Hidromel

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO RIO GRANDE DO SUL – UERGS UNIDADE EM BENTO GONÇALVES CURSO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA

JEAN BRESSAN ALBARELLO

FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA Hidromel

Bento Gonçalves 2010

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JEAN BRESSAN ALBARELLO

FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA Hidromel

Mini Trabalho de Conclusão de Curso apresentado como requisito parcial para a aprovação no componente curricular Metodologia Científica, no curso de Engenharia de Bioprocessos e

Biotecnologia

da

Universidade

Estadual do Rio Grande do Sul

Anamélia Saenger de Vasconcellos Orientadora

Bento Gonçalves 2010

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JEAN BRESSAN ALBARELLO

FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA Hidromel

Mini Trabalho de Conclusão de Curso apresentado como requisito parcial para a aprovação no componente curricular Metodologia Científica, no curso de Engenharia de Bioprocessos e

Biotecnologia

da

Universidade

Estadual do Rio Grande do Sul

Aprovado em ____/____/______

BANCA EXAMINADORA ____________________________________________________ Componente da Banca Examinadora – Instituição a que pertence ____________________________________________________ Componente da Banca Examinadora – Instituição a que pertence ____________________________________________________ Componente da Banca Examinadora – Instituição a que pertence

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Dedico este trabalho aos colegas e professores que auxiliaram e incentivaram a realiza-lo, em especial àqueles que contribuíram com conhecimentos técnicos.

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“O hidromel era a bebida dos deuses, o néctar que antecedeu o vinho e a cerveja nas preferências humanas, titânicas e divinas.” (CORREIA, Andrei Barros)

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RESUMO

Este trabalho tem como objetivo aprofundar os conhecimentos técnicos sobre fermentação alcoólica, bem como sua aplicação prática. Fator fundamental para um processo fermentativo satisfatório é o conhecimento das propriedades dos açúcares e demais nutrientes existentes em um mosto, assim como o processo de preparação do mesmo. O Hidromel é considerado a primeira bebida alcoólica produzida no mundo, ainda pouco conhecido em algumas partes do mundo, principalmente no Brasil, contudo encontra-se em boa fase de pesquisas e de expansão. Muitos fatores afetam a produtividade da fermentação alcoólica, tratando-se de hidromel, é necessário um controle eficaz durante o processo fermentativo quanto às necessidades fisiológicas das leveduras. Palavras-chave:

fermentação

Hidromel. Produtividade. Leveduras.

alcoólica.

Açúcares.

Nutrientes.

Mosto.

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO..........................................................................................................8 2. PREPARAÇÃO DO MOSTO...................................................................................9 2.1. PREPARAÇÃO DE MOSTOS DE MATÉRIAS PRIMAS AÇUCARADAS.........10 2.2. PREPARAÇÃO DE MOSTOS DE MATÉRIAS PRIMAS AMILÁCEAS E FECULENTAS...........................................................................................................10 2.3. PREPARAÇÃO DE MOSTOS DE MATÉRIA PRIMAS CELULÓSICAS...........10 3. METABOLISMO DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA EM LEVEDURAS.............12 3.1. PRODUTOS SECUNDÁRIOS DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA...................14 4. CONTROLE DO PROCESSO FERMENTATIVO..................................................15 4.1. NUTRIÇÃO DAS LEVEDURAS..........................................................................15 4.2. CONTROLE DA TEMPERATURA......................................................................16 4.3. MANUTENÇÃO DO PH......................................................................................16 4.4. CONCENTRAÇÃO DE AGUÇARES E DE INOCULO.......................................16 4.5. CONTROLE DE CONTAMINAÇÃO MICROBIANA VIA ANTISSÉPTICOS E ANTIBIÓTICOS..........................................................................................................17 5. HIDROMEL............................................................................................................18 5.1 PREPARO DO HIDROMEL.................................................................................18 5.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO...........................................................................20 6. CONCLUSÃO........................................................................................................21

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1. INTRODUÇÃO

Esta pesquisa tem como tema fermentação alcoólica, suas particularidades e suas características críticas do ponto de vista do controle microbiológico. Os diferentes métodos de preparação do mosto e o ciclo da fermentação dependem exclusivamente, em primeira análise, dos tipos de carboidratos a serem lisados. Não obstante disso, as propriedades físico-químicas tanto do mosto quanto do ambiente onde é realizado o processo fermentativo, requerem atenção especial, pois as leveduras responsáveis pela fermentação exigem substratos nutritivo e ambiente favorável a elas. Quanto mais aplicarmos cálculos estatísticos sobre os fenômenos da fermentação alcoólica, mais avançaremos à uma fermentação com total eficácia e produtividade.

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2. PREPARAÇÃO DO MOSTO

O primeiro processo é a preparo do substrato, que é o tratamento das diferentes matérias primas, este processo varia de acordo com a matéria prima a ser utilizada para a obtenção de açúcares a serem “convertidos” em etanol (CH3CH2OH) e dióxido de carbono (CO2). As matérias primas são divididas em três grupos: matérias açucaradas (cana de açúcar, beterraba, sorgo sacarino, milho sacarino, mel, melaços e frutas), matérias amiláceas e feculentas (grãos amiláceos, raízes e tubérculos feculentos) e matérias celulósicas (palha, madeira, resíduos agrícolas e resíduos sulfíticos de fábricas de papel). As matérias primas açucaradas podem ser de dois tipos: diretamente fermentescíveis (monossacarídeos), são utilizados para produção de bebidas alcoólicas tais como vinhos; e os materiais não diretamente fermentescíveis (dissacarídeos) são fermentados somente após a hidrólise¹ (invertase) dos dissacarídeos em monossacarídeos, a invertase é a enzima responsável pela hidrólise, esta enzima é produzida pelo agente de fermentação.

1. Hidrólise da sacarose em glicose e frutose.

As matérias amiláceas e feculentas são classificadas como infermentescíveis, podendo ser fermentadas somente após uma hidrólise denominada sacarificação. O processo de sacarificação requer altos valores e conhecimentos em termos de processos, devido a isto é pouco utilizado no Brasil, entretanto, muito utilizado em países como a Escócia para a produção de Uísque. Matérias celulósicas requerem técnicas de sacarificação ainda mais complexas que as matérias primas amiláceas e feculentas, além disso, possuem um rendimento de produtividade de etanol muito inferior que outras matérias, por estes motivos estas matérias celulósicas são as menos utilizadas para produção de etanol por fermentação alcoólica.

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2.1. PREPARAÇÃO DE MOSTOS DE MATÉRIAS PRIMAS AÇUCARADAS

As matérias primas são diluídas em concentrações adequadas (15 a 25º Brix). Quanto mais diluído for o mosto, mais rápida será a destilação, entretanto, há maior risco de contaminações. Quanto menor for a concentração de açúcar no mosto, mais lenta será a fermentação e pode haver sobra de açúcares não fermentados devido à ausência de hidrolise em todos os dissacarídeos. Muitas vezes é conveniente aquecer, decantar e filtrar o mosto, para evitar contaminações e uma fermentação mais eficiente.

2.2. PREPARAÇÃO DE MOSTOS DE MATÉRIAS PRIMAS AMILÁCEAS E FECULENTAS

Grãos, raízes e tubérculos devem ser sacarificados, pois os agentes de fermentação não possuem enzimas capazes de quebrar amido e/ou fécula. Geralmente a sacarificação é feita por meio biológico (fungos), mas pode também ser realizada por meios químicos e ação direta de enzimas. Umas das enzimas que atuam na sacarificação são: amilofosfatase, amilopactinase, α-amilase, β-amilase e maltase. A sacarificação via ação enzimática requer técnicas de controle avançadas e valores pouco econômicos. Na área da biotecnologia, o método de sacarificação mais utilizado é pela ação de fungos com propriedades amilóticas, este é um método eficiente e de fácil controle, além de apresentar viabilidade econômica. Os fungos mais utilizados são: Amylomyces rouxii, Aspergillus oryzae, Chlamydomucor oryzae, Rhizopus japonicus e Mucor delemar. Uma goma de amido é preparada e diluída em água, então os fungos são inoculados e o mosto contendo fungos deve permanecer em agitação durante 24 horas para que as leveduras possam ser adicionadas.

2.3. PREPARAÇÃO DE MOSTOS DE MATÉRIA PRIMAS CELULÓSICAS

Devido à grande complexidade do procedimento da preparação do mosto, da baixa produtividade da produção de etanol via fermentação desta matéria prima,

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presença de substâncias tóxicas e pouca utilização no “Mundo da Fermentação Alcoólica”, os procedimentos da preparação de mosto de matérias primas celulósicas estão pouco presentes na literatura.

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3. METABOLISMO DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA EM LEVEDURAS

A transformação de glicose para etanol e dióxido de carbono é composta por 12 reações², sendo que cada uma destas reações é catalisada por uma enzima glicolítica específica. A fermentação alcoólica ocorre no citoplasma das leveduras (células eucarióticas). As leveduras mais utilizadas são as Saccharomyces, estas leveduras possuem capacidade de realizar dois tipos de metabolismos de acordo com a quantidade de oxigênio atmosférico (O2) disponível no meio em que estão inseridas: em ausência de O2 ocorre anaerobiose (fermentação alcoólica), transformando cada molécula de glicose (C6H12O6) em duas moléculas de etanol (2CH3CH2OH) e duas de dióxido de carbono (2CO2); em presença de O2 ocorre aerobiose, convertendo glicose em biomassa, água (H2O) e dióxido de carbono (CO2). O objetivo das leveduras quando fazem metabolismo anaeróbico (quebra da glicose) é simplesmente gerar energia para elas mesmas em forma de adenosina trifosfato (ATP). O etanol e o dióxido de carbono resultantes são excreções das leveduras, sendo que o etanol também pode ser convertido em ATP por metabolismo oxidativo, por este motivo, o controle da quantidade de oxigênio em uma cuba de fermentação é fator crucial para uma fermentação eficiente. A fermentação alcoólica é dividida em três fases: fase preliminar (multiplicação celular e liberação de CO2); fase tumultuosa (parte mais demorada do processo, em que os açúcares são quebrados e há intensa liberação de CO2, o mosto fica menos denso e as quantidades de álcoois e ácidos aumentam); e fase complementar (diminiu a liberação de CO2, concentração de açúcares é próxima de zero e a concentração de etanol é próxima ao máximo possível (proporcional ao teor de açúcar quebrado)).

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2. Fermentação Alcoólica (seqüências de reações enzimáticas).

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3.1. PRODUTOS SECUNDÁRIOS DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

Diferentemente do objetivo do homem (obtenção do etanol), os objetivos das leveduras são crescer e proliferarem-se, para cumprir tais metas, estes fungos produzem outros compostos que formam a biomassa (polissacarídeos, lipídios, proteínas, ácidos nucléicos, etc.), compostos de interesse metabólico e de sobrevivência/adaptação. Experimentos comprovam que em escala industrial, cerca de 90% dos açúcares são convertidos em etanol, e os 10% restantes são utilizados para formar os

seguintes

compostos:

glicerol,

ácidos

orgânicos

(acético,

pirúvico

e

principalmente succínico), álcoois superiores, acetoína, butilienoglicol e outros compostos em quantidades insignificantes. A secreção de grandes quantidades de glicerol mantém o equilíbrio redox celular e auxiliam no controle osmótico quando grandes quantidades de saís e açúcares estão presentes no mosto. A secreção de ácido succínico (segundo componente secundário mais abundante) ainda é um dilema entre estudiosos da área, pois não exerce função metabólica, mas acredita-se que em ação sinérgica com o etanol, o ácido succínico sirva de “armamento” contra outras culturas microbianas que competem pelo substrato.

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4. CONTROLE DO PROCESSO FERMENTATIVO

Diversos fatores, tais como: temperatura, pressão osmótica, pH, teores de oxigênio, nutrientes, inibidores, concentração de leveduras e contaminação bacteriana, afetam o rendimento da fermentação alcoólica. Um dos fatores que mais afetam é a alteração estequiométrica de um dos componentes do processo fermentativo, fazendo com que ocorra maior produção de compostos secundários e aumento da biomassa.

4.1. NUTRIÇÃO DAS LEVEDURAS

Posteriormente à seleção das leveduras a serem utilizadas, estas deverão ser nutridas para que a fermentação ocorra sem mais problemas. Muitas vezes os nutrientes exigidos pelas leveduras já se encontram presentes no mosto, quando tais nutrientes não estão presentes, devemos adicioná-los em concentrações adequadas a fim de não prejudicar a vida das leveduras e consequentemente a eficiência da fermentação alcoólica. Os nutrientes³ indispensáveis para a nutrição das leveduras são: nitrogênio, fósforo, enxofre, potássio, magnésio, cálcio, zinco, manganês, cobre, ferro, cobalto, iodo e vitaminas como tiamina e ácido pantotênico. Qualquer um destes nutrientes quando em excesso, podem comprometer a fermentação.

3. Tabela de nutrientes necessários no mosto para fermentação alcoólica satisfatória.

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4.2. CONTROLE DA TEMPERATURA As “temperaturas ideais” são muito relativas, em escala industrial é comum que a temperatura esteja entre 26 a 35ºC. Quanto maior for a temperatura, maior será a velocidade da fermentação, contudo, maior será o risco de contaminação bacteriana, maior a vulnerabilidade das leveduras perante a toxidez do álcool e maior evaporação de etanol em cubas de fermentação abertas.

4.3. MANUTENÇÃO DO PH

Grande parte das leveduras empregadas em processos fermentativos possui resistência a baixos níveis de pH, sendo que o pH predominante em fermentações varia entre 4 a 5,5. Experimentos comprovam que quanto mais ácido for o mosto, maior será a produtividade de etanol, pois bactérias e outros contaminantes não sobrevivem em meios de baixo pH (cerca de 3 a 4) e a produção de glicerol como componente secundário da fermentação é muito reduzida em meios ácidos (pH 3 a 4). Quando não ocorre correção de acidez, o pH pode variar de 5 a 6,8, apesar de pH 6,8 ser praticamente neutro, fermentações alcoólicas podem apresentar bons resultados nesta faixa de pH (dependendo de outros fatores).

4.4. CONCENTRAÇÃO DE AGUÇARES E DE INOCULO

As concentrações de açúcares possuem limites, quanto maior a concentração de açúcar no mosto, maior serão a velocidade da fermentação e produção de etanol, e menor o crescimento das leveduras, que, consequentemente diminuirá a produção de glicerol como composto secundário. Todavia, se a concentração de açúcar ultrapassar os limites previstos em refratômetro (ºBrix), haverá desequilíbrio osmótico entre leveduras e o meio (mosto), este desequilíbrio leva a uma fermentação alcoólica inadequada e ineficiente. Assim como a concentração de açúcar, a concentração de inoculo também possui limites e interfere na produtividade da fermentação. Quanto mais leveduras

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estiverem inoculadas no mosto, mais rápido e mais produtivo será o processo fermentativo, além de restringir a produção de glicerol e contaminação por outros microrganismos. Apesar dos benefícios anteriormente citados, uma grande concentração de levedura requer grandes quantidades de açúcar, fazendo com que as leveduras disputem nutrientes, diminuindo a viabilidade da levedura como fermento.

4.5.

CONTROLE

DE

CONTAMINAÇÃO

MICROBIANA

VIA

ANTISSÉPTICOS E ANTIBIÓTICOS

Existe no mercado um vasto número de produtos que protegem o mosto contra diversos tipos de microrganismos específicos e ao mesmo tempo criam um ambiente favorável às leveduras. Antissépticos são pouco usados em escala industrial, mas possuem grande potencial repressor de crescimento e proliferação bacteriana. Antibióticos também podem ser usados para inibição de contaminações, são mais eficientes que antissépticos e trazem menos riscos que os mesmos. Antibióticos devem ser utilizados de acordo com o microrganismo em que se deseja eliminar.

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5. HIDROMEL

O mel é composto por água, glicose, frutose, sacarose, maltose, sais minerais, vitaminas, enzimas, hormônios, proteínas, ácidos, aminoácidos e fermento, estes componentes possuem variação de um tipo de mel para outro, conclui-se que nenhum mel é igual a outro. Há registros de que o hidromel é a bebida alcoólica fermentada mais antiga do mundo, muito consumida pelos povos antigos como gregos e romanos. Atualmente, segunda a legislação brasileira, o hodromel é definido como bebida alcoólica fermentada de solução de mel de abelhas em água potável com adição de minerais e leveduras.

5.1 PREPARO DO HIDROMEL

Questões higiênicas possuem influência direta no rendimento e no sabor do produto final das bebidas fermentadas, devido a este fato, os recipientes utilizados no processo fermentativo para obtenção do hidromel foram lavados com água e detergente, posteriormente preparou-se solução de hipoclorito de sódio em concentração de 100mg/L, onde os recipientes lavados foram imersos durante aproximadamente 30 minutos. O último dos processos de desinfecção foi o enxágue dos recipientes com água quente até total remoção do odor de cloro dos mesmos. O mosto foi preparado com 200g de mel de abelhas da Associação Farroupilhense de Apicultores e 800mL de água potável fervida da Bebidas Fruki S/A, nestas proporções o teor de etanol a ser produzido teoricamente seria de aproximadamente 8%, de acordo com a fórmula:

(1) Onde: Y é a quantidade de mel em gramas a ser utilizado para cada litro de mosto, X é o teor alcoólico desejado em graus por litro, 20 é a constante correspondente a massa em gramas de açúcar necessário para produzir teor alcoólico de 1 grau por litro, 100 é a constante que representa a porcentagem total do volume do mosto e 80 é a constante que representa a porcentagem de açúcares fermentescíveis existente no mel.

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A solução de mel em água foi pasteurizada, já na cuba de fermentação, em temperatura de 65ºC por 30 minutos para eliminar possíveis microrganismos que pudessem

comprometer

a

eficiência

da

fermentação

alcoólica.

Após

a

pasteurização, o mosto foi resfriado a uma temperatura de aproximadamente 30ºC, então

foram

adicionados

quatro

gramas

de

levedura

para

panificação

(Saccharomyces cerevisiae) Saf-instant da Lesaffre Group. Montou-se a estrutura de escapamento de gases de modo que possibilitasse o acompanhamento do processo fermentativo e impedisse a entrada de ar no recipiente de fermentação. A cuba de fermentação foi mantida em local arejado e com baixa luminosidade, a fermentação ocorreu em temperatura média de 12ºC. Em momentos em que a liberação de bolhas era praticamente imperceptível (lenta), o mosto era agitado. Quando a fermentação chegou ao fim – ausência de liberação de bolhas – a parte líquida presente na cuba de fermentação foi transferida a outro recipiente (desinfetado) através de um sifão, assim, sedimentos são separados para descarte. Para retirar o restante de leveduras e outros sólidos do hidromel, realizou-se ultra filtração. Em um funil colocou-se filtro de papel e pequenos pedaços de gelatina sem sabor. Esta filtração é bastante lenta, entretanto, apresenta bom resultado, melhorando o aroma e o sabor, além de diminuir consideravelmente a turbidez do hidromel. O último procedimento foi a pasteurização a aproximadamente 80ºC por 45 minutos, esta alta temperatura e o tempo da pasteurização foi utilizado devido ao fato de ter sido empregado leveduras preparadas para panificação, ou seja, leveduras mais resistentes à altas temperaturas. O objetivo da pasteurização é cessar a fermentação e eliminar microrganismos que possam degradar o álcool etílico existente no hidromel, transformando o mesmo em vinagre de mel. A pasteurização torna-se mais eficiente quando é feito choque térmico no pasteurizado.

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5.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A fermentação do hidromel durou cerca de 150 horas, sendo que a velocidade das bolhas de gases liberados pelas leveduras atingiu uma média de 0,2905 bolhas por segundo. A partir desta velocidade podemos calcular o volume aproximado de dióxido de carbono (CO2) liberado na fermentação através da fórmula:

(2) Onde: V é o volume de CO2 contido em cada bolha, 4/3 é constante, 3,1415 e r é o raio da bolha (aproximadamente 0,8cm).

π é constante de valor

O volume de CO2 liberado por cada bolha foi de 1,2063cm³, multiplicando este valor pelo número estimado de bolhas totais libertadas em todo o processo fermentativo, teremos o volume de CO2 liberado em toda a fermentação, o resultado será 156870cm³. Para um bom resultado em termos de produção de etanol na fermentação do hidromel, é necessário suprir as necessidades das leveduras, pois são estas que produzem o álcool etílico. Existem compostos que são indispensáveis para a sobrevivência do fermento. Muitas vezes, os nutrientes não estão presentes no mosto, devido ao baixo teor protéico-nutritivo do mel. Em muitos casos é conveniente adicionar sucos de frutas no mosto, pois enriquecerá o meio em que as leveduras serão inoculadas, gerando maior rendimento e eficiência da fermentação alcoólica.

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6. CONCLUSÃO

Quando tratamos de processos microbiológicos, temos que levar em consideração que qualquer evento e/ou substância desfavorável à fermentação podem vir a ocorrer, portanto, questões higiênicas e de controle constante do processo de fermentação são indispensáveis. As leveduras possuem suas capacidades, limitações e necessidades, por conseguinte, a busca pelo conhecimento e aperfeiçoamento da fermentação é de extrema importância. Fermentação é a quebra de carboidratos em dióxido de carbono e álcool etílico, mas o processo fermentativo não depende exclusivamente desta reação, pois precauções devem ser tomadas em todas as etapas da obtenção de determinada bebida alcoólica. É inútil alcançar máximo rendimento em termos de produção de etanol, e deixar que microrganismos que degradam álcool contaminem o produto final, destruindo-o.

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REFERÊNCIAS

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