HPLC High Pressure Liquid Chromatography High Performance Liquid Chromatography Liquid Chromatography Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
HPLC HP
L C
The most frequently used technique
High Performance High Pressure
Liquid Cairan sebagai Fase gerak
Chromatography Teknik Pemisahan
HPLC Ditinjau dr sistem peralatan HPLC termasuk kromatografi kolom, krn dipakai fase diam yang diisikan atau terpacking di dalam kolom. Ditinjau dr fasa pemisahan HPLC termasuk kromatografi adsorpsi atau partisi. Proses pemisahan dilaksanakan di dalam kolom disertai pemakaian pelarut pengembang dengan tekanan tinggi.
PRINSIP KERJA HPLC/KCKT
Kerja KCKT pada prinsipnya pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolaran dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah. KCKT biasanya dilakukan pada suhu kamar. Jadi senyawa yang tidak tahan panas dapat ditangani dengan mudah.
Molekul analit akan keluar dr kolom scr acak, demikian pula respon detektor thd analit yg keluar dr kolom tsb tdk serempak thd semua molekul.
r o t k e t e d p a g g n a T
r o t k e t e d p a g g n a T
waktu
waktu
Kegunaan HPLC/KCKT KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa KOMPLEKS
MAKSUD DAN TUJUAN HPLC Didapatkan pemisahan yg baik dan selektif serta proses analisis berlangsung dalam waktu relatif singkat
Keunggulan dan Kelemahan HPLC Keunggulan Dapat dilakukan pada suhu kamar Analisis kuantitatif yang cepat dengan presisi dan akurasi yang tinggi Dapat dioperasikan secara otomatis Sensitivitas detektor yang tinggi Dapat diaplikasikan untuk berbagai analit dalam jenis sampel yang lebih luas
Kelemahan
Sulit ditemukan detektor yang universal Efisiensi pemisahan lebih rendah daripada GC Lebih rumit dalam pelaksanaannya Lebih mahal
HPLC Instrumentation Penunjuk Tekanan & Kecepatan alir
Degasser
Tempat injeksi 70 mbar A
A
B
B
C
C
Pump
A
A
B
C
A
B
C
Pemroses Data
B C Solvents
Detector
Gradient mixer Column
Fase Gerak/Eluen
Fase gerak: harus murni, bila berupa campuran pelarut maka harus campur. Mis metanol:air Fase gerak diletakkan dalam botol-botol reservoir. Cek vol,kejernihan,kristalis asi dapar
HPLC Mobile Phase
Saling campur Melarutkan sampel Harus murni pro-HPLC non korosif Low cost UV transparency Others: low viscosity, low toxicity, non flammability
Kemurnian Fase gerak
Diperlukan solvent dengan kemurnian tinggi. Adanya pengotor (impurities) pada solvent dapat menimbulkan gangguan analisis. Gunakan HPLC grade Air sebagai fase gerak: digunakan water for injection.
Solvent
UV Cutoff (nm)
Acetonitrile Water Cyclohexane Hexane Methanol Ethanol Diethyl Ether Dichloromethane Chloroform Carbon Tetrachloride Tetrahydrofuran
190 190 195 200 210 210 220 220 240 265 280 (220)
Toluene
285
Isocratic and Gradient Elution Elusi dapat dilakukan dengan 2 cara : Isocratic elution: Komposisi fase gerak tetap selama elusi. Gradient elution: Komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi. Digunakan apabila pemisahan tdk sempurna, u/ sampel yg kompleks. Kelebihan : peak bagus, sensitivitas bagus Kekurangan : butuh alat khusus u/ gradien, hasil belum tentu sm di setiap alat,t panjang
Degasser
Menghilangkan udara (gas nitrogen dan oksigen) yang terlarut. Adanya udara dapat menimbulkan variasi tekanan pada pompa atau timbulnya noise pada detektor tertentu (Amperometric Detector). Cara: vacuum degassing, pengaliran gas helium atau ultrasonikasi.
Pompa HPLC
Pompa Pencampur untuk menarik solvent fase gerak dari botol reservoir Pompa Analisis mengalirkan fase gerak ke dalam kolom Sistem Pompa: Tekanan Tinggi Tekanan rendah
HPLC Columns Kolom:
Bagian terpenting dalam pemisahan
HPLC Column Categories
Column Hardware: Standard or Cartridge, stainless, titanium Chromatographic Modes: Normal-phase (NPC), reversed-phase (RPC), ion-exchange (IEC), size exclusion (SEC) Dimensions: Preparative, semi-prep, analytical, fast LC, micro, nano Support Types: Silica, polymer, zirconia, hybrid
Chromatogram
r o t k e t e D n o p s e R
0
Peak A
Peak B
height
1
2
3
4
Waktu (menit)
5
6
7
width Area =
width x height 2
Prosedur Analisis Kromatograf Preparasi sampel
Sampel
Kromatogram B
E C
A
r n o t o k p e s t e e R d
D
0
5
10 15 waktu (menit)
20
Preparasi Sampel
Larutan Siap disuntikkan, diencerkan atau ditambah dapar/standar internal lebih dahulu Padat Perlu dilarutkan terlebih dahulu Saring (0.2 0.45 μm) sebelum disuntikkan –
Solid
Handling grinding, milling, homogenization Extraction Shaking, ultrasonication, Soxhlet, Liquid-liquid Extraction, Solid Phase Extraction (SPE) Liquid Handling Pipetting, dilution, concentration, pH/ionic strength adjustment Phase separation filtration, centrifugation, precipitation Sample clean-up: Column chromatography, SPE Derivatization: pre or post column derivatization
HPLC, Mengapa perlu tekanan tinggi?
Pada HPLC digunakan ukuran partikel packing kolom (silika) yang sangat kecil, umumnya 3-10um. Ukuran partikel makin kecil luas permukaan makin besar transfer massa dari fase gerak ke fase diam atau sebaliknya makin besar kolom semakin efisien dan resolusi peak semakin baik. Penggunaan ukuran partikel kecil diperlukan tekanan tinggi Pada kecepatan alir 0.5 sampai 5 ml/menit, panjang kolom 10-30 cm dibutuhkan tekanan 70-400 atm (1000 – 6000 psi)
H u k u m v a n D eem t er
Van Deemter Plot (smaller particles have smaller A & C terms)
Pemilihan Mode HPLC SEC
NPC Normal Phase
Size Exclusion (GPC, GFC)
IEC
HILIC
Reversed Phase RPC
Ion Exchange
Klasifikasi HPLC Berdasarkan Mekanisme
Kromatografi adsorpsi (adsorption chromatography) Kromatografi Partisi (partition chromatography) Kromatografi Pertukaran ion (ion exchange Chromatography) Size exclusion chromatography (SEC) Kromatografi Permeasi Gel Kromatografi Filtrasi Gel
Kromatografi Fase Normal Disebut juga kromatografi adsorpsi (adsorption chromatography) Pemisahan didasarkan atas adsorpsi/desorpsi analit pada fase diam polar (silika atau alumina) Analit polar lebih tertahan daripada analit non polar karena gugus silanol pada silika.
Kromatografi Fase terbalik
Pemisahan didasarkan atas koefisien partisi analit dalam fase diam dan fase gerak Urutan elusi: analit polar terelusi lebih dahulu, analit non plar terelusi terakhir Cocok untuk analisis zat-zat yang larut dalam air, semipolar atau beberapa senyawa non polar. Untuk analit berupa ion dapat dianalisis dengan RP-HPLC menggunakan dapar dan teknik pasangan ion (ion-pair).
Chromatography Stationary Phases
Silica Gel
Derivatized Silica Gel
O O O | | | OSiOSiOSiOH | | | O O O | | | OSiOSiOSiOH | | | O O O
O O O | | | OSiOSiOSiOR | | | O O O | | | OSiOSiOSiOR | | | O O O
bulk (SiO2)x
surface
relatively polar surface “normal phase”
bulk (SiO2)x
surface
relatively nonpolar surface “reversed phase”
Where R = C18H37 hydrocarbon chain (octadecylsilyl deriv. silica or “C18”)
Residual Silanol
Pada derivatisasi silika: Karena efek halangan ruang, tidak semua gugus silanol mengalami derivatisasi, sehingga masih ada gugus silanol tersisa (Residual silanol) Residual silanols menyebabkan timbulnya puncak yang berekor (tailing) khususnya untuk analit asam dan basa Untuk menghilangkan residual silanol dilakukan proses “endcapping” penggunaan molekul rantai pendek
Reversed-phase mobile phases Water Methanol Acetonitrile THF Additives, salts, acids, bases Ion pairing
Ion Exchange Chromatography Pemisahan didasarkan atas pertukaran ion analit dengan ion dari gugus fungsi bahan pendukung padat fase diam Contoh Fase diam: senyawa sulfonate (penukar kation); ammonium kuarterner (penukar anion) Fase gerak: dapar Aplikasi: analisis ion, asamasam amino, protein/peptida, polinukleotida
Size Exclusion Chromatography
Untuk pemisahan makromolekul (BM > 10000). Disebut GFC jika digunakan untuk pemisahan molekul biologis yang larut air Disebut GPC jika digunakan untuk penentuan Bobot molekul suatu polimer organik. Fase gerak umumnya toluen dan tetrahidrofuran.
HPLC Columns Kolom:
Bagian terpenting dalam pemisahan
Kolom HPLC
Bentuk Partikel Spherical atau irregular Partikel spherical mengurangi tekanan dan kolom lebih awet
Ukuran Partikel
Umumnya 3-10µm Makin kecil ukuran partikel, makin tinggi efisiensi
Kolom HPLC Ukuran Pori-pori Bervariasi antara 6010,000Å Makin besar pori-pori analit molekul besar dapat tertahan lebih lama. Pilih 150Å untuk sampel BM 2000.
Kolom Monolitik Batangan silika monolitik Kecepatan alir dapat ditingkatkan dengan resolusi yang baik, t analisis cepat. Boros eluen
Kolom Monolitik
Pori-pori besar kecepatan alir dapat ditingkatkan waktu analisis makin cepat
High Pure Silica Spherical particles
Almost no metal impurities (< 5 ppm) Excellent peak symmetry Extended stability: pH range 1.5 to 10.5
irregular
spherical
monolithic
HPLC Detectors
UV-Vis Detector Photodiode array Detector (PDA = DAD) Refractive Index Detector (RID) Fluorescence Detector (FLD) Evaporative Light Scattering Detector (ELSD) Electrochemical Detector (ECD) Conductivity Detector Radiometric Detector
Hyphenated Systems LC-MS; LC-MS/MS; LC-NMR
PDA
Dengan menggunakan software dapat menampilkan kromatogram dan spektra serapan UV/Vis sampel Dapat mengenali panjang gelombang maksimum, peak matching (menghitung match factor atau MF), library search dan evaluasi kemurnian peak (peak purity) Dapat menampilkan 3-D spektra
Spektra 3D
Pelarut untuk sampel
Pelarut sebaiknya sama dengan fase gerak Jika tidak dapat terjadi pengendapan di kolom, pelebaran peak, tailing atau terbentuknya peak baru.
Ion Suppression Ion suppression chromatography Adjustment of pH of the eluent by adding buffer salts Affects ionizable compounds
organic acids organic bases
In reversed phase we need to suppress ionization as much as possible May need very precise pH control
Pengaruh pH Fase gerak Pada pemisahan senyawa polar pada RP-HPLC : pH sebaiknya dikontrol digunakan buffer Contoh : Campuran nikotin dan Asam Salisilat pKa Nikotin : 6.16 dan pKa : As. Salisilt = 2.96 Pembuatan buffer : 67 Mm Buffer sitrat + 2,2 ml/L HCl 25% pH = 6.05 67 mM Buffer sitrat + 3,0 ml/L HCl 25% pH = 5.85 67 mM Buffer sitrat + 4,0 ml/L HCl 25% pH = 5.65 pH : 5.65 Nikotin keluar sebelum As. Salisilat 6.05 As. Salisilat keluar sebelum Nikotin 5.85 satu peak
Ion Pairing HPLC
When ion suppression is not effective the sample may be ionized and the ion-pairing technique used. Weak acids Ion-suppression (pH 2-5) or paired ion (pH 7-8) Weak bases Paired-ion (pH 2-5) or ionsupression (pH 7-8) Reagents: sodium hexanesulfonate, sodium heptanesulfonate, dibutylamine etc.
Memilih Panjang Gelombang Detektor UV
Pemilihan Panjang Gelombang (UV)
?
