambientes especiales, por ejemplo bajo la acción de la radiación UV.
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Figura 4. Descomposición de la lignina
Formación de las sustancias húmicas. Las sustancias húmicas (SH) son los materiales orgánicos más ubicuos y ampliamente distribuídos existentes en ambientes terrestres y acuáticos. Cuando hablamos de SH nos referimos a compuestos de alto peso molecular, de color marrón oscuro que son ricos en grupos aromáticos. Se srcinan de materia orgánica vegetal, animal y microbiana. Además del suelo, podemos encontrar SH en lagos, ríos, compost, sedimentos y turberas. Los productos de la descomposición de la lignina y los polisacáridos de las paredes celulares son dos de sus principales precursores. En una primera etapa se rompen las uniones glicosídicas entre la lignina y los polisacáridos. Luego, la lignina pierde sus grupos metoxilos y fenólicos, aumentando su proporción de grupos carboxilos y carbonilos. A este proceso se lo denomina Humificación, y depende de la descomposición de componentes de srcen vegetal de alto y bajo peso molecular y la síntesis de componentes celulares microbianos. Durante la descmposición de los tejidos vegetales el 70% del carbono orgánico se mineraliza, mientras que la lignina se une covalentemente a las SH. De modo que una parte de la lignina se degrada mientras que otra, al mismo tiempo, sufre una nueva polimerización. Los residuos nuevos y antiguos se van combinando al azar, con restos de materia orgánica fresca, formando un cuerpo muy complejo. Restos de pared celular o fracciones citoplasmáticas de diferentes organismos se unen a los polímeros fenólicos, y de esta manera se estabilizan y quedan protegidos de la degradación microbiana. Todos estos procesos son extremadamente lentos, y la acumulación de una cantidad considerable de humus puede verificarse luego de 100 o 10.000 años de acuerdo a las condiciones ambientales. El tiempo medio de permanencia de estos compuestos en el suelo oscila entre 200 a 2.000 años. El humus del suelo representa la materia orgánica natural más abundante en los ecosistemas terrestres,
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constituyendo una de las mayores reservas de carbono orgánico del suelo (aproximadamente 3 x 1012 toneladas) (Yanagi et al., 2008). En un lapso relativamente corto, de 0 a 9 años, se pierde a la atmósfera en forma de CO 2 el 90% del C incorporado al suelo como materia orgánica (por ejemplo, restos de cosechas o rastrojos). El 10% que permanece en el suelo luego de diez años constituye el residuo que no es ni fácil, ni rápidamente utilizable como fuente de energía por los microorganismos (humus), el cual se acumula lentamente, y constituye la mayor parte de la MO del suelo, conteniendo más del 90% del C y del N del mismo. El proceso de humificación es una transformación de la estructura de los compuestos orgánicos, que supone una disminución progresiva de los más lábiles, junto con un aumento de estructuras aromáticas más complejas, dando macromoléculas con mayor resistencia a la biodegradación. La diversidad de los precursores orgánicos y la cantidad de factores y condiciones que intervienen en el proceso dan lugar a que no exista una única estructura molecular, sino distintas estructuras macromoleculares, como ocurre con la lignina (Labrador Moreno, 1996). Es por ello que la estructura del humus es extremadamente compleja y heterogénea. La humificación se considera un proceso análogo a la síntesis de lignina, donde los precursores son producidos o alterados enzimáticamente y la síntesis resulta de la condensación en moléculas más grandes. Una de las teorías de la formación del humus establece que lignina y proteínas de la materia orgánica se condensan para formar ácidos húmicos (AH) (fig. 5). Esta teoría se ha denominado “Teoría de la lignina” para explicar la formación de la MO del suelo. Sin embargo, no permite explicar la formación de sustancias húmicas en los océanos, donde no existe lignina.
Figura 5. Formación de sustancias húmicas por reacción entre productos de la descomposición del fenol con aminoácidos y compuestos alifáticos. Fuente: Paul, 2007.
Actualmente se considera que la “Teoría de los Polifenoles” es la más aceptable para explicar la formación del humus. Los compuestos fenólicos se pueden polimerizar en forma química, por condensación o a través de radicales libres, o pueden hacerlo enzimáticamente. Las mayores fuentes de fenoles durante la descomposición de la materia orgánica son:
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1. Polifenoles derivados de la degradación de la lignina. 2. Polímeros fenólicos (melaninas) sintetizadas por muchos hongos, actinomicetes y bacterias, a partir de compuestos alifáticos diferentes de la lignina. 3. Polifenoles de srcen vegetal diferentes a la lignina. Esta fuente puede ser importante en bosques con mucho aporte de materia orgánica. No todos estos polifenoles son estables, sino que pueden ser degradados por los microorganismos del suelo. Alternativamente, pueden sufrir recombinación, frecuentemente convirtiéndose en quinonas. La oxidación puede ser espontánea, o mediante peroxidasas o fenoloxidasas muchospara microorganismos. Lasconteniendo quinonas sufren condensación o se combinan con sintetizadas compuestos por aminados formar polímeros nitrógeno.
Estructura del humus según la solubilidad o no de los productos luego del tratamiento con álcali y ácidos En la estructura heterogénea que es el humus se reconocen diferentes fracciones sobre la base de la solubilidad en ácidos y álcali: 1.
Ácidos fúlvicos (AF): Constituyen moléculas de peso molecular entre 1.000 y 30.000. Son solubles en NaOH, manteniéndose solubles a pH 2,0. Están formados por series de anillos aromáticos altamente oxidados, con numerosas cadenas laterales. Se forma a partir de benceno y ácidos fenólicos. Las moléculas se unen entre sí a través de uniones puente de hidrógeno.
2.
Ácidos húmicos (AH): también se extraen en solución alcalina, pero precipitan a pH 2,0. Su peso molecular oscila entre 10.000 y 100.000. Contienen anillos aromáticos y compuestos nitrogenados cíclicos. Se unen a cadenas de péptidos y su estructura aún no se conoce. Estos humatos se unen a arcillas a través de cationes polivalentes, como calcio y magnesio. Humina: no es extraíble con NaOH. Está formada por ácidos fúlvicos y ácidos húmicos combinados con materia orgánica insoluble en diferentes estados de descomposición. Es una sustancia extremadamente compleja y heterogénea, y constituye la mayor parte de la materia orgánica del suelo.
3.
Biodegradación de las sustancias húmicas. La deshumificación. El humus es también muy resistente a la degradación biológica. Sin embargo, existen muchos microorganismos que pueden descomponer lentamente los AH. Los más activos son los hongos basidiomicetes y los actinomicetes, quienes también descomponenen la lignina. Su degradación, al igual que la de la lignina, ocurre bajo condiciones de co-metabolismo, en presencia de fuentes de carbono fácilmente asimilables, tales como glucosa y pentosas, aunque existen excepciones. El primer estudio que demostró la degradación microbiana de los AH fue el de Hurst y col. (1962), que informaron que los hongos basidiomicetes que colonizan madera Trametes versicolor y Hypholoma fasciculare fueron capaces de decolorar los AH del suelo. Esto también se observó con Streptomyces y fue asociado a la actividad de peroxidasas (Dari et
al., 1995) siendo mayor la degradación bajo condiciones de burbujeo con oxígeno y dependiente de la adsorción de los AH a la superficie de la célula microbiana.También fue necesaria la presencia de glucosa en el medio, ya que sin ella no hubo degradación. Por su parte Gramss et al. (1999) aislaron hongos y bacterias capaces de degradar una fracción húmica que se obtuvo por solubilización en álcali (ácidos húmicos). Esos microorganismos fueron identificados como hongos basidiomicetes degradadores de maderas,
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hongos formadores de ectomicorrizas, microhongos, y eubacterias. La degradación también se asoció con la actividad de peroxidasas, β-glucosidasas y la acción de oxidantes abióticos como el peróxido de hidrógeno.
A continuación se presenta un estudio de caso de la degradación de AH por un hongo habitante del suelo.
Degradación de ácidos húmicos por e l hongo basidiomicete Collybia d ryophil a. Steffen y col. (2002) Degradation of humic acids by the litter-decomposing basidiomycete Collybia dryophila. App. Environ. Microbiol. 68: 3442-3448. El trabajo que analizaremos es muy interesante ya que, en general, los microorganismos que degradan AH tienen su hábitat en maderas, troncos, etc., y por lo tanto dicha actividad se halla muy relacionada con la lignolisis. Sin embargo, Steffen et al. (2002) estudiaron la capacidad de degradar AH del hongo basidiomicete Collybia dryophila que es un habitante del suelo, y que no sería considerado un hongo lignolítico en sentido estricto. Este hongo es una especie muy común en bosques de Europa y Norteamérica, creciendo en diferentes estratos de la broza de coníferas y otros árboles de hojas caducas. Fue aislado de basidiocarpos y se creció en un sustrato compuestopor acículas, ramas, musgo y partículas de suelo rico en humus. Los aislamientos obtenidos se crecieron en agar extracto de malta al 2%, con el agregado de cloranfenicol y benomil para inhibir el crecimiento de bacterias y hongos, respectivamente. Los AH que se utilizaron en esta investigación se obtuvieron por extracción alcalina de la broza depositada en el suelo del bosque. Para estudiar la mineralización se utilizaron AH marcados con 14C, midiéndose la liberación de 14CO2 y también, midiendo la decoloración (A 450 nm) en medio líquido. La decoloración se produce por la depolimerización de los AH y su conversión en otros compuestos. Otro aspecto estudiado en este trabajo fue la necesidad o no de la presencia de Mn2+ para la mineralización de los AH. En la figura 6 se muestran los resultados obtenidos con y sin agregado de Mn 2+al medio de cultivo. Sin Mn2+ el hongo mineralizó cerca del 20 % de los AH, mientras que el 35 % lo incorporó en su biomasa o quedó estrechamente unido a la superficie celular. El agregado de Mn2+ al medio de cultivo indujo un aumento en la degradación de aproximadamente un 50% y además, redujo la cantidad de AH asociados al micelio del hongo (dato no mostrado). En estudios previos de otros autores, se observó que enzimas extracelulares del tipo de lacasas y peroxidasas estarían involucradas en la mineralización de los AH, y que las mismas necesitan de la presencia de Mn2+ para exhibir su mayor actividad. Analizando los resultados de la figura 6 podemos concluir que los mismos coinciden con los antecedentes previos que había en la literatura.
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Figura 6. Mineralización de 14C-Ácidos húmicos por Collybia dryophila en cultivo líquido. Círculos llenos: hongo en medio suplementado con Mn 2+; círculos vacíos: hongo en medio sin suplemento de Mn2+, diamantes: control, sin hongo. Los datos son el promedio de tres repeticiones y las barras el desvío estándar.
Los resultados del estudio enzimático se muestran en la figura 7. El hongo C. dryophila excretó al medio una peroxidasa dependiente de la presencia de Mn 2+ (Mn-peroxidasa) y una lacasa. La disponibilidad de manganeso resultó crítica para la actividad de la peroxidasa. Las actividades de ambas enzimas fueron muy bajas sin el agregado de Mn 2+, 30 U/l para la Mn-P y 9 U/l para la lacasa (fig. 7 A). Con el agregado de Mn 2+ la actividad de la peroxidasa aumentó significativamente (de 30 U/l a 80 U/l), mientras que la actividad de la lacasa no se vio modificada (fig. 7 B). La presencia de AH en el medio de cultivo también estimuló la actividad de ambas enzimas (figura 7 C), obteníendose los valores más altos cuando el medio tenía Mn 2+ y AH (fig. 7 D). Los resultados obtenidos pusieron en evidencia la capacidad de este hongo para mineralizar AH tanto naturales como los sintéticos, siendo esto últimos preparados a partir de catechol. Los autores concluyen que este hongo podría jugar un rol importante en el reciclado del carbono orgánico que forma parte del humus del suelo y que además podría tener promisorias aplicaciones biotecnológicas.
Mineralización de las sustancias carbonadas y la fertilidad de los suelos Los microorganismos que mineralizan las sustancias carbonadas de los materiales vegetales en el suelo son comunes en áreas de cultivo y en zonas forestales así como en tejidos vegetales en descomposición. La microflora responsable presenta una alta heterogeneidad fisiológica, lo cual permite que este tipo de transformaciones tenga lugar en hábitats muy diversos: sitios con o sin O2, en medios de pH ácido o alcalino, y temperaturas cercanas al punto de congelación y hasta los 65C. Por todo esto, entre las bacterias celulolíticas hay especies mesofílicas, aerobias y anaerobias, hongos filamentosos, bacterias termofílicas y actinomicetes. En condiciones naturales ellos ejercen una acción común, en diferentes momentos y condiciones, siendo el resultado final el producto de estas complejas comunidades.
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Los microorganismos aerobios convierten la celulosa en: CO 2 + H2O + material celular (nuevas células en crecimiento). Las sustancias carbonadas extracelulares producidas pueden constituirse en elementos cementantes, tales como cápsulas, gomas y mucílagos microbianos. Los mismos favorecen a la estructuración del suelo pues mantienen las distintas partícul edáficas unidas y/o cementadas formando los agregados.
l)/ U ( a s a c c a l , a s a d i x ro e -p n M l)/ U ( a s a c c la a s a id x o r e
m n 0 5 4 a ia c n a rb o s b A
-n p M Días de cultivo
Días de cultivo
igura 7. Actividad de Mn-peroxidasa (círculos llenos) y lacasa (diamantes llenos) del ultivo de C. dryophila en medio líquido y decoloración de los AH de la broza diamantes vacíos). Los datos corresponden al promedio de tres repeticiones y las arras al desvío estándar. A: medio sin Mn2+ ni HA. B: medio con 200 µM de Mn 2+ MnCl2) sin AH. C: medio con 250 mg de AH pero sin Mn 2+. D: medio con 200 µM de n2+ (MnCl2) y 250 mg de AH. C y D: decoloración de los AH por medición de la isminución de la absorbancia a 450 nm. Cada dato corresponde al promedio de tres epeticiones y las barras al desvío estándar.
En general, los hongos son los principales causantes de la degradación de la celulosa en suelos húmedos y en zonas forestales, mientras que las bacterias tienen mayor peso en los suelos agrícolas y en lasloszonas discutido que muchos hongos parecenbajo ser cultivos capaces de descomponer restossemiáridas. leñosos y Hemos la madera de los bosques así como de degradar totalmente la celulosa, lo que marca un contraste con las bacterias, porque en ellas, la posesión de todas las enzimas necesarias para degradar la celulosa es bastante rara. En anaerobiosis las bacterias celulolíticas, mayormente miembros del género Clostridium, descomponen la celulosa con producción de ácidos orgánicos: acético, fórmico,
láctico y butírico, que resultan un buen sustrato para otros microorganismos del suelo, y que si persisten las condiciones anaerobias, esos ácidos grasos volátiles (AGV) pueden dar lugar a la
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generación de metano. Estos microorganismos se hallan en suelos anegados, micrositios anaerobios de suelos aerobios, fango de ríos y ciénagas. Los microorganismos anaerobios tanto mesófilos como termófilos, al liberar compuestos que serán sustrato para otros microorganismos, contribuyen con fuentes de energía para el reciclado de los nutrientes. En todos los procesos mencionados, no sólo los factores ambientales, como rangos de pH y temperatura, afectarán la velocidad de reacción de las enzimas implicadas, sino que la velocidad de desaparición del sustrato o formación de productos, estará regida también por el tipo de suelo, estación del año, y tipos de vegetación (Alexander, 1980). Las enzimas presentes en el suelo pueden provenir de diversos orígenes (Meeting, 1993). Sin embargo, debido a que la mayoría y de las enzimas son de srcen microbiano, otros factores que rigen el tamaño de la comunidad tendrán influencia en la actividad enzimática (Alexander, 1980).
Degradación de restos orgánicos en condiciones anaerobias. La producción de Biogás y su aprovechamiento. La digestión anaeróbica de la materia orgánica es un proceso que ocurre en forma espontánea en la naturaleza y forma parte del ciclo biológico del Carbono. Gracias a las enzimas de los diferentes microorganismos, los residuos orgánicos sufren reacciones de hidrólisis, fermentación, acetogénesis y metanogénesis (Brock, Biología de los Microorganismos, 2008) (fig.1). La interacción que se establece entre diferentes grupos metabólicos de procariotas permite la generación de metano (biogás) a partir de sustancias de elevado peso molecular. En la hidrólisis de los polímeros participa un consorcio complejo de microorganismos cuyas enzimas extracelulares (celulasas, celobiasas, xilanasas, amilasas, lipasas y proteasas) hidrolizanlibre. las moléculas complejas. molécula de es hidrolizada en celobiosa glucosa Hasta cinco grupos La metabólicos de celulosa procariotas pueden participar de lay fermentación de la celulosa. La mayor parte de estos microorganismos son bacterias anaerobias estrictas tales como las pertenecientes a los géneros Acetovibrio, Clostridium y Ruminococcus. También actúan algunas bacterias anaerobias facultativas como Pseudomonas (Doi 2008). A este grupo de bacterias se las denomina celulolíticas e hidrolíticas. Los monómeros resultantes de la hidrólisis de las moléculas complejas, por acción de las bacterias fermentadoras primarias, dan lugar a la aparición de H2 y CO2, ácido acético y ácidos grasos volátiles (AGV: propiónico, butírico y succínico) (fig. 1). Posteriormente, por un segundo proceso de fermentación, enelque actúan bacterias oxidantes de AGV y productoras de H2, esos AGV son transformados en acetato, CO 2 e H2, y finalmente, las arqueas metanógenas convierten esos productos en gas metano (fig. 1). Otra alternativa es la producción de metano directamente a partir de acetato. Esto se debe a la acción de bacterias fermentativas sobre los monómeros y la consecuente producción de CO2 e H2. Luego, actúan bacterias homoacetogénicas que sintetizan acetato, el cual finalmente es reducido a metano por las arqueas metanogénicas (fig. 1). El biogás, formado por una mezcla de metano (CH4), dióxido de carbono (CO 2) y diversas impurezas, es un combustible renovable de alta calidad que se obtiene cuando los microorganismos descomponen la materia orgánica en ausencia de oxígeno. La producción de metano la realizan los metanógenos, microorganismos del dominio Archaea, los cuales son anaerobios estrictos. La mayoría de ellos usan al CO 2 como aceptor final de electrones en la respiración anaeróbica, reduciéndolo a CH4 y el donante de electrones es generalmente el H 2. La reacción en esta vía metabólica es la siguiente:
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También otros sustratos pueden convertirse a metano, por ejemplo el metanol (CH3OH), el formiato (HCOO) y las metilaminas. La producción de CH 4 depende de la generación de esos sustratos por otros microorganismos que descomponen la materia orgánica compleja en condiciones de anaerobiosis. Todo el H2 que producen los procesos fermentativos primarios es consumido inmediatamente por las metanogénicas, las homoacetogénicas o las reductoras de sulfato (en ambientes con arqueas altas concentraciones de sulfato). Los organismos que resultan clave en la conversión de la materia orgánica compleja en metano son los fermentadores secundarios, especialmente las bacterias oxidadoras de los AGV productoras de H2 (fig. 1). Las bacterias productoras de H2 ven favorecido su crecimiento cuando se asocian con organismos consumidores de H 2 (ej. metanógenas, homoacetógenas y reductoras de sulfato). Bacterias de los géneros Syntrophomonas y Syntorphobacter realizan estas fermentaciones secundarias y su nombre se debe a la necesidad que tienen de establecer relaciones sintróficas con otras bacterias, las cuales consumen el H 2 que ellas producen. Estas reacciones de transferencia interespecífica de hidrógeno son las que determinan la velocidad de la conversión de los polímeros complejos en metano. Salvo la microbiota celulolítica, los restantes grupos microbianos dependen unos de otros, transfiriéndose el H 2 entre especies hasta llegar a la formación de CH4 (fig.1). En general, en la naturaleza, las comunidades sintróficas forman sedimentos u otros agregados que contienen varios productores y consumidores de H 2 asociados.
Hábitats de microorganismos metanogénicos Estos organismos tienen una amplia distribución en la Tierra. Los eructos de los rumiantes y el CH4 liberado en las zonas pantanosas y encharcadas son las fuentes principales de metano. Sin embargo, existen otros hábitats considerados óxicos donde la producción de metano se lleva a cabo en microambientes anóxicos (por ej., en el interior de un agregado de suelo). La producción de metano puede ser abiogénica (minería del carbón, escapes industriales, combustión de biomasa, volcanes, etc.) o biogénica (rumiantes, termites, suelo pantanosos, humedales, vertederos de basura, etc.). En ambientes acuáticos también existe metanogénesis, sobre todo de aguas dulces. Los valores elevados de sulfato en aguas y sedimentos marinos determinan que el acetato y el H 2 sean utilizados por las bacterias reductoras de sulfato, las cuales son mejores competidoras que las metanogénicas por esos sustratos.
Cultivo de microorganismos metanogénicos Se ha aislado una gran variedad de metanogénicos pertenecientes a diferentes géneros, los cuales morfológicamente pueden presentarse como bacilos cortos o largos, cocos en varios tipos de agrupaciones, filamentosos y algunos tienen forma de placa. El crecimiento de estos microorganismos se ve estimulado cuando en el medio hay también acetato, mientras que algunas especies requieren de la presencia de aminoácidos. Bajo condiciones de laboratorio
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algunos metanogénicos necesitan de agregados complejos como el extracto de levadura Polímeros complejos Celulosa, otros polisacáridos, proteínas y lípidos Bacterias celulolític as y otras bacterias hidrolíticas
Hidrólisis
Monómeros Azúcares, aminoácidos Bacterias fermentativas
H2 + CO2
Homoacetógenos
Fermentación
Acetato
Acetogénesis
Acetato
AGV= Propionato; Butirato; Succinato y Alcoholes
Bacterias oxidantes de ácidos grasos y productoras de H2 (sintrofos)
Fermentación
Metanógenos Metanogénesis Metanógenos
H2 + CO2
Acetato
Metanógenos
CH4
Figura 1. Descomposición anaeróbica de la materia orgánica y producción de metano. Fuente: Brock, Biología de los Microorganismos, Cap. 14, Edición 2008).
o hidrolizados de caseína. Por su parte los microorganismos metanogénicos del rumen
necesitan para crecer una mezcla de ácidos grasos de cadena ramificada. Como fuente de nitrógeno utilizan el NH4+, y algunos fijan N2. Además, muchos requieren de la presencia de Fe, Co y Ni para un adecuado crecimiento.
Composición del Biogás La composición del biogás depende del tipo de residuo orgánico utilizado para su producción y de las condiciones en que ese residuo se procesa. En el cuadro 1 se resume la composición promedio del biogás según la fuente que lo srcina. El valor calorífico varía entre 17 y 34 MJ/m3 según el contenido de CH4. La mezcla de gases obtenida debe purificarse si va a ser utilizada como combustible en motores de explosión. Para ello se eliminan el gas carbónico haciendo burbujear el biogás a través de agua y el ácido sulfhídrico haciéndolo burbujear a través de una solución de soda cáustica en agua que contiene sulfato de cobre disuelto, o pasándolo por una trampa de limadura de hierro (esponjilla de alambre), o con la introducción de pequeñas cantidades de aire (3% a 5% del volumen del depósito para el biogás) reduciendo así en un 95% el ácido sulfhídrico producido. La humedad se elimina circulando el biogás entre cloruro de calcio o silica gel.
Principales factores que afectan a la producción de biogás en un digestor Diversos factores afectan a la actividad metabólica microbiana involucrada en el proceso metanogénico. Los más importantes son: el tipo de sustrato o materia prima (nutrientes disponibles), el nivel de acidez (pH), la temperatura del sustrato, la agitación o el grado de mezclado, el tiempo de retención (TR), la presencia de compuestos inhibidores y la relación
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Carbono/Nitrógeno. A continuación se detallan cómo influyen cada uno de estos factores en la producción de biogás. Tipo de materia prima: La materia prima fermentable puede ser desechos agrícolas, lodos
cloacales, aguas residuales orgánicas de las industrias y basuras de diferentes tipos (cuadro 1). El proceso microbiológico requiere de fuentes de carbono y nitrógeno y también de sales minerales (azufre, fósforo, potasio, calcio, magnesio, hierro, manganeso, molibdeno, zinc, cobalto, selenio, tungsteno, níquel y otros). Normalmente las sustancias orgánicas como el estiércol y lodos cloacales presentan estos elementos en proporciones adecuadas. Sin embargo, en la digestión de ciertos desechos industriales puede ser necesaria la adición de los metales enumerados. Las sustancias con alto contenido de lignina deben someterse a tratamientos previos (cortado, macerado, compostado) a fin de liberar los componentes que puedan ser transformados. En lo atinente a estiércol animal la degradación dependerá fundamentalmente del tipo de animal y de la alimentación que haya recibido. A modo ilustrativo, el cuadro 2 muestra la cantidad de estiércol producido por distintos tipos de animales y el rendimiento en gas en litros (L) tomando como referencia el kilogramo de sólidos volátiles (Kg.S.V). pH: El pH óptimo para la digestión está entre 7,0 y 7,2, aunque el rango satisfactorio va de 6,6 a
7,6. La digestión microbiana comienza a inhibirse a pH 6,5. Una vez que se ha estabilizado un digestor, el lodo queda amortiguado, es decir la concentración de protones no varía aun cuando se añadan cantidades relativamente grandes de ácido o álcali. Si esta capacidad de amortiguación se destruye y el pH disminuye cesa la metanogénesis. Las bacterias metanogénicas solo podrán multiplicarse cuando haya avanzado la fermentación de los substratos primarios por acción de las bacterias fermentativas y se haya consumido todo el oxígeno disuelto, de manera que el potencial redox haya alcanzado un valor menor a -200 mV. El pH no debería bajar demasiado (por ejemplo debido a los ácidos producidos por los Clostridium) como para inhibir el crecimiento de las bacterias metanogénicas. La concentración de ácidos grasos volátiles no debería superar los 2 a 3 g/L, expresados como ácido acético. Si el valor es mayor, la digestión se interrumpirá en dos o tres días debido a que los metanogénicos no pueden utilizar los ácidos a la misma velocidad con que éstos se producen. Cuadro 1 . Composición del biogás en función del sustrato fermentado. Fuente: Adaptado de Carrillo Leonor, Microbiología Agrícola, Universidad Nacional de Salta.
Gases
Metano CO2
H2S
Lodos
Rellenos
agrícolas
cloacales
sanitarios
50-80%
50-80%
45-65%
30-50%
Vapor de agua Hidrógeno
Desechos
20-50%
34-55%
Propiedades
combustible ácido, asfixiante
saturación
saturación
saturación
corrosivo
0-2%
0-5%
0-1%
combustible
100-7000ppm
0-1%
0,5-100ppm corrosivo, olor, tóxico
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Amoníaco
trazas
trazas
trazas
corrosivo
CO
0-1%
0-1%
Trazas
toxico
Nitrógeno
0-1%
0-3%
0-20%
inerte
Oxígeno
0-1%
0-1%
0-5%
corrosivo
Cuadro 2. Cantidad de estiércol producido según la especie animal y características del mismo. Fuente: INTA.
Especie
Peso Vivo
Kg. Estiércol/día
L/Kg.S.V
% CH4
Cerdos
50
4,5-6
340-550
65-70
Vacunos
400
25-40
90-310
65
Equinos
450
12-16
200-300
65
Ovinos
45
2,5
90-310
63
Aves
1,5
0,06
310-620
60
Caprinos
40
1,5
110-290
--
Temperatura: Las bacterias metanogénicas son sumamente sensibles a los cambios ambientales, especialmente a una disminución repentina de solo unos pocos grados de temperatura. La actividad biológica y por lo tanto la producción de gas aumenta con la temperatura. Se debe tener en cuenta que a diferencia de la digestión aeróbica, la cual produce desprendimiento de calor, la fermentación no lo produce. Por ello los digestores que trabajan a temperaturas meso y termofílicas poseen generalmente sistemas de calefacción, aislamiento y control, los cuales podrían ser obviados en digestores rurales económicos lográndose una menor eficiencia en la producción de biogás. La gama de temperatura para la digestión anaeróbica tiene dos zonas óptimas una mesófila (30-40°C) y otra termófila (45-60°C). Casi todos los digestores funcionan dentro de los límites de temperaturas mesófilas y la digestión óptima se obtiene a 35°C. La velocidad de digestión a temperaturas superiores a 45°C es mayor que a temperaturas más bajas. A temperaturas superiores a 60ºC la producción de CH 4 decae rápidamente. Agitación – mezclado: Los objetivos buscados con la agitación son la remoción de los metabolitos producidos por las bacterias metanogénicas, el mezclado del sustrato fresco con la población bacteriana, evitar la formación de costras que se forman dentro del digestor, uniformar la densidad bacteriana, evitar la formación d e espacios “muertos” sin actividad biológica y aumentar la producción de biogás. Existen varios mecanismos de agitación utilizados desde los más simples que consisten en un agitado-mezclado manual o el provocado por la entrada y salida de los líquidos, hasta el uso de equipos sofisticados que involucran agitadores a hélice, recirculadores del sustrato e inyectores de gas.
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Tiempo de retención (TR): Es el tiempo medio de permanencia del sustrato en el reactor o digestor, para ser degradado por la acción de los microorganismos. El TR está íntimamente ligado con dos factores: el tipo de sustrato y la temperatura del mismo. Su valor puede ser obtenido dividiendo el valor de la capacidad del biodigestor por la tasa a la cual la materia orgánica es introducida en el digestor. La selección de una mayor temperatura implicará una disminución en los TR requeridos y consecuentemente serán menores los volúmenes de reactor necesarios para digerir una determinada cantidad de material. En un digestor donde los residuos permanecen 12 días la producción de gas por unidad de sólidos volátiles totales añadidos diariamente es 20% mayor a 45°C que a 35°C.
En los climas cálidos los digestores pueden funcionar sin calefacción pero hay que aumentar el tiempo de retención. La regulación de la temperatura puede lograrse haciendo circular agua caliente a través del tanque por medio de termointercambiadores. Inhibidores: Los microorganismos metanogénicos son considerados más sensibles a inhibidores que los otros microorganismos participantes en el proceso de degradación anaeróbica. La presencia de metales pesados, antibióticos y detergentes pueden inhibir e incluso interrumpir el proceso fermentativo. Cuando es demasiado alta la concentración de ácidos volátiles (más de 2.000 ppm para la fermentación mesofílica y de 3.600 ppm para la termofílica) se inhibirá la digestión. También una elevada concentración de nitrógeno y amoníaco destruye a las bacterias metanogénicas. Los organismos metanogénicos son sensibles a los antibióticos que afectan la síntesis de proteínas o lípidos y a los que interfieren con la función de la membrana citoplasmática. Los antibióticos empleados en las explotaciones agropecuarias llegan a los excrementos animales pero, como ocurre también con los antihelmínticos, no suelen afectar mayormente la digestión debido a la dilución con materiales no tóxicos. Relación C/N: Una relación C/N de 16/1 se considera óptima para una buena
producciónbiogás de gasa yvalores para una fermentación estable losnoexcrementos animales, aunque obtenerse mayores de relación C/Nde ésta debería superar el valor 30/1. puede En el cuadro 3 se muestra la relación C/N de varios materiales residuales. Cuadro 3. Relación C/N de diversos materiales utilizados como sustratos en un biodigestor. Fuente: Adaptado de Carrillo Leonor, Microbiología Agrícola, Universidad Nacional de Salta.
Contenido de nitrógeno y relación C/N en varios residuos De srcen animal
C/N
%N
Estiércol equino
25
2,3
Heno
Estiércol vacuno
18
1,7
Alfalfa
Estiércol de corral
14
2,15
6-10
5,5-6,5
Heces humanas
De srcen doméstico Basura en general
25
2,2
Cáscara de papas
25
1,5
De srcen vegetal
C/N
%N
12
4
16-20
2,4-3
Algas marinas
19
1,9
Restos de lino
58
1,0
Paja de trigo
128
0,3
Aserrín
511
0,1
119
Condiciones para la utilización del biogás Cuando el CH4 se produce en contenedores cerrados, llamados biodigestores, éste puede ser utilizado directamente como combustible en reemplazo del gas natural o bien indirectamente, para generar energía eléctrica. La construcción de biodigestores ha sido una práctica antigua en varias zonas rurales del mundo, especialmente en Asia. En los últimos años en América Latina ha crecido el interés por esta tecnología para generar combustible y tratar ecológicamente los residuos orgánicos. El proceso en un biodigestor difiere de otros tipos de fermentaciones ya que no es necesario utilizar cultivos puros de microorganismos. Las diversas bacterias capaces de descomponer las sustancias orgánicas y producir biogás están ampliamente distribuidas en la naturaleza y son aportadas en los mismos residuos orgánicos en descomposición. Pueden emplearse diversos materiales orgánicos tales como residuos vegetales, estiércol, basura doméstica, algas, efluentes de las industrias de alimentos, etc. Durante la bioconversión de materiales orgánicos a CH 4, las diferentes etapas tienen distinta velocidad: la degradación de la celulosa ocurre en semanas, la de las hemicelulosas y proteínas en días y la de las moléculas pequeñas, como azúcares, ácidos grasos y alcoholes, en horas. En cambio la lignina no es degradada en la mayoría de los sistemas de digestión anaeróbica.
Aplicaciones del Biogás La aplicación del biogás en el área rural ha sido muy importante y dentro de ella se pueden diferenciar dos campos claramente distintos. En el primero, el objetivo buscado es producir energía, sanidad y fertilizantes orgánicos para los agricultores de zonas marginales o para productor medio de los de países con sectores muy bajosdesarrollada ingresos y difícil acceso a laselfuentes convencionales energía. En este rurales caso ladetecnología ha buscado lograr digestores de mínimo costo y mantenimiento, fáciles de operar pero con eficiencias pobres y bajos niveles de producción de energía. El segundo tipo de tecnología está dirigido al sector agrícola y agroindustrial de ingresos medios y altos. El objetivo buscado en este caso es brindar energía y solucionar graves problemas de contaminación. Los digestores de alta eficiencia desarrollados para esta aplicación tienen un mayor costo inicial y poseen sistemas que hacen más complejo su manejo y mantenimiento. CAPÍTULO 8
LOS MICROORGANISMOS Y EL NITRÓGENO Ciclo del Nitrógeno. Utilización del nitrógeno por los microorganismos: formas nitrogenadas orgánicas e inorgánicas del suelo. Mineralización: aminización, amonificación. Inmovilización. Nitrificación. Desnitrificación. Fijación biológica simbiótica de nitrógeno: métodos de medición. Biología de Rhizobium y Bradyrhizobium. Grupos de inoculación cruzada. Mecanismo de infección en la interacción rizobio-leguminosa. Regulación génica de la nodulación. Regulación de la fijación de nitrógeno. Producción de inoculantes para leguminosas. Otras asociaciones microbianas de importancia agrícola. Fijación simbiótica de nitrógeno: Frankia. Fijación no simbiótica de nitrógeno: Azospirillum, Azotobacter.
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Material de estudio: Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biología de los Microorganismos, 8a edición. Prentice Hall. Capítulo 14 (14.14 y 14.23)
Introducción El nitrógeno (N) es un nutriente esencial para el crecimiento de todos los organismos vivos ya que forma parte de las moléculas de proteínas, ácidos nucleicos y muchas otras de mediano y bajo peso molecular, indispensables para el normal desarrollo del metabolismo celular. Constituye entre el 0,3% y el 5% del peso seco de los vegetales. El 98% del N de la tierra se encuentra formando parte de rocas y minerales de la corteza y por lo tanto no asequible para los organismos vivos. Solamente el 0,01% del N en la tierra se encuentra en la biosfera, como componente de los organismos vivos. Por otra parte, a pesar de que aproximadamente el 78% de la atmósfera terrestre está formada por N 2, éste constituye solamente el 1,9% de la masa total de N en la Tierra. El N atmosférico se encuentra mayoritariamente en forma de N 2, con los dos átomos de N unidos covalentemente por medio de una triple ligadura. Esta molécula sólo puede ser metabolizada por algunos microorganismos, por lo tanto esta forma de N no es inmediatamente asequible a las plantas superiores. Éstas solamente pueden utilizar el N proveniente de formas combinadas, como el NO3-, NO2-, NH4+ o aminoácidos y compuestos orgánicos de bajo peso molecular. Estas formas nitrogenadas son metabolitos producto de la degradación de la materia orgánica, y se encuentran en bajas concentraciones en la solución del suelo. Dado que el N es el nutriente requerido en mayor cantidad por las plantas, en el suelo se produce una gran demanda de compuestos nitrogenados, lo cual determina su rápido ciclado en el ecosistema. El N asimilable disponible es absorbido por las raíces de los vegetales principalmente en forma de nitrato. Éste posteriormente es reducido y es incorporado a las estructuras de la planta como N orgánico, la cual es luego ingerida por los animales herbívoros. La mayor parte del N orgánico vuelve al suelo por medio de las deyecciones durante la vida del animal, los restos vegetales y los exudados radicales. Luego de su muerte, los compuestos de N orgánico acumulados por animales y plantas retornan al suelo por medio de la descomposición. Allí es liberado nuevamente bajo formas inorgánicas por la acción microbiana, que serán reabsorbidas por otros organismos, liberadas a la atmósfera, o lavadas a los horizontes inferiores del suelo. Todos estos procesos ocurren simultáneamente, a velocidades variables, y el resultado es la cantidad de N disponible para el crecimiento de las plantas.
FRACCIONES NITROGENADAS DEL SUELO Nitrógeno inorgánico Las formas de N más fácilmente asimilables para las plantas y microorganismos son las moléculas solubles, de bajo peso molecular, como el nitrato (NO 3-) y el amonio (NH4+). El NO3es extremadamente soluble, y al ser un anión, es poco adsorbido por las cargas negativas de las partículas de arcilla y por lo tanto es fácilmente lavable por las precipitaciones a los horizontes inferiores del suelo. A este proceso se lo conoce como lixiviación. Por su parte el NH4+, al ser un catión, se adsorbe rápidamente sobre las partículas de algunas arcillas y por lo tanto es mucho menos lavado por lixiviación.
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También forma parte de esta fracción el nitrito (NO 2-), en concentraciones menores, pero que pueden ser elevadas bajo condiciones de baja concentración de oxígeno donde el proceso de nitrificación esta globalmente reducido. Además, existen en el suelo concentraciones bajas de óxido nitroso (NO 2) y de óxido nítrico (NO), que se pierden a la atmósfera a través de la desnitrificación.
Nitrógeno orgánico libre Esta fracción la integran aminoácidos y aminoazúcares, compuestos nitrogenados de bajo peso molecular, que pueden ser absorbidas por las raíces a partir de la solución del suelo. Otros compuestos orgánicos libres de alto peso molecular, tales como proteínas, no pueden ser absorbidos por las plantas.
Nitrógeno unido a la materia orgánica del suelo La materia orgánica del suelo es un concepto mal definido que se utiliza para englobar los materiales orgánicos en diferentes estados de descomposición. Podemos distinguir dos fracciones principales. La primera fracción incluye aquellos materiales orgánicos de rápida descomposición, como residuos de cosechas, y donde podrían incluirse hasta los cuerpos de los organismos del suelo, que mientras viven retienen su N. La descomposición bacteriana de estos residuos produce una gran pérdida de carbono, el cual es utilizado como sustrato respirable. La segunda fracción está formada por el humus, el cual está formado por un complejo de moléculas de diferente peso molecular. Es muy estable, de lenta descomposición, compuesto mayormente por derivados fenólicos de la lignina y/o otras sustancias que se polimerizan, y que no es utilizado como fuente de carbono por la mayoría de los microorganismos. El N que se encuentra como N orgánico formando parte del humus, constituye la mayor fracción del N en el suelo. Aunque existen diferencias entre suelos, en general alcanza al 90% del N total. Es el gran reservorio de N del suelo, y está en equilibrio con las otras fracciones nitrogenadas. Sin embargo el N no es accesible para las raíces. La interconversión de las distintas fracciones de N en el suelo las llevan a cabo los microorganismos del mismo. Su relevancia agronómica y ambiental, así como los procesos involucrados, serán analizados a continuación.
MINERALIZACIÓN El N almacenado en la materia orgánica del suelo se transforma en N inorgánico, que queda libre y disponible para el crecimiento de las plantas y organismos. Este proceso, conocido como mineralización, se produce por medio de dos reacciones principales: aminización y amonificación. 1) Aminización Comprende la degradación de las proteínas de la materia orgánica a compuestos orgánicos aminados de bajo peso molecular. Es llevada a cabo por numerosos organismos, principalmente hongos y bacterias, que obtienen a cambio energía y productos necesarios para su crecimiento. La hidrólisis de las proteínas es llevada a cabo enzimáticamente por proteasas y peptidasas. Esta hidrólisis ocurre por sustitución nucleofílica, donde el sitio activo de la enzima se une al átomo de C electrofílico del grupo carbonilo (C=O) del péptido. Al mismo tiempo el átomo de N es desplazado y recibe un protón donado por el agua o la enzima.
122
Si el producto de la reacción es otro péptido, el proceso se repetirá, hasta que todos los aminoácidos sean liberados. Las proteinasas (o proteasas) peptidasas tienenmicroorganismos amplia distribución el suelo, y pueden tener diversos orígenes. Si bien yexisten numerosos en elensuelo capaces de hidrolizar proteínas, las variaciones estacionales de la población microbiana no coinciden con los cambios en la actividad proteolítica del suelo. Gran parte de la actividad proteolítica podría provenir de plantas o animales, aunque no se conoce hasta qué punto contribuiría cada una de las fuentes a la actividad total. Además, estas enzimas pueden ser estabilizadas en el suelo, y permanecer activas en forma libre mucho tiempo después de que el organismo que las srcinó haya sido totalmente descompuesto. 2) Amonificación Consiste en la liberación del N de los compuestos aminados, principalmente aminoácidos. Es llevada a cabo por numerosos microorganismos heterótrofos que obtienen energía de la oxidación de estos compuestos. La desaminación oxidativa de los aminoácidos está catalizada por deshidrogenasas y oxidasas de aminoácidos. Ambas reacciones involucran la oxidación inicial del aminoácido, la formación de un aminoácido intermediario, y finalmente la liberación de un cetoácido y NH 4+. +
+
Sin embargo, mientras que la deshidrogenasa utiliza NAD como de electrones y H , la oxidasa contiene flavoproteínas, donde el flavín nucleótido (FAD)aceptor es inicialmente reducido, y posteriormente reoxidado por el O2 con formación de H2O2.
Reacción de la deshidrogenasa:
Reacción de la oxidasa:
Los aminoazúcares, por otro lado, se encuentran en el suelo principalmente formando parte de polímeros, como la quitina o los peptidoglicanos, y la liberación de NH4+ requiere su previa hidrólisis a amino-monosacáridos. Esta reacción se lleva a cabo por medio de aminoglican-hidrolasas. Los amino-monosacáridos así formados son degradados por medio de
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una serie de reacciones que liberan NH 4+. El esqueleto carbonado continúa luego la vía oxidativa de la glicólisis.
Hidrólisis de la urea. La urea del suelo proviene principalmente de las excretas de los animales y de las prácticas de fertilización. Es hidrolizada a CO 2 y NH4+ por medio de las enzimas ureasas. Estas son enzimas extracelulares producidas tanto por los microorganismos (bacterias, hongos y actinomicetes) como por las raíces de los vegetales.
La unión de la enzima con compuestos orgánicos e inorgánicos del suelo le confiere a la misma diferentes grados de estabilidad, pudiendo ésta permanecer activa en el suelo por largo tiempo.
Amonio en el suelo El NH4+ liberado por los procesos previos mencionados puede ser absorbido por las raíces, oxidado a NO2- y NO3-, reasimilado por los microorganismos del suelo, o fijado sobre las arcillas. El NH3 es un compuesto volátil, que se evapora a la atmósfera. En el rango de pH observado normalmente en el suelo (5-6,5), el NH 3 en solución se protona, transformándose en NH4+. Este se encuentra en equilibrio con la fracción de amonio adsorbido sobre las arcillas, y con la fracción gaseosa:
La mayor parte del NH4+ se encuentra adsorbida sobre las arcillas, por lo tanto es poco susceptible de ser lixiviado por las precipitaciones a los horizontes inferiores del suelo. Sin embargo las pérdidas por volatilización pueden ser importantes. Estas van a depender de la diferencia entre la presión parcial de NH 3 en equilibrio con la solución del suelo, y la presión parcial de NH3 en la atmósfera. Estas presiones dependen, por un lado, de la temperatura del suelo, y por otro de la concentración de NH 3 y pH de la solución del suelo. Cuanto más alcalino sea el pH, y mayor la temperatura, mayores serán las pérdidas. Las pérdidas de amoníaco por volatilización pueden ser importantes en los campos de pastoreo, sobre todo porque este es un importante componente de entre las excretas animales. Según Freney y el Black (1988) esta volatilización puede alcanzar el 7 y el 27% del N de la orina, y entre 9 al 86% en lotes donde se aplican abonos orgánicos. En cultivos, las pérdidas varían de acuerdo con el tipo de fertilizante aplicado. Cuando se aplica NH 4+, en maíz se han medido pérdidas del 1 al 7% por hora del total del fertilizante aplicado. Cuando la aplicación se hace como urea, las pérdidas son menores.
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Inmovilización La materia orgánica del suelo es degradada por los microorganismos, liberando NH 4+. Este ión es el producto de excreción de todos los organismos heterótrofos del suelo que utilizan la materia orgánica como sustrato respiratorio. La cantidad de NH 4+ liberado al suelo va a depender de las proporciones respectivas de carbono y nitrógeno presentes en el suelo. Cuando se añade al mismo un sustrato de alto contenido proteico, tal como sangre desecada, el 80% del nitrógeno agregado se libera como NH 4+ y solo el 20% queda retenido por la biomasa bacteriana. Cuando se agrega además un sustrato de alto contenido en carbohidratos, como la celulosa, la población bacteriana la usará para aumentar su biomasa, y la cantidad de NH 4+ liberado será menor. Al agotarse ese sustrato respirable, los organismos morirán, y el nitrógeno será liberado. Que el nitrógeno del suelo en un determinado momento sea inmovilizado o liberado va a depender de la relación C/N del sustrato agregado al suelo (Fig. 1). En general, en un suelo en equilibrio, la relación C/N es aproximadamente 10/1. Cuando se agrega materia orgánica con una relación C/N mayor que 30 hay una inmovilización neta del N del suelo, que es utilizado por los microorganismos para aumentar su biomasa incorporando también los carbohidratos del material agregado. Posteriormente, al agotarse el sustrato respirable y producirse la muerte de los microorganismos, el nitrógeno acumulado es devuelto al suelo lentamente. Si la relación C/N de la materia orgánica agregada es menor que 20, se produce inicialmente una liberación de NH4+ durante el proceso de descomposición. Cuando se agrega (NH4)2SO4 o urea, la relación C/N de la materia orgánica activa baja y es relativamente poco el N que se inmoviliza del suelo. Sin embargo, no puede establecerse con certeza una relación C/N crítica que controle las tasas de mineralización/inmovilización, ya que las mismas también dependen del tipo de materia orgánica agregada (cantidad de lignina y polifenoles), de las características del suelo y de los factores ambientales. Nitrificación En el proceso de nitrificación, el NH4+ libre en el suelo es oxidado a NO2- en un primer paso, y luego el NO2- resultante continúa su oxidación hasta NO3-. Este proceso es llevado a cabo por bacterias autótrofas Gram negativas de la familia Nitrobacteriaceae. Todos los miembros de esta familia son aerobios obligados, adquieren su energía de la oxidación de NH 4+ o NO2- y obtienen su carbono del CO2 y carbonatos. La capacidad de oxidar NH4+ a NO2- en el suelo ha sido descrita en los géneros Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus y Nitrosovibrio. Nitrosospira y Nitrosomonas son los
géneros de mayor distribución en los suelos agrícolas. Sin embargo, la presencia de diferentes microclimas con condiciones diferentes en volúmenes limitados de suelo, permite la actividad de todos los géneros.
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80 RELACIÓN C/N
INMOVILIZACION NETA 60 MINERALIZACION NETA
40 20
O3C A N T I D A D
CO2
TIEMPO
Figura 1. Efecto de la relación C/N sobre la inmovilización del nitrógeno.
Las bacterias nitrificadoras autótrofas son aerobias estrictas y dependen del transporte de electrones a través de la cadena de citocromos para producir ATP, siendo el O 2 el aceptor final de los electrones. La oxidación de una molécula de NH 4+ a NO2- involucra el transporte de seis electrones y la formación transitoria de hidroxilamina y de nitroxilo:
Esta reacción puede producir alternativamente óxido nitroso (N 2O), especialmente en condiciones de baja oxigenación.
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La oxidación de NO2- a NO3- en el suelo es llevada a cabo por bacterias de los géneros Nitrobacter, Nitrococcus y Nitrospira. Esta transformación involucra el transporte de 2e-, y está
mediada por una oxidasa. Los electrones son transportados a través de la cadena de citocromos, generando ATP
Arthrobacter, Mycobacterium y Varias, actinomicetes bacterias heterótrofas de los géneros Pseudomonas como Streptomyces griseus y hongos como Aspergillus flavus, Penicillium spp. y Cephalosporium entre otros, también pueden oxidar el amonio y el nitrito
llevando a cabo un proceso conocido como nitrificación heterótrofa. Estos microorganismos no obtienen energía de esas oxidaciones ya que las reacciones no están acopladas a la generación de ATP. Sin embargo, son capaces de producir NO 3- tanto de fuentes inorgánicas como orgánicas. Las fuentes inorgánicas se oxidan en la misma forma que en la nitrificación quimioautótrofa, en tanto que para las fuentes orgánicas el camino de oxidación sería como sigue:
La tasa de la nitrificación depende de factores ambientales como el suministro de amonio (su sustrato) y la presencia de oxígeno (proceso aerobio). El laboreo del suelo, el quemado, el talado de la vegetación, la disposición de residuos orgánicos, la fertilización y la deposición atmosférica de nitrógeno, tienen efectos bien documentados sobre la producción de nitratos en los suelos. La nitrificación ocurre en un rango amplio de temperatura y aún en suelos bajo la nieve aunque el proceso es muy lento bajo esta condición. Por muchas décadas se pensó que la nitrificación se inhibía en suelos ácidos, probablemente debido a que el aumento del pH por el encalado de los suelos con carbonato de calcio o magnesio al mismo tiempo estimula la nitrificación. Además, las bacterias nitrificadoras cultivables tienen un pH óptimo de 7,5-8. Actualmente se sabe que el proceso de nitrificación ocurre también en suelos forestales con valores de pH<4,5. En los suelos forestales ácidos, luego de una perturbación del ambiente como el talado, quemado, etc., las tasas de mineralización de N son mayores que las de inmovilización. Bajo esas condiciones, la existencia de micrositios con pH adecuado y la nitrificación heterótrofa pueden explicar la generación de nitrato. Además, en los últimos años y gracias al avance del empleo de técnicas de biología molecular, se ha observado que existe tanto en el agua como en el suelo una presencia importante de Arquebacterias que también realizan la oxidación del amonio y, que según los investigadores, serían más abundantes en suelos que las bacterias al. 2006).profundidades (Leiningeraetmayores El elevado número de estos microorganismos en varios ecosistemas su presencia del suelo, indicaría que están adaptados a un rango ymás amplio de condiciones ambientales y que podrían tener un metabolismo más versátil que el de las bacterias nitrificantes autótrofas. Este hallazgo también permitiría explicar la existencia de la nitrificación en suelos de pH ácido.
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Desnitrificación Se conoce como desnitrificación al conjunto de procesos que conducen a la pérdida en forma gaseosa del nitrato del suelo. El NO 3- y el NO2- del suelo sirven de sustrato para un grupo de microorganismos aerobios facultativos que utilizan estos compuestos como último aceptor de electrones durante la respiración anaerobia, liberando N 2 y N2O. La mayoría de estos organismos son heterótrofos, obteniendo sus fuentes de C y energía a partir de sustratos orgánicos. En ausencia de O 2, el NO3- o sus óxidos derivados sirven como aceptores finales de electrones transportados por la cadena respiratoria durante la oxidación de esqueletos carbonados. Este proceso se conoce como reducción disimilatoria porque sus productos no son asimilados sino liberados a la atmósfera. La capacidad de utilizar óxidos de N como aceptores de electrones ha sido descrita en aproximadamente veinte géneros de bacterias. La mayoría pertenece a las Proteobacterias. Muchas bacterias desnitrificadoras reducen anaeróbicamente también a otros aceptores de electrones, tales como el Fe 3+ y ciertos aceptores orgánicos. Debido a que el NO 3- es un aceptor terminal de electrones menos eficiente que el O2, la desnitrificación tiene lugar cuando el O2 no está disponible. En la mayoría de los suelos esto ocurre luego de una lluvia importante con el suelo saturado de agua y una difusión del O 2 drásticamente lenta a los micrositios. La desnitrificación comienza cuando la concentración de poros llenos de agua supera el valor del 60% de la capacidad de retención del suelo. También adentro de los agregados, en la vecindad de materia orgánica en rápida descomposición y en la rizosfera, la demanda de oxígeno puede ser superior a la difusión y darse condiciones para el desarrollo de la desnitrificación. La desnitrificación es el único evento del ciclo del N en el cual el nitrógeno fijado vuelve a la atmósfera como N2, cerrándose el ciclo. La desnitrificación es también una fuente importante de N2O, un gas con efecto invernadero que consume el ozono. La gramo presencia de desnitrificadores en el suelo es universal su densidad puede superar al millón por de suelo, con concentraciones aún mayores en lay rizosfera. Las bacterias desnitrificadoras pertenecen a diferentes familias. Las más estudiadas pertenecen a los géneros Pseudomonas y Paracoccus, pero también se ha descrito esta capacidad en géneros como Alcaligenes, Achromobacter y Bacillus. También se conoce esta actividad en bacterias fijadoras de N2 como Azospirillum y numerosas especies de Rhizobium. La reacción se lleva a cabo enzimáticamente, en sucesivos pasos, que involucran la transferencia de cinco electrones al átomo de N.
2 NO3nitrato
4 H+
2 HNO3ácido nitroso
4 H+
2 H2N2O2 ácido hiponitroso
Estas reacciones están catalizadas por una nitrato y una nitrito reductasas disimilatorias. El ácido hiponitroso puede ser luego deshidratado y oxidado a N gaseoso, que se pierde a la atmósfera, o deshidratado a óxido nitroso, que es volátil, y pasa a la atmósfera donde es luego reducido a N2. La cantidad de NO3- perdida como N2O y N2 a la atmósfera puede ser considerablemente bajo ciertas condiciones. La desnitrificación en el suelo depende principalmente de tres factores: concentración de oxígeno, concentración de nitrato y
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disponibilidad de carbono. Sin embargo, el contenido hídrico, el pH y la temperatura son factores a tener en cuenta en un gran número de situaciones. 2 H+ N2 -2 H2O
2 H2N2O2 ácido hiponitroso
- H 2O
- H2O N2O
N2
óxido nitroso
El oxígeno del suelo es consumido principalmente por las raíces de las plantas y los organismos aerobios. Este consumo puede alcanzar hasta 70 mmol O 2 cm-2 h-1, y ser mayor que la tasa de reposición del mismo por difusión desde la atmósfera. En condiciones de anegamiento, el déficit de oxígeno puede ser considerable, hasta encontrarse condiciones de total anaerobiosis. Sin embargo, en suelos inundados la desnitrificación se ve limitada por la falta de NO3-, ya que la nitrificación está inhibida a bajas concentraciones de O 2. En consecuencia, la desnitrificación puede ocurrir en la rizosfera y en la interface agua-sedimento, lugares donde hay suficiente O 2 para que la nitrificación genere el NO 3- , el cual podrá difundir hacia los desnitrificadores en zonas cercanas más anaeróbicas. El déficit de oxígeno induce la actividad disimilatoria de los organismos desnitrificadores (Tabla 1). Las condiciones de anaerobiosis son muy frecuentes incluso en suelos muy aireados, donde se encuentran micrositios de baja aireación, donde las condiciones favorecen la desnitrificación. Dado que los organismos involucrados son mayoritariamente heterótrofos, estos requieren C asimilable para obtener energía. En suelos no saturados el contenido de C es a menudo el factor que limita a la desnitrificación. El C actúa a dos niveles, por un lado provee dadores de electrones para los desnitrificadores y por otro, estimula el consumo de O 2 por los heterótrofos. Por lo tanto la presencia de materia orgánica es un factor importante en la regulación tanto de la velocidad como de la magnitud de la desnitrificación. En general, se encuentra una relación lineal entre la cantidad de carbono extractable del suelo y la actividad desnitrificadora. Sin embargo, en condiciones naturales, es difícil que la disponibilidad de C resulte limitante para la desnitrificación, aunque puede ocurrir que en las capas inferiores del suelo, con escasa materia orgánica, donde la desnitrificación se vea inhibida por falta de sustratos respirables. También, puede ocurrir que se inmovilice el N durante la descomposición de los sustratos carbonados y no haya NO 3- para desnitrificar. En la tabla 1 se observa el efecto del agregado de glucosa y la concentración de oxígeno sobre la pérdida de NO3- del suelo por el proceso de desnitrificación. A bajas tensiones de O 2 (0,46%) el agregado de una fuente de carbono de rápida utilización como la glucosa induce un aumento en la pérdida de NO3- por desnitrificación, desde el día 0 (comienzo del experimento) al día 10, con respecto a la pérdida del NO 3- en el suelo sin el agregado de glucosa. Bajo condiciones de alta concentración de O2, si bien se observan diferencias entre los tratamientos con y sin glucosa, la magnitud de la desnitrificación es mucho menor que en el caso anterior. Este experimento demuestra la relación que existe entre los tres factores que regulan a este
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proceso microbiano: la baja tensión de O2, la disponibilidad de nitratos y la presencia de una fuente de carbono fácilmente utilizable. La cuantificación de las pérdidas de nitrógeno por desnitrificación no es sencilla. La utilización de una fuente con 15N, espectrometría de masa y de emisión, cromatografía gaseosa y bloqueo enzimático con acetileno son las técnicas más utilizadas para estudiar este proceso. Existen pocos datos de las pérdidas por desnitrificación de 15N aplicado como fertilizante, y los datos son muy variables. Se ha estimado que en un cultivo de trigo se pierden entre 7 y 13 kg de N/ha/año cuando se aplican 70 kg N/ha como fertilizante, y entre 18 a 38 kg/ha en pasturas que recibieron 250 kg/ha. En base a numerosas observaciones se ha generalizado que las pérdidas de N2 + N2O de los suelos varían entre 0 y 20% del N aplicado como fertilizante en suelos arables, y del 0 al 7% en pasturas. La presencia de cultivos provoca la desecación del perfil y así reduce las condiciones de anaerobiosis pero además las raíces compiten activamente con los microorganismos por el uso del NO 3-. Esto hace que en promedio las pérdidas de N del sistema por desnitrificación sean menores al 10% del flujo total de N en el mismo. Tabla 1. Efecto del O2 y del contenido de C sobre la desnitrificación
Sin glucosa
Con 0,5% de glucosa
NO3-
N Total
NO3-
N Total
(mg/100 g suelo)
(mg/100 g suelo)
(mg/100 g suelo)
(mg/100 g suelo)
Día
0,46% O2
0
78,3
154,7
78,3
154,7
5
72,5
147,9
23,2
150,8
10
63,5
143,4
1,4
114,8
2,27 % O2 0
78,3
154,7
78,3
154,7
5
79,0
149,0
55,5
150,5
10
76,5
152,4
58,5
143,6
La desnitrificación bajo ciertas condiciones puede representar una ventaja, por ejemplo para remover el exceso de NO3- de los suelos, a fin de evitar su lixiviación hacia las aguas subterráneas o superficiales. Además, el tratamiento de las aguas residuales tiene como uno de sus objetivoseste remover el Nmás favoreciendo a la nitrificación y luego a la desnitrificación. Trataremos tema con profundidadprimero en el capítulo de Biorremediación.
FIJACIÓN BIOLÓGICA DEL NITRÓGENO Si bien el 78% de la atmósfera está formado por N2, éste no se encuentra disponible para la mayoría de los organismos vivos, ya que éstos no son capaces de romper el enlace N N, y deben utilizar el N existente en alguna forma reducida. Solamente algunos organismos
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procariontes son capaces de romper la unión N N a través del proceso conocido como fijación biológica del N2. Este proceso involucra la transferencia de 8 electrones a la molécula de N 2 para formar dos moléculas de NH3, y requiere la presencia de Mg 2+. Paralelamente se produce una molécula de H2 de acuerdo con las siguientes reacciones: Mg2+ N2 + 6 e- + 12 ATP + 8 H +
2 NH4+ + 12 ADP + 12 Pi Mg2+
2 H+ ++24eATP H 2 + 4 ADP + 4 Pi ___________________________________________________________ Mg2+ N2 + 16 ATP + 8 e - + 10 H+ 2 NH4+ + H2 + 16 ADP + 16 Pi Esta reacción la cataliza un complejo enzimático conocido con el nombre de nitrogenasa, que se encuentra solamente en algunos organismos procariontes. Este complejo enzimático está formado por dos subunidades. Una de ellas es conocida como ferro-sulfo proteína. Esta subunidad tiene un peso molecular de 60.000 Da, y contiene cuatro átomos de Fe y cuatro grupos sulfidrilo (-SH). La otra subunidad se conoce como ferro-molibdo proteína, y tiene un peso molecular entre 200.000 y 300.000 Da. Contiene 28-32 átomos de Fe, 28 grupos -SH y dos átomos de Mo2+. Esta enzima rompe específicamente las uniones N N, N N
NH3 + H2
pero también es capaz de romper la unión C N-
CH4 + NH4+
y la triple unión de la molécula de acetileno: HC CH
H2C=CH2
Esta reacción es especialmente útil porque en base a ella se ha desarrollado una técnica para medir la actividad de la nitrogenasa.
La nitrogenasa es inhibida por la presencia de O 2. Esta enzima se encuentra presente en diferentes organismos procariontes. Estos pueden ser de vida libre o vivir en simbiosis con otros organismos. Los encontramos entre las bacterias, cianobacterias y actinomicetes (Tabla 2). Métodos para medir la fijación biológica de nitrógeno Estimar la cantidad de N fijado mediante fijación biológica es generalmente complicado, principalmente porque el N recientemente fijado no puede diferenciarse del nitrógeno reducido preexistente, y porque la cantidad de N fijado suele ser muy pequeña en comparación con la cantidad de N reducido presente en el sistema. Por lo tanto, se han desarrollado una serie de técnicas para poder medir la fijación biológica del N.
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Tabla 2. Ejemplos de los géneros de microorganismos capaces de fijar nitrógeno
Géneros H eterótr ofos
Aerobios
Azotobacter, Beijernkia, Derxia, Xanthobacter
Aerobios facultativos
Paenibacillus, Klebsiella
Microaerofílicos Azospirillum, Thiobacillus Anaerobios
Clostridium, Desulfovibrio
Simbiontes
Rhizobium, Bradyrhizobium, Frankia, Nostoc
Autótrofos
Nostoc, Anabaena, Gloeothece, Rhodospirillum, Rhodopseudomonas
Cambios en el balance de N: Este es el método más preciso, y consiste en estimar la cantidad inicial de N reducido presente en el sistema, donde solo se suministra N molecular, y la cantidad presente luego de un determinado tiempo. La diferencia entre las dos cantidades indica la cantidad de N fijado. Este método solo es aplicable en algunos sistemas muy simples y controlados, tales como una planta cultivada en hidroponia o bacterias creciendo en un cultivo de laboratorio, pero es inaplicable en sistemas más complejos como un suelo o un cultivo en el campo. Reducción de acetileno: Este método se basa en la capacidad que tiene la nitrogenasa para romper la triple ligadura de la molécula de acetileno y transformarla en etileno. Por lo tanto, se puede estimar la actividad de la enzima nitrogenasa suministrando acetileno a la planta o bacteria en un sistema cerrado, y medir el etileno formado al cabo de un determinado tiempo, en un cromatógrafo gaseoso. Este método es el más usado para medir fijación de N, y resulta muy útil siempre y cuando se consideren sus desventajas. El método no mide fijación de N sino que solamente estima la actividad de la enzima, por lo tanto sólo sirve para hacer comparaciones entre organismos o sistemas en determinadas condiciones, pero de ninguna manera se pueden extrapolar los resultados como medidas de la fijación de N. Además, después de un tiempo el etileno resulta tóxico para la planta y la actividad medida cae. Utilización del isótopo 15N: Este es un isótopo pesado del N, no radiactivo, que tiene una abundancia en la naturaleza del 0,3663%. Por lo tanto, suministrando a la planta N enriquecido con este isótopo se puede diferenciar el N proveniente de diferentes fuentes. Se lo puede usar de diferentes maneras para estimar la fijación de N. El sistema más directo es suministrar a la planta N 2 marcado con 15N, medir el incremento de este isótopo en la planta y estimar entonces directamente la cantidad de N2 fijado. Sin embargo este método es poco usado, entre otras cosas por la dificultad para manipular N gaseoso, la necesidad de trabajar en sistemas cerrados y la imposibilidad de aplicarlo en sistemas extensivos. La otra alternativa es suministrar a la planta 15N en forma de NO3- o NH4+. Lo que se hace entonces es estimar la fijación de N a través de la dilución del 15N suministrado por el N 2 no marcado proveniente de la fijación. Esto se lleva a cabo cultivando la planta leguminosa y una planta control no fijadora en un suelo marcado con la misma proporción de 15N. Luego de
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un tiempo se cosechan ambas plantas, y se estima qué proporción de todo el N presente en la leguminosa proviene de la fijación biológica, según la ecuación: % de N fijado= [1-15N planta prueba / 15N planta control] x 100 Este método es el más usado actualmente, aunque también tiene inconvenientes, como por ejemplo, todo el volumen de suelo donde absorben las raíces debe estar igualmente marcado, dado que si parte de la raíz de una de las plantas absorbe N con un enriquecimiento más bajo, se pueden cometer errores bastante groseros (Fig. 2 C y D).
Figura 2. Uti lización de l a té cni ca de la di luci ón de 15N. A y B corresponden a una marcación correcta del suelo. Las raíces de las dos plantas absorben de suelo igualmente marcado. B y C corresponden a una marcación incorrecta. Las raíces absorben de suelos marcados en forma diferente.Con las técnicas aquí mencionadas se han podido hacer estimaciones bastante
confiables de las cantidades de N2 fijado en diferentes sistemas (Tabla 3). Tabla 3. Cantidad de N fijado por diferentes sistemas (Adaptado de Paul y Clark, 1989).
Cultivo
Kg N/ha/año
Leguminosas
140-300
Arroz
30
Pastura
15
Bosque
10
No Leguminosas
5
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FIJACIÓN SIMBIÓTICA DEL NITRÓGENO Las plantas superiores no han conseguido desarrollar durante su evolución la capacidad de sintetizar el complejo enzimático nitrogenasa y de fijar N2. Sin embargo, muchas plantas han desarrollado la estrategia de asociarse simbióticamente con organismos procariontes capaces de fijar N2. A continuación describiremos algunas de las asociaciones simbióticas de mayor importancia para la agricultura.
LA ASOCIACIÓN ENTRE LAS PLANTAS LEGUMINOSAS Y LOS RIZOBIOS. NODULACIÓN. Este grupo de bacterias está formado por organismos Gram- con forma de bastón. No producen endosporas. Su tamaño oscila entre 0,5-0,9 µm x 1,2-3,0 µm, y son móviles cuando jóvenes con 2-4 flagelos perítricos, polares o subpolares. Cuando las condiciones de crecimiento son adversas acumulan sustancias de reserva en gránulos de poli-ß-hidroxibutirato (PHB). Son aeróbicas a microaerofílicas, con un óptimo aproximadamente en 0,01 atmósferas de O 2. Su crecimiento es óptimo a pH neutro a alcalino, con escaso o nulo crecimiento a pH 5 o menor. Poseen la enzima nitrogenasa, y pueden desarrollarse en vida libre o establecerse como simbiontes en plantas de la familia Fabaceae (leguminosas). Se conoce una sola planta no leguminosa nodulada por rizobios, el género Parasponia de la familia Ulmaceae. Inicialmente, los rizobios se clasificaron en función de su velocidad de crecimiento y de la especie de planta que podían infectar. Las especies de rizobios de crecimiento rápido tienen un tiempo medio de duplicación en medio de cultivo extracto de levadura-manitol de 2 a 4 horas, y en el mismo medio agarizado producen colonias en 3-5 días. Las especies de crecimiento tienenEsta un tiempo de duplicación de en cerca de 8 horas, y forman rápido coloniaso en cultivo enlento 6-8 días. antiguamedio designación fenotípica, rizobios de crecimiento lento, es a veces aún utilizada cuando no se conoce con exactitud el género al que pertenece el rizobio. Luego se vio que esta clasificación era artificial, ya que bacterias de características muy distintas podían infectar a la misma especie vegetal. Actualmente, para su clasificación se utilizan características bioquímicas y genotípicas, como análisis de secuencia del gen ribosomal 16S e hibridación DNA-DNA. Todas las bacterias conocidas que nodulan leguminosas se clasifican dentro de las Proteobacterias (clases Alfaproteobacteria y Betaproteobacteria). Los rizobios clásicos pertenecen a Alfaproteobacterias y se distribuyen entre muchos géneros, siendo Rhizobium y Bradyrhizobium los más comúnmente conocidos. Una clasificación taxonómica actual de los rizobios puede consultarse en: Weir BS (2010). The current taxonomy of rhizobia. New Zealand rhizobia website. http://www.rhizobia.co.nz/taxonomy/rhizobia.html.
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Tabla 4. Ejemplos de especies de rizobios y sus respectivas plantas huésped. Especie bacteriana
Planta huésped
de crecimiento rápido Rhizobium etli
Phaseolus vulgaris
Rhizobium leguminosarum biovar trifolii
Trifolium
Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli Rhizobium leguminosarum biovar viciae
Phaseolus Pysum, LaThyrus, Lens, Vicia
Rhizobium tropici
Phaseolus vulgaris, Leucaena
Rhizobium galegae
Galega officinalis, G. orientalis
Mesorhizobium loti
Lupinus, Lotus, Ornithopus
Mesorhizobium
Astragalus sinicus
Ensifer meliloti (Sinorhizobium meliloti)
Melilotus, Medicago, Trigonella
Ensifer fredii
Glycine max
de crecimiento lento Bradyrhizobium japonicum
Glycine max
Bradyrhizobium elkanii
Glycine max
Bradyrhizobium sp.
Vigna
Bradyrhizobium sp.
Lupinus
Bradyrhizobium sp.
Arachis hypogaea
BIOLOGÍA DE LOS RIZOBIOS Las bacterias de los géneros Rhizobium y Bradyrhizobium crecen en forma saprofítica libres en el suelo y la rizosfera. En el suelo no rizosférico su crecimiento es lento, con un tiempo medio de duplicación entre 241-361 horas. En cambio en la rizósfera de las leguminosas su tiempo medio de duplicación es entre 9-12 horas. Esta diferencia se debe en parte a la presencia de sustratos carbonados respirables, pero principalmente a la presencia de factores específicos secretados por la raíz, los cuales estimulan la división y crecimiento de los rizobios. Este estímulo es inespecífico, por lo tanto en la rizósfera de una leguminosa pueden encontrarse abundantes rizobios que no sean los específicos para esa especie.
Infección: Se conoce como infección una serie de procesos que conducen a la penetración de la bacteria en las células radicales de la planta huésped. Estos involucran un complejo intercambio de señales de reconocimiento entre la raíz y la bacteria. El primer evento de la infección es la adhesión entre la bacteria y la célula radical. Los rizobios creciendo libres en el suelo poseen flagelos, los cuales les otorgan cierta capacidad de
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movimiento aunque ésta es muy limitada Sin embargo, se ha comprobado que mutantes de Rhizobium deficientes en movilidad son menos eficientes para infectar que las bacterias con su
movilidad normal. Por lo tanto, la movilidad y el quimiotaxismo parecen ser importantes en la infección. La raíz secreta compuestos que tienen efecto quimiotáctico sobre las bacterias. Estos compuestos pertenecen al grupo de los flavonoides, y se han identificado un número considerable de falvonoides involucrados en estos procesos. Varios de ellos se representan en la figura 3. Los flavonoides constituyen los primeros factores de reconocimiento entre la bacteria y la raíz, y determinan la especificidad entre la bacteria y su planta huésped.
Flavanona, Isoflavona y Chalcona. reconocidos por los Figura 3. Flavona, productos (proteínas) de los genes nod de Flavonoides diferentes rizobios.
La fijación de la bacteria sobre la célula radical es esencial para que se produzca la infección. Esta unión se realiza normalmente sobre el extremo de un pelo radical, probablemente debido a la atracción ejercida por los compuestos secretados por la planta. Recientemente se ha descubierto que en la unión de la bacteria al pelo radical intervienen unas proteínas llamadas ricadesinas. Estas son proteínas de un peso molecular de 14.000 kDa, con cinco locus de unión para el Ca 2+. Estas proteínas producen un puente entre la bacteria y el pelo radical, que fija a ambos entre sí. Son secretadas por la bacteria, y reconocen un locus específico en la superficie del pelo. Por lo tanto también contribuyen al reconocimiento bacteria-planta huésped. Posteriormente el pelo radical produce microfibrillas de celulosa que anclan y fijan la bacteria. En esta unión también están involucradas lectinas, que son proteínas producidas por la planta que ligan células, pero su papel en esta unión todavía es controvertido.
Regulación génica de la nodulación Los siguientes eventos de la infección están regulados por una serie de genes ( genes nod ) que pueden estar ubicados en un plásmido de la bacteria, conocido como plásmido sym, o
en el cromosoma bacteriano, lo cual depende del género de rizobio. Ese plásmido también contiene los genes nif, que codifican para la síntesis de la nitrogenasa, y los genes fix, que regulan funciones específicas durante la fijación de N2. Cepas de Rhizobium a las que se les elimina el plásmido sym son incapaces de nodular. Si se introduce el plásmido sym específico
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para una especie vegetal a una cepa no específica, entonces ésta se torna infectiva para dicha especie vegetal. Entre estos genes existe uno llamado nodD , que cumple el papel de regulador de la transcripción del resto de los genes nod, conocidos como genes comunes de la nodulación, que están mayoritariamente involucrados en la determinación de la especificidad de la infección, y se los denomina genes nod A, B, C, E, F ,... , etc. Hasta ahora se han descrito más de treinta genes bacterianos involucrados en la nodulación.
Mecanismo de inducción de la nodulación El producto de la transcripción del gen nodD es una proteína que se une con un flavonoide específico excretado por la planta huésped. (Fig. 4). Cuando este “reconocimiento” se ha realizado, el complejo flavonoide-proteína se une al locus nod-box . Esta unión específica desencadena la transcripción del resto de los genes nod. Los productos de transcripción de los genes nod son principalmente compuestos que inducen la producción por parte de la raíz de
fitohormonas que van a inducir la curvatura del pelo radical y la división de las células de la corteza radical.
Iniciación de la nodulación Una vez que la bacteria se fijó sobre el pelo radical, éste se curva sobre la bacteria, formando lo que se conoce como gancho de infección (Figura 5A). La posterior penetración de la bacteria dentro del pelo radical se produce por la degradación de la pared celular vegetal, la cual se lisa en el sitio de contacto con la bacteria, la membrana plasmática se invagina, y se deposita nueva pared celular formando el tubo de infección (Figura 5B). Este tubo continúa alargándose hacia la base del pelo radical. Simultáneamente, se comienzan a dividir las células del parénquima cortical como consecuencia nod. Esta de los productos de con los genes división antes de que elque tubo de infección se ponga en contacto las células corticales. Laocurre bacteria, a medida avanza, se divide numerosas veces dentro del tubo de infección. Ese tubo de infección está formado por la invaginación de la membrana plasmática, de la célula del pelo cortical del huésped, de modo que la bacteria permanece siempre en el espacio intercelular. Por afuera de esa membrana se deposita pared celular de la planta.
Al llegar el tubo de infección a la base de la célula del pelo radical y tomar contacto con la célula cortical, la pared celular esta célula se lisa, se forma un poro, y la membrana plasmática se invagina. Las bacterias se liberan del tubo de infección y la membrana de la célula cortical se cierra alrededor de las bacterias produciéndose un proceso de endocitosis. Esa nueva estructura que forman las bacterias rodeadas por la membrana celular se denomina simbiosoma. El espacio interior del simbiosoma es un continuo del espacio extracelular, y la bacteria no se pone nunca en contacto con el citoplasma de la célula radical, sino que siempre está en un compartimiento externo. Dentro de cada célula pueden srcinarse muchos simbiosomas (Fig. 5C). Durante un tiempo, la bacteria puede dividirse dentro del simbiosoma. Finalmente deja de dividirse y se producen notables cambios. Cambia la composición de la pared celular bacteriana, aumenta el tamaño celular, se acumulan gránulos de polifosfatos, y se producen cambios en el metabolismo. Luego se sintetiza la nitrogenasa, y comienza la fijación de N 2. La bacteria así transformada se conoce como bacteroide. La membrana que limita al simbiosoma ahora se conoce como membrana peribacteroide (Fig. 5D). El bacteroide de los rizobios de nódulos de
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crecimiento determinado conserva su capacidad de dividirse una vez que se ha diferenciado en la forma fijadora de nitrógeno (Denison 2000). Gen eral ida de s d el inter cam bi o d e se ña les n e a l nter i acc iónrizob ios legu m ino sa Rizob ios Genes nod nodD nod Box nodABC nodSUIJ
Proteí na N odD
Exo po lisac ári do s Otra señal en el proce so denod ul aci ón
Proteínas Nod
Proteí na N od D +Flavo no ide
es InfecciónFactor r Fl avo no idesPelo adical
N od
Señ al esde l rizob io
Señ al es e d a l p lan ta Nodu linas
PLANTA
EN O D12,tc e
Figura 4. Eventos tempranos en la interacción rizobio-leguminosa Simultáneamente ocurren cambios en la célula radical. Se produce un aumento del volumen celular. Este aumento se traduce como un ensanchamiento de la raíz, que se conoce como nódulo. Además ya se han activado los genes sym de la planta, que inducen la producción de proteínas específicas para la nodulación, conocidas como nodulinas. Una de estas nodulinas es la leghemoglobina. Esta es una proteína que contiene un grupo hemo similar al de la hemoglobina, lo que le confiere color rojo. Este grupo es sintetizado por la bacteria, mientras que la proteína es sintetizada por la planta. La leghemoglobina se acumula en la célula vegetal del nódulo, y regula la transferencia de O2 al bacteroide, para crear las condiciones de microareofilia requeridas para la fijación de N2. Si bien el proceso descrito arriba es representativo para muchas especies, existen muchas excepciones donde no se produce tubo de infección, sino que la bacteria penetra en la raíz a través de la epidermis, se multiplica en el espacio intercelular y luego penetra en las células corticales, como ocurre en maní. En otras familias de plantas tales como las Ulmaceae, en especies del género Parasponia sp., se ha comprobado que tanto Rhizobium como Bradyrhizobium pueden infectar y producir nódulos de estructura diferente a los de las leguminosas, pero éstos la mayoría de las veces no son efectivos aun cuando se ha detectado la
presencia de leghemoglobina en ellos. El producto de la reducción de N2 es NH4+. Este es exportado a través de la membrana peribacteroide, y fijado a esqueletos carbonados en las células del nódulo a través de la enzima glutamina sintetasa. Este es posteriormente transferido a otros esqueletos carbonados mediante transaminaciones, y exportado a los vasos del xilema. La forma de exportación de N depende de la especie de leguminosa. En soja se exporta en
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forma de ureídos, como la alantoína. En otras especies, como la alfalfa y algunos tréboles, el N se exporta como asparagina y glutamina
Regulación de la fijación de N 2 La fijación de N2 por la simbiosis rizobio-leguminosa está básicamente regulada por la demanda de N de la planta, que suministra fotosintatos al bacteroide. En plantas de soja, a las que se le eliminan los frutos durante el llenado, se puede detectar inmediatamente una disminución de la actividad fijadora de sus nódulos. La planta además puede regular el número de nódulos que se forman en sus raíces. Una vez que la raíz ha nodulado, la planta produce compuestos que inhiben la formación de nuevos nódulos. Si se acoda una planta de alfalfa nodulada con una no nodulada, y se inocula a esta última con Rhizobium, no se producirá nodulación. Asimismo, se han obtenido mutantes en soja y arveja, que no poseen este sistema de regulación y producen raíces hipertrofiadas con una enorme cantidad de nódulos. Por otro lado, una vez formado el nódulo el bacteroide produce unos compuestos conocidos como rizopinas, que inhiben la formación de nuevos nódulos. Sólo pueden infectar exitosamente aquellas bacterias que pueden degradar estas rizopinas, y solamente son capaces de hacer esto aquellas bacterias de la misma cepa que las producen. Por lo tanto, una vez que una cepa se estableció en la raíz, es muy difícil que sea reemplazada por otra. En presencia de determinados niveles de nitrato en el suelo la fijación de N 2 puede verse inhibida. Aún no se conoce completamente cuál es el mecanismo de esta inhibición, pero se postulan como causas posibles la acumulación de NO2 dentro del nódulo, que tendría efectos tóxicos. Otra posibilidad, es que se produzca una competencia por fotosintatos entre la nitrato reductasa y la nitrogenasa. También se postula que podría existir un mecanismo de retroalimentación (feed back) producido por la acumulación de aminoácidos en el nódulo.
Tipos de nodulación De acuerdo con el grado de compatibilidad entre la cepa bacteriana y la leguminosa infectada se pueden obtener diferentes tipos de nodulación según el siguiente esquema: I. NO NODULADO: No hay nódulos. Plantas pequeñas y cloróticas. II. NODULADO: Señales de iniciación de nódulos. 1. Ineficientes: nódulos con interior verde o blanco. 2. Eficientes: nódulos con interior rosa o rojo.
Inoculantes microbianos Un inoculante microbiano es un producto que contiene un cultivo artificial de microorganismos. Generalmente es aplicado sobre la semilla y/o sobre el suelo para establecer algún tipo de asociación benéfica entre una planta y el microorganismo en cuestión. Los inoculantes microbianos pueden clasificarse en monovalentes, es decir que contienen un solo tipo de microorganismo, y en polivalentes cuando dos o más microorganismos están incluidos en su formulación. El uso de inoculantes microbianos es una alternativa adecuada para mejorar la productividad de sistemas agrícolas y ganaderos y resulta una tecnología que puede asociarse con los principios de sustentabilidad, siempre y cuando se la aplique en forma correcta. Para lograr un
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resultado positivo para el cultivo y el ambiente es necesario contar coninoculantes de calidad probada, es decir, que la cantidad del microorganismo deseado esté dentro de los niveles necesarios para garantizar su eficiencia yque no aporten microorganismos no deseados. Recono cimiento y unión
El pelo radi cal se curva luegodel contact o con izobi r o ysedeti ene el crecimiento lular ce
Rizobiobre li
A el Pelo radical
Pelo radical
Unión Unión polar
R ecept or
El cordón de infección penetrala célul as co rticale esti mulando su divi sión
B Ba cteri as de ntro del cordó n de nfección i Nó dul os
Célula sana
Vacuol a
C Pelo radical
Bacteroides membrana peri ba cteroi de
Célul a infectad a Célul a endivi sión
Rizobios noerenciado dif s
D
Figura 5. Infección y establecimiento de los nódulos radicales.
Inoculantes a base de ri zobios El rendimiento de los cultivos está estrechamente relacionado con la disponibilidad de N durante su ciclo de crecimiento y desarrollo. Las leguminosas constituyen un caso particular, ya que el N puede ser provisto mediante la asociación simbiótica con bacterias denominadas rizobios en forma general. Por ello, el uso de inoculantes conteniendo este tipo de microorganismos es el más generalizado en los sistemas de cultivos tanto agrícolas (ej. soja) como forrajeros (ej. alfalfa). Se asegura la asociación simbiótica entre el rizobio y la leguminosa mediante la aplicación de un inoculante de calidad adecuada para permitir que cepas del microsimbionte específicas y efectivas se instalen en la raíz de la planta y formen nódulos para activar en forma eficiente el proceso de fijación biológica del nitrógeno (FBN). El propósito de la inoculación es lograr establecer en la rizosfera de la plántula una población vigorosa de la cepa bacteriana aplicada. Esta debe haber sido seleccionada por su competitividad y eficiencia con el fin de lograr una nodulación rápida y efectiva en las raíces las plantas huesped. En este proceso de instalación de la simbiosis rizobio-leguminosa es importante: a) contar con la cantidad suficiente de bacterias sobre la semilla b) que la bacteria esté en óptimas condiciones para colonizar a la leguminosa. Por ello, la forma que se use para aplicarla deberá asegurar una buenaposibilidad de supervivencia.
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c) que las características del medio donde se implante el vegetal permitan una adecuada colonización de la rizósfera por parte del rizobio para que se formen una cantidad suficiente de nódulos con funcionamiento efectivo, es decir, unasimbiosis exitosa en términos productivos. Los dos primeros aspectos están regulados por la legislación argentina. En nuestro país, es el SENASA el ente oficial que regula y acuerda con los fabricantes de inoculantes y organismos de investigación como el INTA, Universidades y organizaciones profesionales, cuáles son los valores apropiados para cada tipo de producto. Las exigencias en cuanto al número de bacterias en el inoculante y por semilla deben garantizarse y estar declaradas en el marbete comercial del producto. Por otra parte, las características del modo y sitio de aplicación pueden condicionar la eficiencia de la simbiosis, aún cuando los puntos a) yb) sean completamente satisfactorios.
Calidad de los inoculantes Cualquiera sea el tipo de producción que finalmente se prepare, se deberá tener en cuenta varios elementos para garantizar la calidad del inoculante. En general, se debe tener en claro que lo más importante es la calidad de la cepa bacteriana a utilizar. Ésta debe provenir de un cuidadoso proceso de investigación y desarrollo llevado a cabo previamente. La cepa a utilizar debe tener la capacidad de competir con la microflora nativa y naturalizada para establecer la nodulación lo más temprano posible. Además, debe a su vez estar adaptada a las condiciones de manejo del cultivo sobre el cual se va a aplicar, así como a la logística de almacenamiento y transporte impuesta por la comercialización del inoculante. Como ya se mencionó, la concentración adecuada de bacterias y la ausencia de contaminantes durante toda la vida útil del producto son características fundamentales para garantizar la calidad de un inoculante. La realización de recuentos de bacterias viables en el inoculante, con capacidad de nodular en condiciones controladas, durante el periodo entre la fabricación y elútil vencimiento delrequeridos inoculante,para permite la calidad 2006). de éste se mantiene durante su vida en los niveles ejercerestablecer su funciónsi(REDCAI,
Evaluación de inoculantes Para establecer cuál fue el resultado de la inoculación de un cultivo pueden considerarse determinaciones microbiológicas y agronómicas. Entre las primeras, puede estimarse el establecimiento de la cepa del inoculante a través de la determinación de su presencia en los nódulos de las plantas, por ejemplo, utilizando técnicas de biología molecular que permitan la identificación de la cepa utilizada en el inoculante. Estas metodologías se aplican casi exclusivamente con fines de investigación. Entre las determinaciones agronómicas, se pueden considerar tanto la nodulación temprana como la máxima, la ubicación de los nódulos en el sistema radical, el aspecto del cultivo, su nivel nutricional y su rendimiento. Cuanto más temprana sea la nodulación mayor será el tiempo total durante cual la FBN estará ocurriendo, con la consiguiente ventaja para el estado nutricional del cultivo. Un inoculante de calidad, puede garantizar que en los primeros quince días de la emergencia el 100% de las plantas del cultivo de soja estén noduladas en la corona de la plantas, siempre y cuando las condiciones ambientales para la germinación sean óptimas. cultivo, su pero estadolosnutricional y suderendimiento, pueden compararse entre cultivos El conaspecto y sin del inoculación, resultados estas observaciones están siempre influenciados por numerosas características del ambiente y delmanejo aplicado a éstos.
Inoculantes de Azospirillum y otras PGPR Numerosas bacterias rizosféricas con capacidad para asociarse con plantas de cultivo se utilizan como inoculantes en el mundo y su capacidad de promoción del crecimiento vegetal está bien documentado. En el caso de Azospirillum se cuenta con información que demuestra que su
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inoculación puede promover el rendimiento de cultivos en diferentes tipos de suelos y áreas climáticas de todo el mundo (Okon, Labandera 1994; Bashan et al., 2004; Bashan, de-Bashan 2010). En la producción de inoculantes a base aAzospirillum es necesario tener en cuenta sus particularidades para una formulación apropiada que garantice la calidad del inoculante producido. En nuestro país se están realizando esfuerzos continuados para mejorar tanto la tecnología de producción como de aplicación de los inoculantes a base de Azospirillum desde hace más de dos décadas (Cassan, García de Salamone 2008). Desde hace ya varios años existen inoculantes comerciales de Azospirillum recomendados para cultivos decereales, extendiéndose a otros cultivos como el girasol, hortícolas y en la soja encoinoculación conBradyrhizobium japonicum. En Argentina también se comercializan inoculantes conteniendo cepas dePseudomonas spp., tanto en formulaciones monovalentes como en mezcla con otros microorganismos, a fin de mejorar la instalación, nutrición yproducción de diversos cultivos con resultados variables. Naiman et al. (2009) citan incrementos en la producción de trigo respecto a los controles sin inocular y sin fertilizar del 16 y 19% cuando la inoculación se realizó con inoculantes deAzospirillum y Pseudomonas, respectivamente, mientras que el incremento debido al aporte de 45 kg N/ha fue del 13%. Los procedimientos microbiológicos para la evaluación de inoculantes en Argentina está siendo estandarizado (Albanesiet al., 2013).
Elaboración de un inoculante commercial. La producción en gran escala de un inoculante se realiza engeneral en varias etapas: 1) Preparación del inóculo inicial a partir de cultivos conservados de la cepa a multiplicar. 2) Desarrollo de la bacteria en un medio líquido hasta alcanzar una alta densidad de células, compatible con la utilización y/o comercialización del inoculante. 3) Formulación del inoculante. 4) Envasado y almacenamiento del producto. El primer proceso es una operación de laboratorio usando un medio de cultivo líquido (caldo) adecuado para la bacteria en cuestión. Diversas modificaciones suelen aplicarse cuando los motivos económicos así lo indican, odebido a la mayor o menor disponibilidad de ciertos sustratos y nutrientes. Se inocula el caldo (aprox. 250-500 ml) partiendo de un cultivo bacteriano puro conservado en freezer (-20C a -80C). Se crece bajo condiciones adecuadas de aireación y temperatura y se usa este cultivo para inocular un volumen mayor (aprox. 10 litros) de caldo fresco, a fin de realizar un aumento de escala. Este será el inóculo utilizado en la segunda etapa. En la segunda etapa, también se utilizan medios de cultivo líquidos, en tanques de producción llamados fermentadores (aproximadamente 100 litros), aunque más precisamente son llamados bio-reactores dado que el proceso de cultivo es aeróbico. Se inocula con el cultivo obtenido en la primera etapa y se crece bajo condiciones controladas de temperatura, pH, concentración de nutrientes y aireación, entre otros factores.Los niveles que se alcanzan dependen de los factores y condiciones del proceso y en general se consideran buenos rindes bacterianos cuando se llega a niveles que varían entre 109 y 1010 bacterias por mililitro. La concentración bacteriana alcanzada varía con la bacteria que está siendo producida. Puede haber o no una siguiente etapa de aumento de escala, en la cual el contenido del reactor de 100 litros se transfiere a otro de 1.000 litros, y nuevamente se deja multiplicar el cultivo por el tiempo adecuado según la velocidad de crecimiento de la bacteria que se estáproduciendo.
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La tercera etapa es crucial para la calidad del producto final. Laformulación del inoculante consiste en el mezclado del caldo bacteriano con sustancias o medios de acondicionamiento que favorezcan la estabilidad y conservación del producto. Cuando se utiliza turba acondicionada convenientemente u otro sustrato sólido, el inoculante final es un producto sólido. En el caso de la impregnación de la turba, éste último puede o no ser estéril. La impregnación del sustrato se realiza en varios pasos. A continuación se ejemplifican para el caso en que el sustrato sea turba: a.- Preparación de la turba: Se la seca hasta un 10% de humedad, preferiblemente por secado al aire, se la muele para que pase por un tamiz de malla de 120. Se lleva el pH hasta un valor de 6,5-7,2, usando de calcio o carbonato deSphagnum magnesiospp., finamente pulverizados. Argentina se usancarbonato comúnmente las turbas de musgos: procedentes de turberasEn de Río Grande, provincia de Tierra del Fuego, y de ciperaceas:Carex spp. de turberas de El Hoyo, provincia del Chubut. b.- Impregnación propiamente dicha: Es el mezclado del caldo bacteriano con la turba ya acondicionada. Generalmente la proporción del caldo agregado es la cantidad suficiente para llevar la humedad del productoal 60-70% del peso seco. Se realiza en equipos adecuados para asegurar una impregnación homogénea o en su defecto se realiza una homogenización posterior. c.- Maduración: Este proceso dura de 4 a 7 días, a una temperatura de 25 C-28C, se logra la más perfecta humectación de las partículas de turba y también la disipación del calor. Además, en esta etapa se produce un aumento de 2 a 5 veces en el número de bacterias viables, siempre que no existan sustancias antagonistas o tóxicas en la turba. En el caso de los inoculantes líquidos, se procede al mezclado del caldo de cultivo junto con el soporte, cuyos componentes se mezclan y se esterilizan previamente en otro fermentador. Luego, se transfiere el proporciones cual llegó al que título al ytanque dondeal está el soporte previamente enfriado,elsecultivo, mezcla en fijarequerido, el fabricante se procede envasado en condiciones asépticas. Los soportes para inoculantes líquido contienen en general un adherente (goma guar, alginato, etc.), el cual puede actuar también como protector de la desecación, micronutrientes, etc. Los componentes del soporte son secretosy cada empresa formula el propio. En la última etapa,envasado y almacenamiento del inoculante, tanto para los inoculantes sólidos como para los líquidos, se utilizan bolsas de polietileno que por sus características retienen satisfactoriamente la humedad y aseguran un conveniente intercambio gaseoso. En el caso de inoculantes líquidos, esta etapa es fundamental para la calidad del producto y debe realizarse manteniendo las condiciones de asepsia necesarias, para evitar el ingreso de contaminantes al producto formulado. El almacenamiento, en general, se realiza en cámaras a temperatura controlada (4°C-10°C), durante el mismo se pueden producir cambios en la cantidad de microorganismos viables, que dependerán del lapso yde las condiciones de humedad ytemperatura de conservación. En términos generales, cuando la temperatura está entre 0°C y 5oC, la reducción decimal del recuento de viables en inoculantes deB. japonicum es menor que cuando la temperatura es de25ºC. Sin embargo, esto no puedegeneralizarse para todos los tipos deinoculantes. Existen en el mercado de inoculantes productos elaborados sobre soporte líquido acuoso u oleoso. Estos tienen amplia difusión tanto a nivel nacional como internacional, especialmente los acuosos. Sin embargo, las bondades de estos productos dependen en gran medida de las condiciones de producción y almacenamiento y requieren mayor tecnología de producción, lo cual determina que todavía se sigan produciendo inoculantes con soportes sólidos.
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LA ASOCIACIÓN ENTRE ACTINOMICETES Y LAS RAÍCES DE ÁRBOLES Y ARBUSTOS Frankia es un actinomicete que forma nódulos en especies no leguminosas de árboles, arbustos y algunas herbáceas (Tabla 5).Estos nódulos poseen actividad fijadora de 2Ny se denominan actinorrícicos. La mayor parte de los hospedantes deFrankia son importantes colonizadores de suelos pobres en N y como su hábitat son regiones templadas y frías, cumplen el rol de las leguminosas en zonas tropicales (exceptoCasuarina spp. que son representantes actinorrícicos de áreassubtropicales). La naturaleza de esta asociación simbiótica ha sido objeto de muchas especulaciones desde que en 1866 Woronin detectó por primera vez la presencia de un microorganismo en los nódulos radicales de Alnus glutinosa al que llamó Schinzia alni y lo consideró un hongo filamentoso. Numerosos intentos para aislar el endosimbionte desde 1910 fracasaron, hasta que Callaham et al. (1978) lograron aislar y cultivar un microorganismo de desarrollo miceliar y de crecimiento lento con todas las características de un actinomicete. Posteriormente fue clasificado dentro de la familia Frankiaceae en el género Frankia.
En nódulos maduros, el actinomicete puede estar presente en tres estados diferentes: a) hifal, b) vesicular y c) con formación de esporangios con esporos. a) En la etapa inicial de la infección las hifas invaden las células del hospedante y forman grupos o masas en su interior causando perforaciones en las paredes celulares y pasando de una célula cortical a otra. Estas hifas son muy delgadas, poseen un diámetro de 0,3 a 1 μm, son septadas y se ramifican poco. Durante todo el proceso de infección las hifas se encuentran rodeadas por una cápsula de polisacáridos producida por la célula hospedante. En el citoplasma de la célula radical se manifiesta una intensa actividad de las organelas relacionadas con el proceso de encapsulación. b) El estado vesicular se caracteriza por la formación de vesículas de distintas formas según las especies y se localizan en el extremo de hifas formando en conjunto el aspecto de un racimo de uvas. c) El tercer estado corresponde a la formación de esporangios con sus esporos. Los primeros son hinchamientos fusiformes de las hifas más gruesas y presentan divisiones tanto en sentido longitudinal como transversal. Estos esporangios normalmente se observan en el interior de las células del hospedante y ocasionalmente también en los espacios intercelulares entre células infectadas. Al madurar se desintegran liberando a los esporos que se destacan por su gruesa pared celular. Estos esporos de forma irregular, de 0.5 a 1.5 μm de diámetro, se forman por septación del esporangio Contrariamente a las hifas y vesículas que siempre están presentes en los nódulos actinorrícicos (excepto en especies de Casuarina y Allocasuarina que no forman vesículas), los esporangios y esporos a veces están ausentes. En especies de Alnus, Camptonia y Myrica se observaron nódulos libres de esporos (Sp-) y nódulos con esporos (Sp+). Evidencias experimentales corroboran que la esporulación dentro de los nódulos es un carácter genético del microsimbionte. La organización del tejido de un nódulo Sp+ es igual aldel nódulo Sp-. La morfología del nódulo puede ser de dos tipos: tipoMyrica y tipo Alnus. En los primeros, el ápice de cada rama nodular o lóbulo da srcen a una raicilla apogeotrópica. Los segundos carecen de raíces nodulares y presentan ramificación pseudodicotómica (Fig. 6). Los nódulos tipo Myrica se llaman rizotammios y los tipoAlnus se denominan coraloides. Dentro de cada lóbulo nodular hay un gradiente de edad. Las células del hospedante cerca del ápice del nódulo son más jóvenes que las que están próximas a la base. Las células infectadas del nódulo senescen después de la diferenciación de los esporangios y mueren
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cuando el esporangio está maduro. En este estado también las vesículas son senescentes y los esporangios persisten dentro de las células en las regiones más bajas del lóbulo nodular. En la Figura 7 se esquematiza ese gradiente de edad. La zona A contiene células no infectadas y células pos-meristemáticas. La zona B está formada por células pos-meristemáticas, algunas de las cuales comienzan a estar infectadas por los filamentos deFrankia pero aún no hay fijación de N2. La zona C es la de mayor actividad, donde se producen hemoglobina y una serie de enzimas relacionadas con la producción de energía y compuestos nitrogenados reducidos. La zona D es la zona de senescencia, donde se observaría la síntesis deuna serie de proteasas.
Tabla 5. Plantas actinorrícicas
Familia
Género
Casuarinaceae
Casuarina
Coriariaceae
Coriaria
Betulacea
Alnus
Datiscaceae
Datisca
Myricaceae
Myrica
Rosaceae
Comptonia Rubis Dryas Cercocarpus
Rhamnaceae
Ceanothus Discaria Colletia Trevoa Kenthrothamus
Eleagnaceae
Eleagnus Hippophae
Figura 6. Esquema de las fases del desarrollo de los dos tipos de nódulos actinorrícicas
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Figura 7. Localización de los diferentes estados del microsimbinte en una rama nodular .
Vías de infección Algunos hospedantes son infectados por medio de los pelos radiculares mientras que en otros la entrada del microsimbionte se produce por los espacios intercelulares del tejido de la raíz. Algunas especies admiten ambos mecanismos de entrada. Infección del pelo radicular En el comienzo del proceso se produce una deformación de la pared del pelo radicular y un encurvamiento como consecuencia de la presencia deFrankia. Si bien todos los pelos pueden curvarse sólo unos pocos pueden infectarse. Hay una gran actividad metabólica en el citoplasma del hospedante para formar el material que encapsula a las hifas. Los pelos no infectados degeneran y los infectados presentan sus organelas con gran actividad. Con el ingreso del microsimbionte hay un aumento de la actividad mitótica en el cortex radicular en las proximidades de las infecciones del pelo radicular y esto lleva a la formación de una zona llamada pre-nódulo, el cual con el avance delproceso se transforma en nódulo. Colonización intercelular Los pelos radicales no se deforman, las hifas penetran entre las células epidérmicas atravesando la lámina media. No se encapsulan, pero las células epidérmicas y corticales de la planta secretan material dentro del espacio intercelular. Este tipo de infección se produce en tejidos corticales de raíces maduras y al mismo tiempo un primordio del lóbulo nodular se inicia en el periciclo. La presencia simultánea de nódulos activos y senescentes, de distintos tamaños y edades en el sistema radicular, sugiere la continua formación y desintegración de nódulos durante la vida del hospedante. Ocasionalmente los nódulos pueden alcanzar una edad de10 años. Protección del oxígeno y fijación del N2 Uno de delosqueresultados del deaislamiento l978 fueEsto el descubrimiento la fijaciónmás de N2sorprendentes es máxima cerca los niveles de deFrankia O2 de la en atmósfera. contrasta con lo observado en los rizobios, que sólo es capaz de expresar actividad nitrogenasa cuando los niveles de O2 son extremadamente bajos. Varias evidencias de naturaleza fisiológica, citológica y genética indican que la función de la vesícula es proteger a la nitrogenasa del O2. Especialmente su pared, formada por variascapas de naturaleza lipídica rica en hopanoides, bacterihopanotetrol y un fenilacetilester que sólo se encuentran en Frankia. Estos lípidos actuarían como una barrera para la difusión de O 2. Sin
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embargo, el desarrollo de una envoltura con apropiado espesor y composición lipídica necesita varios días. Por ello, se considera que otros mecanismos están involucrados para completar la protección de la nitrogenasa, como las actividades de las enzimas superóxido dismutasa y catalasa que se encuentran en mayor cantidad en las vesículas que en las hifas. En Casuarina y Allocasuarina no se forman vesículas y se asume que la protección del O 2 está determinada por un espesamiento y lignificación de las paredes de la célula donde tiene su asiento la nitrogenasa, una disposición anatómica del tejido nodular que evita una gran aireación y un aumento de la hemoglobina. El hecho que la diferenciación de infectadas las hifas intracelulares se correlaciona con que la estas hifas lignificación de las paredes de las células del hospedante, lleva a suponer intracelulares (y no las invasoras) serían en Casuarinaceae la contraparte de lasvesículas de otras simbiosis actinorrícicas.
Genética Los estudios con respecto a la nitrogenasa han demostrado que esta enzima es similar a la de otros fijadores de N2, con los genes estructuralesDHK. Los genes nifH y nifD de Frankia tienen un alto grado de homología con los correspondientes genes deAzotobacter y cianobacterias, no así el gen nifK. Si bien ha resultado bastante sencilla la identificación de estos genes, no ha ocurrido lo mismo con los genes nod, donde los intentos han tenido éxito limitado. Se hace necesaria la realización de más estudios sobre la fisiología, bioquímica y estructura fina de los nódulos en desarrollo que aporten datos acerca de qué genes están involucrados en la nodulación. Se ha avanzado en el estudio de las auxinas y citoquininas deFrankia y se especula que pueden tener importancia en el proceso denodulación.
Factores ambientales que influyen sobre la nodulación y la fijación pH: Contrariamente a la mayor parte de las leguminosas muchas plantas actinorrícicas pueden desarrollar en suelos ácidos (ej.Myrica gale), pero en general el pH óptimo para la fijación está comprendido entre 4,2 y 7. Temperatura: La temperatura óptima para la actividad de la nitrogenasa varía según las especies, para algunas oscila entre 20 y 25oC y para otras entre 30 y 35oC. Aireación y humedad: La formación de nódulos requiere un cierto grado de humedad en elsuelo y suficiente O2. Las raíces noduladas se hallan presentes sobre todo enlas capas más superficiales del suelo y es difícil hallarlos en suelos inundados, excepto enMyrica gale. Nutrientes: Para una adecuada nodulación y fijación de N2 se necesita un buen nivel de P y Ca y además cubrir los requerimientos de ciertosmicroelementos tales como Co, Cu yMo. Relaciones con otros microorganismos rizosféricos Se destaca la acción sinérgica deFrankia con otros microorganismos de la rizosfera como Pseudomonas, Azospirillum y micorrizas tanto ectótrofas como vesículo-arbusculares. Las micorrizas son asociaciones simbióticas entre plantas y hongos que favorecen la provisión de P y aumentan la exploración del perfil de suelo.
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Fijación de N2 a campo y aplicaciones del sistema actinorrícico Datos de fijación evaluados en bosques deAlnus oscilaron entre 60 y 85 Kg de N ha-1 año.Varias experiencias conAlnus glutinosa indicaron que pueden llegar a sobrepasar la eficiencia de la fijación de muchas leguminosas. 1
Como la gran mayoría de las especies actinorrícicas son leñosas, no son apetecidas por el ganado por lo tanto pueden utilizarse como recuperadoras de la fertilidad de suelos agotados o erosionados, sin correr el riesgo que sean devoradas. Las plantas actinorrícicas ofrecen un interesante campo para su estudio desde el punto de vista básico y aplicado, dado el avance de las técnicas moleculares que permiten conocer mejor la diversidad genética de las especies involucradas en esta simbiosis. La optimización de esta simbiosis puede mejorar el nivel y disponibilidad de N del suelo en cultivos consociados de plantas actinorrícicas con plantas de interés económico. Por ejemplo, en muchos lugares del mundo se emplean especies árboreas actinorrícicas consociadas con plantas deimportancia comercial como la asociación de Populus spp. con Alnus spp.. Los programas de reforestación necesarios para mitigar el impacto ambiental y cubrir las exigencias de la industria papelera que requiere ejemplares de rápido desarrollo, han despertado el interés por el establecimiento de la fijación biológica de N 2 en especies forestales y representa un gran desafío tecnológico para nuestro país.
FIJACIÓN NO SIMBIÓTICA DE NITRÓGENO. FIJADORES LIBRES Y ASOCIATIVOS. La medida de la actividad nitrogenasa por medio del método de la reducción del acetileno permitió examinar diversos ecosistemas en donde podría existir la fijación potencial de N2. Esta metodología permitió confirmar que existía fijación de N2 asociada con sistemas no simbióticos en particular en la rizosfera de gramíneas tales como sorgo, arroz y maíz. Se ha podido identificar y clasificar numerosas bacterias fijadoras de N2 de la rizosfera, en distintos géneros de esta familia de plantas. Estas bacterias han sido aisladas de la rizosfera, superficie de la raíz, y en algunos casos del interior de la raíz. Muchas bacterias que desarrollan en el suelo son capaces de fijar N2 en cantidades importantes. Algunas crecen en el suelo libre pero la mayoría ocupan la rizosfera, con diversos grados de asociación con las raíces. Los géneros de mayor distribución en los suelos son Azotobacter, Azospirillum, Beijerinckia y Derxia. También se ha descripto esta capacidad en especies del género Paenibacillus. Azotobacter spp.: Son bastones aerobios de 2-3 µm de ancho por 3-10 µm de largo, pleomórficos, formadores de quistes, con flagelos perítricos. Las especies A. chroococcum y A. vinelandii están limitadas a suelos neutros y sólo esporádicamente se encuentran en suelos
tropicales húmedos. Generalmente no prosperan en la rizosfera de las plantas, atribuyéndose a la A. paspali que es abundante en la acumulación de sustratosnotatum bacteriostáticos, excepto la en especie rizosfera de Paspalum , siendo remarcable este caso la alta especificidad plantabacteria que llega hasta ecotipo. Azotobacter puede acumular en su protoplasma grandes concentraciones de polihidroxibutirato
(PHB), sustancia que actualmente se ensaya para la elaboración de plásticos biodegradables. La importancia de Azotobacter en el suelo está más relacionada a su capacidad de degradar sustancias recalcitrantes y a sus exopolisacáridos capsulares que contribuyen a la agregación del suelo que a su eficiencia como fijador de N2.
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spp.: Contrariamente a Azotobacter, las especies de Beijerinckia son representantes de zonas tropicales. Fueron aisladas de suelos cultivados con arroz y también de la superficie de raíces de caña de azúcar. Son muy tolerantes a la acidez, desarrollan en medios con valores de pH de 3 a 9. Se encuentran en gran número en suelos tropicales del tipo Latosol. Al microscopio, generalmente se distinguen fácilmente las células en forma de bastón porque en cada extremo lleva un glóbulo de PHB. La eficiencia de la fijación es de 13-30 mg N g -1 de sacarosa consumida. Beijerinckia
Derxia spp.: son bastones más delgados que Beijerinckia, desarrollan colonias con mayor cantidad de mucus que las de Azotobacter y Beijerinckia. La especie más repartida en suelos
tropicales es D. gummosa. La eficiencia de la fijación alcanza a 25 mg N g -1 de glucosa asimilado. Azospirillum spp.: Son bastones ligeramente curvos de 0,8 a 1,0 µm de diámetro por 2 a 4 µm
de longitud y muchas veces son puntiagudos. Acumulan gránulos de PHB en condición de fijación de N2, llegando a acumular el 50% del peso seco de su masa celular, mientras que las células cultivadas con NH4+ acumulan sólo el 1%. Los azospirilos son Gram _, muy móviles en medios semisólido. Esos movimientos son del tipo vibracional y son propulsados por un flagelo polar. Cuando crecen en un medio con agar blando pueden observarse numerosos flagelos perítricos. Son aerobias cuando el medio contiene una fuente combinada de N y posee principalmente un metabolismo respiratorio con el O2 o NO3- como aceptores finales de electrones. Han sido caracterizadas numerosas especies de Azospirillum. Algunas de ellas como A. brasilense y A. lipoferum han sido ampliamente estudiadas. La mayoría de ellas se han encontrado en forma libre en el suelo o en asociación con raíces vegetales en muchas partes del mundo y frecuentemente en gran número (hasta 107 bacterias g-1 de raíz). Las plantas hospedantes más citadas son gramíneas de zonas tropicales como maíz, sorgo, caña de azúcar y arroz, pero también se han encontrado en zonas templadas y frías. Su inoculación generalmente produce incrementos de rendimientos en cultivos de grano que en promedio pueden oscilar entre un 10 y 30%. Además, hay numerosas evidencias que muestran que esta rizobacteria tiene capacidad de producir asociaciones benéficas con cultivos hortícolas, forrajeros, frutales y no tradicionales. Micrografías electrónicas de barrido han revelado que la colonización se efectúa preferencialmente en la zona de elongación de la raíz y en la base de los pelos radiculares. La quimiotaxis de Azospirillum se ve favorecida por los exudados radiculares. Los mecanismos por los cuales Azospirillum favorece el crecimiento vegetal son varios. Ciertas combinaciones Azospirillum-planta permitieron demostrar utilizando la técnica de dilución isotópica de 15N que pueden lograse niveles de N provenientes de fijación biológica que se equiparan a un aporte de 100 kg N ha -1. Por otra parte, Azospirillum produce factores de crecimiento tales como ácido indol acético, ácido indol láctico, ácido indol butírico, indol 3etanol, indol 3-metanol, varias giberelinas, citoquininas y ácido abcísico. Algunas de estos fitoreguladores se han purificado y se han agregado a plántulas reproduciéndose los efectos de
Azospirillum sobre el desarrollo y morfología de la raíz, es decir, alargamiento y mayor
producción de pelos radiculares. Este proceso favorecería una mayor absorción de agua y nutrientes que mejoraría el estado nutricional de las plantas inoculadas con esta rizobacteria. En la literatura referida este tema se considera que dependiendo de la combinación azospirilo-planta pueden intervenir uno o más de estos procesos en la promoción del crecimiento y rendimiento en cultivos de importancia agronómica en diferentes suelos y áreas climáticas del mundo. Por ejemplo, en ensayos con dos variedades de tomate se estableció que
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la promoción del crecimiento y la sanidad del cultivo dependen en gran medida de la combinación entre el genotipo vegetal y la cepa de A. brasilense con la cual se haya inoculado las semillas de tomate (Romero y col. 2003, Correa y col. 2007). Existen en el mercado, tanto en el ámbito nacional como internacional, formulaciones comerciales de Azospirillum que no difieren en alternativas a las mencionadas para rizobios . De todas maneras es necesario invertir en investigación y desarrollo a fin de optimizar la eficiencia de las asociaciones azospirilo-planta.
LA ASOCIACIÓN DE LA CAÑA DE AZÚCAR CON BACTERIAS ENDOFITAS. Hace algunos años se ha demostrado que la caña de azúcar se asocia con bacterias de las especies Gluconacetobacter diazotropicus (antes conocida como Acetobacter diazotropicus) H erbaspir il lu m seropedicae y H . r ubri subalbicans . Estas bacterias se desarrollan dentro de las plantas como endofitos. Se considera un endofito un hongo o bacteria que durante todo o parte Se de su ciclo de vida invade el tejido de plantas vivas, sin causarles síntomas o enfermedad. ha observado que en muchos casos la presencia de endofitos mejora el crecimiento de las plantas y los protege de ataques de patógenos. Se ha determinado que las bacterias antes mencionadas, cuando están presentes, pueden fijar por lo menos hasta el 60% del N requerido por la caña de azúcar. La asociación entre estas bacterias y la caña de azúcar constituye un campo de intensas investigaciones tanto en el ámbito nacional como en el internacional. No se conoce claramente como se produce la infección, y se postula que hay en el suelo esporas que penetran las raíces y luego migran a la parte aérea. Otra posibilidad es que la bacteria permanezca viable en el rastrojo hasta la cosecha del año siguiente e infecte a las nuevas plantas.
CAPÍTULO 9 MICORRIZAS Clasificación de las micorrizas. Su biología. Aspectos nutricionales. Efectos benéficos. Preparación de inoculantes. Su relación con el ciclo del P. Material de estudio: Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biología de los Microorganismos, 8a edición. Prentice Hall. Capítulo 14 (14.21)
Introducción Las plantas han desarrollado numerosas estrategias para poder sobrevivir en distintos ambientes. Una de las estrategias más exitosas es la capacidad de las raíces para asociarse con microorganismos estableciendo simbiosis mutualistas. Una micorriza es una asociación simbiótica mutualista entre un hongo no patógeno y células vivas de la raíz. Esta relación produce beneficios tanto para la planta, debido a que mejora la absorción de agua y minerales, como para el hongo, que recibe nutrientes orgánicos de la planta.
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Los hongos micorrícicos son simbiontes obligados, lo cual implica que no pueden multiplicarse sin estar asociados a una planta huésped. En cuanto a las plantas, casi todas las especies viven con este tipo de simbiosis, salvo ciertas especies de las familias de las Ciperáceas, Juncáceas, Urticáceas, Quenopodiáceas, Cariofiláceas y Crucíferas, que son menos infectadas que otras. Casualmente, muchas de estas especies no formadoras de micorrizas constituyen malezas persistentes de cultivos agrícolas. El srcen de esta asociación es muy antiguo. Los registros fósiles evidencian la presencia de individuos de la división Glomeromycota hace 600 millones de años, alrededor de 100 millones de años antes que el surgimiento de las plantas en la superficie terrestre. Nicolson (1975) estimó que estos hongos pudieron haber evolucionado como una adaptación para la eficiente absorción de fósforo y muchos investigadores postulan que pudieron haber participado en la colonización de ambientes terrestres por parte de las plantas (Berbara et al, 2006). Históricamente, las micorrizas se han dividido en dos grandes grupos: las endomicorrizas (MA) y las ectomicorrizas (ECM). Las primeras están presentes en plantas herbáceas y arbustivas de ecosistemas naturales y de interés agronómico mientras que las ectomicorrizas se encuentran en plantas arbóreas, muchas de uso forestal (Pináceas, Fagáceas, Quercináceas, entre otras). Las ectendomicorrizas, por su parte, constituyen un grupo con características intermedias entre las ECM y las MA. La clasificación y características resumidas en la Tabla 1 incluyen los grupos de las endo- y ectomicorrizas, así como las subdivisiones surgidas recientemente. En este capítulo se analizarán con mayor detalle a las MA y las ECM pues éstas representan, junto al selecto subgrupo de las micorrizas ericoides, el 90% de todas las asociaciones.
ENDOMICORRIZAS Este grupo incluye las micorrizas arbusculares, las arbutoides y ericoides, y las micorrizas de orquídeas. Las MA poseen particular consideración porque se asocian simbióticamente con la mayoría de las plantas silvestres y cultivadas formadoras de endomicorrizas. Todos estos hongos comparten el mismo modo de infección: las hifas penetran en el tejido cortical de la raíz de la planta e infectan progresivamente las células de la corteza. Sin embargo, las estructuras visibles son significativamente diferentes entre los distintos tipos (Tabla 1). Aún existiendo un amplio grado de susceptibilidad del hospedante y de adaptabilidad del hongo a determinadas condiciones, las endomicorrizas están presentes en casi todos los suelos, en asociación con una gran variedad de plantas de distintos grupos taxonómicos. La gran diversidad de hospedantes de las MA hace que éstas sean sumamente importantes para el crecimiento de las plantas en un amplio espectro ecológico y geográfico. La principal contribución del hongo está en la absorción y traslocación de agua y nutrientes. Los beneficios se manifiestan especialmente en aquellos donde los defactores del como crecimiento se encuentran por debajo de los valores óptimoslugares para el desarrollo las plantas, en zonas desérticas de suelos pobres con alta cantidad de arena. Asimismo, existen beneficios indirectos para las plantas y el ecosistema, principalmente a través de su interacción con el ambiente edáfico al participar en la dinámica del carbono y en la agregación del suelo.
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Tabla 1. Clasificación de las micorrizas y sus características.
Clasificación clásica Endotróficas o endomicorrizas
Clasificación actual Arbusculares
Ericáceas
Ericoides
Planta hospedera Desarrollo Se han mayoritario del hongo encontrado en la dentro de la raíz. mayoría de las Hifas externas no plantas de la formadoras de manto. corteza terrestre Características
Micelio septado, salvo en no hifas viejas. Hifas intercelulares que no forman red de Hartig, e hifas intracelulares que forman arbúsculos y en ciertos casos vesículas. Rudimento de manto. Ericaceae Hifas septadas inter e Epacridaceae intracelulares, las Empetraceae intracelulares forman masas compactas que pueden ser lisadas o digeridas. No se forman
vesículas ni arbúsculos. Arbutoides Forman manto. Hifas septadas intra e intercelulares, las intercelulares no forman red de Hartig. La planta huésped Orquidáceas tiene un período de su ciclo de vida heterótrofo durante el cual, para sobrevivir, necesita ser infectada por un hongo micorrícico que forma micelio septado. Hifas pueden
Ectotróficas o ectomicorrizas
Formadoras de manto (sheathing)
evolucionar como micorriza o parásitas. Manto que cubre la raíz. Hifas sólo intercelulares que forman la red de Hartig. Micelio septado.
Hongo Glomeromycota 4 Órdenes 11 Familias 17 Géneros
Ascomycota
Ericaceae Pyrolaceae Monotropaceae
Basidiomycota
Orchidaceae
Basidiomycota
Betulaceae Fagaceae Pinaceae Eucaliptus
Basidiomycota
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La aplicación práctica de las endomicorrizas es solo factible en áreas como fruticultura, horticultura, floricultura y revegetación de espacios degradados, donde es común o factible la existencia de una etapa de trasplante. Esto se debe a que hasta el momento no se ha podido cultivar las MA en medios artificiales debido a que se trata de un hongo biótrofo obligado, o sea que necesita de un hospedante para completar su ciclo de vida. Esto constituye una diferencia tecnológica con respecto a los hongos involucrados en las asociaciones ectomicorrícicas (ver ECM).
Colonización de la raíz por el hongo: proceso y estructuras involucradas La infección se odesarrolla de la activacióndedel micelio del hongo,micorrizadas. mediante la germinación de esporas de micelioa partir infectivo procedente fragmentos de raíces En primer lugar, el hongo forma un apresorio sobre la superficie de un pelo radicular o epidermis de la raíz y luego las hifas penetran la pared celular por medio de acciones mecánicas y/o enzimáticas. Cuando se establece la simbiosis micorrícica, ocurren en la raíz cambios anatómicos y citológicos: en el área invadida se genera una hipertrofia de los tejidos celulares, aumenta el plasmalema y el citoplasma del hospedante, así como también el núcleo de las células infectadas modifica su forma y se vuelve más voluminoso. A partir de la formación del apresorio comienza el desarrollo de micelio interno, el cual ocurre intra e intercelularmente. En el interior de algunas células del hospedante el hongo forma enrollamientos que permiten extender la infección longitudinalmente en la raíz para penetrar las células más internas de la corteza. Una vez en la corteza, se forman ramificaciones a partir de hifas intercelulares y el plasmalema del huésped se invagina, rodeando totalmente la estructura fúngica hasta que ésta se encuentra en el interior de la célula. Seguidamente, esta estructura del hongo se ramifica repetidamente, dando lugar a una estructura arborescente llamada arbúsculo. En la zona de contacto huésped-arbúsculo se forma una fase donde se ha comprobado que ocurre la mayor transferencia de nutrientes entre ambos simbiontes. Por otra parte, el micelio interno puede formar vesículas que actúan como órganos de reserva. Éstas son formadas solamente por algunos géneros de MA y consisten en ensanchamientos terminales o intermedios de hifas, que se disponen inter o intracelularmente. Las vesículas se desarrollan más tardíamente que los arbúsculos, en las regiones más antiguas de la infección, y contienen material lipídico. El hecho de encontrarlas asociadas con raíces viejas o muertas sugiere que también desempeñan un papel como órganos de reposo y/o de propagación del hongo. Al mismo tiempo las hifas crecen en el exterior, estableciéndose posteriormente puntos de entrada. Se observa entonces la presencia de un sistema micelial integrado por dos fases: un micelio interno, ubicado dentro de la corteza de las raíces micorrizadas, y un micelio externo de extensión variable, el cual coloniza el suelo pudiendo llegar a extenderse varios centímetros desde la raíz. Se presentan dos tipos de hifas extramatriciales: aquellas que avanzan a través de amplias superficies del suelo y las hifas absorbentes (Figura 1). La presencia del micelio externo constituye uno de los principales pilares de la asociación, que estas hifas se desarrollan más alláhacia del suelo que circunda la raíz, de trascienden la rizósfera ya y transportan nutrientes directamente la planta, lo cual resulta especial importancia para la absorción de nutrientes poco móviles. Además de asistir en la absorción de nutrientes, esta red externa de hifas participa en la agregación de las partículas del suelo. A partir del micelio externo del hongo, y excepcionalmente dentro de la raíz, se pueden formar grandes cantidades de esporas de resistencia de paredes gruesas, las cuales pueden sobrevivir por varios años. Las esporas pueden ser de tipo clamidospórico (con pedicelo) o azigospórico (sin pedicelo).
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Taxonomía de hongos micorrícicos arbusculares La taxonomía de los hongos formadores de MA (HFMA) ha sufrido numerosos cambios. Según la clasificación de Schüßler et al. (2001), basada en el análisis de las secuencias de ARN ribosomal, es probable que estos hongos provengan de un ancestro común con los phyla Ascomycota y Basidiomycota. Estos autores ubicaron a los HFMA dentro del phylum Glomeromycota, compuesto por hongos simbiontes obligados que forman endomicorrizas arbusculares (MA) o endocitobiosis con organismos fotosintéticos (Tabla 2). La familia Geosiphonaceae incluye al hongo Geosiphon pyrifomis que establece endosimbiosis con cianobacterias. Si bien esta asociación puede no ser considerada micorrícica, indica la posibilidad de tipos ancestrales de simbiosis entre hongos y organismos fotoautótrofos, reflejando un posible estadio evolutivo primitivo de la asociación micorrícica arbuscular cuando las plantas todavía no colonizaban la tierra y las cianobacterias eran organismos preponderantes en el planeta (Schubler et al, 2001).
Figura 1. Diagrama de una endomicorriza. AD, azigosporo en desarrollo, AP apresorio, AZ azigosoporo con hifas infectivas, CA células auxiliares, CL clamidospora, EV esporo vegetativo de Glomus, ME micelio extraradicular, PR pelo radicular, TG tubo germinativo.
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Tabla 2. Clasificación de hongos micorrícicos arbusculares (HMA) (Schüßler & Walker, 2010)
Phylum Glomeromycota Clase Glomeromycetes Órdenes (4)
Familias (11)
Glomerales
Glomeraceae
Diversisporales
Claroideoglomeraceae Gigasporaceae
Acaulosporaceae Entrophosporaceae Pacisporaceae Diversisporaceae Paraglomerales Archaeosporales
Paraglomeraceae Geosiphonaceae Ambisporaceae Archaeosporaceae
Géneros (17) Glomus Funneliformis Rhizophagus Sclerocystis Claroideoglomus Gigaspora Scutellospora Racocetra Acaulospora Entrophospora Pacispora Diversispora Otospora Paraglomus Geosiphon Ambispora Archaeospora (incluye a Intraspora)
Papel nutricional de las MA El papel de las MA en la nutrición vegetal en suelos con baja fertilidad o en ambientes degradados o con niveles considerables de algún tipo de estrés es una de las áreas más interesantes de investigación, con un alto potencial para su aplicación práctica en agricultura sustentable y recuperación de suelos degradados. Los beneficios nutricionales de las MA resultan de interacciones dinámicas y complejas entre las raíces y el micelio fúngico moduladas por el ambiente. El papel primario de las MA en el aumento de la absorción de nutrientes se debe a que el micelio externo contribuye con el aumento tanto de la superficie de contacto con el suelo como del volumen explorado. Es sabido que las especies vegetales con un sistema radicular extremadamente ramificado dependen menos de MA para la absorción de nutrientes que otras plantas con sistemas radiculares pivotantes con pocas ramificaciones. Por otra parte, la disponibilidad de nutrientes en el suelo puede afectar el establecimiento y funcionamiento de esta simbiosis. De acuerdo al aumento del nivel de fertilidad, la dependencia de la condición micorrícica para un buen desarrollo decrece hasta un punto en que la planta se vuelve inmune a la colonización. La disponibilidad de fósforo ejerce una influencia muy marcada en la micorrización y será analizada luego con mayor detalle. En cuanto al N, se sabe que altos niveles reducen la colonización.
Otros factores que afectan a las MA Además de la disponibilidad de nutrientes, el ambiente puede regular la formación de MA a través de otros factores tales como:
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- pH Existe gran variabilidad entre las especies e incluso entre ecotipos. Generalmente, las especies de Gigaspora y Acaulospora se encuentran en suelos de pH bajos mientras que el género Glomus comúnmente aparece en suelos próximos a la neutralidad o alcalinos y difícilmente forma asociaciones micorrícicas en suelos con elevada acidez. - Humedad La colonización es aparentemente más rápida cuando la humedad del suelo es menor a la capacidad máxima de retención. Suelos anegados presentan menor colonización debido a la falta de oxígeno. - Luz y temperatura Ambos tienen efecto sobre el desarrollo del hospedante y, por ende, sobre la disponibilidad de nutrientes para el hongo. La temperatura del suelo parece influir en la actividad fisiológica de la micorriza más que afectar su desarrollo. - Biológicos La presencia de otros organismos del suelo puede afectar la funcionalidad de las MA. Los nematodes, por ejemplo, pueden alimentarse del micelio reduciendo su eficiencia en el transporte de nutrientes. - Agroquímicos Además de los efectos ya mencionados de los fertilizantes vía nutrición, se ha encontrado que muchos fungicidas e insecticidas inhiben la micorrización. Medios artificiales y prácticas de inoculación de MA Como las esporas recogidas del suelo no desarrollan en medios artificiales, se inoculan en plantas susceptibles (Rye grass, cebolla, trébol, Panicum, Bracchiaria, etc.) para obtener raicillas infectadas que junto con las esporas sirven de inóculo para los ensayos de investigación o para las actividades comerciales en viveros (plantas forestales, frutales y ornamentales).
ECTOMICORRIZAS (ECM) En este caso los hongos micorrícicos forman un denso manto que envuelve la raíz (Fig. 2). Desde este manto las hifas individuales crecen hacia fuera introduciéndose en el suelo, y hacia dentro intercalándose entre las células del córtex de la raíz, a través de la lámina media, formándose un entramado denominado red de Hartig. Esta red puede ser más evidente en algunas asociaciones que en otras así como el manto que envuelve la raíz puede variar en grosor. En algunos árboles la micorriza presente puede evidenciar un manto muy reducido o estar totalmente ausente, formando las llamadas ectendomicorrizas. Esta simbiosis produce grandes cambios en la morfología radical. Se estimula la formación de raíces laterales, se elongan radialmente las células corticales y se suprime la formación de pelos radicales. Si bien esto último la superficie de absorción, el efecto queda contrarrestado por las hifas micorrícicas, quereduciría incrementan el volumen de suelo explorado. Las raíces infectadas suelen hallarse en la capa del mantillo del suelo y el micelio se extiende a través de las hojas caídas y produce grandes cuerpos fructíferos por encima del nivel del suelo (hongos sombrero), que liberan una gran cantidad de esporas que serán dispersadas por el viento. A diferencia de las endomicorrizas, los hongos ectomicorrícicos pueden crecer sin influencia de la planta huésped en un medio que contenga azúcares simples y vitaminas. La planta hospedante se beneficia con esta relación ya que las hifas externas facilitan la
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entrada a la raíz de los compuestos orgánicos y minerales del suelo. El hongo, además de utilizar los fotoasimilados de la planta, está protegido de la competencia con otros microorganismos, lo cual compensa su escasa habilidad competitiva saprofítica. Los hongos ectomicorrícicos son de gran importancia para la forestación. Pertenecen en su mayoría al grupo Basidomycota. Son organismos aerobios, que crecen preferentemente en suelos permeables y aireados con bajo o mediano grado de fertilidad. Los géneros más comunes son Boletus, Amanita, Russula, Suillus, Scleroderma, Agaricus y Pisolithus. Son simbiontes característicos en forestales de las familias Fagaceae, Betulaceae y en particular de Pinaceae.
Figura 2. Representación esquemática de las estructuras externas e internas de las microrrizas ectótrofas.
Preparación de inoculantes ectomicorrícicos (hongos sombrero) Para obtener los inóculos iniciales de estos hongos se puede proceder de dos formas:
- Obtener las esporas y sembrarlas en un medio sólido adecuado, ya sea agar malta o agar extracto de levadura glucosado a pH5, e incubar a 25°C. - Si se trata de un basidiomicete, sembrar un trocito del “sombrero” en el mediosólido adecuado, e incubar a 25°C.
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Con cualquiera de las dos técnicas al cabo de un tiempo se obtiene micelio, que luego se inocula medio de cultivo líquido y se incuba con agitación. Éste es el inóculo que se emplea para impregnar la turba que se usará como inoculante.
BENEFICIOS DE LA MICORRIZACIÓN Entre los posibles beneficios directos para las plantas se han observado: Asistencia en la absorción de agua y nutrientes, fundamentalmente de aquellos poco móviles como los fosfatos, amonio y elementos catiónicos de K, Zn y Cu, favoreciendo un mejor estado nutricional en la parte aérea de la planta. Mayor tolerancia frente a diversos factores de estrés abiótico: sequía, valores desfavorables de pH, alto contenido de sales, exceso de erosión eólica, etc. Las glomalinas8 que sintetiza y exuda el hongo de MA poseen cargas negativas que inmovilizan ciertos cationes fitotóxicos, impidiendo que sean absorbidos. Esto aumenta la tolerancia de algunas plantas a suelos con alto contenido de metales pesados.
Mayor tolerancia frente al ataque de organismos patógenos, como se ha observado ante nematodes y hongos como Fusarium, Pythium y Rhizoctonia. Ésta podría estar inducida indirectamente a partir de los beneficios fisiológicos sobre la planta, pero también directamente mediante la competencia con el patógeno o la activación de sistemas de defensa en la planta. Aumento en eficiencia fotosintética, que compensaría las pérdidas de C por transferencia al hongo.
A nivel productivo estas ventajas de la micorrización permiten por ejemplo:
Mejorar la aclimatación de plantas micropropagadas (manzano, duraznero, entre otros). Reducir la mortalidad de plantas ornamentales y frutales que se desarrollen en sustratos con bajo contenido de fósforo y buena aireación, así como incrementar el peso seco de hojas y raíces y lograr una floración significativamente más precoz mediante la utilización de micorrizas del género Glomus (G. mosseae, G. intraradices y G. viscosum). Aumentar rendimientos cuanti y cualitativamente, permitiendo una disminución en la cantidad de fertilizantes empleados. Las micorrizas permiten una aplicación exitosa mediante el recubrimiento de las semillas, lo cual mejora su calidad (Read, 1999). Mejorar en sitios degradados y/o contaminados la implantación de las plantas destinadas a la recuperación y/o revegetación. Utilizar conjuntamente con micorrizas otros microorganismos de control biológico o promotores de crecimiento, desarrollando sistemas micorrizosféricos beneficiosos para la nutrición y la protección vegetal (Barea, 2004).
Los principales beneficios indirectos de la micorrización conocidos hasta el momento son:
Participación en la formación de agregados estables en el suelo a través de la producción de hifas y exudados. Entre estos últimos, las glomalinas favorecerían adicionalmente la agregación química (floculación) de las partículas del suelo. Esto resulta de gran importancia en suelos con baja actividad química, como aquellos arenosos, limosos o tropicales.
8 * Glomalinas: glicoproteínas de estructura similar a los ácidos húmicos cuya síntesis por parte de los hongos micorrícicos arbusculares está siendo recientemente estudiada.
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Interacción de los HFMA con la diversidad y abundancia de las comunidades vegetales : e.g., mayor diversidad fúngica ha resultado en una mayor diversidad de plantas (Berbara et al., 2006). Mayor eficiencia del ciclaje de nutrientes móviles, reduciendo procesos de lixiviación: por ejemplo, la red de hifas captura parte del N no absorbido por las plantas. Drenaje de carbono atmosférico a partir de su asimilación por parte del hongo y su acumulación en estructuras estables, como la quitina de sus paredes. Posible transferencia de N entre plantas a través de la red de hifas de EM de clima templado y de MA, la cual se comprobó entre individuos de distinta familia (Berbara et al., 2006).
Los beneficios enunciados no se observan en todas las asociaciones micorrícicas, sino que su ocurrencia dependerá del genotipo vegetal y fúngico, de su interacción y de las características ambientales imperantes.
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EL FÓSFORO: IMPORTANCIA BIOLÓGICA, CICLO E INTERACCIÓN CON MICORRIZAS El siguiente análisis es principalmente para las MA y en alguna medida para las ECM, ya que las asociaciones fúngicas con orquídeas y ericáceas actúan de un modo bastante diferente al de las demás micorrizas. Por otra parte, dado que la contribución principal del hongo en la asociación micorrícica es la absorción y translocación de nutrientes, con particular relevancia en el caso del P, a continuación se analiza el rol de este elemento en la fisiología de la planta y desde la perspectiva del rol de la simbiosis micorrícica.
Importancia del fósforo en la planta Junto con el nitrógeno y el potasio, el P constituye uno de los principales macronutrientes para las plantas. Forma parte de los ácidos nucleicos, fosfolípidos y vitaminas, y es indispensable en procesos de transporte, almacenamiento y transformación de energía. Además, actúa en los caminos metabólicos de la fotosíntesis, respiración y división y elongación celular. También estimula la formación temprana y el crecimiento de las raíces, interviene en la formación de los órganos de reproducción de las plantas, es vital para la formación de semillas y acelera la maduración de los frutos en los cuales generalmente se almacena en altas concentraciones. Deficiencias severas de P provocan una atrofia en la planta. Se pueden producir áreas necróticas en las hojas, frutos y tallos. Los síntomas generales que se observan en una deficiencia de P son: ralentización de la germinación y el crecimiento, reducción drástica del crecimiento aéreo y radicular, tallos más cortos y delgados, y pérdida del color verde del follaje, que luego puede secarse y finalmente morir.
Absorción de P y rol de las micorrizas El fósforo es absorbido casi enteramente en forma inorgánica, como fosfatos solubles, pero muchas veces se encuentra en el suelo en forma no disponible. Entonces, el P que se encuentra en formas insolubles o constituyendo la materia orgánica debe necesariamente solubilizarse, tarea en la cual participa activamente la microbiota del suelo. Cuando el proceso se realiza sobre el P mineral es llamado solubilización y si el sustrato fosforado es orgánico, la liberación de P se conoce como mineralización. En el primer proceso actúan ácidos minerales y orgánicos, productos del metabolismo microbiano y también de srcen vegetal; y en el segundo la actividad de las enzimas fosfatasas juega un rol principal. La figura 3 describe el ciclo del P y el rol de la microflora del suelo. Sin embargo, a pesar de que existen mecanismos para liberar el P a formas asimilables, existe el inconveniente de que es un nutriente que rápidamente vuelve a insolubilizarse. Aquí es donde juegan un papel muy importante las micorrizas, debido a que sus redes de hifas actúan como grandes bombas que retiran los fosfatos del pool soluble a una velocidad 1000 veces superior a la de la raíz. A su vez, este proceso obliga a una mayor solubilización de la fracción lábil para restablecerse el equilibrio. Una vez absorbido por las hifas, el P es acumulado como gránulos de polifosfato en las vacuolas de los arbúsculos. Estos gránulos son luego transportados por la corriente citoplasmática hasta los extremos más finos de las hifas, donde las fosfatasas alcalinas los convierten a formas iónicas. Finalmente, el P pasa al hospedante en forma de fosfatos a través de los plasmalemas de ambos simbiontes, lo que se pudo comprobar por el aumento de la actividad ATPasa en el plasmalema de la célula hospedante que envuelve las ramas del arbúsculo. También a través del arbúsculo es que el hospedante provee al hongo de fotosintatos
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en forma de azúcares solubles para que éste los almacene como lípidos. Por esa razón, en vesículas y micelio se puede observar la formación de glóbulos lipídicos. Sostener esta simbiosis representa para la planta un costo energético de alrededor del 10-12% más de carbono que una planta no micorrizada, de todos modos, el hongo lo compensa mejorando el estado hídrico del hospedante e incrementando su tasa de fotosíntesis. Esto se logra a través de una mayor fijación de CO2, niveles de clorofila, grosor de las hojas y apertura de estomas, favoreciendo así la entrada de CO2. Este balance energético es fundamental para que los organismos asociados obtengan un beneficio real durante la interacción.
Figura 3. Ciclo del fósforo (P) y rol de la microflora del suelo.
CAPÍTULO 10 TRANSFORMACIONES MICROBIANAS DEL HIERRO Y EL AZUFRE Transformaciones microbianas del azufre. Ciclo biológico del S. Mineralización. Inmovilización. Oxidación del S mineral. Reducción del S orgánico. Transformaciones microbianas del hierro. Procesos de reducción-oxidación. Transformaciones directas del hierro de la forma orgánica a la forma inorgánica y viceversa. Procesos de reducción, solubilización y precipitación del Fe mediados por microorganismos en algunos tipos de suelo.
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Material de estudio: Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biología de los Microorganismos, 8a edición. Prentice Hall. Capítulo 13 (13.11) Capítulo 14 (14.15)
TRANFORMACIONES MICROBIANAS DEL AZUFRE El azufre es un elemento que se encuentra en la naturaleza, en rocas ígneas y sedimentarias bajo la forma de pirita (FeS 2), yeso (CaSO4.2H2O), azufre (S) y formando parte del humus del suelo y del mar. Es un constituyente de todos los organismos encontrándose en moléculas de péptidos, proteínas, vitaminas, enzimas y ácidos lípidicos. En los suelos, la mayor parte del azufre se halla localizada en la fracción orgánica proveniente de los restos de animales y vegetales, pudiendo llegar a constituir cerca del 80% del azufre total. La intensificación de la agricultura en los últimos años, provocó una disminución en los porcentajes de materia orgánica y una baja reposición de los nutrientes, lo cual ha generado deficiencia de azufre en algunos suelos de nuestro país. Como consecuencia de esto, se han determinado respuestas a la aplicación de S en trigo en el centro-norte de la Región Pampeana (Martínez et al., 2001; Salvagiotti et al., 2004), en donde la actividad agrícola se desarrolla hace más de un siglo sin el aporte de fertilizantes azufrados. El azufre es un elemento reactivo, que se encuentra en distintos estados de oxidación en el suelo: desde +6 en S042- y sus derivados hasta -2 en H2S y sus derivados, como se observa en la Tabla 1.
Forma Sulfato
Fórmula SO42-
Estado/s de oxidación 6
Sulfito
SO32 -
4
Tiosulfato
S2O32
-1 y +5
Tetrationato
S4O6 2-
-2 y +6
Elemental
S8
0
Polisulfuro
Sn2-
-2 y 0
Sulfuro
S2-
-2
Tabla 1. Estado de oxidación de formas microbiológicamente importantes de azufre en los suelos. En condiciones de reducción, el azufre se presenta en las formas de FeS, FeS 2 (piritas) y H2S. En la pedogénesis y formación del suelo, la pirita se oxida hasta SO 42-, y en esta forma de ión soluble es asimilado por las plantas y los microorganismos e incorporado a sus biomasas, siguiendo el proceso de inmovilización.
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Las plantas absorben el azufre principalmente como sulfatos aunque se han citado casos de crecimiento de plantas con aminoácidos azufrados como la metionina, y existen en la actualidad evidencias que demuestran que los vegetales pueden usar SO 2 atmosférico. El contenido de S varía desde 0.002 % hasta 5% en suelos calcáreos y salinos de zonas áridas y semiáridas. En suelos agrícolas de zonas húmedas y semihúmedas, el porcentaje normal es de 0,01 a 0,05 % de S, pero muchas veces no está en forma aprovechable porque se encuentra formando parte de la materia orgánica. Otra fuente de provisión de S al suelo es por medio de las lluvias que arrastran el SO 2 de la atmósfera que es un producto de las emanaciones industriales. El SO2 al combinarse con el agua forma ácido sulfuroso (H 2SO3) que se oxida rápidamente a sulfúrico (H2SO4), responsable de la lluvia ácida. También algunos fertilizantes y pesticidas pueden tener S en su formulación, como el caso de los superfosfatos, donde este elemento se encuentra bajo forma de CaSO 4. Las pérdidas de S en los suelos presentan los ritmos de pérdida de la materia orgánica. La magnitud de las pérdidas dependen de las lluvias, la capacidad de retención del suelo, las características del drenaje, la inmovilización por los microorganismos durante la descomposición de los restos vegetales. Debido a la lixiviación, los sulfatos raramente se acumulan en zonas húmedas y semihúmedas. Además puede perderse S como H2S y otros compuestos gaseosos producidos por la actividad microbiana, pérdidas que pueden llegar a ser importantes en suelos anegados. El S orgánico se encuentra formando moléculas de glutation, cisteína, metionina, coenzima A, biotina y tiamina. En algunos compuestos, el S está unido directamente al C. En otras moléculas el S está unido a los esqueletos carbonados por medio de puentes de -O(ésteres sulfato) o puentes de -N-. Los puentes disulfuros (-S-S-) sirven de unión entre péptidos en las moléculas proteicas, el grupo sulfidrilo (-SH) proporciona sitios para los cationes metálicos y para la unión de los grupos prostéticos a las enzimas.
Ciclo biológico del S Si bien este ciclo es muy complejo, se podría simplificar en las siguientes reacciones (Figura 1): A) MINERALIZACIÓN o descomposición de complejas moléculas orgánicas que contienen azufre a moléculas inorgánicas más simples. B) INMOVILIZACIÓN o asimilación de estos compuestos en células microbianas por procesos de reducción asimilatoria de SO42- a S orgánico. C) OXIDACIÓN de compuestos inorgánicos del azufre como tiosulfatos, sulfuros, sulfitos y azufre elemental. D) REDUCCIÓN de las formas inorgánicas por reducción desasimilatoria de SO42-. A) MINERALIZACIÓN Los compuestos orgánicos en el suelo pueden ser sustratos adecuados para una gran variedad de microorganismos y presentan procesos similaresson a la amonificación. En condiciones anaeróbicas losheterótrofos productos resultantes de la mineralización sulfatos, sulfuros y compuestos volátiles como metil mercaptanos, mientras que en condiciones aeróbicas los sulfatos representan el metabolito final más importante y abundante. Este proceso de liberación es realizado por la microflora heterótrofa del suelo, constituida por una gran diversidad de microorganismos. Los estudios se han concentrado fundamentalmente en los microorganismos que mineralizan los aminoácidos cistina, cisteína y
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metionina. Entre estos microorganismos encontramos a Aspergillus niger, Pseudomonas sp. y especies de Microsporium, entre otros.
Figura 1. Ciclo del Azufre.
Factores ecológicos que influyen en la mineralización de S orgánico. Humedad: La mayor producción de SO 42- a partir de S orgánico se produce cuando la tasa de humedad está próxima a la capacidad de campo. En suelos anegados, además de la formación de sulfuros, el S orgánico da srcen a mercaptanos, que son muy tóxicos para los vegetales, especialmente el arroz. Temperatura: La mineralización se detiene por debajo de 10°C pero se incrementa con el aumento de la temperatura de 20 a 40°C y decrece después. Relación C/S: Los valores de esta relación variarán con la naturaleza de la sustancia carbonada. Cuando en los residuos el cociente se encuentra por debajo de 200 habrá una ganancia neta de SO42- inorgánico y si es mayor de 400 habrá una pérdida neta. Efecto de la vegetación: Las plantas ejercen una acción positiva sobre la mineralización de S orgánico a través de su efecto rizosférico, al excretar sustancias carbonadas que contribuyen a la proliferación microbiana o enzimas que catalizan la descomposición de MO. Por otra parte, pueden actuar inhibiendo la mineralización, como el caso de algunas plantas perennes que producen sustancias tóxicas para la microflora. B) INMOVILIZACIÓN Los sulfatos producidos en la descomposición son absorbidos por los vegetales e inmovilizados en proteínas microbianas. Este último proceso, que se manifiesta con mayor intensidad en otoño e invierno, impide las pérdidas por lixiviación. Durante la degradación de la MO, la microflora del suelo puede consumir parte del azufre mineral o el azufre que forma parte de proteínas y aminoácidos, provocando la desaparición transitoria de este elemento en sus formas asimilables por las plantas. Esto no suele presentarse en condiciones de campo de forma
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tan crítica como para el nitrógeno, puesto que la relación C/S necesaria para que se presente inmovilización debe ser ≥ 200. Los hongos retienen el S como ésteres de este elemento. En forma de S o se encuentra en los esporocarpos de ectomicorrizas y en algunos grupos de bacterias que utilizan H 2S como agente reductor en la fotosíntesis anoxigénica.
C) OXIDACIÓN de S mineral Este proceso puede realizarse por vía química o biológica, pero cuando las condiciones ecológicas son favorables, la segunda vía es más eficaz. Los microorganismos que intervienen pueden clasificarse en cuatro grupos: 1) Bacterias quimiolitotrofas, familia Thiobacillaceae. 2) Microorganismos heterótrofos, familias Bacillaceae y Achromobacteraceae entre otras. 3) Bacterias quimiolitotrofas, familia Beggiatoaceae 4) Bacterias fotolitotrofas, familias Chlorobacteriaceae y Thiorodaceae. Los dos primeros grupos son representantes del suelo y los dos últimos de ambientes acuáticos.
1) Las bacterias de la familia Thiobacillaceae se conocen comúnmente como tiobacilos. Son pequeños bastoncitos no esporulados que oxidan H2S, S, tiosulfatos y politionatos. La especie típica es Thi obacil lus thiooxida ns que desarrolla a pH 2-5 y es estrictamente aerobia. Otras especies: Th. denitrificans crece a pH entre 5-8. Puede sustituir al O2 por NO3- como aceptor de electrones, Th. ferrooxidans: desarrolla a pH entre 1-1,5, también oxida Fe.
2) Microorganismos heterótrofos: Existen bacterias aerobias (Bacillus, Achromobacter, Pseudomonas, Microccocus), actinomicetes, hongos y levaduras que oxidan S inorgánico. Si bien esta acción es más lenta que la de los tiobacilos, pueden ser los primeros oxidadores en suelos neutros y alcalinos hasta que el pH baje lo suficiente para que actúen los tiobacilos. 3) Beggiatoaceas: Son bacterias aerobias quimiolitotrofas cuyo hábitat son las aguas sulfurosas de temperatura elevada o de ciertos suelos hidromorfos. La especie tipo es Beggiatoa, que obtiene la energía para vivir de la oxidación de H 2S con formación de S que se acumula en el interior de las células. Cuando en el medio falta S, estas bacterias oxidan el stock intracelular de S0 hasta H2SO4. 4) Bacterias fotosintéticas sulfurosas: Estas bacterias son anaeróbicas que obtienen su energía de la luz y utilizan como fuente de electrones al H2S. Estas condiciones las encuentran en barros y aguas estancadas ricas en MO conteniendo H 2S y expuestas a la luz. También en lagos donde se presentan como una capa coloreada sobre los depósitos de sal. Consecuencias agronómicas de la oxidación de S mineral En general, la oxidación del S en el suelo no modifica sensiblemente el pH pues los sulfatos formados son asimilados por las plantas. Cuando los aportes de S elemental son importantes en suelos básicos, pueden generar los siguientes resultados: 1) Estimulación de la actividad de Thiobacillus con producción de H2SO4 que neutraliza la alcalinidad del suelo y mejora su estructura por floculación de coloides. 2) El H2SO4 solubiliza fosfatos tricálcicos y los transforman en fosfatos dicálcicos y monocálcicos asimilables por los vegetales.
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3) La acidificación promovida por la sulfooxidación solubiliza otros elementos importantes como el Mn, que pasa de tetravalente insoluble a divalente soluble y aprovechable por las plantas. En otros casos el aporte de S es muy perjudicial. Por ejemplo, el tratamiento de enfermedades causadas por hongos y oomycetes, como el mildiu y los oidios, ha llevado a la ruina a muchos viñateros por el exceso de acidez.
D) REDUCCIÓN DE S INORGÁNICO: La reducción desasimilatoria de SO42- es realizada por un grupo de bacterias llamadas sulfatoreductoras. Son microorganismos heterótrofos, anaerobios estrictos que utilizan los SO 4-2, y otras formas de S inorgánicos como aceptores de electrones para llevar a cabo la respiración. La energía la obtienen de sustratos orgánicos y en ciertos casos pueden utilizar el H 2 como fuente de energía y electrones. Los representantes más conocidos son las bacterias Desulfovibrio y Desulfotomaculum. Las primeras son unos bastoncitos en forma de vibrión no esporulados con una cilia polar, mesófilos. El segundo género está representado por bastones rectos o curvos, esporulados, con cilias peritrícas, termotolerantes o termófilas estrictas. El hábitat de estas bacterias son los suelos anegados ricos en MO por la vegetación halófila o presencia de algas, así como también lagos salados y sedimentos marinos.
Factores ecológicos que facilitan la sulfatoreducción a) Presencia de SO42b) Anaerobiosis estricta c) Cantidad suficiente de sustancias donadoras de electrones. Estasdiferencias, condicionesel ecológicas se parecen aLos las sulfatoreductores que favorecen a lasedesnitrificación, existen dos pH y la anaerobiosis. desarrollan a unpero pH muy inferior a los desnitrificadores y necesitan anaerobiosis estricta, en cambio estos últimos son anaerobios facultativos.
Consecuencias agronómicas de la sulfatoreducción Este proceso puede alcalinizar el suelo porque los sulfuros hidrolizables que se forman pueden dar srcen a bases Na2S + 2 H2O -> H2S + 2 NaOH CaS + 2 H2O -> H2S + Ca(OH)2 El CO2 producto de la actividad microbiana o vegetal puede reaccionar con el NaOH o Ca(OH)2 provenientes de la reducción del S y formar carbonatos y bicarbonatos. NaOH + H2CO3 ---> NaHCO3 + H2O Ca (OH)2 + 2 H2CO3 -> Ca(HCO3)2 + 2H2O Por otra parte, el H2S es muy tóxico para las raíces de las plantas, en arroz producen la podredumbre o evitan la absorción de elementos nutritivos. Generalmente esto puede suceder en suelos irrigados ricos en sulfatos, pero si hay Fe activo en la rizosfera se forma FeS que no es dañino.
Corrosión anaerobia de metales en el suelo La corrosión de metales especialmente de hierro y acero es frecuente en suelos arcillosos, neutros y mal aireados así como también en las aguas poluídas. La corrosión no se produce en ambientes ácidos. Las bacterias que intervienen son las del género Desulfovibrio.
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TRANSFORMACIONES MICROBIANAS DEL HIERRO Introducción Prácticamente todos los organismos, con excepción de un pequeño grupo de bacterias fermentadoras homolácticas, necesitan hierro en pequeñas cantidades (ver Capítulo 3). Este micronutriente es utilizado como cofactor para muchas enzimas metabólicas y proteínas reguladoras debido a su capacidad de existir en dos estados de oxidación estable, hierro ferroso (Fe2+) e hierro férrico (Fe 3+). Sin embargo, el hierro no solo tiene una función nutritiva, el Fe 2+ puede funcionar como fuente de electrones para microorganismos que oxidan hierro bajo condiciones oxigénicas y anoxigénicas, mientras que el Fe 3+ puede funcionar como un aceptor terminal de electrones bajo condiciones anoxigénicas para los microorganismos reductores del hierro. En este capítulo abarcaremos todas las transformaciones microbianas de este elemento. Aunque el hierro es uno de los elementos más abundantes en la corteza terrestre, solamente una pequeña porción de este elemento se encuentra en forma soluble (Fe2+ o Fe-quelado), y por tanto, asimilable para las plantas y microorganismos. En condiciones alcalinas o neutras y en presencia de oxígeno, el hierro ferroso es inestable y se oxida espontáneamente a hierro férrico. Los microorganismos influyen en la solubilización del Fe, ya que cambian el estado de oxidación de este elemento traza a través de su metabolismo energético, sintetizan y secretan sideróforos, y cambian el potencial redox y el pH del suelo. En consecuencia, la disponibilidad para las plantas de este metal es altamente dependiente de la actividad de los microorganismos.
Transformaciones microbianas Oxidación y Reducción. Las reacciones de oxido-reducción biológicas están asociadas a la producción de energía por los microorganismos. Los compuestos inorgánicos reducidos (Fe 2+) son oxidados por microorganismos quimioautótrofos para generar electrones usados en la producción de ATP, mientras que compuestos oxidados (Fe3+) son reducidos durante la producción de energía bajo condiciones anaeróbicas cuando el elemento en cuestión actúa como un aceptor de electrones terminal alternativo (ver Capítulo 3). Oxi dación del F e.
Los microorganismos están involucrados en la oxidación de hierro, pero no todas las oxidaciones del hierro son mediadas por microorganismos. El ion ferroso Fe 2+ es rápidamente oxidado al estado férrico Fe3+ en condiciones aeróbicas a pH>5. Por eso, es difícil probar la oxidación microbiológica en medios neutros o alcalinos. Esto explica por qué la mayoría de las bacterias oxidantes de hierro son acidófilas estrictas. Estos microorganismos extraen la energía necesaria para el crecimiento según la siguiente ecuación: Fe2+ + H+ + ¼ O2
Fe3+ + ½ H2O
Los electrones generados en esta reacción son usados en la producción de ATP. Esta oxidación solo produce una pequeña cantidad de energía disponible y por esta razón las bacterias del hierro deben oxidar grandes cantidades de hierro para crecer. Por lo tanto, una población pequeña de estas bacterias puede causar la precipitación de gran cantidad de hierro.
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La bacteria oxidante de hierro más conocida es Acidithiobacillus ferrooxidans (antiguamente conocido como Thiobacillus ferrooxidans) que puede crecer autotróficamente usando hierro ferroso y compuestos reducidos de azufre como donadores de electrones. Esta bacteria vive en ambientes donde el ácido predominante es el sulfúrico y donde, además, hay mucho sulfato. En estas condiciones, el hierro férrico no precipita como hidróxido, sino formando parte de un compuesto mineral llamado jarosita [Fe3H (SO4)2 (OH)6]. La jarosita es un precipitado amarillento o marrón, que le da el color amarillo típico al drenaje ácido de las minas. Otros acidófilos oxidantes del hierro incluyen Leptospirillum ferroxidans, Sulfolobus spp. y Acidianus spp. Estos organismos son comunes en ambientes contaminados con ácidos como vertederos de minas de carbón, mientras que la arquea Sulfolobus vive en aguas termales ácidas a temperaturas cercanas al punto de ebullición del agua. Los microorganismos también pueden oxidar el hierro en forma indirecta actuando sobre el medio. Por ejemplo, las algas, con su fotosíntesis oxigénica, enriquecen el medio creando las condiciones para que se produzcan oxidaciones de naturaleza química. Por la acción microbiana se forman ácidos, H2CO3, HNO3, H2SO4 o ácidos orgánicos que facilitan los procesos oxidativos. Por otra parte, a pH neutro, en medios anóxicos a los que llega la luz, las bacterias fototrópicas anoxigénicas pueden oxidar Fe2+ a Fe3+, en un proceso que ya se ha estudiado en el capítulo 3. La fuente principal de electrones para los fotótrofos anoxigénicos, a diferencia de los fotótrofos oxigénicos, no es el agua sino alguna sustancia del medio. Unas pocas bacterias rojas pueden usar el hierro ferroso como donador de electrones produciendo hierro férrico. Reducción del F e.
Algunos microorganismos utilizan el Fe3+ como aceptor terminal de electrones para generar energía durante la respiración anaeróbica. La reducción bacteriana del hierro férrico a ferroso es el principal medio de solubilización de este elemento en la naturaleza, teniendo un rol importante en la mineralización de la materia orgánica en ambientes con bajas concentraciones de O2 (como ser suelos saturados con agua o en el interior de los agregados), donde además el sulfato y nitrato están en cantidad insuficiente para realizar la oxidación de estos elementos. El Fe3+ actúa como un aceptor terminal de electrones alternativo (ver Capítulo 3) en el metabolismo energético de algunos hongos y gran variedad de bacterias quimioorganotrofas y quimiolitotrofas. Los electrones que viajan por cadenas transportadoras de electrones terminan en un sistema de reductasa del hierro férrico. Ese flujo establece un gradiente de protones que puede ser usado para generar ATP. Un amplio rango de arqueas y bacterias son capaces de conservar energía a través de la reducción de Fe 3+ a Fe 2+. Ejemplos: Geobacter, Desulfovibrio, Pseudomonas y Acidithiobacillus. El Fe3+ también puede acompañar la fermentación, en la cual las formas oxidadas del metal sirven como aceptor de electrones suplementarios. Ambos procesos están referidos como reducción desasimilatoria de hierro. Este término se utiliza para diferenciar este proceso de la reducción del hierro para su incorporación dentro de los componentes celulares, la cual se denomina reducción de de sustancias hierro asimilatoria. reducciónsintetizadas del Fe en forma se srcina por la acumulación orgánicasLa reductoras por losindirecta microorganismos, como el ácido oxálico, aldehídos, etc.
Transformaciones directas del hierro de la forma orgánica (quelatado) a f ormas inorgánicas y viceversa. Aunque es uno de los elementos más abundantes en el ambiente, el hierro suele ser un factor limitante para el crecimiento bacteriano ya que, como se mencionó anteriormente, en condiciones aeróbicas y a pH alcalino o neutro forma complejos de hidróxido de hierro
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insolubles. Consecuentemente, las bacterias y hongos han desarrollado sistemas de transporte especializados y de alta afinidad con la finalidad de adquirir la cantidad suficiente de este elemento. La mayoría de las bacterias tienen la capacidad de producir y secretar unas moléculas denominadas sideróforos para obtener el hierro que necesitan. Los sideróforos son agentes quelantes del hierro especiales que facilitan la solubilización y captación de este metal. Son moléculas de bajo peso molecular (de 500 a 1500 Da), solubles en agua y que muestran una gran afinidad por iones férricos. Muchas bacterias han desarrollado también la capacidad de explotar el hierro que forma complejos con sideróforos producidos por otras especies bacterianas o fúngicas. La capacidad de utilizar sideróforos se asocia a la presencia de sistemas de transporte que puedan reconocer y mediar la absorción de los complejos de sideróforos férricos hacia el interior de la célula. Existen diferentes estrategias para incorporar el Fe quelado. En el primer mecanismo (Figura 2A), el hierro luego de ser transportado es clivado del sideróforo por una reductasa citoplasmática que reduce el Fe3+ a Fe 2+, disociándolo del complejo. El sideróforo sin el hierro puede ser destruido (no se recicla) o puede ser secretado al ambiente (se recicla). En el segundo mecanismo (Figura 2B) el complejo Fe-sideróforo se une a un receptor en la superficie celular donde el hierro es simultáneamente clivado y transportado sin el pasaje concomitante del sideróforo. En el tercer mecanismo (Figura 2C) la remoción reductiva del hierro ocurre en un sitio a cierta distancia de la proteína transportadora teniendo la posibilidad de re-oxidarse y precipitar en la superficie celular. Este es quizás el mecanismo menos eficiente ya que el Fe 2+ no está directamente acoplado con el transporte del hierro. La excreción de sideróforos es inducida por la falta de hierro. La expresión de los sistemas de adquisición de hierro se regula como respuesta a la concentración intracelular de hierro, aumentando cuando hay unamientras limitación dicho elemento. elevadas Dado quedela dicho escasezmetal de hierro reduce el crecimiento bacteriano, quedeconcentraciones pueden ser tóxicas, la concentración intracelular de hierro es controlada cuidadosamente. En los últimos 20 años, los sideróforos se han investigado en relación a la nutrición vegetal ya que también sirven como fuente de hierro para las mismas, pero no todos los sideróforos pueden ser utilizados por las plantas y distintas especies y variedades de plantas tienen diferentes habilidades para utilizar tipos específicos de sideróforos.
Sin reciclado
MEDIO EXTERNO o PERIPLASMA
Con reciclado
2A
2B
2C MEMBRANA PLASMÁTICA
CITOPLASMA
Figura 2. Mecanismos generalizados del transporte Fe-sideróforo en los microorganismos. Adaptado de Crowley et al. (1991).
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RELEVANCIA AMBIENTAL DE LAS TRANSFORMACIONES MICROBIANAS DEL HIERRO. Oxidación de la pirita. Una de las formas más comunes de hierro y azufre en la naturaleza es la pirita (FeS 2), que proviene de la reacción entre el azufre y el sulfuro ferroso (FeS). La pirita forma una estructura cristalina muy insoluble, muy frecuente en carbones bituminosos y otros depósitos minerales. Su oxidación por parte de las bacterias Su oxidación por parte de las bacterias tiene mucha importancia para el desarrollo de las condiciones de acidez en las minas y drenajes mineros. En este proceso los aceptores de electrones pueden ser el oxígeno y el ión férrico, el cual solamente está presente cuando el pH es menor a 2,5. A mayores valores de pH el hierro férrico precipita como hidróxido. La primera vez que la pirita entra en contacto con el aire, como ocurre en excavaciones mineras, se produce una reacción química con el oxígeno: FeS2 + 3 ½ O2 + H2O →Fe2+ + 2 SO42- + 2 H+ Esta reacción lleva al desarrollo de condiciones ácidas bajo las cuales el hierro ferroso que se forma es bastante estable en presencia de oxígeno. Sin embargo, A. ferrooxidans oxida el hierro ferroso a férrico y éste último puede reaccionar con más pirita para oxidarla, produciéndose más iones ferrosos y sulfato: Fe2+ + H+ + 1/4O2 → Fe3+ + ½ H2O FeS2 + 14 Fe3+ + 8 H2O →15 Fe2+ + 2SO42- + 16 H+ El aumento en la tasa de oxidación de la pirita hace que algunos iones ferrosos se escapen y sean transportados por las aguas subterráneas hasta cursos de agua cercanos. Al salir a drenajes aireados, las bacterias oxidan el ión ferroso y se forma un precipitado de hierro férrico, responsable del color anaranjado de las aguas. Esta oxidación bacteriana de los minerales de azufre es el factor principal que determina el drenaje ácido de las minas, un problema ambiental que es muy frecuente en zonas donde hay minas de carbón. Debido a que no todo mineral de carbón posee sulfuro de hierro, el drenaje ácido no se produce en todas las cuencas mineras de carbón. La mezcla de las aguas ácidas de las minas con las aguas naturales de ríos y lagos causa una degradación importante en la calidad del agua natural, ya que la acidez y el contenido de metales disueltos resultan tóxicos para la vida acuática. Estas aguas tampoco son aptas para el consumo humano, ni la actividad industrial. La oxidación de la pirita también puede ocurrir químicamente, pero el paso que determina la tasa de oxidación de esta reacción es la oxidación del ión ferroso a férrico, la cual ocurre a pH bajo si la bacteria está presente. El ácido que se forma ataca a otros minerales de la roca, por ejemplo al aluminio que es soluble a pH bajo. El Al 3+ a concentraciones de unos pocos gramos por litro de agua es tóxico para los organismos acuáticos.
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Lixiviación microbiana de metales Consideraremos aquí una situación en la cual la acidez y la solubilidad del metal que producen las bacterias acidófilas desempeñan una función beneficiosa para la minería. El sulfuro, al combinarse con muchos metales, forma minerales muy insolubles, y muchas menas (minerales de los cuales se puede extraer un elemento) de donde se extraen dichos metales son sulfuros. Si la concentración del metal en la mena es baja, es posible que no sea económicamente rentable concentrar el mineral por medios químicos convencionales. En esas condiciones se suele aprovechar la lixiviación microbiana (concentración de metales valiosos de un mineral por acción microbiana) que, a su vez, dañan menos el medioambiente ya que no tiene los altos requerimientos energéticos de la fundición y no produce emisiones gaseosas nocivas. Bacterias como A. ferrooxidans pueden actuar como catalizadores y acelerar la tasa de oxidación de minerales que contienen sulfuros, ayudando a solubilizar el metal. Esta reacción es útil, sobre todo, para la recuperación de cobre, ya que el sulfuro de cobre que se obtiene es muy soluble en agua. La mayoría de los sulfuros metálicos se oxidan espontáneamente, pero en presencia de esta bacteria la velocidad es mucho mayor. En el proceso de lixiviación microbiana la mena de baja ley (baja concentración del elemento) se amontona en una pila de lixiviación, a través de la cual se hace pasar una solución de ácido sulfúrico diluido (pH 2). Se recoge el líquido que sale del fondo de la pila, rico en mineral y se transporta a una planta donde se precipita y purifica. El líquido sobrante, al cual se agrega ácido para mantener el pH bajo, se vuelve a verter sobre la pila y el ciclo se repite. Otro mecanismo, tal vez el más importante en minería, se produce por oxidación indirecta de la mena de cobre, con iones férricos formados a partir de la oxidación de iones ferrosos. La pirita está presente en casi todas las menas y su oxidación determina la formación de hierro férrico. Éste resulta un buen oxidante de los minerales que tienen sulfuros y la reacción del CuS con el férricoA.determina la solubilización del cobre y la ferroso formación de hierro Conoxidar O 2 y amás pH ácido vuelve a oxidar al hierro a férrico, el ferroso. cual puede ferrooxidans sulfuro de cobre. Otro aspecto interesante del metabolismo de esta bacteria es que a pesar de que la mayoría de las reacciones discutidas arriba requieren oxígeno molecular, las reacciones de oxidación pueden realizarse de forma anaeróbica debido a que A. ferrooxidans puede utilizar el hierro férrico como aceptor terminal de electrones en ausencia de oxígeno.
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CAPÍTULO 11
NICHOS ECOLÓGICOS ESPECIALES DE UTILIDAD AGRÍCOLA. Nichos ecológicos especiales de utilidad agrícola. La fermentación láctica como método de conservación de forrajes en el ensilado. Biología y microorganismos del compost. Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biología de los Microorganismos, 8 a edición. Prentice Hall. Capítulo 14 (14.13)
LA FERMENTACION LÁCTICA COMO MÉTODO DE CONSERVACIÓN DE FORRAJES: ENSILADO 1. Definición El ensilado es un sistema de conservación biológica basado en la fermentación láctica. Debido a este fenómeno el forraje sufre transformaciones físicas, químicas y biológicas que imposibilitan cualquier otra actividad microbiana conservándose durante años sin alteraciones. Se debe considerar que el material ensilado no es de mejor calidad nutricional que el material del cual se srcina, debido a que se utiliza como una técnica para conservar y no para mejorar el material vegetativo empleado (Stefanie et al., 2001) La conservación de los forrajes, mediante la técnica del ensilado, surge como una opción viable por su utilidad y facilidad de implementar por parte de los productores. Esta alternativa asegura la disponibilidad del recurso forrajero durante todo el año en sistemas de producción de rumiantes (Titterton & Bareeba, 2001).
Cultivos para ensilar Una gran variedad de plantas pueden ser ensiladas fácilmente, no obstante es conveniente señalar sus diferencias en cuanto a su disponibilidad en azúcares (Tabla 1). Tabla 1. Diferencias de disponibilidad de azúcares de distintos forrajes (Frioni, 1999).
Longitud de corte El picado del forraje debe ser fino para minimizar el espacio de aire entre las partículas de forraje y permitir que las bacterias ácido lácticas entren en contacto directo con los azúcares solubles, el largo del picado deberá ser de aproximadamente 2 cm, dependiendo el cultivo (Nicklas, 1997). 2. Proceso físico-químico y microbiológico del ensilado A partir de la cosecha y de la ubicación del forraje en el sitio de ensilado se puede dividir este proceso en cuatro fases principales: respiración, fermentación, estabilización y deterioro aeróbico.
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2.1. Respiración Inicialmente, cuando el forraje se comienza a colocar dentro del ensilado, se observa una oxidación (aeróbica) de los constituyentes de la planta a través de la acción conjunta de las enzimas de los microorganismos presentes (mohos, levaduras, bacterias aeróbicas y anaerobias facultativas) y de las mismas plantas, lo cual lleva a un incremento de la temperatura y el consiguiente calentamiento de la masa de forraje. Durante esta fase, los carbohidratos hidrosolubles (CHS, azúcares primarios de las plantas) son convertidos a CO2, calor y agua por la célula vegetal y microorganismos aeróbicos específicos. Este proceso continuará hasta que se disminuya el oxígeno o los CHS se consuman totalmente (Herrera et al., 2007). Esa respiración de los HCS significa una pérdida de valor nutritivo y por lo tanto habrá que tratar de llevar al mínimo la duración de esta fase, eliminando el oxígeno lo más rápido posible. Las condiciones de compactación del forraje como las condiciones de cierre hermético del ensilado modifican la cantidad de oxígeno disponible y por lo tanto el período de respiración. Las desventajas de una extensa fase aeróbica son: 1) excesiva pérdida de materia seca que podría estar disponible para las bacterias productoras de ácido láctico o para el ganado al consumir el ensilado y 2) producción de calor excesivo contribuyendo al incremento potencial de la desnaturalización de las proteínas del forraje por calor (Herrera et al., 2007)
2.2. Fermentación A medida que desaparece el oxígeno del medio, se desarrolla otro tipo de microflora que produce ácido acético en pequeñas cantidades (Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella sp.). La acción de estas bacterias se manifiesta hasta que el pH desciende a 4,5. El forraje sin cortar tiene un número bajo de bacterias lácticas localizadas en la zona de magulladuras o partes muertas de las plantas. También están presentes endosporas de clostridios (Clostridium spp.). Luego de la cosecha y si las condiciones son anaeróbicas, el número de bacterias lácticas (Lactobacillus plantarum, L. casei, L. brevis, L. bulgaricus, Streptococcus lactis, Pediococcus cerevisiae y Leuconostoc mesenteroides) proliferan rápidamente si las condiciones de ensilado son anaerobias, produciendo exclusivamente ácido láctico (bacterias homofermentativas) o ácido láctico junto con otros productos como ácido acético y etanol (bacterias heterofermentativas). Estos productos de fermentación de azúcares solubles reducen el pH en el ensilado hasta un valor de aproximadamente 4 (3,8-4,2). Debido a ese descenso del pH, cesa toda actividad biológica y se obtiene un material estable y preservado en su calidad (esto ocurre generalmente en la primer semana). Las mejores condiciones para la preservación del ensilado son aquellas que favorecen una rápida fermentación homoláctica. En términos generales es posible afirmar que esto ocurrirá cuando exista un adecuado suministro de azúcares solubles para producir la fermentación ácidoláctica y se logre una rápida caída del pH de manera de evitar la acción de bacterias del género Clostridium. Bajas presiones osmóticas debido a excesiva humedad en el forraje, alto contenido de proteínas y valores de pH superiores a 5,4 favorecen la proliferación de los clostridios afectando negativamente el proceso de ensilado. Los clostridios metabolizan los azúcares y el ácido láctico para producir butirato y una serie de productos menores (acetato, propionato, etanol, etc.). También degradan proteínas y aminoácidos produciendo acetato, butirato, cadaverina, putrescina, amoníaco, etc. Dado que el ácido butírico es más débil que el ácido láctico, y que muchos de los productos nitrogenados que derivan de la degradación de aminoácidos son bases, la actividad de los clostridios en un ensilado revierte o hace más lenta la reducción de pH que se necesita para la estabilización del ensilado. En estas condiciones el
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período de fermentación se prolonga a expensas de los nutrientes del forraje, resultando un ensilado de bajo valor nutritivo y, además, de pobre aceptación por parte de los animales, debido al olor fuerte y desagradable del ácido butírico. Los clostridios, además de causar pérdidas del valor nutritivo del forraje, pueden contaminar la leche con sus esporas (cuando se suministra forraje ensilado en la sala de ordeñe) provocando problemas durante la maduración de quesos, sobre todo los de pasta dura. A esto debe sumarse el riesgo para la salud de los animales cuando C. botulinum, agente del botulismo, está presente en el material ensilado. Esto puede deberse a la incorporación de tierra cuando se levanta el material vegetal para el ensilado.
2.3. Estabilización Como ya se indicó, de producirse adecuadamente la fermentación láctica el pH del ensilado desciende hasta 3,5-4,0. En estas condiciones cesa la actividad de las bacterias lácticas y por tanto la producción de ácido láctico. El ensilado se estabiliza al detenerse toda actividad biológica en la masa de forraje. Si se evita la entrada de aire o agua, el forraje ensilado se mantiene por años sin que se altere su calidad. En la Figura 1 se observa la evolución de la temperatura, pH y concentración de ácido acético y láctico durante los primeros días de ensilado.
3. Requisitos para la fermentación láctica Para que se lleve a cabo la fermentación láctica se deben cumplir una serie de requisitos:
Presencia de bacterias lácticas. Cantidad suficiente de HCS, necesarios para el desarrollo de las bacterias lácticas.
Condiciones de anaerobiosis para evitar el desarrollo de microorganismos aerobios indeseables. Humedad y temperatura adecuadas. Estos factores serán analizados a continuación con cierto grado de detalle. Con respecto a las bacterias lácticas, ya se ha indicado que se encuentran sobre la superficie de las hojas de las plantas a ensilar, por lo cual solo hay que crear las condiciones favorables para la proliferación de las mismas. Tabla 2. Especies de bacterias lácticas comúnmente encontradas en f orraje verde y en ensilados
Homofermentativas
Heterofermentativas
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus brevis
Pediococcus acidolactici Streptococcus durans
Lactobacillus buchneri Lactobacillus fermentum
Enterococcus faecalis
Lactobacillus viridescens
Enterococcus faecium
Leuconostoc mesenteroides
Streptococcus lactis
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Figura 1. Evolución de la temperatura, pH, ácido láctico y acético en los primeros días del ensilado.
En la Tabla 2 se indican las especies de bacterias homo y heterofermentativas más comunes que pueden encontrarse en el forraje tanto antes y como después de ensilar. En la Tabla 3 se puede observar que de un total de nueve establecimientos examinados, en solo cinco se contaron bacterias lácticas sobre los cultivos en crecimiento al momento de la cosecha y otros dos contenían números muy bajos de microorganismos. El número de bacterias lácticas estimadas sobre el forraje puede depender de la metodología empleada tanto en el muestreo como en el recuento y de sus posibilidades para detectar y cuantificar todos los tipos de bacterias lácticas que existen. De todas maneras, es bastante sorprendente que en la mayoría de los ensilados las bacterias lácticas dominan la fermentación alcanzando números máximos del orden de 109 UFC/ml en 2 ó 4 días, seguidos por un período más lento y de constante declinación de la actividad biológica. En la Tabla 3 también resulta interesante observar como el número de bacterias lácticas aumenta significativamente cuando la muestra se toma en el momento de construcción del ensilado. Este incremento puede lograrse por el agregado de aditivos al forraje que se va a ensilar, por ejemplo, el agregado de azúcares solubles (melaza, triturado de remolacha, etc.). El contenido óptimo de HCS está determinado principalmente por la especie, el momento de corte y el tipo de cosecha. En esta tabla cada establecimiento puede corresponder a una combinación particular de todas estas variables. Un contenido bajo de HCS en el forraje determina que el pH no baje lo suficiente como para alcanzar el estado de estabilización. Normalmente se requieren un mínimo de 6 a 12% de HCS para una apropiada fermentación en el ensilado. El forraje de maíz, cosechado en estado de grano lechoso, contiene suficientes HCS como para asegurar un proceso completo de ensilado. Por su parte las leguminosas (por ejemplo alfalfa) contienen baja cantidad de HCS, es por ello que su ensilado resulta más dificultoso (Herrera et al., 2007). En este último caso cobra relevancia el agregado de aditivos e inoculantes microbianos con bacterias lácticas.
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La anaerobiosis se logra por el correcto compactado del material y los factores que inciden en la eficiencia de la eliminación del aire son el tipo de picado, el estado de madurez del forraje, el contenido de humedad y el tipo de ensilado. El rango de temperaturas para el crecimiento de bacterias lácticas es de 5 a 45 oC, con un óptimo de 30oC. La mayoría de las especies crecen a 15 oC, pero no lo hacen a 45 oC. Sin embargo, hay excepciones como L. fermentum que puede crecer a 45oC pero no a 15oC. Las dos especies de Enterococcus crecen en un rango de temperaturas entre 10 y 45oC. Por su parte, diversas especies de Pediococcus tales como P. damnosus, P. pentosaceus y P. acidilactici tienen óptimos de temperatura de crecimiento de 25, 30 y 40 oC, respectivamente. Diversos trabajos confirman que un número más elevado de bacterias lácticas se obtiene en menor tiempo en ensilados mantenidos a temperaturas de 30 oC que en aquellos a temperaturas entre 15 y 20oC. Tabla 3. Cantidad de bacterias lácticas presentes sobre el follaje de cultivos para ensilado de vari os establecimientos.
Establecimiento
Cantidad de bacterias lácticas sobre el follaje (UFC ml-1) [1] Del cultivo en crecimiento previo a la cosecha
Previo al ingreso para la construcción del ensilado
A
0
10
B
0
670
C
50
860
D
0
280[2]
E
0
20.000[2]
F
4
170[2]
G
240
900.000[2]
H
126
2600[2]
I 5 5200[3] unidades formadoras de colonias por mililitro de material vegetal macerado en medio agar acetato. [2] con agregado de azúcar. [3] con agregado de forraje de remolacha triturado. Adaptado de McDonald et al. (1991). [1]
4. Características de un buen ensilado Debe tener un valor de pH entre 3,5-4,0, un contenido de ácido láctico entre 4,0-8,0 %, de ácido acético no mayor al 0,5-3,0% y el ácido butírico debe estar ausente o presente en muy pequeñas cantidades. La cantidad de oamoníaco presente debe ser menor al 10-15% del nitrógeno total. El color será amarillo verdoso marrón verdoso, y el olor agradable y avinagrado (ácido láctico). La textura del material será firme, y las hojas no serán fácilmente separables del tallo.
5. Deterioro aeróbico Esta fase comienza con la apertura del silo y la exposición del ensilado al aire. Esto es inevitable cuando se requiere extraer y distribuir el ensilado, pero puede ocurrir por daño de la cobertura del ensilado (ej. roedores o pájaros), antes de iniciarse la explotación del mismo. El período de deterioro puede dividirse en dos etapas. La primera se debe al inicio de la
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degradación de los ácidos orgánicos que lo conservan, por acción de hongos y levaduras, y ocasionalmente por bacterias que producen ácido acético. Esto induce un aumento en el valor del pH, lo cual permite el inicio de la segunda etapa de deterioro. En la segunda etapa se produce un aumento de la temperatura y la actividad de otros microorganismos que también deterioran el ensilado, como algunos bacilos. La última etapa también incluye la actividad de otros microorganismos aeróbicos (hongos) y facultativos (enterobacterias). El deterioro aeróbico ocurre en casi todos los ensilados al ser abiertos y expuestos al aire. Sin embargo, la tasa de deterioro depende de la concentración y la actividad de los organismos que causan este proceso en el ensilado (Stefanie et al., 2001).
6. Rol del ensilado en el sistema de producción Debido a la oferta forrajera estacional discontinua, la cual se da en la mayor parte de los sistemas de producción, se produce un desfasaje entre los requerimientos de los animales y la oferta de forraje cuando se trabaja con cargas medias a altas. Para mitigar el desequilibrio entre la oferta de forraje y los requerimientos animales el productor cuenta con recursos tales como verdeos de invierno, granos, henos, forrajes diferidos, ensilados, etc. Por lo tanto el ensilado puede usarse no solo como seguro para condiciones climáticas adversas, sino también como un recurso más de la cadena forrajera.
7. Ventajas del ensilado Permite balancear la composición de la ración frente a pastoreos deficitarios. Permite mediante el encierre de la hacienda, esperar a que haya piso en una pradera con exceso de humedad. Es el método que mejor se adapta para la conservación de cultivos enmalezados. Puede ser conservado durante más tiempo que el heno. No tiene riesgos de incendio.
8. Desventajas del ensilado Tiene mayor costo que el heno. Se debe transportar más material al ensilar que al henificar. Debe compactarse adecuadamente para permitir una fermentación láctica. Su distribución y racionamiento son más complicados, salvo que se confeccionen silos tipo bala. BIOLOGÍA Y MICROORGANISMOS DEL COMPOST Introducción La descomposición de las plantas ocurre en cualquier lugar donde las plantas crezcan. Cuando una planta muere es atacada por los invertebrados y microorganismos del suelo y se convierte en minerales, CO2, agua y humus. Esta es la forma en que los nutrientes se reciclan en el ecosistema. Esta descomposición natural puede favorecerse creando condiciones ideales, en esto consiste el procedimiento llamado compost (Figura 1). El arte del compost ha sido parte de nuestra cultura desde la antigüedad. En la actualidad existen varias razones por las cuales sigue siendo una práctica de incalculable valor porque a) permite convertir los restos de cosecha y la basura municipal en un recurso natural
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útil, b) soluciona parte de los problemas ambientales que surgen de otros manejos de la basura y c) genera al mismo tiempo un mejorador del suelo barato y de alta calidad. Los residuos orgánicos ocupan en el mundo un lugar prioritario ya que constituyen entre el 30 y el 65% de los residuos domiciliarios y más del 85% de los residuos considerados agrícolas (Sztern y Pravia, 1999). Es por esta razón que la tendencia actual es la reducción sustancial del volumen de los residuos cuya fracción orgánica será la materia prima de los procesos de compostaje.
¿Cómo se construye una pila de compost? Para obtener un buen compost es necesario generar las condiciones ambientales adecuadas para el desarrollo de microorganismos. El compost es el resultado de la acción microbiana sobre los residuos orgánicos. Restos de cosecha y residuos urbanos orgánicos son un sustrato apropiado para el desarrollo de las bacterias y hongos que participan en el proceso. Algunos invertebrados tales como gusanos e insectos también contribuyen en la formación del compost favoreciendo la actividad microbiana. Para construir una pila de compost es necesario tener en cuenta tres aspectos claves: 1. Una adecuada relación C/N para sostener el crecimiento de la flora del compost. Esto se logra seleccionando apropiadamente los materiales que forman la pila. 2. Una aireación adecuada obtenida en general mezclando la pila. 3. El control de la humedad. Estos tres elementos favorecen el aumento de la temperatura y aseguran una rápida descomposición de los residuos y la obtención de un producto aprovechable para el suelo.
Figura 1. Proceso de compostaje. Sustratos y productos principales.
Materia orgánica En términos generales existen dos tipos de sustratos orgánicos que sirven de alimento o sustrato para los microorganismos del compost:
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a) ricos en carbono: mayormente material vegetal seco o muerto como paja, hojas secas, astillas de madera o aserrín, menos usualmente papel, principalmente cartón. Estos materiales funcionan como fuente de carbono y energía para los organismos. Como se trata de material seco conviene humedecerlo antes de agregarlo a la pila. b) ricos en nitrógeno: material vegetal fresco a menudo verde como restos de pasto, frutas, verduras, hojas verdes, café, té, bosta fresca, etc. Funcionan como una fuente de nitrógeno para los organismos. La combinación de estos dos materiales proporciona el mejor balance nutricional para los microorganismos del compost. Además, proporciona una mejor y humedad de la pila. Lo ricos en carbono suelen ser voluminosos y promueven unaaireación buena aireación mientras que los ricos en nitrógeno contienen más agua y mantienen húmeda la pila.
Aire Los microorganismos del compost son aeróbicos y no pueden crecer a menos que tengan aire. Además de la elección de los componentes de la pila, conviene mezclar los ingredientes de la pila con un rastrillo o pala de jardín, para que entre aire y armar la pila de nuevo de manera más floja. Para la producción en gran escala existen mezcladores mecánicos y en algunos casos se usan tambores rotatorios.
Agua Idealmente la pila debe tener un nivel de humedad tal que una delgada capa de agua cubra cada partícula para facilitar el desarrollo y dispersión de los microorganismos en todos los estratos. Si la humedad está por debajo de este nivel el desarrollo microbiano será pobre y se hará más lenta la descomposición, si el nivel de humedad es mayor, se genera una condición anaeróbica desfavorable para la maduración completa del compost. En climas secos puede ser necesario mojar la pila ocasionalmente y en caso de tiempo lluvioso conviene cubrirla.
Temperatura Otro aspecto a considerar es la temperatura. En climas fríos la pila se mantiene durmiente en invierno pero en primavera el proceso recomienza. Las pilas más calientes se descomponen más rápido. En climas fríos para que se mantenga el calor y permitir que los microorganismos mantengan un metabolismo más rápido y activo, la pila no debe tener más de 1 metro cúbico. En climas templados generalmente se construyen pilas de forma piramidal con una base de 2m x 2m, con una altura aproximada de 1,5m y una superficie superior de 1,5m x 1,5m. La pila puede estar encajonada o no. Se alternan capas de 20 cm de residuos carbonados con capas de 10cm de material verde rico en nitrógeno. Si el material está picado, la maduración del compost se acelera. Cada capa es humedecida de manera que no alcance a estar saturada. La pila puede cubrirse con suelo, heno o plástico para retener el calor. El compost terminado es oscuro y tiene olor a tierra. Usualmente es difícil reconocer los ingredientes srcinales aunque a veces pueden verse trozos de materiales de difícil descomposición (por ejemplo, paja).
¿De qué manera el compost mejora el suelo? El compost produce mayores beneficios en el suelo que los fertilizantes sintéticos.
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En primer lugar agrega materia orgánica, lo que mejora su estado de agregación y mejora la interacción del agua con las particulas del suelo. En suelos arenosos el compost ayuda a la retención de agua, evitando el drenaje y protegiendo a las plantas de la desecación. En suelos arcillosos, el compost aumenta la porosidad permitiendo que el agua drene más rápidamente y no permanezca inundado o se torne quebradizo. El compost además inocula el suelo con un vasto número de microorganismos benéficos que extraen nutrientes de la porción mineral del suelo y los dejan a disposición de las plantas. También tiene valor como fertilizante ya que posee pequeñas cantidades de N, P y S.
Biología del compost Hay una compleja red alimentaria en una pila de compost que se puede representar como una pirámide con consumidores primarios, secundarios y terciarios. La base de la pirámide es la fuente de energía proveniente de la materia orgánica de los residuos vegetales y animales. Como se puede ver en esta pirámide de la Figura 2 los residuos orgánicos como las hojas u otros materiales vegetales son consumidos por algunos tipos de invertebrados como milpies, caracoles y babosas, estos invertebrados trituran el material vegetal creando una mayor superficie de acción para las bacterias, hongos y actinomicetes, y estos microorganismos son a su vez consumidos por otros invertebrados. Muchas clases de gusanos, como las lombrices de tierra y los nematodes comen plantas en descomposición y microorganismos y excretan compuestos orgánicos que enriquecen el compost. Además ellos construyen túneles que favorecen la aireación de la pila. En esta pirámide, cada descomponedor que muere excreta o agrega más alimento a la red de los otros descomponedores.
Fases del compost Durante el proceso de compost, los microorganismos descomponen la materia orgánica y producen CO2, agua, humus y calor. Bajo condiciones óptimas, existen cuatro fases (Trautmann y Olynciw, 2000; Coyne, 2000) (Fig. 3).
La fase mesofílica o de temperatura moderada, que dura un par de días.
La fase termofílica o de alta temperatura, que puede durar desde unos pocos días hasta meses.
La fase de enfriamiento que dura varios meses.
La fase de maduración.
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Figura 2. Red alimentaria de una pila de compost.
Microorganismos del compost Diferentes comunidades de microorganismos predominan durante las distintas fases. La descomposición inicial es llevada a cabo por microorganismos mesofílicos que consumen rápidamente los compuestos solubles, fácilmente degradables. El calor que producen causa un aumento rápido de la temperatura del compost. Cuando se alcanza una temperatura de 40°C, los microorganismos mesofílicos se vuelven menos competitivos y son reemplazados por los termofílicos. En la fase termófila la microflora mesófila es sustituida por la termófila, las altas temperaturas (60-70ºC) favorecen el desarrollo de organismos capaces de degradar moléculas más complejas tales como las proteínas, los ácidos grasos y los polisacáridos como la celulosa y la hemicelulosa, las principales moléculas estructurales de las plantas. Estos microorganismos transforman el nitrógeno en amoníaco y el pH del medio se hace alcalino, a los 60º los hongos termófilos cesan su actividad y aparecen bacterias esporógenas y actinomicetes (Nakamura et al, 2004). Por otro lado, se produce una disminución del carbono presente en el material, lo que conlleva un descenso de la relación C/N ya que se degradan sustancias como celulosa y lignina (Forgarty & Tuovinen, 1991), también en esta fase la mayoría de los microorganismos patógenos, parásitos, fitotoxinas y semillas de malezas son destruidos (Avendaño, 2003).
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En la etapa de enfriamiento, a medida que estos compuestos altamente energéticos son agotados, la temperatura baja gradualmente y los microorganismos mesofílicos vuelven a colonizar y se encargan de la fase final de maduración de la materia orgánica remanente. La etapa de maduración, se encuentra marcada por una baja tasa de actividad microbiana, al agotarse los sustratos, se produce una caída gradual de la temperatura, la cual será igual a la del medio ambiente, lo que indica el término de la elaboración del compost. Durante esta etapa los productos resultantes de la etapa termofílica del compostaje se estabilizan, lo que involucra una descomposición más avanzada de ácidos orgánicos, una disminución de los compuestos resistentes y la formación de compuestos húmicos. Se debe continuar con un manejo apropiado de la humedad y oxígeno para mantener la actividad microbiana (Bonilla & Mosquera, 2007).
Figura 3. Evolución de la temperatura e interacción con microorganismos frecuentemente reportados en cada estado de evolución hasta maduración del proceso de compostaje (Bonilla & Mosquera, 2007).
Actualmente, el uso de inoculantes termofílicos es una alternativa viable en el tratamiento de residuos de srcen orgánico ya que presentan enzimas muy estables frente a temperaturas extremas, garantizando, de esta manera, una capacidad de degradación mayor que la obtenida por géneros microbianos mesófilos. La inoculación permite obtener un rendimiento óptimo en la tasa de degradación de cada tipo de residuo a tratar, sin alterar la calidad del producto final, por el contrario, se logra la producción de un compost con altos niveles de nitrógeno, fósforo y potasio, que ayudan a incrementar la viavilidad de los suelos (Moreno et al., 2001).
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Bacterias Representan el 80-90% del billón de microorganismos típicamente presentes en el compost. Son responsables de la mayor parte de la descomposición y de la generación de calor. Son de categorías nutricionales diversas y usan un amplio rango de enzimas para romper químicamente una gran variedad de sustancias orgánicas. Al comenzar el proceso, predominan las bacterias mesofílicas que en general corresponden a las especies que se encuentran en la superficie del suelo, Pseudomonas, un grupo caracterizado por su diversidad metabólica, Bacillus, °iobacillus y Enterobacter son algunos de los géneros encontrados. Bacterias celulolíticas del género Cellulomonas también están presentes. A medida que el compost se calienta la población inicial es desplazada por miembros del género Bacillus, un grupo con capacidad de degradar proteínas y por actinomicetes (Nocardia, Streptomyces, etc.). La cantidad de Bacillus es regularmente alta entre los 50 y 55°C, pero decrece dramáticamente por arriba de 60°C. Cuando las condiciones se vuelven desfavorables estas bacterias sobreviven formando endosporas y vuelven a estar activas cuando las condiciones se vuelven favorables. En las mayores temperaturas del compost se han aislado termófilas extremas como las bacterias del género Thermus. En la fase termofílica (40 a 60°C) desarrollan fundamentalmente los actinomicetes. En el compost este grupo cumple un rol fundamental en la degradación de compuestos orgánicos complejos como la celulosa, las hemicelulosas, la quitina y la lignina. Poseen enzimas capaces de degradar materiales resistentes como corteza de árbol, trozos de madera y papel. Algunas especies aparecen en la fase termofílica y otras se vuelven importantes en la etapa de enfriamiento o maduración cuando solo quedan los materiales más resistentes y participan en las últimas etapas de formación de humus. Los actinomicetes son los responsables del olor a tierra en la fase final del compost. Forman filamentos ramificados en forma de telaraña que suelen verse en la parte superior de la pila, en las etapas finales.
Hongos Incluye a los hongos filamentosos y las levaduras. Típicamente saprofíticos (obtienen energía de la materia orgánica de las plantas y animales muertos) y aeróbicos que encuentran un hábitat ideal en el compost. Las especies fúngicas son numerosas tanto en las fase mesofílica como en la termofílica. Crecen como filamentos casi invisibles o como colonias blancas o grises vellosas en la superficie de la pila. Los hongos son responsables junto con los actinomicetes de la descomposición de polímeros complejos (celulosa, hemicelulosa, pectinas, lignina). La presencia de los hongos en el compost es importante porque degradan los restos vegetales y animales permitiendo que las bacterias continúen con la descomposición una vez que la celulosa se ha agotado. Pueden atacar material demasiado seco, ácido o con bajo contenido de nitrógeno de difícil descomposición por las bacterias. Protozoos y rotíferos Estos animales microscópicos unicelulares (protozoos) o multicelulares (rotíferos) se encuentran en la película de agua en el compost. Se alimentan de materia orgánica, bacterias y hongos. Física del compost La velocidad a la que madura el compost depende de factores físicos y químicos. La temperatura es uno de los parámetros claves, así como algunas características físicas de los ingredientes del compost como el tamaño de las partículas y el contenido de humedad. Otras consideraciones físicas incluyen el tamaño y la forma del sistema que afectan la aireación y la tendencia a retener o disipar el calor.
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Temperatura El calor del compost es un subproducto de la degradación de la materia orgánica. El calor depende del tamaño de la pila, la humedad, la aireación y la relación C/N. Además la temperatura ambiente también afecta la temperatura del compost. Una curva típica de la evolución de la temperatura en la pila de compost se describe en la Figura 4. Temp.
80
60
40
tiempo
Figura 4. Curva de temperatura típica de una pila no mezclada. El compost en gran escala de uso comercial o para reciclado de residuos urbanos alcanza temperaturas entre 60 y 70°C en 3 ó 4 días. Por arriba de 65°C se hace necesario remover o airear la pila para evitar la muerte de los organismos beneficiosos. La fase termofílica (40 a 60°C) dura desde varias semanas a varios meses dependiendo del tamaño de la pila y de la composición de los ingredientes. En esta fase la descomposición ocurre más rápidamente y es también importante para destruir patógenos termosensibles. Los invertebrados del compost sobreviven a esta etapa moviéndose a la parte externa de la pila o permaneciendo en estado de dormición. Para asegurar reducción significativa de 40°C los patógenos el compost debería mantenerse al menos 5 díasuna a una temperatura mínima de con temperaturas que excedan los 55°C por lo menos 4 horas durante este período. Cuando el compost empieza a enfriarse, si se remueve la pila se produce un nuevo pico de temperatura por el aumento del contenido de oxígeno y la exposición de materia orgánica que no fue descompuesta. Existe un momento en que la temperatura cae y no puede ser restablecida mezclando o removiendo la pila. Esto indica el fin de la fase termofílica y en este punto los microorganismos inician un largo proceso de curación o maduración. En esta etapa continúan ocurriendo reacciones que hacen que la materia orgánica remanente se vuelva más estable y apta para usar como mejorador del suelo.
Tamaño de las partículas Los microorganismos se desarrollan sobre la superficie de las partículas orgánicas. Por lo tanto, cuanto menor es el tamaño de las partículas aumenta la relación superficie/volumen y esto conduce a un aumento de la actividad microbiana, el sustrato carbonado está más disponible y por consiguiente la velocidad de descomposición aumenta. Por otra parte cuando las partículas son demasiado pequeñas y compactas la circulación de aire en el interior de la pila empeora, lo que disminuye la disponibilidad de oxígeno y el ritmo de descomposición. Aireación El oxígeno es esencial para mantener el metabolismo respiratorio que conduce a la oxidación del material de la pila. Al comienzo de la actividad oxidativa la concentración de oxígeno en los poros es cercana a 15-20% (semejante a la concentración de la atmósfera) y la de CO2 oscila entre 0,5 y 5%. A medida que la actividad biológica progresa el oxígeno cae y el CO2 aumenta. Si la concentración de oxígeno cae por debajo del 5% se crean condiciones de
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anaerobiosis. Mientras la actividad anaeróbica se mantiene baja la pila de compost actúa como un biofiltro que atrapa y degrada los compuestos olorosos que resultan de la descomposición anaerobia. Cuando la actividad anaerobia aumenta por encima de cierto límite se producen olores desagradables y el compost no alcanza su estado maduro. Existen varios factores que conducen a condiciones anaeróbicas: 1) humedad excesiva 2) baja porosidad 3) sustratos que se degraden muy rápidamente 4) un tamaño excesivo de la pila. Para mantener la condición aeróbica se pueden usar recipientes con agujeros de aire, armar agujeros de aire en la pila y en el compost de gran escala el mezclado o rotación mecánica, el uso de cañerías de ventilación y el flujo forzado de aire son algunas de las opciones.
Humedad Un contenido de humedad de 50 a 60 % es considerado óptimo, la descomposición microbiana ocurre más rápidamente en la película delgada de agua que rodea las partículas orgánicas. Mientras que muy bajos contenidos de humedad (<30%) inhiben la actividad bacteriana, contenidos muy altos (>65%) genera condiciones anaeróbicas y el consecuente enlentecimiento de la descomposición y la producción de olores desagradables. El contenido de humedad del material compostable varía mucho como se muestra en la Tabla 1. A menudo los materiales ricos en nitrógeno son muy húmedos y los ricos en carbono son secos. Combinando los distintos tipos de material se puede obtener una humedad adecuada. Tamaño de la pila En sistemas aireados pasivamente la pérdida de calor es proporcional a la superficie expuesta y el calor producido es función del volumen. Las pilas más grandes por lo tanto tienden a sobrecalentarse y las más pequeñas tienden a ser demasiado frías. Usualmente la altura ideal de la pila es de 1 a 3 m y el ancho cercano al doble. Las pilas que lleven sustratos que se degradan rápidamente (estiércol, restos de pasto verde, restos de alimento) deben estar en el rango inferior y los más porosos y de descomposición más lenta deben tener tamaños cercanos al rango superior. Los sistemas de aireación forzada con reciclado del flujo de aire o el uso de aire precalentado permiten aumentar el tamaño de la pila. Tabla 1. Contenido de humedad de diversos materiales.
aterial
umedad relativa (%)
uraznos
80
echuga
87
limento seco (pellets)
10
iario
5
Química del compost Relación C/N El carbono y el nitrógeno son los elementos más importantes para el crecimiento bacteriano. Para proveer cantidades apropiadas de estos elementos, la relación C/N debe ser aproximadamente de 30/1. A relaciones mayores la provisión de nitrógeno es insuficiente para
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un crecimiento óptimo de las poblaciones microbianas, el compost se mantiene frío y la descomposición ocurre lentamente. A relaciones menores, el exceso de nitrógeno es eliminado en forma de gas amoníaco causando un olor desagradable. En general, los materiales verdes y frescos son ricos en nitrógeno y los oscuros y secos ricos en carbono. Se pueden estimar las condiciones óptimas simplemente usando una combinación de estos materiales. Las relaciones C/N deben ser ajustadas teniendo en cuenta la biodisponibilidad de estos componentes. Comúnmente, los materiales ricos en carbono son derivados de la madera o material lignificado, lo que reduce su biodegradabilidad. Las relaciones C/N de materiales usados para el compost se muestran en la Tabla 2. Tabla 2. Relaciones C/N de diversos materiales usados para fabricar compost Adaptado de Dickson et al. (1991).
Materiales ricos en carbono
C/N
Hojas en otoño
30-80:1
Paja
40-100:1
Astillas de madera o aserrín
100-500:1
Papel
150-200:1
Diario o cartón corrugado
560:1
Materiales ricos en nitrógeno C/N Restos vegetales
15-20:1
Café
20:1
Pasto cortado
15-25:1
Estiércol 5-25:1 Los fertilizantes nitrogenados, a diferencia de las fuentes de nitrógeno naturales que tienen un tiempo de liberación compatible con el ritmo de crecimiento de la población, quedan disponibles tan rápidamente que exceden la capacidad de asimilación de la comunidad del compost y se pierden en forma de amonio. Para imitar un tiempo de liberación natural los fertilizantes sintéticos deben ser usados de manera limitada y en aplicaciones seriadas.
Capacidad de Intercambio Catiónico (CIC) Los residuos orgánicos tienen una CIC variable cercana a 40 meq/100 g. Durante el proceso de compostaje este parámetro tiende a llegar a niveles de 70-80 meq/100g, debido a la desaparición de la materia orgánica fácilmente degradable y al aumento de la materia orgánica humificada (Larco Reyes, 2004).
Balance nutritivo Cantidades adecuadas de P, K y elementos traza (Ca, Fe, B, Cu, etc) son esenciales para el crecimiento microbiano. En general estos elementos no son limitantes porque están presentes en las concentraciones necesarias en los materiales del compost.
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pH Un rango de pH entre 5,5 y 8,5 resulta óptimo para los microorganismos del compost. A medida que las bacterias y hongos digieren la materia orgánica se liberan ácidos orgánicos. Consecuentemente, en las primeras fases del compost se produce una caída del pH que favorece el crecimiento de los hongos (generalmente acidófilos) y la ruptura de la celulosa y la lignina. En general, los ácidos orgánicos son posteriormente consumidos en fases posteriores. Sin embargo, si el ambiente se vuelve anaeróbico la acumulación de ácidos como resultado de la fermentación puede bajar el pH por debajo de 4,5 y limitar seriamente la actividad microbiana. Presencia de microorganismos patógenos La gran mayoría de los microorganismos potencialmente patógenos para humanos presentes en los residuos orgánicos son destruidos durante el proceso de compostaje en la fase termofílica, por lo que se considera un proceso sanitario (Tabla 3). La destrucción de patógenos durante la fase termófilica permite la obtención de un abono orgánico no contaminante. Por otro lado, el crecimiento de los patógenos puede verse inhibido por la competencia por los nutrientes con otros microorganismos y por la aparición de otros organismos que actúan como biocontroladores (Bonilla & Mosquera, 2007). Tabla 3. Temperatura y tiempo requerido para la eliminación de microorganismos patógenos para la salud humana.
Microorganismo
Temp (ºC)
Escherichia coli O157:H7 Escherichia coli O157:H7 Salmonella
60 60
Tiempo de exposición 60 minutos
65
Salmonella typhosa
60
Salmonella Salmonella sp.
3 semanas 24 horas
Fuente
Soldier y Strauch 1991 Juneta
et al. 1997 Coger et al. 2001
20 minutos
Tim 1980
55
60 minutos
Tim 1980
60
15-20 minutos
Tim 1980
Shigella sp.
55
60 minutos
Tim 1980
Escherichia coli
57
72 horas
Paul 2000
Coliformes
70
60 minutos
Tim 1980
187
CAPÍTULO 12 BIORREMEDIACIÓN Material de estudio: Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biología de los Microorganismos, 8a edición. Prentice Hall. Capítulo 14 (14.19 y 14.20)
Biorremediación Se entiende por remediación a todo proceso que restablece, en un sistema contaminado, las funciones biológicas, de sustento y de soporte, mediante la reducción o eliminación de los contaminantes que produjeron su alteración. La atenuación natural es el comienzo de la biorremediación, y se podría definir como un conjunto de procesos físicos, químicos y biológicos que se dan de forma espontánea luego de la aparición del contaminante. La contaminación puede ser antrópica, como por ejemplo derrames de petróleo, o natural como son las erupciones volcánicas (Orozco et al., 2003). Cuando la remediación es realizada por organismos vivos, como plantas y microorganismos, se denomina biorremediación. (Adriano et al., 1999). Diversos autores utilizan este término para hacer referencia a la remediación realizada por microorganismos (bacterias y hongos) mientras que emplean el término fitorremediación para hacer referencia a la acción de las plantas en el proceso remediador. La remediación llevada a cabo por los hongos se denomina micorremediación (Singh, 2006). Para llevar a cabo la biorremediación, debe analizarse si la sustancia contaminante es biodegradable y si el proceso no deja efectos adversos o secundarios en el sistema (Atlas & Bartha, 2002). La degradación de los contaminantes debe dar como producto sustancias menos nocivas o inocuas (Martín Moreno et al., 2004). Si la contaminación es pequeña y las condiciones del sistema son favorables, por medio de la atenuación natural la biorremediación puede llevarse a cabo in situ y sin la intervención antrópica (Martín Moreno et al., 2004). Sin embargo en la mayoría de los casos el tiempo de degradación del contaminante suele ser muy largo y es así que se requiere la aplicación de técnicas de biorremediación dirigida. La biorremediación dirigida tiene como ventajas frente a otras metodologías de remediación que puede realizarse tanto in situ como ex situ, y suele ser más económica si la comparamos, por ejemplo, con métodos físicos. La biorremediación intrínseca o in situ es una tecnología en pleno desarrollo que requiere de seguimiento para asegurar una efectiva limpieza del sistema. En la Figura 1 (Atlas & Bartha, 2002) puede verse un ejemplo de un acuífero contaminado por hidrocarburo, sometido a biorremediación in situ. En el mismo se detallan las distintas zonas de influencia de nutrientes y oxígeno, así como también la zona contaminada. Los procesos de landfarming o remediación de suelos poseen la ventaja de ser más sencillos de realizar que la remediación de aguas, ya que en estas últimas influyen las corrientes. En los primeros tratamientos de remediación de suelos, se requiere que el área sea confinada para la correcta aplicación de los mismos. Una forma consiste en cubrir el suelo a tratar con un plástico con una salida de gases, los cuales se recolectan para evitar así la contaminación atmosférica (Atlas & Bartha, 2002). Como se verá más adelante otra forma de confinamiento se da en los vertederos donde se arrojan los desechos domiciliarios e industriales. La función del mismo es evitar la dispersión de líquidos, gases y material particulado contaminante (Martín Moreno et al., 2004). El tiempo que tarde el proceso de biorremediación en llevarse a cabo depende del compuesto a degradar, la cantidad a degradar, las condiciones del lugar (pH, temperatura, humedad, entre otros) y fundamentalmente de la composición de la comunidad microbiana
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autóctona (Atlas & Bartha, 2002; Adriano et al., 1999). Esta última característica es importante debido a que cada microorganismo degrada diferentes compuestos y se desarrollan bajo distintas condiciones (Martín Moreno et al., 2004). Se denominan microorganismos endógenos a aquellos que están presentes en el ecosistema a remediar. Por contraposición, los microorganismos exógenos son los que se introducen para llevar a cabo el proceso biorremediador debido a que los microorganismos autóctonos no degradan la sustancia contaminante o es baja su actividad por las condiciones del ecosistema. . Es fundamental que la eficacia de los microorganismos exógenos sea probada anteriormente para evitar alterar el ecosistema por el agregado de microorganismos sin la eficacia requerida (Martín Moreno et al., 2004). Por otra parte, para acelerar el proceso de biorremediación, hay técnicas que mejoran el ambiente como por ejemplo la adición de nutrientes o la oxigenación, (Atlas & Bartha, 2002). Para evaluar cuál es el factor que debe adicionarse para acelerar la biorremediación, se realizan ensayos de laboratorio con las comunidades autóctonas degradadoras de xenobióticos, a las cuales se las somete a distintas condiciones de humedad, temperatura, oxigenación, etc., llevándose a cabo antes y después del ensayo el recuento de microorganismos y la evolución de la concentración del material contaminante a fin de comparar con los controles sin tratar. La velocidad de desaparición del contaminante (su degradación) es una medida de la eficacia de la biorremediación. La siembra de degradadores de xenobióticos solo es necesaria cuando los microorganismos autóctonos no son buenos degradadores de la sustancia contaminante y hasta incluso les resulta tóxico (Atlas & Bartha, 2002). Sin embargo, en diversas ocasiones no hay tiempo de realizar ensayos de laboratorio debido a que el contaminante puede lixiviarse o fotodegradarse. Esto trae efectos secundarios, en el agua o en el aire en el primer y segundo caso respectivamente, si la biorremediación no se desarrolla en forma correcta (Atlas & Bartha, 2002). A su vez, no realizar ensayos de laboratorio puede aumentar los efectos colaterales. A modo de ejemplo, aumentar el oxígeno parala acelerar puede aumentar la altoxicidad del caso contaminante provocando mortandadla debiorremediación la fauna del ecosistema (Ghosal et ., 1985). En de que el contaminante no permita la proliferación de los microorganismos autóctonos, deben inocularse repetidamente o agregar un sustrato que permita un crecimiento adecuado. A continuación, se describirán en forma más detallada algunas de las técnicas de biorremediación de suelos y de aguas.
Biorremediación in situ y ex situ de suelos La remediación de suelos en el sitio de contaminación, es más rápida desde el punto de vista operativo debido a que no requiere la remoción y el traslado del suelo contaminado como sucede con las técnicas ex situ. Sumado a esto, la cantidad de suelo a remediar puede ser mayor debido a que no hay limitación del transporte y capacidad de los reactores. En este sentido, Martín Moreno et al (2004) describen a las técnicas in situ como aquellos casos en que es “el propio suelo el que funciona como un reactor biológico”. Sin embargo, desde el punto de vista
biológico, el proceso es más lento debido a que las condiciones del sistema no son las óptimas para que se lleve a cabo una remediación rápida, y si se adicionan componentes éstos deben ser monitoreados. Otra desventaja es que la aplicación de componentes en ciertos casos puede distribuirse de forma heterogénea quedando sitios sin ser tratados (Martín Moreno et al., 2004).
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Pozo de inyección
Zona de influencia del H2O2 Flujo de agua subterránea
Zona de influencia del O2 Zona de influencia de los nutrientes
Figura 1. Zonas de contaminación de un acuífero y de influencias de inyección de peróxido de hidrógeno, nitrato y fosfato. La zona de influencia de los nutrientes es mayor que la zona aeróbica de influencia del oxígeno. (Fuente: Cookson 1995, citado en Atlas y Bartha, 2002).
En contraposición, las técnicas ex situ son más rápidas y efectivas desde el punto de vista biológico, pero suelen ser más costosas y más lentas desde lo operativo. Dependiendo de la cantidad de suelo a remediar y del tipo de reactor, la biorremediación puede ser lejos del lugar a biorremediar, o si el reactor puede transportarse puede realizarse en el lugar de la contaminación. De todas formas, esta última se considera una técnica ex situ porque el suelo debe sacarse de su lugar y pasar por el reactor. El compostaje, por ejemplo, es una técnica ex situ aplicable para distintas situaciones de contaminación de suelos. El suelo contaminado se mezcla en proporciones adecuadas con diversos sustratos, tales como paja de cereales y/o guano de producciones animales, de tal manera que se favorezca al sistema con la difusión de oxígeno y humedad, optimizando así el metabolismo microbiano del sistema (Atlas & Bartha, 2002; Martín Moreno et al., 2004; Medaura et al., 2007).
Biorremediación de aguas Las aguas profundas pueden ser remediadas por distintas metodologías. La elección dependerá de cuales sean las condiciones geológicas e hidrológicas locales. En los sistemas in situ se realizan pozos de extracción del agua contaminada y ya en la superficie se agregan nutrientes y oxígeno. El agua es reintroducida por otro pozo cercano para que los microorganismos lleven a cabo la biorremediación. Otra técnica es la difusión directa de aire en las aguas profundas, o columnas de oxigenación. La primera metodología tiene como desventaja que el aire puede no llegar a todos los sitios contaminados y la segunda, es más costosa por el armado de las columnas (Martín Moreno et al., 2004) Los residuos líquidos generados por actividades humanas son dirigidos por alcantarillados y sistemas cloacales a distintos sitios. El sistema de alcantarillado pluvial desagua en ríos y arroyos recolectando el agua de lluvia, la cual no pasa por ningún sistema de
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remediación. La misma en ocasiones sufre desviaciones para ser utilizada por productores hortícolas y piscicultores. En cambio, el sistema cloacal transporta agua con elevada carga de materia orgánica, por lo cual no puede ser vertida directamente a cursos de agua y debe ser dirigida a plantas de tratamiento, donde se la somete a remediación física, química y biológica. Posteriormente, es derivada a cursos de agua o a redes de consumo doméstico. Esto es un ejemplo de remediación de aguas ex situ, debido a que las mismas son remediadas en plantas de tratamiento fuera del punto de contaminación (Atlas & Bartha, 2002). Por medio de dicho tratamiento se busca eliminar bacterias patógenas como Salmonella y parásitos como Giardia. En primera instancia los líquidos son filtrados con el fin de extraer desechos grandes como plásticos, metales, etc. se A continuación deja sedimentar, eliminando así undetercio de la materia orgánica. Finalmente, aplica, en unasecámara de aireación, un conjunto microorganismos denominado “barro activado”.
A pesar de que las aguas naturales poseen una capacidad natural de autopurificación, es importante no arrojar xenobióticos a la red pluvial. En tal caso, los microorganismos heterótrofos mineralizan los nutrientes orgánicos, y las algas y plantas acuáticas superiores utilizan e inmovilizan el amonio y el nitrato previamente nitrificado. Las poblaciones alóctonas de bacterias comunes y patógenos compiten con las poblaciones autóctonas viéndose estas últimas favorecidas por su adaptación al medio (Atlas y Bartha, 2002). Los ríos que reciben aportes importantes de materia orgánica debido al vertido de aguas residuales y contaminación agrícola o industrial pueden ver reducido los niveles de O 2 del agua debido a la respiración bacteriana que libera nutrientes inorgánicos a partir de la mineralización de la materia orgánica (Figura 2). Esa disminución de los niveles de O2 en ecosistemas de aguas frescas es indeseable debido a que provoca la muerte de animales acuáticos. Si las condiciones de anoxia se mantienen proliferarán las bacterias anaerobias, las cuales son responsables de los malos olores, debido a sustancias tales como aminas, sulfuro de hidrógeno, mercaptanos y ácidos grasos, algunos los de cuales resultan tóxicos para organismos superiores. A debido medidaa que el agua de se aleja del de punto vertido aumenta el número de algas y cianobacterias, la presencia los nutrientes inorgánicos, principalmente PO43-, NH4+ y NO3-. El consumo de esos nutrientes inorgánicos por algas y cianofíceas y la reducción en el contenido de MO determina que, aguas abajo del sitio de vertido, los niveles de O2 del río se recuperen (Figura 2).
Figura 2. Efecto de la incorporación de aguas residuales y otras aguas de desecho ricas en materia orgánica en un río. Inmediatamente se produce un aumento en el número de bacterias heterotróficas y un descenso en los niveles de O2. Si el aporte en las aguas residuales tiene, por ejemplo, amonio, éste es oxidado a nitrato por las bacterias nitrificantes. El aumento en el número de algas y cianobacterias es principalmente una repuesta a los nutrientes inorgánicos, especialmente fosfatos.
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Demanda biológica de oxígeno La demanda biológica de oxígeno (DBO) es una medida del consumo de oxígeno requerido para la oxidación microbiana de materia orgánica y amonio, fácilmente degradables, en las aguas residuales. Estas pueden ser de cuatro fuentes: aguas domésticas o urbanas, industriales, escorrentias de usos agrícolas y pluviales. En el tratamiento de residuos líquidos, el objetivo de las operaciones es la reducción de la DBO asociada a la materia orgánica en suspensión y disuelta, seguida ocasionalmente de la eliminación de nutrientes inorgánicos y de compuestos orgánicos recalcitrantes antes de la descarga del efluente. El nivel de DBO se determina comparando el nivel de oxígeno disuelto (OD) de una muestra de agua tomada inmediatamente, con el nivel de OD de una muestra de agua que ha sido incubada en un lugar oscuro durante 5 días. La diferencia entre los dos niveles de OD representa la cantidad de oxígeno requerido para la descomposición de cualquier material orgánico en la muestra y es una buena aproximación del nivel de la DBO. La muestra de aguas residuales se diluye en agua saturada de oxigeno y se encierra en una botella sin espacio de aire. La cantidad de OD se mide normalmente con un electrodo de oxígeno. Como algunos compuestos orgánicos no se oxidan fácilmente, y como se forma también biomasa microbiana, la DBO es menor que la demanda química de oxígeno (DQO), que se mide utilizando oxidantes químicos fuertes. Como su solubilidad es baja, el oxígeno disuelto en aguas naturales rara vez excede los 8 mg/L y con frecuencia es mucho menor debido a la actividad microbiana heterótrofa. Se considera que un agua potable tiene adecuado o bueno nivel de DBO cuando este es menor que 8 y 5 mg/L, respectivamente. Generalmente en las aguas de srcen doméstico este valor fluctúa entre los 200 a 300 mg/L. El reaprovisionamiento del OD de la atmósfera (reaireación) y/o por producción fotosintética de oxígeno, puede ser considerablemente más lento que el consumo de oxígeno por parte de los microorganismos heterótrofos en presencia de sustratos orgánicos abundantes. En consecuencia, el impacto principal de la sobrecarga de aguas residuales naturales es la reducción o el agotamiento de su contenido de OD. Una vez agotado éste, los procesos de autopurificación se hacen drásticamente más lentos. Los productos de fermentación y la reducción de los sumideros de electrones secundarios, como el nitrato y sulfato, producen olores, sabores y colores nocivos o desagradables, el agua se convierte en anóxica o séptica. La falta de oxígeno mata forzosamente los organismos aerobios. La descomposición de estos organismos muertos constituye una demanda adicional de oxígeno. La turbidez y los productos metabólicos tóxicos, como H2S, también interfieren con la regeneración fotosintética de oxígeno, retardando aún más el proceso de recuperación. La entrada de una única dosis de aguas residuales en un ambiente léntico (aguas estancadas, remansos), produce un periodo séptico de agotamiento de oxígeno al que se asocia una reducción de la diversidad biológica. Después de un periodo séptico prolongado, la difusión de oxígeno finalmente reairea el sistema y permite la mineralización de los productos de fermentación acumulados. Los nutrientes minerales liberados de la materia orgánica degradada pueden entonces producir una floración (bloom) de algas. Si no hay más alteraciones, la sucesión secundaria finalmente restituirá la comunidad acuática a su estado anterior. Cuando un habitat lótico (unpreviamente río que fluye)descritos recibe una entrada continua en de estado aguas residuales sin atratar, los acontecimientos pueden observarse estacionario diversas distancias río abajo del vertido de las aguas residuales. Dependiendo de las tasa de emisión de aguas residuales, de flujo, de la temperatura del agua y de otros factores ambientales, la calidad del agua puede revertir a un estado próximo al srcinal, a distancias que van de unos pocos hasta varias docenas de kilómetros río abajo desde el punto de vertido de las aguas residuales. Las condiciones sépticas en aguas naturales, tanto si ocurren temporalmente como de manera constante, nunca son recomendables. Para evitarlas, el tratamiento de las aguas
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residuales tiene como objetivo reducir la DBO antes del vertido, algo que se consigue en tres etapas. Estas se denominan tratamientos primario, secundario y terciario de aguas residuales, respectivamente. Las dos primeras causan una mayor reducción de la DBO srcinal. La tercera etapa normalmente esta dirigida a eliminar nutrientes minerales y/o compuestos orgánicos recalcitrantes. Las aguas entran en la planta depuradora a través de pantallas, sifones y mecanismos de espumación que eliminan los objetos más grandes, arenilla, espuma flotante y grasa. El tratamiento primario elimina solamente los sólidos en suspensión. Esta extracción se consigue en tanques de sedimentación o piletas, donde los sólidos se sacan del fondo. Pueden someterse a digestión anaeróbica y/o compostaje antes de la distribución final en terraplenes o como acondicionadores de suelo. Sólo un bajo porcentaje de la materia orgánica suspendida o disuelta se mineraliza durante la depuración de residuos líquidos. La mayor parte de la materia orgánica se elimina por sedimentación, en cierto modo, el problema de eliminación simplemente se desplaza al área de residuos sólidos. Sin embargo, este desplazamiento resulta esencial dada la fragilidad de los ecosistemas acuáticos debido a su bajo contenido en OD. La parte líquida de las aguas residuales que contiene materia orgánica disuelta se somete a tratamiento adicional o se vierte después del tratamiento primario. Los residuos líquidos varían en composición, y si contienen principalmente sólidos y poca materia orgánica disuelta, el tratamiento primario puede eliminar un 70-80% de la DBO y considerarse adecuado. No obstante, en las aguas residuales domésticas típicas, el tratamiento primario elimina sólo 30-40 % de la DBO y es necesario el tratamiento secundario para una reducción aceptable de la DBO. En el tratamiento secundario se mineraliza una menor porción de la materia orgánica disuelta y una parte mayor en estado disuelto de transforma en sólidos que pueden eliminarse. La combinación de tratamientos primario y secundario reduce la DBO srcinal de las aguas residuales en un 8090%. La fase de tratamiento secundario depende de la actividad microbiana. El tratamiento puede cabo. ser aeróbico o anaeróbico, y se dispone de gran cantidad de mecanismos para llevarlo a A continuación se desarrollarán brevemente algunos casos de contaminantes que pueden ser tratados por medio de biorremediación.
Hidrocarburos La contaminación del suelo y del agua por derrame o pérdidas de hidrocarburos es un hecho frecuente. Esto lleva a que sea uno de los compuestos más estudiados en lo que respecta a su biodegradación por medio de bacterias ( Pseudomonas y Sphingomonas wittichii) y hongos (Cladophialophora sp.). Las cianobacterias han sido menos estudiadas, pero también contribuyen a la degradación de estos compuestos. Sin embargo, en aguas se estudia la degradación por medio principalmente de cianobacterias y algas. Los microorganismos utilizan los derivados de petróleo como fuente de carbono y algunos de ellos producen surfactantes, siendo estos últimos inocuos y biodegradables. Las fracciones de hidrocarburos BTEX (benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos) y algunos PAH (hidrocarburos policíclicos aromáticos) son fácilmente degradables, mientras que otros PAH y algunos componentes de los hidrocarburos del petróleo son muy recalcitrantes y persisten en el sistema por mucho tiempo. Luego de que las primeras fracciones mencionadas son degradadas, las que permanecen estables pueden producir en ciertas circunstancias mayores riesgos. En la Figura 3 (Cookson, 1995, citado por Atlas & Bartha, 2002) puede observarse la aplicación de conceptos vistos anteriormente. La degradación varía en función del tipo de hidrocarburo y la textura del suelo, demostrándose que el petróleo tarda más en biorremediarse que la gasolina y gasoil, independientemente del tipo de suelo, mientras que el tipo de suelo
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afecta el tiempo de biorremediación de los hidrocarburos (ver recuadro “Biorremediación del vertido de petróleo del Exxon Valdez” extraído de Atlas & Bartha, 2002).
Residuos sólidos: su disposición en vertederos controlados La generación de residuos nos compete a todos, debido a que todos producimos, consumimos y finalmente generamos un desecho, ya sea desde un envoltorio de papel de caramelo hasta la viruta de metal que se genera en las industrias metalúrgicas. En la actualidad, en la Ciudad Autónoma de Buenos Aires se generan 5.000 tn diarias de residuos sólidos urbanos y sumado al Gran Buenos Aires, 15.000 tn de residuos llegan diariamente al Complejo Ambiental Norte III del CEAMSE (Coordinación Ecológica Área Metropolitana Sociedad del Estado) (FIUBA-CEAMSE, 2008). Estudios realizados por el CEAMSE determinaron que cerca del 60% de los desechos que llegan diariamente al relleno son compuestos de lenta degradación, como metal, plástico, vidrio, etc., llegando a tardar, como en el caso del vidrio, más de 4 mil años en descomponerse (FIUBA-CEAMSE, 2008). El 40% restante son productos orgánicos que se descomponen a mayor velocidad que los anteriores, incluyendo a restos de poda y jardinería, desechos alimenticios y papel no plastificado. Éstos son atacados por microorganismos anaerobios y facultativos srcinando, principalmente, gas metano, el cual es 24 veces más contaminante en la atmósfera que el dióxido de carbono (Atlas & Bartha, 2002). Es por tal motivo que un relleno sanitario, vertedero controlado o relleno de bioseguridad debe controlar el metano generado por los microorganismos y debe ser tratado.
Figura 3. Tasa de biodegradación en función de la fuente de hidrocarburos y del tipo de suelo. Los hidrocarburos tardan más en degradarse en los suelos de textura fina, mientras que la tasa de biodegradación es menor para el petróleo que para la nafta y gasoil, independientemente del tipo de suelo (Fuente: Cookson 1995, citado en Atlas & Bartha, 2002).
194 En la Figura 4 se pueden apreciar las partes de un relleno sanitario, entre las cuales se encuentra un pozo de recuperación de metano para la generación de electricidad (Miller, 2002). En el Complejo Ambiental NORTE III del CEAMSE el metano es quemado con el fin de eliminar dióxido de carbono a la atmósfera y así obtener bonos de carbono. Además se generan lixiviados, los cuales son recolectados por tuberías ubicadas en la zona más profunda del vertedero y son conducidas a pozos o piletas de tratamiento. Estos lixiviados no deben llegar a las aguas subterráneas para evitar la contaminación de las mismas. En las piletas, los lixiviados son tratados en distintas fases, pasando por lagunas anaeróbicas, lagunas aeróbicas y finalmente lagunas de barros residuales. En cada una de ellas la remediación puede ser biológica y/o físicoquímica dependiendo de los parámetros de los contaminantes (FIUBA-CEAMSE, 2008).
Figura 4. Corte transversal de un relleno sanitario . Se muestran los sistemas de recuperación de gas y de lixiviados, así como también la forma de disposición de las capas de sustratos. (Fuente: CEAMSE-Infografía Relleno Sanitario)
Pesticidas o xenobióticos Los herbicidas, insecticidas y funguicidas son pesticidas, los cuales varían en su naturaleza química, encontrándose productos fosforados, clorados, nitrofenoles, etc. Algunos de
195 ellos son utilizados por los microorganismos como fuente de carbono y dadores de electrones, pero hay otras sustancias que son más persistentes. En la tabla 1 se muestra la persistencia de distintos pesticidas en el suelo. Como se mencionó anteriormente, los componentes del sistema (temperatura, humedad, pH, etc.) afectan al tiempo de degradación. Una práctica común para biorremediar ambientes contaminados con altas concentraciones de pesticidas consiste en arar el suelo para airear y aumentar la superficie específica de contacto entre el plaguicida y los microorganismos del suelo. Además, pueden adicionarse fertilizantes para facilitar y aumentar la disponibilidad de los mismos para los microorganismos, acelerando aun más la biorremediación (Atlas & Bartha, 2002). Tanto bacterias como hongos intervienen en dicho proceso, pero la desaparición de los pesticidas en el suelo no se debe exclusivamente a su remediación, sino que puede deberse a lixiviación, descomposición química espontánea o volatilización.
Tabla 1. Persistencia de herbicidas e insecticidas en el suelo. Fuente: Madigan et al., 1997.
Sustancia
Tiempo requerido para la desaparición del 75-100% Insecticidas Clorados
DDT Aldrin
4 años 3 años
Clordano Heptacloro
5 años 2 años
Lindano
3 años
Insecticidas Organofosforados Diazinon
12 semanas
Malation Paration
1 semana 1 semana
Herbicidas 2-4, D
4 semanas
2,4,5 T
20 semanas
Dalapina
8 semanas
Atrazina
40 semanas
Simazina
48 semanas
Propazina
1,5 años
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Biorremediación del vertido de petróleo del Exx on Valdez (Fuente: Atlas & Bartha, 2002) En marzo de 1989, el superpetrolero Exxon Valdez encalló en el estrecho Prince William de Alaska, vertiendo al mar más de 40 millones de litros de petróleo crudo. La marea negra alcanzó una extensión de más de 1.500km de costa. Fue el peor accidente de esta clase en territorio estadounidense que, además de afectar a peces, aves y mamíferos marinos, arruinó la calidad del medio ambiente prístino de Alaska. La respuesta inicial de la empresa Exxon fue eliminar el petróleo de las rocas del estrecho mediante tratamientos físicos, con un éxito parcial y un gasto de más de 1 millón de dólares diarios. Dada la limitada eficacia del lavado físico de la costa, se pensó en recurrir a la biorremediación para aumentar la eficacia de otros procedimientos de limpieza. La EPA y Exxon acordaron estudiar conjuntamente la factibilidad de la propuesta. El proyecto se centraba en determinar si el suministro de nutrientes podía acelerar la biodegradación por parte de las poblaciones microbianas indígenas (Pritchard y Costa 1991; Bragg et al., 1992). Se incluyeron en el proyecto numerosos ensayos de laboratorio, pero lo esencial era hacer pruebas sobre el terreno para establecer la eficacia de la biorremediación en condiciones reales. Una de las primeras pruebas consistió en aplicar a distintas parcelas de playa contaminada diferentes abonos, entre los cuales había fórmulas solubles en agua, de difusión lenta y oleófilas. La aplicación del abono oleófilo tuvo un resultado espectacular: después de diez días de tratamiento la superficie de las rocas cubiertas de petróleo estaba limpia (Pritchard y Costa 1991) (Figura A). Este resultado parecía confirmar la idea de que la biodegradación del petróleo en aquella zona estaba limitada por la disponibilidad de nutrientes, y que la aplicación de abonos era una buena estrategia de biorremediación. Los espectaculares resultados positivos desplazaron el interés hacia el uso preferente de la biorremediación para tratar el vertido del Exxon Valdez (Beardsley, 1989). Los estudios de toxicidad e impacto ecológico mostraron que los abonos oleófilos y de difusión lenta podían aplicarse sin miedo, a concentraciones que como mínimo doblaban la tasa de biodegradación natural. En 1989 se aprobó el uso de Inipol y de otro abono de difusión lenta para el tratamiento de las costas, y este sistema acaparó gran parte del trabajo de descontaminación. A pesar de los espectaculares resultados visibles de la aplicación de abonos y de la decisión de su empleo extensivo, aún quedaban dudas sobre la eficacia del abono oleófilo y sobre las pruebas científicas de la eficacia de la biorremediación. Aunque las observaciones demostraban que el abono permitía mantener poblaciones mayores de microorganismo degradadores en las costas contaminadas, y que la tasa de biodegradación potencial aumentaba en muestras procedentes de los enclaves tratados con abono, los análisis de hidrocarburos residuales no mostraban diferencias significativas entre las muestras tratadas y las no tratadas (Prince et al., 1990; Chianelli et a ,. 1991). El problema era la alta variabilidad generada por la distribución muy fraccionada del petróleo, tanto en las parcelas experimentales como en las de control. Una costa rocosa contaminada por petróleo es extraordinariamente heterogénea, hasta el
197 punto de que hubo estadísticos que sugirieron el vertido de más petróleo para aumentar la uniformidad de la contaminación, una posibilidad que se rechazó de inmediato. Durante el año siguiente se llevó a cabo otra serie de ensayos sobre el terreno en un intento de establecer la credibilidad científica de la biodegradación de hidrocarburos reforzada por los abonos y de ganar autoridad para continuar la biorremediación de la contaminación petrolífera remanente (Bragg et al., 1992, 1994). Estas pruebas comprendían el muestreo de pozos para registrar concentraciones de oxígeno nutrientescomo en el agua intersticial, además de análisis químicoslasmás detallados del petróleoy residual, la determinación de la concentración de hopanos mediante cromatografía de gases y espectrometría de masas. Los hopanos son hidrocarburos (C27) alicíclicos que no parecen ser biodegradables. Dado que permanecen en los sedimentos que contienen petróleo, los hopanos pueden servir como patrones internos para normalizar las concentraciones de otros hidrocarburos residuales. Esto reduce la variabilidad entre muestras debida a la distribución fragmentada del petróleo y permite análisis estadísticos más significativos. La normalización de los datos químicos, junto con el uso de técnicas complejas de regresión estadística, permitió establecer definitivamente que la biorremediación era un tratamiento eficaz para reducir la concentración de hidrocarburos en las costas contaminadas. La tasa de biodegradación dependía de la cantidad de nitrógeno contenido en el abono que era retenido en el sedimento (Figura B). La tasa de biodegradación de hidrocarburos aumentaba de tres a cinco veces cuando se aplicaba el abono a razón de 4-8 kg por cada 10 m2 de costa contaminada. Estos estudios demos-traron que el abono estimulaba la bio-degradación en el subsuelo, además de la eliminación del petróleo superficial. Aunque podrían haberse conseguido tasas de bio-degradación más altas, la dosis de abono se eligió de manera queadversos, permaneciera bastante por del debajo niveles que habríanpara supuesto efectos ecológicos y también por debajo nivel de de toxicidad amoniacal el salmón. Debido a su eficacia, la biorreme-diación se convirtió en el principal trata-miento para eliminar la marea negra de las costas del estrecho Prince William. La aplicación de abonos redujo el tiempo de eliminación de los hidrocarburos tóxicos biodegradables de los 10-20 años previstos a 2-3 años en los lugares más deteriorados. El éxito de la biorremediación para el tratamiento de la marea negra del Exxon Valdez sirvió también para que se conociera mejor esta técnica y para estimular la investigación y el desarrollo de técnicas de biorremediación para otras aplicaciones.
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Figura B Aumento relativo de la tasa de biodegradación de hidrocarburos totales en sedimentos oleosos predicho por el modelo de regresión derivado de los estudios de campo. La eficacia relativa de la biorremediación es una función de la cantidad de nitrógeno retenida en el sedimento en
Figura A
relación a la concentración de petróleo en el sedimento. De acuerdo con este resultado, la biorremediación podría haberse aumentado hasta diez veces. En la práctica, se aplicaron dosis de 0,03-0,05 M N por mg de petróleo por kg de sedimento, lo que aseguraba una tasa de biodegradación entre tres y cinco veces mayor en las zonas tratadas que en las no tratadas. (Fuente: Bragg et al. 1992.)
Resultado de la aplicación del Inipol en la costa del estrecho Prince William (Alaska). El área tratada con este abono oleófilo (el recuadro blanco de la fotografía) aparecía relativamente limpia al cabo de 10 días. En cambio, la zona cincundante permanecía negra y cubierta de petróleo. Se comprobó que este hecho no era solo atribuible a la eliminación física, sino que se estaba produciendo una degradación biológica del petróleo. (Fuente: Russ Chianelli, EXXON Corporate Research, Anandale, NJ.)
199
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