Laboratoire de Chimie Analytique PharmaceutiquePharmaceutique- Genève
La chromatographie en phase liquide LC / HPLC
LC-MS: processus analytique L’analyse de composés dans des matrices complexes nécessite une préparation de l’échantillon, une séparation, une détection et un traitement des données. Préparation d’échantillon
Séparation
Détection
Analyse des données
Sélectivité -Simplification et accélération de la préparation de l’échantillon -Réduction du temps d’analyse -Automatisation plus facile
Chromatographies Liquide classique et micro-LC HPLC / CPL
Supercritique SFC / CPS
Partage
Exclusion
Polaires
Paires d'ions
Echanges de ligandes
Apolaires
Papier
Adsorption
Couche mince
Echanges d'ions
Autres...
Chirale
Electrophorèse capillaire CE / EC CZE
Diagramme des phases P = f (T) Etat supercritique
P Etat solide
Gazeuse GC / CG
Etat liquide
Gaz - Liquide Gaz - Solide
MEKC Chirale
Chirale
Chirale
Etat gazeux
T
Choix du système chromatographique Analyte
Phase stationnaire
Phase mobile
Propriétés physico-chimiques Chromatographie: partition phase stationnaire – phase mobile En fonction des propriétés PHYSICO-CHIMIQUES des molécules et surtout, en LC … - Volatilité / Polarité - Solubilité - Hydrophobe / Hydrophile - Acide / Base
Choix du type de LC Echantillon
MODE
Chrom. d’exclusion
Hydrophiles (protéines, sucres)
Chrom. adsorption/partage
Lipophiles (polymères)
Chrom. d’échange d’ions
polymère Support rigide poreux
phase normale X+
Chrom. chirale Isomères Enantiomères phase chirale
Lipophiles (sucres, phénols, ac. ac. carboxyliques)
(acides aminés)
colonne cationique
X(nombreuses substances pharmaceutiques)
Hydrophiles (80% des séparations chromatographiques) chromatographiques)
colonne anionique phase inverse
Chromatographie liquide haute performance La chromatographie liquide à haute performance (HPLC) est basée sur le partage de l’analyte entre une phase liquide mobile et une phase stationnaire solide très finement divisée. Pour obtenir une débit satisfaisant, il faut appliquer de très fortes pressions (> 100 bars). Suivant la nature des analytes à séparer, diverses phases stationnaires solides peuvent être utilisées: 1- chromatographie par échange d’ions 2- chromatographie d’exclusion 3- chromatographie de partage 4- chromatographie d’affinité
Chromatographie liquide haute performance 1- Chromatographie par échange d’ions: la phase stationnaire est ionique, l’analyte ionique (ionisable) interagit avec les groupes de charges opposées de la phase stationnaire. La phase mobile est une solution aqueuse de force ionique donnée.
2- Chromatographie d’exclusion: la phase stationnaire est un tamis moléculaire, les analytes sont séparés en fonction de leur taille (masse moléculaire > 10’000 g.mol-1).
Chromatographie liquide haute performance 3- Chromatographie de partage: a. la phase stationnaire est polaire (mode normal) et la phase mobile est un solvant non polaire. b. la phase stationnaire est apolaire (mode inversé) et la phase mobile est un solvant polaire.
4- Chromatographie d’affinité: la phase stationnaire contient un groupement pour lequel l’analyte a une affinité très prononcée. La phase mobile est une solution aqueuse.
Appareillage Injecteur
Pompes
Phase Mobile
Colonne
Réservoir de phase mobile
Four
Phase Stationnaire
Particules de silice
Détecteur
Intégrateur Informatique
En détail… INJECTEUR Volumes injectés entre 10 et 100 μl POMPE Pompes à haute pression (de 50 à 350 bars) COLONNE Longueur et diamètre de la colonne PHASE STATIONNAIRE Phase normale ou phase inverse PHASE MOBILE Nature, polarité ⇒ force éluante DETECTEUR UV, RI, fluorimétrie, électrochimie, réfractométrie, spectrométrie de masse (MS), … CHROMMATOGRAPHIE Procédé: exclusion stérique, adsorption, partage, échange d’ions Mode isocratique ou mode gradient
Injecteur
Vanne de commutation 6 voies
Pompes - Matériaux de fabrication chimiquement résistants aux phases mobiles employées - Capacité de travailler à haute pression - Pas / peu de pulsations (amortisseur de pulsations) - Débit de 0 → 3 ml / min ( →10 ml / min : CLHP-préparative) - Reproductibilité << 1% - Faible volume mort (jusqu’à la colonne) - Possibilité de faire des gradients, du recyclage de solvants - Petit débit de l'ordre du µl de plus en plus utilisé (HPLC capillaire)
Colonnes et connections Standard
Connexion rapide
Colonne courte
Surface de la silice: les silanols géminaux
H
H isolés OH
OH
Si Modification en surface
O
OH
Si
Si
vicinaux O
Si
OH Modification interne
Phase geffée: réaction de silanisation R X
Si
X
R R
X
Si
R
X
MONO-FONCTIONEL X = chloro ou alkoxy
BI-FONCTIONEL
TRI-FONCTIONEL
R: groupement alkyl, aryl, etc.
R Si
OH
R
X
X
R
Si
+
X
Si R
R R
Si HX
O
Si R
R
Phases stationnaires
Phases stationnaires EXCLUSION STERIQUE Gels organiques (polymères) ou supports rigides poreux (pores de taille comparable à la taille des espèces à séparer). ADSORPTION Silice avec silanols à la surface: interactions dipôle-dipôle ou liaisons hydogènes Ordre d’affinité pour les supports adsorbants: hydrocarbures saturés < hydrocarbures aromatiques < éthers < cétones < alcools < amides < acides carboxyliques ECHANGE D’IONS Résine ou silice greffées avec groupements fonctionnels chargés (cations sulfonates –SO3- ou anions ammonium quaternaires –NR3+) Le mécanisme principal est un échange d’ions par des liaisons électrostatiques. PHASE NORMALE Silice greffée avec groupements polaires: silica, amino, nitro, nitrile, diol, cyano. L’échange est basé sur des interactions type dipôle-dipôle, liaisons hydrogène, … PHASE INVERSE ( 80% des séparations chromatographiques ) Silice greffée avec des chaînes alkyle (RP-8, RP-18) ou phényle: caractère apolaire et hydrophobe PHASE CHIRALE Résine optiquement active ou silice greffée avec des cyclodextrines
Adsorption, partage, échange
Les interactions peuvent suivre des mécanismes d’adsorption, d’échange ou de partage. Le premier est un phénomène d’interface alors que les deux autres sont réglés par un phénomène d’échange.
Phase mobile: propriétés des solvants L’équilibre en adsorption est un phénomène de compétition. Les molécules de la phase mobile entrent en compétition avec les molécules de solutés pour les sites polaires d’adsorption (séparation liquide-solide). Plus l’interaction entre la phase mobile et la phase stationnaire est forte, moins l’adsorption du produit en solution sera importante et vice-versa. Les solvants sont donc classés selon leur force qui va dans le même sens que leur polarité.
Phase mobile: propriétés des solvants Propriétés de quelques solvants utiles en chromatographie phase liquide Solvant Isooctane Hexane Toluène Méthyl-t-butyléther Dichlorométhane Propanol-1 Tétrahydrofurane Chloroforme Ethanol Acétate d’éthyle 1,4-Dioxane Acétone Méthanol Acétonitrile Acide acétique Eau
UV cutoff (nM) 215 195 284 210 233 210 212 245 210 256 215 330 205 190 190
Viscosité (cP)
Eb
0.50 0.31 0.59 0.27 0.44 2.30 0.55 0.57 1.08 0.45 1.37 0.36 0.55 0.38 1.10 1.00
99
Indice de Polarité (°C) miscibilité (M) (P) 29 69 111 55 40 97 66 61 78 77 101 56 65 82 118 100
0.1 29 23 20 17 19 19 17 15 11 -
0.1 2.4 2.5 3.1 4.0 4.0 4.1 4.3 4.4 4.8 5.1 5.1 5.8 6.0 10.20
Phase mobile: force éluante PHASE INVERSE Eau Methanol Isopropanol Acetonitrile Acétone Acétate d’éthyle Ether Tétrahydrofuran Chlorure de méthylene Chloroforme Toluène Iso-octane Hexane
!
FAIBLE
PHASE NORMALE Hexane Iso-octane Toluène Chloroforme Chlorure de méthylene Tétrahydrofuran Ether Acetate d’éthyle Acetone Acetonitrile Isopropanol Methanol
FORTE
Détecteur: attention au choix du solvant
Gradient d’élution Il existe deux modes d’élution: - isocratique où l’éluant est de composition fixe - par gradient où l’éluant est de composition variable. Cet éluant peut provenir d’un mélange de 2 à 4 solvants dont les proportions peuvent changer pendant la séparation. Le changement dans le proportions des solvants peut être linéaire, concave ou convexe et même comporter des régions isocratiques. En phase normale, ils sont utiles pour La séparation de solutés de polarité très différente. En phase inversée, ils servent à la séparation de substances de masse molaire différentes d’une série homologue.
Détecteurs en LC 1- Deux types de détection basés: a. sur les propriétés générales (solvant + soluté). Ex: indice de réfraction, conductivité, constante diélectrique,… b. sur les propriétés des solutés. Ex: UV, polarographie, radioactivité,… 2- Principaux paramètres a. bruit: qui se définit comme la variation du signal de sortie d’un détecteur non attribuable au passage du soluté dans la cellule. b. sensibilité absolue: mesurée par un déplacement sur toute l’échelle de l’enregistreur lorsque la sensibilité du détecteur est maximale sans interférence du bruit de fond relative: concentration minimale de soluté détectable pour un signal au moins égal à trois fois la hauteur du bruit de fond.
Détecteurs en LC La sensibilité peut changer avec la nature du bruit de fond (type de détecteur), peut varier avec le débit (polarographie) ou avec la température ambiante La quantité minimale détectable d’une substance peut être augmentée en réduisant le volume mort, en limitant l’élargissement des pics dans la cellule et en optimisant les raccords. c. linéarité: région où le signal de sortie du détecteur est directement proportionnel à la concentration du soluté Signal / Abondance / Aire du pic
Domaine de linéarité
Saturation
Quantité injectée (μl) Concentration (μg/ml, ng/ml)
Détecteurs DETECTEUR
REMARQUES
UV
le plus couramment utilisé. Quantitatif
Réfractométrie différentielle
mesure universelle. Peu sensible et peu pratique
Fluorimétrie
sélectif et sensible. Quantitatif
Electrochimie
détection des substances oxydables et réductibles. Très sensible. Quantitatif
MS
Détecteur universel. Très sensible et spécifique
Conductimètre Infra-rouge Diffraction de la lumière Radioactivité RMN Ionisation de flamme etc…
…
Détection UV UV – visible ¾
¾ ¾ ¾
C’est le détecteur le plus utilisé en HPLC. Il est équipé d’une micro-cuve de circulation de quelques μl dont le trajet optique est généralement de 1 cm. Les cuvettes doivent être construites de façon à empêcher la production de faisceaux parasites et d’éviter la formation de bulles d’air. La réponse est directement proportionnelle à la concentration du soluté élué selon la loi de Lambert-Beer: A=εlc Mesure l’absorbance absolue d’un solvant + soluté ou la différence d’absorbance entre le solvant et le solvant + soluté (en présence d’une cellule de référence). La sensibilité de ce détecteur est de l’ordre de 10-8 M. Trois modèles existent sur le marché: longueur d’onde fixe longueur d’onde variable à l’aide de prisme ou réseaux (λ = 190 à 800 nm). Ils sont alors appelés spectrophotomètres. spectrophotomètres à barettes de diodes pouvant travailler entre 190 et 800 nm et dans le même temps mesurer l’absorbance à λ donnée.
Détection UV
Abs
Abs
A B
detection à λ1
B A
t
detection à λ2
t
Fluorimétrie ¾ Mesure l’énergie de fluorescence d’un soluté excité par une radiation ultraviolette. ¾ L’émission de lumière est mesurée à l’angle droit du faisceau d’excitation. ¾ Ce mode de détection est plus sélectif et plus sensible que l’absorbance UV visible (env. 10-10 M). L’intensité de fluorescence mesurée est directement proportionnelle à la concentration de l’analyte en solution ¾ Peu de composés sont fluorescents par eux-mêmes, il est donc souvent nécessaire de les dériver.
Réfractométrie ¾ Mesure de manière continue la différence d’indice de réfraction entre la phase mobile contenant le soluté et la phase mobile pure correspondant à la référence ¾ Ce détecteur permet une mesure universelle mais peu sensible (env. 10-5 M). ¾ De plus, il est peu pratique car il est très sensible aux fluctuations extérieures (température) et intérieures (densité de la phase mobile). Ainsi, il est impossible de travailler en mode gradient de solvants.
Electrochimie ¾ Permet la détection de substances oxydables ou réductibles (ions métalliques, anions inorganiques, composés nitrés, acides aminés et alcaloïdes) par la mesure le changement de courant entre deux électrodes (électrode à goutte de mercure ou électrode à fil de platine). ¾ Généralement, on effectue la mesure par ampérométrie, c’est à dire que l’on mesure la variation de courant à un potentiel donné. ¾ La sensibilité de la méthode est très importante (env. 10-10 M). ¾ Il est possible de travailler en mode réducteur (E < 0V) ou oxydant (E > 0V). En mode réducteur, l’oxygène dissous dans la phase mobile perturbe la détection. Il est alors nécessaire de dégazer la solution lors de la mesure. ¾ Le système est composé de trois électrodes plongées dans une micro-cellule de volume aussi faible que possible. ¾ L’échantillon est modifié au cours de la mesure.
Conductimétrie - Polarimétrie Conductimétrie Mesure la conductivité électrique due à la présence d’un soluté dans la phase mobile (de façon absolue ou différentielle). Ce détecteur est utilisé pour les solutions ioniques et est très sensible à la température.
Polarimétrie ¾ Mesure l’activité optique de substances possédant un ou des centres d’asymétrie. Cette activité est généralement associée l’activité biologique. ¾ Les nouveaux appareils équipés de laser permettent de détecter des rotations optiques de l’ordre du microdegré.
Spectroscopie infrarouge ¾ Mesure l’absorbance d’une substance dans l’infrarouge et permet l’acquisition du spectre IR des produits séparés par la chromatographie liquide. ¾ Permet d’identifier une substance par son spectre infrarouge, d’en reconnaître les fonctions chimiques (sélectivité). ¾ La difficulté du couplage avec la chromatographie liquide réside dans l’incompatibilité entre ce détecteur et les solvants utilisés, en particulier l’eau. ¾ On utilise maintenant un procédé analogue à celui qui sert dans l’interfaçage de la chromatographie liquide et la spectroscopie de masse.
Spectrométrie de masse ¾ Cette méthode est maintenant largement utilisée dans tous les types de laboratoires d’analyse, car elle permet d’obtenir dans le même temps, une analyse qualitative et quantitative. On peut, à l’aide de cette méthode, déterminer la composition, la structure et la masse moléculaire des composés. De plus la sensibilité de cette technique est très grande, elle est en effet une des méthodes analytiques les plus sensibles. Cette méthode a connu un grand développement ces 20 dernières années, principalement de par la possibilité de la coupler aux chromatographies en phase gazeuse et liquide. ¾ Cette technique suit un processus en chaîne composé des étapes suivantes: ionisation des molécules (éventuellement fragmentation) accélération des ions chargés dans un champ électrique et/ou magnétique séparation des ions suivant leur rapport m/z détection des ions au moyen d’un analyseur approprié Interprétation du spectre de masse obtenu (bibliothèques de référence) ¾ Différents appareillages sont commercialisés pour ce type d’analyse et en fonction de la technique utilisée, il est possible d’obtenir des spectres de masse très différents.
LC-UV-MS: Appareillage Phase mobile (tampon)
Pompes binaires
Système d’exploitation / Traitement des données
Injecteur automatique Colonne thermostatée Interface
Détecteur UV
Détecteur MS
Couplage LC-MS
Chromatographie liquide
Spectrométrie de masse
Sélectivité (séparation)
Sélectivité (détection)
Efficacité
Sensibilité
Robustesse
Information structurelle
Interfaces: électrospray, thermospray
Résolution 1/1
1/4
1/16
Rs = 0.6
Mauvaise résolution α 1.6
Rs = 0.8
N ≈ 100
Rs 0.75
Rs = 1.0
Bonne résolution efficacité
Rs = 1.25
α 1.6
Si le détecteur a une sélectivité suffisante, une résolution importante n'est pas essentielle
N ≈1000
Rs 4.67
Bonne résolution sélectivité α 2.6
N ≈100
Rs 2.2
Allure du pic: cinétique des échanges Diffusion turbulente
Diffusion longitudinale
Resistance au transfert de masse
% de modificateur organique 80 %
48 %
70 %
47 %
60 %
46 %
Type de modificateur organique
MeOH - H2O
THF - H2O
MeOH - THF - H2O
pH de la phase mobile B
pH 2.5
pH 3.0 AH
B N
BH+
pH 3.5 AA-
pH 4.0
Séparation d’un mélange complexe
Influence de la température 30°C
35°C
40°C
45°C
Sélectivité du greffage
Choix de la colonne: type et longueur C8
Phenyl
CN
Applications -Trimacinolone - Prednisolone - Prednisone - Cortisol - Cortisone - Methylprednisolone - Dexamethasone - Flumethasone - Betamethasone - Triamcinolone acetonide - Flunisolide
Analyse en routine des corticostéroïdes par LC-MS
Applications Analyse en routine des diurétiques par LC-MS/MS
- Acetazolamide - Dichlorphenamide - Acide Ethacrinique - Chlorothiazide - Chlorthalidone - Probenecide - Hydrochlorothiazide - Furosemide
