UNALM Facultad de Industrias Alimentarias Análisis de Alimentos I.
INTRODUCCIÓN
En el análisis de alimentos existe un marcado interés por el control en la calidad de los alimentos, es así que para una determinación cuantitativa de los componentes en los alimentos y sus aditivos se suele utilizar la aplicación de la espectrofotometría, el cual mantiene como objetivo determinar la concentración del analito en una determinada muestra; para lo cual, por lo general, se requiere de una transformación química con reactivos
necesarios
para
obtener
productos
coloreados
que
se
medirán
fotométricamente en el intervalo de luz visible y existiendo casos también donde la medición es directa. (Nielsen 1998). La evaluación cuantitativa de la concentración de determinados componentes en disolución se basa en la ley de Lambert–Beer (aplicable solo en disoluciones diluidas, hasta aproximadamente 10 Mm, que de no ser así podría ser una de las causas de no obtener una linealidad entre la absorbancia y la concentración), en la cual las medidas se llevan a cabo con la longitud de onda en la cual se llega a presentar un máximo de absorción, siendo además generalmente primero la medición de la extinción de las disoluciones que contienen la sustancia a investigar en concentraciones exactas, las cuales son llamadas como disoluciones patrón o estándar para con esta llegar a construir la curva patrón, y así buscar la concentración del compuesto buscado de forma matemática o gráfica (realizándose las medidas frente a un blanco). Es así como se llega a registrar el control de las concentraciones de los diversos componentes en los productos alimenticios, resultando esta técnica de mucha utilidad. (Matissek et.al. 1998). El objetivo fue conocer algunos métodos de determinación espectrofotométrica para alimentos líquidos y sólidos, en el caso específico para la determinación del contenido de azúcares reductores por el método del DNS.
~1~ Práctica N°9: Espectrofotometría
UNALM Facultad de Industrias Alimentarias Análisis de Alimentos II.
REVISIÓN DE LITERATURA
El análisis químico puede definirse como el desarrollo de un análisis de rutina a una muestra conocida. La química analítica, sin embargo, es la aplicación del conocimiento químico y se encarga del perfeccionamiento de los métodos establecidos, de extender la aplicación de métodos existentes a nuevos tipos de muestras, y del desarrollo de nuevos métodos para la medición de los fenómenos químicos. (Harvey, citado por Flores 2011). 2.1. Teoría de la absorción La energía E de una radiación es proporcional a la frecuencia de esta: E = h.v Donde el factor de proporcionalidad h es el cuanto de acción de PLANCK. La frecuencia v, esto es, el número de oscilaciones por segundo, es inversamente proporcional a la longitud de onda de la radiación.
v=
c λ
Siendo c la velocidad de la luz. Sustituyendo esta fórmula en la anterior:
E=h . v=
h.c λ
Como h y c son constantes, la energía de una radiación es inversamente proporcional a su longitud de onda; cuanto más pequeña sea esta, mas energética es la radiación, y viceversa. La región ultravioleta del espectro se encuentra en el rango de 200 a 400 nm y la región visible de 400 a 800 nm. Las energías relacionadas a estas regiones son de 150 a 72 Kcal/mol y de 72 a 36 Kcal/mol respectivamente. Estas magnitudes normalmente corresponden a la diferencia de energía existente entre dos estados energéticos moleculares. Las transiciones electrónicas en las moléculas ocurren cuando energía de esta magnitud es absorbida por la molécula. Asimismo, la longitud de onda y la cantidad de energía que un compuesto absorbe depende de la estructura molecular y de la concentración del compuesto en mención respectivamente. (Settle, citado por Flores 2011). Absorción de luz significa captación de energía por la materia, y puede tener lugar de tres maneras:
~2~ Práctica N°9: Espectrofotometría
UNALM Facultad de Industrias Alimentarias Análisis de Alimentos -
Las moléculas entran en rotación. Partes de una molécula(es decir, átomos aislados o grupos atómicos) vibran unas
-
respecto de otras. Un electrón de un átomo o molécula es promovido a un nivel de energía superior. Expresado de una manera gráfica, significa esto que si se imagina un átomo o molécula a modo de un sistema planetario según la teoría de BOHR: un electrón experimenta una transición de una órbita electrónica más alejada del núcleo y de mayor energía. (Maier 1981).
2.2.
Espectrofotometría de absorción
Se basa en medición de transmitancia T o de la absorbancia A de soluciones que están en celdas transparentes que tienen una longitud de trayectoria de b cm. Normalmente, la concentración de un analito absorbente se relaciona en forma lineal con la absorbancia según la ley de Beer:
A=−logT =log
P° =εbc P
Por lo regular, la transmitancia y la absorbancia, no pueden medirse en el laboratorio porque la solución del analito debe estar en un recipiente o cubeta transparente. Como se muestra la figura 1, la reflexión se presenta en las dos interfases aire/pared del recipiente y en las dos interfases pared/solución. La atenuación del haz puede ocurrir como consecuencia de la dispersión del haz puede ocurrir como consecuencia de la dispersión causada por moléculas grandes y, a veces, porque lo absorben las paredes del recipiente. Para compensar todos estos efectos, la potencia del haz transmitido por la solución del analito se compara con la potencia del haz transmitido por una celda idéntica que contiene solo solvente. Skoog et al. (2008)
~3~ Práctica N°9: Espectrofotometría
UNALM Facultad de Industrias Alimentarias Análisis de Alimentos Figura 1: Perdidas por reflexión y dispersión con una solución que está en un recipiente típico de vidrio. Fuente: Skoog et al. (2008) Las pérdidas por reflexión que representan en todos los límites que separan los diversos materiales. En este ejemplo, la luz atraviesa las superficies de contacto airevidrio, vidrio-solución, solución-vidrio y vidrio-aire. Entonces la transmitancia y absorbancia experimentales que se aproximan de manera notable a la transmitancia y absorbancia verdaderas se obtiene mediante las siguientes ecuaciones
T=
P solucion P P solvente P° ≈ A=log ≈ log P solvente P ° P solucion P
2.2.1. Transmitancia Y Absorbancia En la figura 2, se ilustra un haz de radiación paralela antes y después de que ha pasado a través de un medio que tiene un espesor de b cm y una concentración c de una especie absorbente. Como consecuencia de las interacciones entre fotones y los átomos o las moléculas absorbentes. , la potencia del rayo se atenúa desde P0 a P. Al contrario que la transmitancia, la absorbancia de un medio aumenta cuando se incrementa la atenuación de un haz. Skoog et al. (2008)
Figura 2: Atenuación de un haz de radiación mediante una solución absorbente. Fuente: Skoog et al. (2008)
~4~ Práctica N°9: Espectrofotometría
UNALM Facultad de Industrias Alimentarias Análisis de Alimentos En el caso de la radiación monocromática, la absorbancia es directamente proporcional a la longitud b de la trayectoria a través de un medio y la concentración c de la especie absorbente. Esta relación se representa con:
A=abc Donde a es una constante de proporcionalidad que se llama absortividad. La magnitud de a depende de las unidades de b y c. Para soluciones de una especie absorbente, b esta con frecuencia en cm y c en gramos por litro. Entonces, las unidades de la absortividad son L.g-1 .cm-1. 2.3. Aparatos de medida Los aparatos más utilizados en la medida de absorción de luz son colorímetros (medida de la concentración de una sustancia coloreada por comparación con otra, generalmente por método visual), fotometría (medida comparativa de intensidades luminosas mediante atenuación variable de uno de los rayos o por transformación en energía eléctrica) y espectrometría (determinación cualitativa o cuantitativa en función de la longitud de onda). (Maier 1981). Esencialmente, todos los instrumentos son de construcción parecida, representada en la figura 3.
Figura 3: Componentes principales de instrumentos para medir absorción del luz. Fuente: Kirk et al. (1996) 2.3.1. Fuentes de radiación En colorímetros y fotómetros que operan en la región visible se utilizan como fuentes luminosas la luz solar, lámparas incandescentes o lámparas espectrales. Estas últimas son tubos de descarga en gases conteniendo un determinado elemento en forma gaseosa o de vapor (por ejemplo, Hg, Cd), que pueden exigir un calentamiento previo por una corriente transitoria. Este calentamiento previo puede evitarse si la lámpara contiene además un gas noble. En cualquier caso, deben observarse estrictamente las instrucciones de funcionamiento. Las fluctuaciones de tensión de la red pueden
~5~ Práctica N°9: Espectrofotometría
UNALM Facultad de Industrias Alimentarias Análisis de Alimentos ocasionar errores considerables en la medida (sobre todo con lámparas de incandescencia), a consecuencia del cambio en la estabilidad de luz emitida. En ocasiones, el estabilizador de tensión incorporado al instrumento debe precisar el concurso de otro estabilizador magnético o, mejor, electrónico previamente conectado. (Maier 1981). 2.3.2. Ajuste de intensidad La intensidad de la radiación que emite una fuente debe reducirse con arreglo a su potencia en el dominio espectral deseado, a la absorción en el portamuestras y a la sensibilidad del detector. Además, en los “métodos de sustitución” la absorción producida por la muestra en el rayo de medida es “sustituida” en el de comparación por un dispositivo de atenuación óptica. (Maier 1981). 2.3.3. Selección de longitudes de onda En general, las medidas de absorción conviene efectuarlas, a ser posible, con luz monocromática, esto es, luz de una sola longitud de onda, Dicha radiación puede obtenerse aproximadamente mediante monocromadores (prismas o redes), que separan la radiación continua (por ejemplo, de una cámara de incandescencia) en las longitudes de onda aisladas de una cuantía depende de su poder de resolución (Maier 1981). 2.3.4. Portamuestras Como portamuestras se usan cubetas, y como la limpieza juega un papel esencial en la corrección del análisis, deben manejarse aquellas con mucho cuidado. En el visible se emplean cubetas de vidrio (grabado: OS o nada), en el UV, cuarzo (grabado: QU). Las cubetas sucias (incluso películas superficiales invisibles de grasa pueden absorber fuertemente en el UV) se limpian con mezcla crómica (no con álcalis), se lavan brevemente con agua amoniacal al 0.5% y se enjuagan repetidas veces con agua destilada. En el llenado con la solución problema debe asegurarse la ausencia de burbujas de aire partículas de polvo. Las paredes exteriores de las ventanas se secan con un paño de lino limpio, gamuza o papel de filtro, y con otra gamuza seca se frotan hasta recuperar totalmente su brillo (el control se hace observando a través de ellas frente a un fondo oscuro). (Maier 1981). 2.3.5. Detectores En los métodos fotoeléctricos, la medida de la radiación se lleva a cabo con fotoelementos (región visibles), fotocélulas (para UV y visible),
fotomultiplicadores
(visibles y UV), fotorresistencias (en el visible de onda larga e infrarrojo de onda corta), termoelementos, termopilas, bolómetros o células GOLAY (todo para IR). Además,
~6~ Práctica N°9: Espectrofotometría
UNALM Facultad de Industrias Alimentarias Análisis de Alimentos pueden utilizarse placas fotográficas (ventajas: acción acumulativa de la radiación durante un tiempo cualquiera; favorables en el caso de intensidades muy pequeñas). (Maier 1981).
2.3.6. Instrumento indicador En los métodos fotoeléctricos se mide la fotocorriente (directamente o amplificada, con un galvanómetro, por ejemplo, galvanómetro de torsión, galvanómetro de espejo) o la caída de tensión a través de una resistencia elevada (con un electrómetro). Incluso con fotomultiplicadores suele aplicarse la corriente a fin de utilizar galvanómetros sencillos (indicadores). Normalmente, se considera que la fotocorriente producida por el detector (y, por tanto, la indicación en el instrumento) es proporcional a la intensidad de luz que incide sobre aquél. Esto no es estrictamente correcto, según el tipo de detector se cometen errores de 0.1-1.0%. A fin de excluir en lo posible tales errores, así como las oscilaciones de intensidad de la fuente luminosa, que pueden originar errores aún mayores, se han desarrollado distintos métodos de medida que más adelante serán brevemente considerados. Al mismo tiempo, se describirán, como ilustración, algunos aparatos y la forma de operar con ellos. (Maier 1981). 2.4.
Determinación de azúcares reductores totales por espectrofotometría
(Método de ácido dinitrosalicilico DNS) Los azucares reductores poseen un grupo carbonilo libre formando un grupo hemiacetal que le confiere la característica de poder reaccionar con otros compuestos. El método de Miller o DNS (ácido dinitrosalicilico) como reactivo tiene la capacidad de oxidar los azucares reductores mostrando un comportamiento diferencial hacia mono y disacáridos, dando resultados colorimétricos que se puede medir con una longitud de onda de 575 nm. (Cristancho y Monroy 2014). Según Southgate citado por Cristancho y Monroy (2014), en disolución alcalina el azúcar se hidroliza produciendo un compuesto que se reduce a un grupo nitro del DNS, para dar el producto monoamino correspondiente. Esta reacción da un producto colorido en solución alcalina
~7~ Práctica N°9: Espectrofotometría
UNALM Facultad de Industrias Alimentarias Análisis de Alimentos
III.
MATERIALES Y MÉTODOLOGÍA
3.1. MATERIALES: Muestras alimenticias: 1. Caramelos de limón. 2. Jugo de naranja. 3. Jugo de piña.
Figura 4:
Muestras
alimenticias Materiales de laboratorio: 1. Embudo Buchner. 2. Papel filtro. 3. Erlenmeyer. 4. Fiola.
Figura 5:
5. Kitasato. 6. Tubos de prueba. 7. Bomba de vacío. 8. Espectrofotómetro
Materiales de laboratorio
~8~ Práctica N°9: Espectrofotometría
UNALM Facultad de Industrias Alimentarias Análisis de Alimentos 3.2. REACTIVOS -
SOLUCIÓN DE DNS: Disolver 11 g de hidróxido de sodio, 10 g de DNS, 2 g de fenol y 0.5 g de bisulfito de sodio, llevar a un litro y conservar en refrigeración
-
en botella oscura. SAL DE ROCHELLE: Preparar una solución al 40% de tartrato de sodio y
-
potasio y refrigerar. SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE GLUCOSA: Preparar 6 soluciones entre 1.5 a
7.5 x 10−4
g de glucosa anhidra / 0.5 mL de solución.
3.3. PROCEDIMIENTO 3.3.1. Preparación de la curva estándar. 1. Se pesó aproximadamente 0.2 g de glucosa anhidra. 2. Se procedió a colocar dicha cantidad de glucosa anhidra en una fiola de 100ml, para posteriormente llegar a enrasar con agua destilada. 3. Luego, se procedió a tomar alícuotas de 7, 9, 11,14.5, 18 y 20 mL; colocándolas en fiolas de 25 mL para llevarlas a enrasar con agua destilada. 4. Se colocó, en tubos de prueba, 0.5 mL de la solución de glucosa obtenida en la etapa anterior, para adicionar 3mL de DNS y luego se llevó a calentar a ebullición por 5 minutos. 5. Posteriormente cumplido los 5 minutos del tiempo de ebullición, se adicionó 1 mL de sal de Rochelle seguido de 10 mL de agua destilada, y se agitó la disolución obtenida (se mezcló). 6. Se esperó a que enfríe a temperatura ambiente para luego proceder a la medición de la absorbancia en el espectrofotómetro con una lectura de longitud de onda de 550 nm. 7. Se realizó para realizar la curva estándar, tres repeticiones de cada solución, incluyéndose además la lectura de un blanco (agua destilada, el cual presentó una lectura de 0.42-0.43), para la corrección respectiva en la medición del espectrofotómetro; y se sometió la lectura de estos pun estos puntos obtenidos a un análisis de regresión lineal. 8. Se graficó la absorbancia, en el eje de las ordenadas versus la concentración, en el eje de las abscisas.
3.3.2. Análisis de las muestras. A. Caramelo de limón:
~9~ Práctica N°9: Espectrofotometría
UNALM Facultad de Industrias Alimentarias Análisis de Alimentos 1. Se trituraron 2 pastillas del caramelo de limón. 2. Se pesó aproximadamente 0.5 g de la muestra triturada y se diluyó en una fiola con 50 mL de agua destilada. 3. Luego, se procedió a tomar una alícuota de 1 mL de la disolución obtenida y 49 mL de agua destilada en una fiola de 50 mL, y otra alícuota de 1mL de la disolución con 99 mL de agua destilada en una fiola de 100 mL 4. Se colocó, en tubos de prueba 0.5 mL de la solución de glucosa obtenida en la etapa anterior, para adicionar 3mL de DNS y luego se llevó a calentar a ebullición por 5 minutos. 5. Posteriormente cumplido los 5 minutos del tiempo de ebullición, se adicionó 1 mL de sal de Rochelle seguido de 10 mL de agua destilada, y se agitó la disolución obtenida (se mezcló). 6. Se realizó los mismos procedimientos que las soluciones para la curva estándar B. Jugo de naranja: 1. Se diluyó 1 mL del jugo de naranja con 50 mL de agua destilada, dos repeticiones. 2. Se colocó, en tubos de prueba 0.5 mL de la solución de glucosa obtenida en la etapa anterior, para adicionar 3mL de DNS y luego se llevó a calentar a ebullición por 5 minutos. 3. Posteriormente cumplido los 5 minutos del tiempo de ebullición, se adicionó 1 mL de sal de Rochelle seguido de 10 mL de agua destilada, y se agitó la disolución obtenida (se mezcló). 4. Se realizó los mismos procedimientos que las soluciones para la curva estándar.
C. Jugo de piña. 1. Se diluyó 1 mL del jugo de naranja con 50 mL de agua destilada, dos repeticiones. 2. Se colocó, en tubos de prueba 0.5 mL de la solución de glucosa obtenida en la etapa anterior, para adicionar 3mL de DNS y luego se llevó a calentar a ebullición por 5 minutos.
~ 10 ~ Práctica N°9: Espectrofotometría
UNALM Facultad de Industrias Alimentarias Análisis de Alimentos 3. Posteriormente cumplido los 5 minutos del tiempo de ebullición, se adicionó 1 mL de sal de Rochelle seguido de 10 mL de agua destilada, y se agitó la disolución obtenida (se mezcló). 4. Se realizó los mismos procedimientos que las soluciones para la curva estándar. D. Jugo de caña de azúcar. 1. Se diluyó 1 mL del jugo de caña de azúcar con 50 mL de agua destilada, dos repeticiones. 2. Se colocó, en tubos de prueba 0.5 mL de la solución de glucosa obtenida en la etapa anterior, para adicionar 3mL de DNS y luego se llevó a calentar a ebullición por 5 minutos. 3. Posteriormente cumplido los 5 minutos del tiempo de ebullición, se adicionó 1 mL de sal de Rochelle seguido de 10 mL de agua destilada, y se agitó la disolución obtenida (se mezcló). 4. Se realizó los mismos procedimientos que las soluciones para la curva estándar.
IV.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
En el Cuadro 1 se presenta las distintas alícuotas tomadas de una disolución de 0.20056 g de glucosa anhidra en 100 mL de agua destilada cada una con sus respectivas concentraciones y absorbancias.
Cuadro 1: Concentraciones de glucosa y sus absorbancias (550 nm) usadas para la curva de calibración
~ 11 ~ Práctica N°9: Espectrofotometría
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Alícuota
Concentración
Absorbancia
(mL)
(g/mL)
R1
R2
R3
R4
7
0.000561568
0.169
0.164
0.174
-
9
0.000722016
0.392
0.389
0.375
0.382
11
0.000882464
0.482
0.476
0.452
0.486
14.5
0.001163248
0.644
0.466
0.582
0.645
18
0.001444032
0.868
0.927
0.819
0.819
20
0.00160448
0.647
0.637
0.672
-
En la Figura 1 se muestra la curva de calibración de la glucosa que sirve de referencia para la determinación de glucosa en las muestras a una longitud de onda de 550nm.
~ 12 ~ Práctica N°9: Espectrofotometría
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Figura 6: Curva de calibración o estándar de la glucosa
En el Cuadro 2 se presenta las distintas absorbancias de las muestras que con ayuda de la curva de calibración se obtienen las concentraciones finales de glucosa en cada una.
Cuadro 2: Absorbancias y concentraciones de las muestras Muestras
Absorbancias
Concentración (g/mL)
Concentración (g/ 100 mL)
Jugo de caña de azúcar
0.128
0.0002977
0.594
Jugo de piña
0.317
0.0006563
3.2815
Caramelo de limón
0.022
0.0000966
47.46
0.393
0.0008005
0.404
0.0008214
Jugo de naranja
4.1.
4.05475
Curva de Calibración
Según Vargas (2011) mediante un método que obedezca la ley de Beer‐Lambert se puede realizar un análisis cualitativo de cualquier especie en solución, conociendo por supuesto la longitud de onda de máxima absorbancia del analito, esto por medio de la determinación de la absorbancia en función de soluciones de concentración conocida a través de la elaboración de una curva de calibración que las relacione de manera proporcional y linealmente, para lo que se requiere de un método estadístico. El método estadístico clásico y que se adecua a las características para la realización de dicha actividad es el de los Mínimos Cuadrados en los que se grafica la ordenada independiente) con los datos de la respuesta del aparato y
(la
variable
la abscisa
(variable dependiente) en donde se coloca la concentración o el tanto por ciento del analito, lo más habitual (y deseable) es que la gráfica se aproxime a
~ 13 ~ Práctica N°9: Espectrofotometría
UNALM Facultad de Industrias Alimentarias Análisis de Alimentos una línea recta, sin embargo puede darse el caso de que los valores no coincidan en una recta debido a errores aleatorios del proceso de medida, el método de los mínimos cuadrados nos sirve para intentar ajustar la “mejor” línea recta que conecte los puntos. Skoog et al. (2001) menciona que la linealidad del método se observa en la figura 2, la cual es la función de la concentración con absorción; calculada a partir de la ecuación de la regresión lineal determinada por el método de los mínimos cuadrados. El coeficiente de correlación lineal es usado para indicar cuánto puede ser considerada adecuada la recta como modelo matemático.
Figura 2: Absorbancia vs Concentración Fuente: Skoog et al. (2001)
Harris (2007) menciona que en un análisis cuantitativo: 1. Las medidas más fiables de absorbancia son entre 0.4 y 0.9. Si la absorbancia es menor, la potencia radiante que atraviesa la muestra es parecida a la que atraviesa a la referencia, y la incertidumbre relativa de la diferencia entre estos dos números sería grande. Si la absorbancia es alta, llega poca luz al detector y disminuye la relación señal a ruido. 2. Se debe medir la absorbancia en un pico o en un hombro donde dA/dƛ sea pequeña. 3. La anchura de banda del monocromador debe ser tan grande como sea posible, pero pequeña comparada con la banda que se quiere medir.
4.2.
Jugo de caña de azúcar
~ 14 ~ Práctica N°9: Espectrofotometría
UNALM Facultad de Industrias Alimentarias Análisis de Alimentos El porcentaje de glucosa experimental en el jugo de caña fue de 0.594 %, dicho valor no coincide con lo expuesto por Aguirre y Poveda (2001), los cuales mencionan que los azúcares más simples como la Glucosa y Fructosa existen en el jugo de caña con un grado avanzado de madurez en una concentración entre 1% y 5%, además la calidad del jugo depende en buena parte de la proporción de estos Azúcares Reductores, los cuales cuando aumentan por causa del deterioro o la inmadurez de la planta, pueden producir incrementos en el color y variación en el color. Dicho porcentaje, también coincide con Larrahondo (1995), el cual menciona que la celulosa está formado por azúcares sencillos como la glucosa y que el contenido porcentual, se le denomina comúnmente como Brix, y que se encuentra en una concentración de 2% a 5 %. Por otro lado, según Bello et al. (2006), el método del DNS no es recomendable utilizarlo para la determinación de azúcares reductores en muestras intensamente coloreadas, sin embargo en el jugo de caña si es posible, adicionalmente dice que puede variar de 0.9 a 1.2, por lo que estos valores, serían los más próximos al resultado experimental y totalmente diferentes a lo mencionado por los otros dos autores anteriores. Es posible que la cantidad de glucosa teórico de la caña de azúcar no coincida con el experimental, debido a que hubo errores del personal en el momento de realizar la práctica o también mal manejo de los reactivos.
4.3.
Jugo de Piña
El valor de azúcares reductores representados por el porcentaje de glucosa obtenido fue de 3.2815 g por 100 mL de jugo de piña teniendo relación con lo mencionado por Úbeda (2012) donde indica que el porcentaje de glucosa en el jugo de piña es de 2.60 g/100 mL de jugo. Aunque el contenido de glucosa es cercano tiene diferencias significativas esto puede ser debido a que la absorbancia es pequeña (0.317) y se encuentra en un intervalo de error del espectrofotómetro. Según Harris (2007) la mayoría de los espectrofotómetros presentan un mínimo de incertidumbre relativa a valores intermedios de absorbancia (A= 0.4 - 0.9). Si pasa poca luz por la muestra (gran absorbancia), es difícil medir la intensidad. Si pasa demasiada luz (baja absorbancia), es difícil apreciar la diferencia entre la muestra y la referencia.
~ 15 ~ Práctica N°9: Espectrofotometría
UNALM Facultad de Industrias Alimentarias Análisis de Alimentos
4.4.
Caramelo de Limón
Según Gil (2010) los caramelos son masa cristalinas obtenidas por concentración de glucosa o mezcla de azúcar/jarabe de glucosa en un porcentaje mínimo del 50%. En el caso del caramelo de limón el porcentaje obtenido es próximo siendo 47,46% además esta cantidad indica el porcentaje de azúcares reductores presentes en la muestra. El porcentaje determinado tiene gran concordancia con lo sugerido por Malagón (2007) donde menciona que la cantidad de azúcares reductores en porcentaje de glucosa en un caramelo es de 48% teniendo un resultado sin un error significativo aunque las posibles diferencias obtenidas pueden haber sido provocadas por un mal manejo del equipo o en la calibración del blanco.
4.5.
Jugo de Naranja
En la práctica realizada se obtuvo que 100 ml de jugo de naranja contienen 4.05475 g de azúcares reductores, esto se asemeja a lo investigado por Hours et al. (2005) quienes encontraron que en el zumo de naranja el contenido de azúcares reductores es de 4.0 ± 0.5 g en 100ml con el método de la AOAC 31.034; esa cantidad, se encuentra en los límites establecidos por el autor, por lo que hubo influencia del grado de madurez. Así mismo para Úbeda (2012) los resultados del contenido de azúcares reductores fueron de 5 g en 100ml de zumo de naranja con el método de cromatografía líquida de intercambio aniónico con detección amperométrica de pulsos (HPAEC) con un cromatógrafo Metrohm, comprobando así que no se cometió error en la práctica.
~ 16 ~ Práctica N°9: Espectrofotometría
UNALM Facultad de Industrias Alimentarias Análisis de Alimentos Otra causa de la mínima diferencia de resultados respecto a Úbeda (2012) se puede atribuir a la calidad de la sal de Rochelle; ya que si esta se encuentra en mal estado ya sea por vencimiento o algún fenómeno fisicoquímico que haya experimentado no podrá evitar la reacción del DNS con el oxígeno disuelto impidiendo la estabilidad del color y provocando interferencia en la lectura del espectrofotómetro (Ratsimbal et al. 1999).
V.
CONCLUSIONES
Los valores obtenidos de las concentraciones de glucosa por el método DNS y espectrofotometría resultaron respectivamente de 0.594, 3.2815, 47.46 y 4.05475. Siendo la concentración de la muestra de jugo de piña, caramelo de limón y jugo de naranja como los valores que más se acercaron a los valores referenciales. El caramelo de limón presentó una mayor concentración de glucosa (azúcar reductor) en comparación con las demás muestras. La linealidad en una gráfica absorbancia – concentración de la Ley de Beer
es
efectiva
mayormente
en
disoluciones
diluidas
aproximadamente 10 mM.
~ 17 ~ Práctica N°9: Espectrofotometría
hasta
UNALM Facultad de Industrias Alimentarias Análisis de Alimentos Los reactivos que pasaron de la fecha de vencimiento afectan los datos requeridos por calcular. (Por ejemplo una sal de Rochelle en mal estado, llegaría a impedir que se dé la reacción del DNS con el oxígeno, lo cual a su vez generaría distorsiones con el paso de la luz en la disolución efectuada).
VI. BIBLIOOGRAFÍA AGUIRRE, M. POVEDA, C. 2001. Jugo de Caña de Azúcar envasado en Vidrio.
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AOAC. 2005. Official Methods of Analysis. 20 edition. Association of Official Analytical Chemist. Arlington, Va., U.S.A.
BELLO, D. BOCOURT, E. DÍAZ, Y. 2006. Determinación de azúcares reductores totales en jugos mezclados de caña de azúcar utilizando el método del ácido 3,5 dinitrosalicílico. 40 (2): 45- 50 p.
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102 p. GIL, A. 2010. Tratado de Nutrición. 2° Edición. Editorial Médica Panamericana. Madrid, España. 243 p.
~ 18 ~ Práctica N°9: Espectrofotometría
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HARRIS, D. 2007. Análisis cuantitativo Químico. 3° Edición. Editorial
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de naranja destinados a vinificación. Argentina. 127 p. KIRK, R. SAWYER, R. EGAN, H. 1996. Composición y Análisis de Alimentos de Pearson. 2 ed. Compañía editorial Continental S.A. de C.V.
México. 600 p. LARRAHONDO,
57 (2): 337-354 p. MAIER, H. 1981. Métodos modernos de análisis de alimentos. Tomo I.
Editorial Acribia. Zaragoza. España. MALAGÓN, D. 2007. Estandarización y validación de formulaciones base
J.
1995.
Calidad
de
la
Caña
de
Azúcar.
para confitería en caramelo duro y blando para la aplicación de agentes saborizantes en Disaromas Sa. Tesis Ing. Bogotá, Colombia. Universidad
de La Salle. 75 p. MATISSEK, R. SCHNEPEL, F. STEINER, G. 1998. Análisis de los Alimentos. Fundamentos - Métodos - Aplicaciones. Editorial Acribia, S.A.
Zaragoza. España. 354 -356 p. NIELSEN, S. 1998. Food Análisis. Segunda edición. Aspen Publishers,
INC. Marylan. USA . 443-450 p. RATSIMBA, V. GARCIA, J. DEFAYE, J. NIGAY, H. VOILLEY, A. 1999. Qualitative and quantitative evaluation of mono and disaccharides in Dfructose, D-glucose and sucrose caramels by gas-liquid chromatographymass spectrometry Di-D-fructose dianhydrides as tracers of caramel
authenticity. J. Chromatogr. 844, 283-293 p SKOOG, D. HOLLER, A. NIEMAN, T. 2001. Principios de Análisis
Instrumental. 5ta Edición, Editorial McGraw‐Hill, México. 1028 pp. SKOOG, D; HOLLER, F; CROUCH, S. 2008. Principios de Análisis
Instrumental. 6° ed. Editorial Cengage Learning. México. 336-340 p. ÚBEDA, A. 2012. Análisis del perfil de azúcares en la autentificación de
zumos de frutas. Universidad Politécnica de Cartagena. 25, 45 p. VARGAS, A. 2011. Curvas de Calibración y Método Estadístico de Mínimos
Cuadrados
Relacionados
a
Contaminantes
de
Aguas
Residuales. Tesis Magister. Ciudad de México, México. Universidad Nacional Autónoma de México. 45 p.
~ 19 ~ Práctica N°9: Espectrofotometría
UNALM Facultad de Industrias Alimentarias Análisis de Alimentos
VII.
ANEXO
AOAC Método Oficial 955.39 Color total en aditivos de color Método Espectrofotométrico Primera Acción 1934 Acción final 1960
A. Aparatos (a). Espectrofotómetro.- Para la medición precisa de la absorbancia en la región 400 - 750 nm; preferiblemente con ancho de ranura efectiva de <10 nm. (b) Dos o más celdas de absorción emparejadas B. Reactivos (a). Estándar del colorante a determinar.- Los estándares deben ser cuidadosamente preparadas y de la mayor pureza alcanzable. El contenido de colorante puro de los estándares debe ser conocido con precisión para obtener resultados cuantitativos. (b).
Solventes.- Libre de materia en suspensión.
C. Estandarización Preparar una serie de soluciones de concentraciones conocidas de patrón y determinar la A (absorbancia) de soluciones, corregir la A debida al disolvente ya la célula, a la longitud de onda adecuada. (Longitud de onda en la que la A es máxima.) Ajustar las concentraciones de las soluciones para obtener valores de A de 0,4 - 1,0 con el instrumento y las células utilizadas. Trazar o tabular los datos obtenidos.
~ 20 ~ Práctica N°9: Espectrofotometría
UNALM Facultad de Industrias Alimentarias Análisis de Alimentos D. Determinación Preparar la solución de ensayo en disolvente utilizado en la normalización. (La solución debe ser de tal concentración que la A obtenida esté dentro del rango cubierto por las normas examinadas). Determinar la A de esta solución de ensayo en las mismas condiciones utilizadas en la estandarización. Calcular el contenido total de color de la muestra de ensayo de la absorbancia de la solución de ensayo y la A’ de la solución patrón: Total color = (A/concentración de la solución de prueba) (concentración de la solución estándar/A’) x pureza del estándar Si la línea recta no resulta cuando se trazan los datos de absorbancia y concentración obtenidos del examen de la solución estándar, es decir, si la ley de Beer no se cumple, determine la concentración de solución "desconocida" en comparación con los datos obtenidos a partir de una solución conocida de concentración casi igual. Fuente: AOAC (2005)
~ 21 ~ Práctica N°9: Espectrofotometría