IDENTIFICACION MOLECULAR DE HONGOS
Tomando como punto de partida la visión experimental, se encuentra que el estudio de hongos ha venido presentando gran diversidad de desafíos, desafíos, entre los cuales uno de los más limitantes es el grado de dificultad a la hora de identificar muchos de los aislamientos en medios de cultivo; por esta razón es común encontrar en los reportes de este tipo de investigaciones, una alta frecuencia de hongos categorizados morfológicamente. Afortunadamente, la disponibilidad actual que ofrecen las técnicas moleculares para complementar los estudios taxonómicos de hongos, brinda herramientas que posibilitan la identificación de hongos, aún en ausencia de esporas (Pinzón et al., 2003).
Pinzon, B. B. (2013). Diagnóstico molecular diferencial Colletotrichum gloeosporioides y Fusarium oxysporum en ñame (Dioscorea sp.). Revista Colombiana de Biotecnología, 15(1) 15(1)
La detección molecular por estar basada en el estudio de características genómicas, permite la identificación y diferenciación de organismos fitopatógenos de forma más sensible, específica, certera y rápida (Alves et al ., ., 2002)
Alves, R. G. (2002). A DNA-based procedure for in plant detection of Fusarium of Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli sp. phaseoli.. Phytopathology. Phytopathology. 92: 237-244
La identificación molecular aunque efectiva efectiva por su alto nivel de sensibilidad es una herramienta poco utilizada ya ya que genera altos costos y largos periodos de tiempo tiempo para la obtención de resultados, por esta razón es d e gran importancia encontrar otras alternativas de diagnóstico más accesibles para los productores. La amplificación de los espaciadores internos internos transcritos conocidos como ITS por sus siglas en inglés (Internal Transcribed Spacer) contenidos en el ADN ribosomal (ADNr), es una de las metodologías de diagnóstico molecular más utilizadas para diferenciar entre géneros, especies y variedades de hongos ho ngos relacionados, difíciles de distinguir fenotípicamente, gracias a que se han derivado cebadores específicos de sus secuencias. Mills et al . (1992) sintetizaron primers especie-específicos a partir de ITS para identificar C. gloeosporioides, gloeosporioides, los cuales han sido de uso para su detección detección en diferentes cultivos. Para el género Fusarium Fusarium se han utilizado cebadores como FUM1 (anteriormente FUM5) que permiten la amplificación del gen responsable de la biosíntesis de fumonisinas, metabolito secundario tóxico característico característico de algunas especies, especies, (Agrios 2005). Así mismo, existen
cebadores universales de utilidad filogenética debido al alto nivel de secuencias polimórficas que muestran entre especies estrechamente relacionadas; un ejemplo es el gen del EF-α que codifica una parte esencial de las proteínas que hacen parte de la maquinaria de traducción
Miller, P. R. (1992). Detection and differentiation of Colletotrichum gloeosporioides isolates using PCR. FEMS Microbiology Letters. Sreenivasaprasad, S. and Brown, 137-144.
Agrios, G. N. (s.f.). Plant Pathology. U.S.A: Elsevier Academic Press, 5a Edition, p. 164 y 560. Para re alizar una correcta identificación molecular de Hongos de debe proceder de la siente forma: Aislamientos fúngicos e identificación morfológica
A partir de material vegetal que presente puntos o manchas necróticas se aisla el patógeno asociado al cultivo. Se extraen las lesiones a través de pequeños fragmentos de tejido que sean tratados con solución de hipoclorito durante 1 minuto y se lavan tres veces con agua destilada estéril. A continuación se secan con papel absorbente estéril para ser sembrados en placas de Petri con medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) y se incuban a 25ºC. (Pinzón et al., 2009).
Extracción de ADN
Según Abang et al. (2003) el protocolo más adecuado para la correcta extracción de ADN corresponde a : lisar el tejido fúngico con perlas de cristal de 0.5 mm en el equipo perturbador celular .La cuantificación del ADN extraído se realizó con el fluorómetro Qubit Abang, W. M. (2003). Molecular taxonomic, epidemiological and population genetic approaches to understanding yam anthracnose disease. African Journal of Biotechnology, 2(12), 486-496. Secuenciación de regiones ITS
La identificación molecular a nivel de especie de hongos fitopatógenos se lleva a cabo por secuenciación de los ITS. Para la amplificación de la región completa de los espaciadores se usan cebadores universales denominados ITS1 e ITS4, bajo las siguientes condiciones: buffer NH4 1X, MgCl2 1.5 mM, dNTP 0.2 mM, cebadores 0.3 μM, 1 unidad de Taq Polimerasa (Bioline) y 40 ng de ADN muestra en un volumen final de 20 μl - Programa general de termociclaje recomendado:
ciclo inicial de 2 minutos a 95°C, 34 ciclos de amplificación (desnaturalización por 1 minuto a 95°C, anillamiento por 30 segundos a 50°C y extensión por 2 minutos a 72°C) y un ciclo de extensión por 10 minutos a 72°C.
Amplificación con cebadores específicos
Se seleccionaron cebadores para la detección específica de las especies fúngicas identificadas por secuenciación y se realizaron ensayos por triplicado (Pinzón et al., 2003). Para la amplificación del EF-α y las regiones ITS específicas para C. gloeosporioides se evaluan los cebadores EF-1, EF-2 y CGInt, ITS4; respectivamente según la literatura. Las condiciones usadas son las mismas que para la amplificación de ITS universales. Finalmente los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis en geles de agarosa.
Pruebas de patogenicidad
Para evaluar si los aislados son causantes de la sintomatología observada, se utiliza material vegetal sano de la misma especie y los aislados fúngicos identificados previamente. Luego de lavar el material vegetal con agua corriente, tratarlo con hipoclorito al 1% por 2 minutos y agua destilada estéril; se infecta su superficie con discos de agar de 0,5 cm3 de cada uno de los aislamientos fúngicos. Seguidamente, los ensayos se almacenan en bolsas de plástico resellables que contengan toallas de papel húmedas (agua destilada estéril) y se incuban a aproximadamente 24°C. En el ensayo se evaluaron diferentes condiciones con tres repeticiones: a) El aislado evaluado inicia su colonización en el material vegetal por sí solo b) requiere lesiones en el tejido para poder iniciar la colonización c) se asocia con otros patógenos para iniciar su colonización, puesto que no poseen la maquinaria de penetración necesaria.
MATERIALES Y METODOS
1.) Aislamiento de Hongos MATERIALES: -Material vegetal con síntomas de enfermedad -Agua destilada esterilizada -Cajas de Petri contenido medio de cultivo nutriente-agar (peptona 5g + extracto de carne 3g + agar 15g + 1L de agua destilada)
-Asa bacteria -Mecheros - Bisturí PROCEDIMIENTO: En primer lugar se recolectaron muestras de Colletrotrichum gloeosporoides , el fin de realizar la extracción del Hongo, una vez recolectada la mue stra fue llevada al laboratorio de Fitopatología ubicada en las instalaciones de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia. Se procede a lavar la muestra con abundante agua y haciendo uso de jabón, durante 2 a 3 minutos, esto con el fin de eliminar en gran parte los agentes contaminantes. Una vez se termina el proceso de lavado se corta el trozos de máximo 5mm por 5mm y con un grosor de 1 mm en los cuales el 50% del tejido se encuentre infectado y el réstate no, posteriormente se depositaron las muestras en un vaso que contenía agua destilada, posteriormente se e scurren los pedazos empleando la gasa sobre el recipiente y se ssumergen los trozos durante un minuto en hipoclorito de sodio al 0.5%. y durante un minuto en alcohol al 70%. Se realizan tres lavados de cortes de tejido vegetal con agua destilada estéril. Se Transfieren los trozos sobre una toalla de papel hasta que no se observen húmedos Con EL fin de evitar la infección por otras patógenos, se procede a Flamear las pinzas sobre fuego y se trasferir asépticamente los trozos en las cajas Petri formando una cruz, en el medio correspondiente para aislar al patógeno. Finalmente se Sellan las cajas con calor y posterior con vinipel, para identificarlo se marcar las cajas con la fecha y el nombre del patógeno y se incuban durante ocho días a 25°C
