1. Objetivo y campo de aplicación En esta práctica se identificarán y cuantificarán los componentes mayoritarios mayoritarios (eugenol, β-cariofileno y acetato de eugenilo) de aceite esencial de clavo (Syzygyum aromaticum) por cromatografía gaseosa (GC) utilizando una columna capilar con una fase estacionaria adecuada.
2. Marco teórico. Aceites esenciales Los aceites esenciales son las fracciones volátiles, generalmente destilables por arrastre con vapor de agua, que contienen las sustancias responsables del aroma de las plantas y que son importantes en la industria cosmética (perfumes y aromatizantes), de alimentos (condimentos y saborizantes) y farmacéutica (aromatizantes, saborizantes, fitoterápicos, otras aplicaciones). Los aceites esenciales son mezclas complejas tanto desde el punto de vista cualitativo como cuantitativo. En todos los aceites esenciales se encuentra un número elevado de componentes individuales pertenecientes a diferentes clases de grupos funcionales. Los más importantes pertenecen a dos grupos de metabolitos secundarios: los terpenos y los fenilpropanos. En pocos casos los aromas se deben a compuestos alifáticos que pueden ser alcoholes, aldehídos, cetonas, éteres y/o ésteres. Entre los terpenos predominan los monoterpenos, de formula general C10H16, los sesquiterpenos de formula general C15H24, y los derivados oxigenados de ambos grupos, por ejemplo, alcoholes, aldehídos, cetonas y ésteres. Generalmente estos derivados oxigenados son los responsables del aroma característico del aceite esencial. Los fenilpropanos se caracterizan por tener un anillo aromático unido a una cadena lineal de 3 carbonos. Derivan biosintéticamente del ácido shikímico. El anillo aromático puede estar sustituido en las posiciones 3, 4 y 5 de anillo por grupos hidroxilo, metoxilo o metilendioxilo. En el siguiente cuadro se expresan los principales componentes que presentan los aceites esenciales, relacionando las propiedades terapéuticas con los grupos funcionales que constituyen las mismas.
Cuadro 1. Principales componentes de los aceites esenciales Propiedades terapéutica y su relación con grupos funcionales. Propiedades Nombre vulgar Principio activo. Estimulantes, Tomillos, mejoranas, Timol, carvacrol, FENOLES bactericidas, fungicidas oréganos, albahacas, eugenol, mentol, viridicidas, parasiticidas clavo de olor, ajedreas. borneol, thujanol. inmunomodu-lantes. DERIVADOS DEL Estipulantes, Canelas, Aldehído cinámico, FENILPROPANO antisépticos clavo,albahaca, anís, metileugenol,metil antiespasmódicos. nuez moscada. chavicol, anetol, miristicina. CETONAS Citofiláctico mucolítico Eucalyptus, mentas, Pinocarvona, pulegona, cicatrizante. hissopus decumbens, verbenona, thujona romero a cineol mentona carvona. ALDEHÍDOS Sedantes antisépticos. Lemongrass,citronela,p Citral: neralalmarosa,May Chang citronenelal, neral, geranial. Alcoholes Energizantes, Lavandas, lavandines, Linalol, citronelol, (Monoterpénicos y vigorizantes, petit grain, palo rosa, piperitol, mentrol, sesquiterpénicos) antimicrobianos, coriandro, rosa Otto, cedrol, lavandulol, antivirales, diuréticos. eucaliptos, sándalo, nerolidol, globulol, cedros. santolol. Sedantes, Manzanilla romana, Acetato de ÉSTERES antiespasmódicos, lavanda verdadera, camazuleno, acetato antifúngicos. salvia sclarea. de linalilo, de geralino. XIDOS expectorantes Eucalyptus globulus, 1.8 cineol, linalol-óxido, laurus nobilis bisabolóxido, safrol. Hissopus decumbens Vigorizantes, Limón, naranja, cedros, Limoneno, alfa-pineno, HIDROCARBUROS TERPÉNICOS bactericidas,antivirales, bergamota, pimienta canfeno, pinenos. diuréticos. negra, pinos, nuez moscada, angélica. Manzanilla alemana Camazuleno SESQUITERPENOS Sedantes, antiinflamatorio, Rosa Otto Clavo de singibereno, bacteriostáticos, olor Farneseno, bisaboleno beta cariofileno. dermatofílicos, antivirales.
Extraído de Romero, D. (2004) Plantas aromáticas: Tratado de aromaterapia científica. ° Los componentes más importantes del aceite esencial son eugenol, acetato de eugenilo y β-cariofileno. Pueden ser diferenciados entre sí por TLC (utilizando CH2Cl2/Hexano 7:3 como fase móvil) y por GC. El aceite utilizado en esta práctica se obtuvo por destilación por arrastre con vapor (esto se debe porque muchos componentes de los aceites esenciales son volátiles con el vapor y pueden ser aislados por dicha destilación), durante 2 horas. Se utiliza 35 g de botones florales ya que los componentes de los aceites esenciales se encuentran a
menudo en las glándulas o espacios intercelulares en el tejido de las plantas. A menudo se concentran en semillas, flores hojas o frutos, como es en este caso. El
aceite
obtenido se separa y se seca con MgSO4 anhidro.
Clavo de olor El material conocido como “clavo de olor” está constituido por los botones florales desecados de Syzygium aromaticum (L.)Merr. et Perry. Originario de las Molucas y de las Filipinas, en la actualidad el clavero se cultiva en muchos países tropicales. El clavo posee una cantidad importante de aceite esencial (15-20%), rico en eugenol (80-85%), acetato de eugenilo y β-cariofileno. El clavo también contiene componentes no volátiles como taninos (10-13%), mucílagos y fitosteroles (sitosterol, estigmasterol y campfesterol). El clavo se utiliza principalmente como especia y su aceite esencial posee notables propiedades antibacterianas y se utiliza como antiséptico en odontología. El clavo, además de ser usado como aromático, también se usa asociado a otras drogas, como carminativo, estomacal y tónico. Tiene una acción irritante sobre las mucosas. Posee potencial efecto excitante sobre el sistema nervioso (en dosis extraterapéuticas puede ser neurotóxico).
Eugenol El aceite de clavos es rico en eugenol (4-alil-2metoxi-fenol). Es el responsable de la mayor parte del aroma característico de los clavos, es el componente mayoritario comprendiendo el 7090% del aceite esencial extraído del aceite del clavo de olor, es un fenilpropanoide derivado de la ruta del del ácido shíkímico. Es un fenol o un compuesto hidroxiaromático. Tiene un punto de ebullición 250 -253°C. Aspecto tomado en cuanta para la CG Es utilizando ampliamente en odontología como un sellador endodóntico a base de oxido de cinc y eugenol con propiedades de acción antibacteriana, evitando la formación de microorganismos, actúan contra las bacterias que puedan persistir después de la preparación del conducto redicular. Este efecto disminuye en grado considerable luego del endurecimiento. β-Cariofileno
El cariofileno fórmula molecular C 15H24, con punto de
ebullición 254 -257°C, es un sesquiterpeno bicíclico que se encuentra en los aceites de clavo de olor, pimienta negro y muchos otros. Es insoluble en agua, un líquido incoloro a amarillento ligeramente que contiene 88,16% de carbono y 11,84% de hidrógeno. Huele de madera, picante, y se produce en la naturaleza como una mezcla de isómeros isocariofileno, alfa-cariofileno (humuleno) y beta-cariofileno. También se destaca por presentar un anillo de ciclobutano. Es sintetizado en 1964 po Ej Corey, la cariofileno se describe en la literatura como anti-edémico, anti-inflamatoria, anti-tumoral, anti-alérgica, bactericida y repelente.
Obtención extracto de clavo en hexano Para la obtención del extracto de clavo, es seleccionada la técnica de extracción con solventes volátiles. Esta técnica se basa en la facilidad de los disolventes orgánicos para penetrar en el material vegetal y disolver sus aceites volátiles, debido a las diferencias de punto de ebullición entre el aceite esencial y el solvente. Tiene la ventaja de trabajar a temperaturas bajas, por lo que no provoca la termodestrucción ni alteración química de los componentes del aceite. Además ofrece la posibilidad de separar componentes individuales y/o presentes en poca cantidad.
CROMATOGRAFÍA. La cromatografía es una técnica de análisis químico que agrupa un conjunto importante y diverso de métodos que facilita la separación, identificación y determinación de componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas. La IUPAC define a la cromatografía como un método físico de separación en el cual los componentes a ser separados se distribuyen entre 2 fases, una de las cuales es la fase estacionaria mientras que la otra (fase móvil) se mueve en una dirección definida. La cromatografía implica un potente método de separación con amplias aplicaciones en todas las ramas de la ciencia. “Tal honor debe recaer en el botánico ruso Михаи ́л Семёнович Цвет (Mijaíl Semiónovich Tswett [también Tsvett, Tswet, Zwet, Cvet]) (1872-1919), quien en 1903 empleó una fase inmóvil de polvo de tiza (carbonato de calcio) y una fase móvil de disulfuro de carbono para separar los pigmentos vegetales que estaba estudiando. Se le ocurrió introducir la tiza en una columna y luego hizo pasar por ella los extractos vegetales que contenían los pigmentos que deseaba purificar (clorofilas [verdes], carotenoides [naranjas] y xantofilas [amarillos]). Observó que se podían separar muy bien los colores (pigmentos) en forma de anillos a lo largo de la columna, pero no
bautizó aún la técnica con ningún nombre en el artículo que publicó en ruso al respecto. Utilizó por primera vez el término cromatografía, del griego χρῶμα, -ατος (croma, -atos) «color» y -γραφία (-graphia) «escritura», que quiere decir «escritura en colores», en 1906, en el segundo artículo que ese año envió a la Berichte der Deutschen Botanischen Gesells-chaft (Revista de la Sociedad Botánica Alemana). Su propuesta fue (traducida al inglés1)”. Básicamente, la separación de los componentes por una cromatografía consiste en la afinidad que un compuesto puede presentar frente a otro. La muestra se disuelve con una Fase Móvil (gas, líquido o fluido supercrítico), se hace pasar a través de una Fase Estacionaria (inmiscible) fija en una columna o en una superficie sólida. ¿Cómo separar los componentes? El método de separación cromatográfico, independientemente de su estructura y su complejidad, está constituido por una fase estacionaria y una fase móvil. La muestra (que contiene los componentes a separar) se disuelve en la fase móvil (que puede ser un gas, un líquido o un fluido súper crítico) la cual se hace pasar a través de una fase estacionaria inmiscible fija en una columna o en una superficie sólida. Para que el trayecto de la fase móvil por la fase estacionaria produzca una separación de componentes, uno de los componentes que se desea separar deberá tener un grado relativo de afinidad con la sustancia que conforma la fase estacionaria. De esta manera, a media que la fase móvil se desplaza por la fase estacionaria, los componentes tendrán diferente tiempo de migración debido a las diferentes interacciones que estos componentes presenten con la fase estacionaria. Es decir, el componente más afín a la fase estacionaria se desplazará más lento y los compuestos menos afines se moverán más rápido por la columna o superficie. Como consecuencia de las distintas velocidades de migración, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas distintas que se puede analizar en forma cualitativa y cuantitativa. Básicamente, la clave de separación de componentes en una cromatografía se basa en los diferentes grados de afinidad y relacionamiento que pueden presentar los componentes de la mezcla con la fase estacionaria. Para que la separación sea fructífera, la selección de fase estacionaria y fase móvil deberán ser muy bien pensadas. Conociendo la estructura molecular del componente a separar se deberá elegir de forma que los componentes de la muestra se distribuyan diferenciadamente entre ambas fases
. En general se puede describir que los componentes más retenidos por la F.E. se mueven con más lentitud con el flujo de F.M. por tanto, aquellos unidos débilmente, se mueven con mayor rapidez.
Clasificación de los métodos cromatográficos. Los métodos cromatográficos se pueden clasificar de dos maneras. Según los medios físicos por los cuales las fases estacionaria y móvil se ponen en contacto y según los tipos de fase móvil y fase estacionaria empleados. Teniendo en cuenta la primera clasificación podemos
distinguir dos tipos de
cromatografías: la de columna y en plano o capa fina. En la cromatografía en columna, un tubo estrecho contiene la fase estacionaria a través de la cual la fase móvil se fuerza a pasar por presión. En la cromatografía en plano, la fase estacionaria se fija sobre una placa plana o en los intersticios de un papel; en este caso la fase móvil se desplaza a través de la fase estacionaria por capilaridad o por gravedad. Para la segunda clasificación, el tipo de fase móvil y fase estacionaria, se aprecian tres tipos de cromatografías: cromatografía de gases (CG), cromatografía de líquidos (CL) y cromatografía de fluidos súper crítico (CFS). Cualquiera de estos tres tipos de cromatografías llevan el nombre del estado en el cual se encuentra la fase móvil. Esto quiere decir que en una cromatografía puede realizarse con una fase móvil gaseosa, líquida o con la utilización de un fluido súper crítico, como se había mencionado antes. Para la ejecución de estos tres tipos de cromatografía se hace uso de una columna. Solamente la cromatografía en líquido se puede llevarse a cabo tanto en una columna como en una superficie plana si se lo desea.
FIGURA 1 CROMATOGRAFÍA DE ELUCIÓN EN COLUMNA
En la cromatografía de elución en columna, las diferencias en dichas velocidades, hacen que los componentes se separen en bandas. Es importante pasar por la columna suficiente cantidad de FM para que dichos analitos sean eluídos y detectados. El tamaño de la banda original que contiene al analito siempre es más pequeño que cualquiera de las que llega al detector, debido al producto de la dilución, por lo que es importante que siempre sea acompañada esta técnica con la separación cromatográfica.
CROMATOGRAMAS Al final de la columna se coloca un
detector
que
responde
a
la
concentración del soluto y se registra su señal en función del tiempo, o del volumen de fase móvil añadido, se obtiene una serie de picos como se muestra en la parte inferior de la figura 1. Este gráfico denominado cromatograma, es útil tanto para los análisis cualitativos como cuantitativos. La posición de los picos en el eje del tiempo puede servir para identificar los componentes de la muestra; las áreas bajo los picos proporcionan una
medida cuantitativa de la cantidad de cada componente.
VELOCIDADES DE MIGRACIÓN DE LOS SOLUTOS La eficacia de una columna cromatográfica para separar dos solutos depende en parte de las velocidades relativas con las que se lavan o se purifican las dos especies. Esas velocidades están determinadas por la magnitud de las constantes de equilibrio para las reacciones mediante las cuales los solutos se distribuyen entre las fases estacionaria y móvil. Para A, el equilibrio de distribución se puede escribir: Donde la constante de distribución de equilibrio Kc (constante de distribución) es:
Tempo de retención Aunque la constante de distribución es fundamental para las separaciones cromatográficas, no se puede medir con facilidad. En cambio, es factible medir la cantidad llamada tiempo de retención que es una función de Kc.
El factor de selectividad α de una columna para los dos analitos A y B se define como:
α KB/KA
Siendo KB la constante de distribución para la especie más fuertemente retenida B y KA la constante para la especie menos retenida (A)
ENSANCHAMIENTO DE BANDA Y EFICIENCIA DE LA COLUMNA La eficiencia de una columna cromatográfica se ve afectada por la cantidad de ensanchamiento de banda que ocurre a medida que un compuesto pasa por la columna. Las razones por las cuales las bandas se ensanchan mientras bajan por la columna se detallan a continuación. El ensanchamiento de una zona aumenta a medida que desciende por la columna porque ha habido más tiempo para que haya dispersión. Entonces, el ensanchamiento de la zona está relacionado de manera directa con el tiempo de residencia en la columna y de manera inversa con la velocidad de flujo de la fase móvil.
Descripción cuantitativa de la eficiencia de la columna Dos términos afines se utilizan ampliamente como medidas cuantitativas de la eficiencia de una columna cromatográfica: 1) la altura de plato H 2) el número de platos o cantidad teórica de platos, N. Los dos están relacionados por la ecuación: N= L / H donde L es la longitud (cm) del relleno de la columna. La eficiencia de la columna aumenta, cuanto mayor es el número de platos N y cuanto menor es la altura H del plato Las eficiencias en términos del número de platos varían desde pocos cientos a varios cientos de miles; son frecuentes las alturas de plato que oscilan desde unas pocas décimas hasta una milésima de centímetro o menos. El origen de los términos “altura de plato” y “cantidad de platos teóricos” proviene de uno de los primeros estudios teóricos realizado por Martin y Synge en que trataron a una columna cromatográfica como si fuera similar a una columna de destilación que estuviera constituida por numerosas capas angostas, o platos, distintos pero contiguos, a las que denominaron platos teóricos. Se suponía que en cada plato se establecía el equilibrio de la especie entre las fases móvil y estacionaria. El descenso del soluto por la columna se trataba entonces como una transferencia por etapas de fase móvil equilibrada de un plato al siguiente. La teoría del plato explica de manera satisfactoria la forma gaussiana de los picos cromatográficos y su velocidad de desplazamiento por la columna. Pero la teoría se abandonó en favor de la teoría de la velocidad, debido a que la primera fallaba al intentar justificar el ensanchamiento de los picos de una manera mecanicista. No obstante, los términos originales para la eficiencia se han incorporado a la teoría de velocidad. Esto
nomenclatura es tal vez desafortunada porque tiende a perpetuar el mito de que una columna contiene platos donde hay condiciones de equilibrio. De hecho, el estado de equilibrio nunca se puede alcanzar con la fase móvil en movimiento constante.
La anchura de una curva gaussiana está directamente relacionada con su desviación estándar σ o su varianza σ2. A menudo se supone que las bandas cromatográficas
tienen
una
forma
gaussiana, lo cual es conveniente para definir la eficiencia de una columna en términos de la varianza por unidad de longitud de la columna. Es decir, la altura de plato H viene dada por :
CROMATOGRAFÍA GASEOSA Existen dos tipos de cromatografía de gases: la cromatografía gas-líquido (CGL) y la cromatografía gassólido (CGS). La primera tiene gran aplicación en todos los campos de la ciencia; su denominación se suele abreviar a cromatografía de gases (CG).1 La segunda se basa en una fase estacionaria sólida en que la retención de los analitos ocurre porque hay adsorción. Su aplicación es limitada debido a la retención semiper-manente de las moléculas activas o polares y a la obtención de picos de elución con colas muy notables. La formación de las colas es resultado de la naturaleza no lineal del proceso de adsorción. Por tanto, esta técnica no ha encontrado una gran aplicación excepto para la separación de ciertas especies gaseosas de bajo peso molecular. En la cromatografía gas-líquido el analito se divide entre una fase móvil gaseosa y una fase líquida inmovilizada sobre la superficie de un relleno sólido inerte o en las paredes de un tubo capilar. El concepto de cromatografía gas-líquido fue enunciado por primera vez en 1941 por Martin y Synge, quienes también perfeccionaron la cromatografía de distribución líquido-líquido.
La instrumentación en cromatografía de gas consiste en:
Sistema de gas portador En la cromatografía de gases la fase móvil se llama gas portador y debe ser químicamente inerte. El helio es el gas para fase móvil más común, pero también se usan argón, nitrógeno e hidrógeno. Estos gases se surten en recipientes a presión. Se requieren reguladores de presión, manómetros y medidores de flujo para controlar la corriente del gas. Además, el sistema del gas portador contiene a menudo un tamiz molecular para eliminar el agua y otras impurezas. Los flujos se controlan mediante un regulador de presión de dos etapas colocado en el cilindro de gas y algún tipo de regulador de presión o de flujo instalado en el cromatógrafo. Las presiones de entrada normalmente oscilan entre 10 y 50 psi (lb/in.2) por encima de la presión del entorno, lo que ocasiona flujos de 25 a 150 mL /min con columnas empacadas y de 1 a 25mL /min en las columnas de capilares tubulares. Por lo general se supone que los flujos son constantes si la presión de entrada permanece constante. Los flujos se establecen mediante un rotámetro situado en la cabeza. de la columna; sin embargo, este dispositivo no es tan exacto como el simple flujómetro de pompas de jabón Es importante tener presente los requisitos que debe cumplirse para el gas portador (gas carrier): este debe ser INERTE, no debe interferir con la muestra, fase estacionaria o superficies del instrumento. A de ser PURO, debe estar exento de impurezas que puedan degradar la fase estacionaria y NULA (o escasa) solubilidad en la fase estacionaria.
Sistema de inyección de la muestra Con el fin de tener una alta eficiencia de la columna se requiere que la muestra sea de un tamaño adecuado y que se introduzca como un “tapón” de vapor; la inyección lenta o muestras demasiado grandes causan dispersión de las bandas y una mala resolución. Por tanto, es una parte fundamental del instrumento ya que se debe asegurar que la muestra ingresa de forma adecuada a la columna. Para ello, se utilizan microjeringas para introducir la muestra líquida (0,1 – 20μL), la jeringa atraviesa un septo de goma y se introduce en el “liner”. El inyector está a una temperatura mayor que el punto de ebullición del componente menos volátil de la muestra, para no modificar la misma o descomponerla. Cuando se utilizan columnas capilares, los volúmenes requeridos son mucho menores (100 veces o más) respecto a las columnas rellenas.
Columna y hornos para la columna En cromatografía de gases se usan dos tipos generales de columnas, las empacadas y las tubulares abiertas o capilares. En la mayoría de aplicaciones actuales, las columnas empacadas dejaron paso a las columnas capilares, más eficaces y rápidas. Las columnas cromatográficas empacadas varían desde 1 m hasta 5 m de longitud, y las columnas capilares varían de pocos metros hasta 100 m. Están construidas con sílice fundida o con acero inoxidable, pero también se usa el vidrio o el Teflón. A fin de poder colocarse en el interior de un horno con temperatura controlada, se les da la forma de helicoides con diámetros de 10 a 30 cm. La temperatura de la columna es una variable importante que se tiene que regular hasta unas décimas de grado en el caso de un trabajo preciso. Por consiguiente, la columna se suele alojar dentro de un horno con temperatura controlada. La temperatura óptima de la columna depende del punto de ebullición de la muestra y del grado de separación requerido. En la práctica, con una
temperatura igual o ligeramente superior a punto de ebullición promedio de la muestra se obtiene un tiempo de elución razonable (2 a 30 min). Para muestras cuya temperatura de ebullición varía ampliamente, lo mejor es aplicar una programación de temperatura, con la cual se aumenta la temperatura de la columna en forma continua o por etapas a medida que avanza la separación. En general, la resolución óptima se asocia con una temperatura mínima, pero al reducir esta última se produce un aumento en el tiempo de elución y, por tanto, del periodo necesario para completar un análisis. Algunas veces, los analitos de volatilidad limitada se pueden determinar mediante la formación de derivados que son más volátiles. De igual manera, la derivación se usa a veces para aumentar la detección o el rendimiento cromatográfico .
Sistemas de detección En algunos casos los cromatógrafos de gases se acoplan a instrumentos espectroscópicos como los de infrarrojo. En este caso, el dispositivo espectrométrico sirve no sólo para detectar la aparición de los analitos, sino también para identificarlos.
Características del detector ideal El detector ideal para cromatografía de gases tiene las siguientes características: 1. Sensibilidad adecuada. Justo lo que constituye una adecuada sensibilidad no puede evaluarse de forma cuantitativa. Por ejemplo, las sensibilidades de los detectores que se describen en esta sección difieren por un factor de 10 7. Aunque todos se utilizan extensamente y son satisfactorios en ciertos casos, los menos sensibles no son adecuados para algunas aplicaciones. En general, las sensibilidades de los detectores actuales se encuentran en el intervalo de 10 -8 a 10 -15 g de soluto/s. 2. Buena estabilidad y reproductibilidad. 3. Respuesta lineal para los solutos que se extienda a varios órdenes de magnitud. 4. Intervalo de temperaturas desde la temperatura ambiente hasta al menos 400ЊC. 5. Tiempo de respuesta corto independiente de la tasa de flujo. 6. Alta confiabilidad y manejo sencillo. El detector debería estar a prueba de la impericia de operadores inexpertos, si es posible.
7. No debe destruir la muestra. Por desgracia, no hay un detector que reúna todas estas características. Algunos de los detectores más comunes son los que se mencionan en la tabla que sigue:
ACETILACIÓN DEL EUGENOL. Cuando obtenemos un cromatograma obtenemos una gráfica. De la misma podemos obtener, a simple vista una información cuantitativa de la cantidad de componentes que han pasado por el detector, a su vez, de manera cualitativa, se puede apreciar que hay componentes que tienen mayores y menores velocidad de migración. Pero ¿Cómo podemos saber qué componentes son los responsables de los picos que aparecen en las gráficas? Para la cromatografía de gases en la cual se separarán los componentes ya mencionados (β-cariofileno, eugenol, acetato de eugenilo) se obtendrá un cromatograma de referencia. En la misma se observaran tres grandes picos, a los cuales no tienen identificación de parte del cromatograma. Un método para lograr una identificación de dichos picos es a partir de la acetilación del eugenol para dar acetato de eugenilo. A partir de esta reacción se logrará una disminución en la concentración del
eugenol (disminución en el área del pico) y un aumento de concentración del acetato de eugenilo (aumento del área del pico). De esta manera, el aceite de clavo con la acetilación del eugenol se le realizará una cromatografía de gases para obtener un nuevo cromatograma. Al observar y comparar ambos cromatogramas (el aceite puro y el aceite acetilado) se podrá apreciar la diferencia de dos picos. El aumento del área de un pico reflejará el aumento de la concentración del acetato de eugenilo, debido a la acetilación. La disminución del área de otro pico muestra la disminución de la concentración del eugenol. Reacción:
ESPECTROMETRÍA DE MASAS Uno de los detectores más potentes para cromatografía de gases es el espectrómetro de masas. La combinación de cromatografía de gases con espectrometría de masas se conoce por las siglas GC-MS Los métodos espectrométricos son un gran grupo de métodos analíticos que se basan en la espectroscopía atómica y molecular. La espectroscopía es un término general para la ciencia que trata con las interacciones de varios tipos de radiación con la materia. En la espectrometría de masas se bombardean moléculas con electrones y otras
partículas, rompiéndose las moléculas. El análisis de las masas de los fragmentos da información sobre la masa molecular, permite conocer, con cierta frecuencia, la fórmula molecular, y da pautas sobre la estructura y los grupos funcionales presentes en la molécula. En este análisis se consume o destruye menos de un miligramo de muestra. Los métodos espectrométricos que más se usan se basan en la radiación electromagnética, que es un tipo de energía que adopta varias formas; las más reconocibles son la luz y el calor radiante. Las manifestaciones menos obvias son los rayos gamma y los rayos X, así como la radiación ultravioleta, la de microondas y la de radiofrecuencia.
Proceso. Vaporización de la muestra: La operación inicial consiste en la producción de un flujo constante de vapor de la sustancia. Si esta no se puede vaporizar sin que se descomponga en las condiciones reinantes en la cámara de vaporización (10 -2 torr y temperatura regulable hasta 300°C), hay que transformarla en un derivado más volátil. El vapor producido se transfiere por un orificio, durante todo el periodo de medición del espectro, a la cámara de ionización, la cual se mantiene al igual que todo el resto del aparato a 10 – 6 torr. Como alternativa, se puede vaporizar sustancias termolábiles introduciéndolas directamente en la cámara de ionización. La tasa de flujo procedente de las columnas capilares es casi siempre tan baja que la salida de la columna se puede alimentar de manera directa a la cámara de ionización del espectrómetro de masas. En la actualidad las columnas capilares se emplean de modo invariable en los equipos de GC-MS y los mencionados separadores ya no se utilizan. Ionización y fragmentación de la muestra. De acuerdo con el equipo utilizado, la ionización de una molécula orgánica se
consigue irradiándola con luz ultravioleta de longitud de onda corta (fotoionización), desorbiéndola de una superficie mediante la aplicación de un campo eléctrico fuerte (ionización de campo) o, más comúnmente, irradiándola con un haz de electrones (ionización por bombardeo de electrones). El haz de electrones se produce, a voltaje variable, por un filamento de volframio mantenido a una temperatura apropiada (aproximadamente 1800°C). Los iones orgánicos resultantes, ya sea por ionización de la molécula o por fragmentación del ion molecular, se recoge en un electrodo. Aceleración de los iones: Otro electrodo, con un pequeño potencial positivo, expulsa a los iones a una cámara electrostática, donde se someten a la acción de un campo eléctrico de varios miles de voltios (~ 3000 V). En consecuencia, un ion de masa
m
y de carga
e
es
acelerado a una velocidad v, la que se puede deducir de la relación de igualdad entre su energía potencial (eV) y su energía cinética (1/2 mv 2). Enfoque magnético de los iones: El ion, acelerado en forma conveniente, entra por una ranura al analizador magnético. En este, un tubo curvo de radio r , situado en un campo magnético de intensidad H , se mantendrá en una trayectoria central si su fuerza centrífuga (mv 2/r) está en equilibrio con la fuerza centrípeta del campo (Hev). Dado que el tubo tiene un radio fijo, si se mantiene constante el voltaje del acelerador, a cada ion o grupo de iones caracterizados por la misma relación masa/carga corresponderá una determinada intensidad del campo magnético del tubo. Ya que un flujo constante de la mezcla de todos los iones se desplaza en forma permanente por el tubo, un barrido magnético enfoca sucesivamente todos los iones, de acuerdo con su relación m/e,
sobre el colector. En el instante en que todos los iones de determinados valor m/e
inciden sobre el electrómetro, todos los demás se pierden por el sistema de vacío del aparato. Enfoque cuadrupolar de los iones: En ciertos espectrómetros recientes, como alternativa del analizador electromagnético, se emplea un filtro de masa cuadrupolar, compuesto de cuatro electrodos metálicos, dispuestos en planos perpendiculares entre si y conectados diagonalmente. Cada par de barras recibe una combinación de voltajes de radiofrecuencia (RF) y de corriente continua (DC), de amplitudes crecientes.
Registro del espectro. La intensidad de cada haz iónico dotado de una relación específivca m/e, que sale del analizador, se puede medir directamente directamente por el método de captura o directamente, tras de haberlo transformado en electrones, por medio de un electrómetro
3. PROCEDIMIENTOS 1-
Colocar 0.2 mL de la solución clorofórmica de aceite de clavo en un tubo de rosca con
0.2 mL de cloruro de acetilo, tapar y calentar a 60ºC por 30 minutos. Luego agregar cuidadosamente 2 mL de H 2O destilada y 2 mL de acetato de etilo. Con pipeta Pasteur sacar la capa orgánica (capa superior) y secar con MgSO 4. 2- Correr en TLC el aceite recibido diluido (1 gota en 1 ml de cloroformo), el acetilado y el extracto en hexano utilizando la siguiente fase móvil: CH 2Cl2/Hexano 7:3. Observar al UV (254nm) y finalmente revelar con el revelador sugerido: (anisaldehído/EtOH/H 2SO4). 3- Inyectar en GC el aceite acetilado.
4. CROMATOGRAFÍA GASEOSA Cromatógrafo de gases (marca/modelo): GCMSQP 2010 Columna semicapilar (medidad): Largo: 30 m. Diámetro: 0,5mm. Espesor film: 0,25 micras Fase estacionaria: RTX5MS apolar 100°C aumenta 50°C por minuto hasta Programa de temperatura: 230°C. Split 280°C. Detector (tipo y temperatura): Temperatura del inyector: 250°C. Helio Gas carrier: 1ml por minuto Flujo: Volumen de inyección: 1 microlitro
CÁLCULOS Y RESULTADOS DATOS: ACEITE Área eugenol:
5992102000
ACETILADO Área eugenol: 511948032
Área acetato de
1523131334
Área acetato de
eugenilo:
7310363128
eugenilo:
CÁLCULOS: ACEITE ACETILADO Área total = Área eugenol + Área acetato de Área total = Área eugenol + Área acetato de eugenilo eugenilo Área total = 5992102006 + 1523131334
Área total = 511948031 + 7310363128
Área total = 7,5x109 Área total = 7,8x109 % Área eugenol = (área eugenol / área % Área eugenol = (área eugenol / área total)x100 total)x100 % área eugenol /7,5x109)x100
=
(5992102006 % área eugenol 9 (511948031/7,8x10 )x100
=
% Área eugenol = 80,0% % Área eugenol = 6,6% % Área acetato de eugenilo = (área acetato % Área acetato de eugenilo = (área acetato de eugenilo / área total)x100
de eugenilo / área total)x100
% Área acetato de eugenilo = (1523131334 % Área acetato de eugenilo = (7310363128 / 7,5x109)x100
/7,8x109)x100
% Área acetato de eugenilo = 20,3%
% Área acetato de eugenilo = 93,7%
5. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA UV
ANISALDEHIDO
Eugenol Acetato de eugenilo.
6. DISCUSIÓN DE RESULTADOS Y CONCLUSIONES Detección por luz UV: Considerando los componentes a detectar, β-cariofileno, eugenol y acetato de eugenilo, de los cuales, el eugenol y acetato de eugenilo, son poseedores de grupos cromóferos, se realizó la detección por luz UV (254 nm) para visualizar el tiempo de retención. Según las normas AFNOR es de esperarse el siguiente orden: β-cariofileno, eugenol y acetato de eugenilo. El resultado obtenido reflejo lo esperado. Se puedo observar dos manchas donde se demuestra dos componentes con diferentes tiempos de retención.
Conclusión Al tener conocimiento de las estructuras de los componentes podemos concluir lo siguiente: En esta instancia se esperaba un resultado en donde el β-cariofileno sea el
componente que mayor distancia recorra, indicando su baja afinidad a la fase estacionaria y su alta afinidad a la fase móvil, pero, debido a su falta de grupo cromófero no pudo ser apreciado, en cambio sí se pudo observar con claridad los otros dos componente que lo seguían en tiempo de retención. Seguido al β-carofileno, el acetato de eugenilo y por último el eugenol (en el caso del aceite esencial y el aceite esencial con hexano).
Cromatografía de gases Al analizar los cromatogramas y espectros de masas para el aceite esencial puro y para el acetilado, se observó que el orden de elución fue el siguiente: eugenol, betacariofileno y acetato de eugenilo coincidiendo con lo planteado en las normas AFNOR. Otro observación a tener en cuente es la comparación de los cronogramas del aceite de clavo puro y el acetilado. Utilizando como referencia el cromatograma del aceite de clavo puro, se observó para el eugenol, el área del pico decrece en el cromatograma del aceite acetilado; mientras que para el acetato de eugenilo el área del pico no aumenta como era de esperarse según las normas ANFOR.
Conclusión Experimentalmente el orden de elución coincidió con lo abordado teóricamente en base a su afinidad a una fase estacionaria apolar (OV 101, como lo planteado en las normas ANFOR). Con respecto a las alteraciones presentes en las áreas de los picos del cromatograma del aceite acetilado, nos animamos a considerar que es como resultado a una reacción incompleta de la acetilación del eugenol para la formación del acetato de eugenilo. Como consecuencia la concentración del acetato de eugenilo no aumentó. A su vez, acetilación del eugenol, aun cuando no fue llevada a cabo como se deseaba, sirvió para identificar el pico perteneciente al eugenol en el cromatograma, tanto para el aceite puro y el aceite acetilado, debido a la comparación de ambos.
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Gottlieb, O.R. Filho, R.B. (1976) Introducción a la espectrometría de masa de sustancias orgánicas. Serie de química. Monografía n°.17. Washington, D.C.
Romero, D. (2004) Plantas aromáticas: Tratado de aromaterapia científica. 1°ed. Kier. Buenos Aires.
Skoog,D.A. Holler, F.J. Crouch, S.R. (2008) Principios de análisis instrumental Cap. 26 y 27 6ta Ed. Cengage Learning Editores, México, D.F.
9. REFRENCIAS WEB
http://www.oleosessenciais.org/cariofileno/
www.medtrad.org/panacea/IndiceGeneral/n33-Entremeses-Diaz.pdf
