UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA
INFORME 5
Título: Identificación de hongos medio ambiente Cultivo en cámara húmeda
Integrantes: 20150447-NIQUEN CURO, Jorge Alberto 20150449-ORDOÑEZ RUIZ, Jean Carlo 20150451-OTERO CHUNGA, Sthefany Margarita 20150465-VILCAPOMA TORRES, Rodrigo Amador
N° DE MESA: 4 GRUPO DE PRÁCTICA: Jueves 11-1, E*
2016
INTRODUCCIÓN Los hongos pueden crecer en las áreas menos pensadas, los únicos requisitos para ellas son: ambientes de condiciones cálidas, mojadas y húmedas, además que esté presente sustratos. Los hongos medio ambientales más comunes son: Aspergillus sp, Penicillium sp, Cladosporium sp, Mucor sp, Alternaria sp. Cada uno de los cuales presenta características determinadas desde ausencia o presencia de hifas, septos en ellas; cuerpos fructíferos o ausencia de ellos; esporas; etc. Todas estas incapaces de ser apreciadas a simple vista; sin embargo, son posibles de observar a través del microscopio y con ello diferenciar un tipo de hongo de otro. Este método de observación microscópica es una forma de clasificar a los hongos, pues, a pesar de que muchos presenten macroscópicamente coloraciones, formas y asociaciones, de manera muy similar, al apreciarlos al microscopio sus estructuras y disposición como forma de los cuerpos fructíferos, hifas, septos, esporas, etc., dejan de serlo. La identificación de los hongos filamentosos que se encuentran en el medio ambiente, se basa en el examen macroscópico de la colonia y en sus características microscópicas como la disposición de las hifas. Semejanzas macroscópicas como la forma de la colonia, el color de la superficie, la textura y la producción de pigmentos son muy útiles para la identificación.
OBJETIVOS Teniendo como aprendizaje previo las cuatro sesiones anteriores, en cuanto a la manipulación de los equipos en el laboratorio. En esta sesión seremos capaces de determinar los géneros de hongos más frecuentes presentes en el medio ambiente. Además de determinar las características del desarrollo vegetativo de los hongos a través de un cultivo en cámara húmeda y mediante observaciones periódicas al microscopio.
MARCO TEORICO HONGO Los hongos son un grupo de seres vivos diferentes de las plantas y de los animales, razón por la cual se clasifican en un reino aparte llamado Fungi. Son seres detritívoros, es decir, se alimentan de todo tipo de detritos (restos orgánicos). Constituyen un grupo especial de detritívoros con una importantísima misión ya que se encargan de transformar la materia orgánica, que cae del suelo, en sales minerales que son aprovechadas por las plantas, con lo que se cierran el ciclo de la materia. Así la materia no se pierde, se recicla.
Clasificación del Reino Fungi según Madigan et. al (2003). Filum
Tipos comunes
Reproducción asexual
Reproducción sexual
Chytridiomycota
Allomyces
Zoosporas
Gametos flagelados en algunos quitridios
Moho negro del pan
Se forman esporas inmóviles en un esporangio
Cigosporas
Levaduras, mildíus, mohos, morillas, trufas
Los conidios se estrangulan de los conidióforos
Ascosporas
Setas, hongos corticiáceos, bejines, añublos, royas
Poco común
Basidiosporas
Mohos
Conidios
No se observa fase sexual
(quitidriomicetos) Zygomycota (cigomicetos)
Ascomycota (ascomicetos u hongos con sacos) Basidiomycota (basidiomicetos u hongos de maza)
Deuteromycota (deuteromicetos u hongos imperfectos)
Poseen una gran capacidad de adaptación y pueden desarrollarse sobre cualquier medio o superficie, tanto en bosques como en las ciudades. Se reproducen por medio de esporas, las cuales son diseminadas principalmente por el viento y por el agua. Los hongos han jugado y juegan un papel muy importante en la medicina, la industria y la alimentación. Observación macroscópica y microscópica de hongos Observación macroscópica
Observación microscópica
Color de la colonia: Verde petróleo,
Tipo de hifa: Septada, aseptada.
turquesa, blanco. Aspecto de la colonia: Agamuzado,
Tipo funcional de hifa: Esporangioforo,
algodonado, polvoroso, aterciopelado, mucosa, brillo metálico.
conidióforo.
Forma: Circular, irregular, invasivo.
Tipo de estructura de diseminación:
Esporangiosporas, conidiosporas.
Cámara de húmeda. Según Viteri (2004) Las muestras que no se logran identificar directamente con el uso del microscopio se las colocan en cámara húmeda, las mismas que se depositan en una funda plástica con papel absorbente humedecido con agua esterilizada. Luego se procede a amarrar la funda con piola de algodón y se las deja, alrededor, de 72 horas. Transcurrido ese tiempo se procede a separar los diferentes signos de los microorganismos presentes utilizando una aguja de platino, inmediatamente después se las coloca en el porta objetos que contiene ácido láctico colocando un cubre objeto para la observación al microscopio de luz.
Importancia ecológica, medicinal y simbiótica de los hongos. Los hongos contribuyen en grado importante al equilibrio ecológico del planeta. Como las bacterias, la mayor parte de ellos son saprótrofos, descomponedores que absorben nutrimentos de desechos orgánicos y organismos muertos. A diferencia de las bacterias, muchos saprótrofos fungales son capaces de degradar celulosa y lignina, los principales componentes de las paredes celulares vegetales. Cuando los hongos degradan desechos y organismos muertos, se liberan agua, carbono (en forma de CO2) y componentes minerales de los compuestos orgánicos, y tales elementos recirculan. Algunos tipos de hongos establecen relaciones mutualistas con otros organismos. Las micorrizas son asociaciones mutualistas entre hongos y raíces de vegetales. El hongo micorrícico beneficia a la planta al descomponer materia orgánica del suelo y, de este modo, poner a su disposición agua y minerales como fósforo, mientras que las raíces aportan al hongo azúcares, aminoácidos y algunas otras sustancias orgánicas. *La importancia de las micorrizas se descubrió cuando los horticultores observaron que las orquídeas no crecían a menos de que fueran colonizadas por un hongo apropiado. Los hongos causan tanto ganancias como pérdidas económicas. El ser humano los come y los cultiva para producir diversos agentes químicos. En otros casos, algunos hongos son perjudiciales desde la perspectiva humana porque causan enfermedades en el hombre y otros animales y son los patógenos vegetales más destructivos. (Madigan
MATERIALES Y METODOS -
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Asa de kolle: Consiste de dos piezas: el mango de Kolle y el asa, de bronce cromado y mango con bakelita. Son de un material inoxidable. Sirve para tomar muestras y poder realizar el cultivo en las placas petri.
Lamina porta objetos: Es una lámina rectangular de vidrio muy delgada, donde se colocan objetos de pequeño tamaño o preparaciones de baja escala, las cuales pueden ser analizadas con mayor profundidad en un microscopio.
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Cubreobjetos: Es una fina hoja de material transparente de planta cuadrada (normalmente 20mm x 20mm) o rectangular (de 20 mm x 40 mm habitualmente). Se coloca sobre un objeto que va a ser observado bajo microscopio, el cual se suele encontrar sobre un portaobjetos.
Mechero de alcohol: Es una fuente de calor, de baja intensidad, que funciona con alcohol etílico. Como un accesorio de seguridad se utiliza una pieza que en caso de accidente, cubre la entrada de oxígeno, de manera que el fuego se sofoca. Se utiliza en laboratorio para hacer combustión.
Papel toalla: El papel toalla ayuda a secado de los portaobjetos en el proceso de fijación y observación de los microrganismos.
Algodón y alcohol: El alcohol sirve junto con el algodón para limpiar los portaobjetas de la presencia de grasa porque si no este afectaría el proceso de fijación de microorganismos.
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Soporte de tinción: Es un instrumento de laboratorio, que es como una enorme liga tensada no flexible que se utiliza con los líquidos de tinción.
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Punzon: Es una herramienta de acero de alta dureza con un extremo o boca con
una punta aguda o una que al presionar sobre una superficie queda impresa en troquel. Puede tener varios tipos de punta en función de su uso.
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Pinzas de metal: Se utiliza en el momento final de la incubación por cámara húmeda, nos ayuda a colocar el cubreobjetos sobre el cultivo a incubar.
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Cámara Húmeda: Lugar donde se va poner al cultivo a germinar.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
Grado de aumento Género Color de la colonia Aspecto de la colonia Tipo de la hifa
Grado de aumento Género Color de la colonia Aspecto de la colonia Tipo de la hifa
Grado de aumento Género Color de la colonia Aspecto de la colonia Tipo de la hifa
400x Cladosporium sp Verde petróleo Agamuzado Tabicadas
400x Penicillium sp Turquesa Pulverulento Tabicadas
400x Alternaria sp Marrón Agamuzado Tabicadas
400x
Grado de aumento
Nigrospora sp
Género Color de la colonia Aspecto de la colonia Tipo de la hifa
Blanco Algodonoso Tabicadas
Cultivo en cámara húmeda
Día 2: viernes 23/09/2016
Penicillium sp
Cladosporium sp
Día 4: lunes 26/09/2016
Penicillium sp
Cladosporium sp
Se escogió para realizar los muestreos dos habitaciones del hogar: La sala y el dormitorio. El método utilizado en ambos casos fue con placas de agar sabouraud. Según Custodio (1997), este agar es un medio de cultivo recomendado para el aislamiento y desarrollo de hongos ya que su contenido rico en pluripeptona y glucosa brindan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. Además, el alto contenido de glucosa, la presencia de cloranfenicol y el pH ácido, favorecen el crecimiento de hongos por sobre el de las bacterias. Según Yang (1997), actualmente, se conoce que el aire presente en los ambientes exteriores puede ser la fuente de esporas fúngicas contaminantes de los ambientes internos. A su vez, muchos de estos últimos pueden servir como sitios de amplificación para el crecimiento de los hongos. Así, cuando se presenta una alta humedad (como en el caso de Lima), las esporas pueden germinar y el hongo puede crecer produciendo miles de nuevas esporas que utilizan la materia orgánica de esos sitios. La mayoría de los hongos presentes en los ambientes internos son saprofíticos, porque ellos obtienen lo que necesitan para su metabolismo de materiales muertos, materia orgánica o sustratos como madera, papel, pintura, suelo, polvo, piel y alimentos (Albright, 2001).
Los hongos ambientales aislados e identificados en la práctica son esporas asexuales perteneciente a la subdivisión Cladosporium sp y Penicillium sp. Este resultado es de esperarse ya que según investigaciones de Sneller y col.16 (1979), la incidencia de las esporas fúngicas en ambientes internos (casas) de pacientes alérgicos es de Cladosporium sp como el género más común, luego Mycelia sterilia y Penicillium sp. Para la observación de las muestras en el microscopio se desarrolló la técnica del “montaje por disección”. Divo relaciona esta técnica al uso de una aguja de disección
para tomar una parte de la superficie de la colonia y que luego debe ser depositada sobre una gota de azul de lactonofenol. Con la ayuda de otra aguja o asa microbiológica se extiende el preparado y se cubre con una lámina cubre objetos. Este método es el más habitual pero puede destruir los aparatos esporíferos y dificultar la identificación (Arenas 1993). Pudimos identificar estos hongos gracias a sus características morfológicas vistas al microscopio. En el caso de Penicillium sp, este es un hongo de crecimiento rápido dando colonias blancas aterciopeladas inicialmente, las cuales se cubren con los esporos y van tomando diferentes colores según la especie. Borde relativamente ancho de color blanco, con textura algodonosa. La superficie de la colonia se torna verde azulado, con la zona central más levantada por la acumulación de esporas. El reverso de la colonia es blanco amarillento a verde claro con el centro color café. Se observaron hifas delgadas septadas (Guzmán 1977). En el caso de Cladosporium sp. Se observaron colonias planas aterciopeladas, de color verde petróleo un poco más claro hacia la periferie, formada por micelio de hifas gruesas septadas y oscuras. Presentan conidióforos con conidios ovoides sobre los cuales se ven dos sitios donde se ven dos conidios (Guzmán 1977). La placa usada en el muestreo de la sala fue muy pobre en número de colonias, solo presentó colonias muy pequeñas, lo cual nos hace pensar que el desarrollo del muestreo tuvo algún error, tal vez la placa no fue destapada. Sin embargo, Buttner (1997) afirma que la técnica usada presenta algunas limitaciones. El muestreo por gravedad, o por deposición, es un método no cuantitativo en donde el medio agarizado es expuesto al ambiente y los organismos ambientales son colectados principalmente por gravedad. La recolección de microorganismos ambientales por este método está afectada por el tamaño y la forma de las partículas y por el movimiento del aire circundante. Como resultado de ello, las partículas grandes tienen mayor probabilidad de ser depositadas en la superficie de recolección. Esto puede llevar a la tergiversación de la prevalencia de los microorganismos ambientales y a la exclusión de las partículas pequeñas del muestreo. Tampoco, la concentración de hongos ambientales puede ser determinada por este tipo de muestreo porque el volumen del aire considerado no es conocido.
La muestra se colocó en un ambiente con humedad relativa próxima al 100% ya que favorece el desarrollo de los hongos. La atmósfera saturada se obtuvo colocando las muestras en placas petri sobre papel filtro estéril y humedecido. Es importante que la muestra se no esté en contacto con agua libre para evitar la aparición de otros organismos. Manteniendo estas condiciones, se realizaron observaciones diarias de la muestra, a partir del segundo día.
El primer día de observación no fue favorable ya que, a diferencia de las demás placas, en la nuestra se apreciaban tan solo puntos negros y una de ellas mostraba una cantidad casi imperceptible de hifas. La primera placa recién presentaba signos de desarrollo de hifas. Se concluye que el crecimiento de las especies en hongos no siguen los mismos patrones y por eso las diferencias en el tiempo de crecimiento además con esto pudimos decir que se trataba de los hongos Penicillium sp y Cladosporium sp.
CONCLUSIONES
Se pudo identificar a los hongos realizando dos observaciones: macroscópica y microscópica. En la primera, se identifican los aspectos generales de la colonia, color, aspecto, forma. En la segunda, el tipo de hifa (cenocítica o septada), tipo funcional de hifa (esporangióforo y conidióforo) y estructuras de diseminación (esporangiosporas y conidiosporas). En caso de que no se haya podido identificar al hongo por las dos observaciones mencionadas, se procede a realizar un cultivo en cámara húmeda, donde se determinará las características de desarrollo vegetativo de los hongos que no se pudo identificar. Las muestras observadas fueron obtenidas en distintos horarios y ambientes. Pudiéndose identificar Cladosporium sp, Penicillium sp, Alternaria sp, Nigrospora sp. Estos hongos son muy frecuentes en el medio ambiente. Los hongos se encuentran en todo tipo de ambiente, siendo su crecimiento promovido por condiciones húmedas y cálidas. Los hongos forman esporas que flotan en el aire hasta encontrar las condiciones favorables para su crecimiento. El agar Sabouraud es un medio de cultivo que permite el aislamiento de levaduras y hongos, ya que es un medio rico en nutrientes, debido a sus niveles de peptonas y dextrosa, lo que favorece el crecimiento fúngico. Además posee un pH ligeramente ácido lo que favorece el crecimiento fúngico más que el bacteriano. Mediante el cultivo en cámara húmeda se pudo observar efectivamente que el crecimiento de la hifa se realiza por extensión apical, ya que la síntesis y deposición de los componentes de la pared se da de esta forma.
CUESTIONARIO 1 1. Haga una descripción morfológica de 5 géneros de hongos del medio ambiente considerando las características de desarrollo en medio de cultivo y las características observadas al microscopio.
Aspergillus Presentan conidióforo corto, liso, vesícula con fiálides, uniseriada, ocupando 2/3 de la vesícula. Los conidios en cadenas forman una compacta columna sobre la vesícula, son de color verde, finamente rugosos, globosos o subglobosos. La textura de las colonias es aterciopelada, afelpada, vellosa o algo plegada, con margen blanquecino o beis. El color inicialmente es blanco virando en aproximadamente siete días a un verde azulado por la producción de conidias. El reverso de la colonia es incoloro.
Fusarium El color de las colonias es blanco, crema, pardo claro o pardo rojizo mezcladas con zonas de color púrpura; raramente en cepas de aislamientos clínicos pueden presentar masas mucosas verdes azuladas, formadas por macroconidias que nacen de esporodoquios. La textura es algodonosa o lanosa. Se caracteriza por presentar conidióforos de esporodoquios cortos, ramificados. Conidióforos de hifas aéreas generalmente no ramificados, muy largos, reducidos a una simple fiálide más o menos cilíndrica, en cuyo ápice se puede encontrar un conidio no desprendido. Macroconidias en masas mucosas, hialinos, mayormente con tres septos, ligeramente curvados, fusiformes, pero con extremos más o menos redondeados.
Mucor El color de las colonias es blanquecino al inicio, con el tiempo cambia a marrón. El reverso de la colonia es blanquecino. La textura es algodonosa. Presentan hifas aseptadas y gruesas. Se caracteriza por presentar esporangióforos, esporangios. Carecen de apófisis, estolón y rizoides. Las columnillas son hialinas, siendo visibles si el esporangio se encuentra intacto. Los esporangios son esféricos o redondos y de color gris a negro, estando llenos de esporas.
Rhizopus Inicialmente son blancas pero luego cambian a gris parduscas. El micelio carece de septos. Presentan estolones y rizoides. Los esporangióforos no son ramificados, tienen una longitud de 2 mm, generalmente están en grupos, formando verticilos en cuya base se sitúan los rizoides. Las apófisis pueden estar presentes pero son poco evidentes. Presentan esporangios esféricos, los cuales son de color gris pardusco a negro. La columnilla es subesférica. Las esporangiosporas son angulares y con estrías longitudinales, grisáceas, subesféricas o elipsoidales.
Penicillium Este género se caracteriza por formar conidios en una estructura ramificada semejante a un pincel que termina en células conidiógenas llamadas fiálides. En la figura se esquematizan los tipos de conidióforos del género Penicillium, cuyas ramificaciones se ubican formando verticilos. Si hay sólo un verticilo de fiálides el pincel es monoverticilado. Las ramificaciones de un pincel poliverticilado son ramas, rámulas, métulas y fiálides. Los conidios generados en fiálides suelen llamarse fialoconidios para indicar su origen. En la fiálide, al dividirse el núcleo, se extiende simultáneamente el extremo apical que luego se estrangula separando a la espora recién formada. Se llama conectivo a la porción de pared que une entre sí a los conidios permitiendo la formación de cadenas, y en algunas especies se aprecia claramente con el microscopio óptico. Las colonias de Penicillium son circulares si no hay impedimento alguno para su crecimiento, con un borde neto muchas veces sin fructificación y mostrando el color del micelio. Éste es generalmente blanco, pero en algunas especies es amarillo, anaranjado, púrpura o pardo claro. La superficie de la colonia madura, o sea con sus conidios formados, puede ser: aterciopelada, ligeramente algodonosa o con pequeños haces (fascículos) de conidióforos. En unos pocos casos los haces miden varios milímetros (coremios) con el extremo constituido por las cadenas de esporas.
2. Los nombres genéricos de muchos hongos son derivados de características morfológicas. De cuales derivan los nombres Penicillium, Aspergillus y Rhizopus
El primero deriva de “penicillius”, que significa “pincel” en latín, ya que la estructura
fructífera asume esta forma. El segundo fue dado por el sacerdote y biólogo italiano Pier Antonio Micheli, quien al ver la estructura reproductiva del hongo le pareció un hisopo de los usados para salpicar agua bendita. Estos, en latín, se llaman “aspergillus”,
sustantivo que proviene del verbo latino “spargere”, que significa “esparcir, salpicar”. El tercero se llama así ya que en griego “ρήιζω” es “raíz”, en referencia a las “raíces” de
este hongo. 3.
Por qué razón algunas colonias aisladas del medio ambiente no desarrollan esporas en el medio de cultivo utilizado
Porque el agar muchas veces satisface las necesidades nutritivas del hongo, por lo que este se extiende de manera vegetativa. Este comportamiento se puede entender considerando que la producción de esporas es un proceso altamente energético y de dispersión, por lo que mientras haya nutrientes necesarios y suficientes, se priorizará el crecimiento vegetativo.
CUESTIONARIO 2 1.
Cuál es la ventaja del empleo de la cámara húmeda en el estudio de los hongos
Permite aislar pequeñas cantidades de hongos para separarlos y proceder a su identificación a través de la observación de las estructuras vegetativas, que al ser pocas son más fáciles de observar; a la vez que se exigió el crecimiento de cuerpos fructíferos y las estructuras reproductivas se observaron con mayor claridad. 2.
¿Existen diferencias ente los hongos a nivel del crecimiento y diferenciación del micelio? Explique
Sí, ya que no solo se distinguen entre especies, si no que entre grupos se puede observar diferente tipo de colonización. Los basidiomicetos desarrollan la mayor complejidad al formar estructuras erguidas y altamente especializadas. Dependiendo de la estructura del micelio, se puede asignar el espécimen a un orden taxonómico.
BIBLIOGRAFIA
VITERI, I. 2004. Tecnologías de Manejo Integrado de Problemas Fitosanitarios que Afectan al Cultivo de Pimiento Morrón. Tesis de Grado. Universidad de Guayaquil. Ecuador. MADIGAN, T. 2003. MARTINKO, M. PARKER, J. Brock Biología de los Microorganismos. Décima edición. Pearson Prentice Hall. España. ALBRIGHT, D. 2001. Human health effects of airborne mycotoxins exposure in fungicontaminated indoor environment. National Institutes of health. ARENAS, R. 1993. Micología médica ilustrada. McGrraw Hill. México. BUTTNER, M. 1997. Sampling and analysis of airbone microorganisms. American society for Microbiology. Washington. GUZMAN, A.M. 1997. Laboratorio de microbiología clínica: diagnóstico de las enfermedades infecciosas. España. CUSTODIO, E. 1997. Factors Asociated with Leishmania Asymptomatic infection. SNELLER MR, R. 1979. Incidence of fungal spores at the homes of allergic patients in an agricultural community.
YANG, C. 1997. Manual of environmental microbiology. American society for Microbiology. Washington.
