HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN: ANÁLISIS ENZIMÁTICO DE LA DIAZTASA STARCH HYDROLYSIS:ENZYMATIC ANALYSIS DIASTASE Moreno Moreno C, Pala Palacio ciosA. sA. Corporación Tecnológica de Bogotá, Tecnología en Química IndustrialDepartamento BogotáColombia 15/12/2014
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RESUMEN Con el objetivo de realizar una hidrólisis enzimática y hacer un estudio cinético de una solución que contenía enzima (α -amilasa). Se prepararon soluciones soluciones de la enzima enzima (diastasa) al 2% y del sustrato (almidón) también al 2 % para así realizar la hidrólisis de esté obteniendo como producto dextrinas. Mediante el uso de tartrato de cobre alcalino y el arsenomolibdato, se midieron las absorbancias a 620 nm para realizar la curva y obtener una gráfica de Michaelis-Menten para evaluar la acción enzimática de la diastasa.
Palabras Clave: Diastasa, almidón, sustrato, enzima. ABSTRACT With the objective of carrying out a enzymatic hy drolysis and make a kinetic study of a solution containing enzyme ( α-amilasa). Preparing enzyme solutions (diastase) and 2% of substrate (starch) also performed well at 2% to conduct the hydrolysis of this product obtained as dextrins. Using alkaline copper tartrate and ar senomolibdato absorbances were measured at 620 nm for the bend and obtain a MichaelisMenten plot for evaluating the enzymatic action of diastase. Key Words: Diastase, starch, substrate, enzyme.
INTRODUCCIÓN El almidón es un poliglucosido constituido por restos de glucosa unidos por enlaces α glucosidicos, es un polisacárido de reserva en el
que se almacena la glucosa y a partir del cual, la glucosa puede ser movilizada con fines metabólicos por degradación enzimática. (Geissman, págs. 567-568) . El almidón está constituido por amilosa con enlaces 1-4 y amilopectina con ramificaciones entre enlaces 1-6. El término hidrólisis aplica a las reacciones químicas orgánicas o inorgánicas donde el agua efectúa una doble descomposición con otro compuesto, el hidrógeno va para un compuesto y el hidroxilo a otro, en el caso del almidón esta hidrólisis puede ser catalizada por enzimas (Reinaldo J. Velasco et al. 2008). La hidrólisis de almidón se realiza en dos etapas: Licuefacción y sacarificación, la licuefacción es la primera etapa en la que actúan enzimas como α-amilasa y β amilasa dando lugar a la formación de dextrinas. La etapa de sacarificación, se realiza utilizando enzimas como glucoamilasas, pululanasas o mezclas de enzimas, que forman moléculas de D-glucosa a partir de las dextrinas obtenidas durante la licuefacción. La actividad de estas enzimas depende principalmente de la temperatura y el pH (Anaya V. F. J. 2004; Mera l, et al. 2003).
MATERIALES Y MÉTODOS Tabla 1 Materiales.
Material
Cantidad
Vaso de precipitado de 250 ml Vaso de precipitados de 50mL Vidrio de reloj
2 1 1
Micro espátula Tubos de ensayo
1 9
Pipeta grad. de 10ml
2
5 6
Se prepararon dos soluciones, una de amilasa 2% en NaCl 0.1% y una solución de almidón 3% en buffer (Acetato de sodio 1M, Ácido acético 1M). En 9 tubos de ensayo se adicionaron los volúmenes de las soluciones anteriormente preparadas (Tabla 2). Estos se dejaron reaccionar por 10 minutos, luego se llevaron a ebullición por 5 minutos más, una vez se enfriaron se adiciono 1 ml de solución de tartrato de cobre alcalino dejando los tubos 5 minutos en baño de María. Por último se agregó a cada tubo 1 ml de solución de arsenomolibdato, homogenizando por inversión. Finalmente se centrifugo por 3 minutos a 2000 rpm y se midió absorbancia a 620 nm. Tabla 2 Soluciones en los tubos de ensayo.
Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5 6 Almidón 3 - 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 ml Agua ml 1 0.5 0.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 Enzima - 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 ml
RESULTADOS
Y
DISCUSIÓN
DE
RESULTADOS Acción E nzimática de la Di astasa Tabla 3 Absorbacia de las soluciones.
Tubo BB Absorbancia 0.000
BS 0.135
Tubo Absorbancia [S] mM 1 2 3 4
0,049 0,041 0,043 0,124
0,086 0,094 0,092 0,011
BE 0.025
µM/min 5,73×10-3 6.26×10-3
0.016
0,375
0,24
0,178
2.86×10-3
0,043
Grafica Michaelis-Menten 0.003
o p 0.0025 m e i 0.002 T / a i c0.0015 n a 0.001 b r o s0.0005 b A 0 0
0.02
0.04
0.06
Absorbancia
Ilustración 1 Gráfica de Michaelis-Menten.
Debido a la desviación cinética en los datos experimentales (dado por la inhibición del sustrato) no se logró trazar con precisión la hipérbola michaeliana requerida, es por esto que no se logro determinar los valores de K m y Vm, lo que se observa en la gráfica es la fase preestacionaria donde la velocidad de reacción va en aumento constante relacionada con las concentraciones de las sustancias reaccionantes. Para que se pueda ver la fase estacionaria se dice que la velocidad de formación de productos debe ser uniforme y por tanto la concentración del complejo permanece constante. (Macarulla & Marino, 1992). La grafica de LineweaverBurk da una representación lineal de la gráfica de Michaelis-Menten dando del inverso de la velocidad inicial frente al inverso de la concentración inicial de sustrato permitiendo hallar el valor de km y de Vmax más exactos. No se realizó la gráfica de LineweaverBurk porque en un principio no se obtuvieron los valores K m y Vm mediante la ecuación de Michaelis-Menten, sin estos no se puede obtener la representación doble recíproca (Lineweaver-Burk).
6.13×10-3
H idrolisis del A lmidón
7.3×10-4
Para la degradación del almidón se usó la enzima hidrolasa (diastasa) la cual ejerce un efecto catalítico sobre la hidrolisis produciendo la
ya sea de amilosa o amilopectina. La hidrolisis hace que la molécula de almidón sea cada vez más pequeña dando la alfa amilasa y amilopectina esta ultima una vez por acción de nuevo de la amilasa rompe los enlaces α 1 -4 produciendo dextrinas las cuales son fragmentos de polisacáridos más pequeños que el almidón con uniones de glucosa lineales o ramificadas . Según la siguiente reacción: ruptura
de
los
enlaces
α
1 -4
espectrofotómetro (Rakoff, 1980), relacionando la absorbancia con la concentración.
Según la siguiente reacción: Ilustración 3 Formación del azul de molibdeno a partir de la descarboxilación del azúcar oxidado.
CONCLUSIONES No se logró realizar el estudio cinético de la α -amilasa a partir de la hidrolisis enzimática del almidón, ya que no se obtuvo los valores de Km y Vm. Se realizó la hidrolisis parcial del almidón con la producción de dextrinas. La Temperatura y el pH que afectan la velocidad de la reacción deben permanecer constantes.
(MacFaddin, 2003, pág. 388)
La solución de tartrato alcalino se usa como reactivo de Fehling la cual se basa en la acción reductora que tienen los azúcares (por la presencia del grupo carbonilo que presentan) sobre los iones cúpricos en medio alcalino, este se oxida a ácido y reduce la sal de cobre (II) en medio alcalino a óxido de cobre (I), que forma un
Bibliografía Geissman. (1973). Principios de Química Orgánica. Barcelona: Reverte S.A. MacFaddin, J. (2003). Pruebas
bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica . Argentina: Panamericana S.A.
precipitado de color rojo.
Macarulla, J., & Marino, A. (1992). Bioquímica Cuantitativa (Vol. 2). Barcelona: Reverte, S.A. Rakoff, H. (1980). Quiica organica fundamental. M exico D-C: Limusa.
Ilustración 2 Formación de cobre reducido a partir del tartrato de cobre y el azúcar reductor.
El arsenomolibdato forma una tonalidad azul debido a que ocurre una descarboxilación sobre el azúcar reductor, la cantidad de azul de molibdeno es proporcional a la concentración de azucares presentes en la muestra, la intensidad del
color
puede
ser
cuantificable
con
