UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN ANTONIO ABAD DEL CUSCO ESCUELA DE POS GRADO
MAESTRIA: EN QUIMICA MENCION PRODUCTOS NATURALES
ASIGNATURA PRODUCTOS NATRURALES II
TEMA: CROMATOGRAFIA DOCENTE: MGT. Leoncio Solis MAESTRISTAS:
Q.F. Q.F. CANDIA LOPEZ Caol Q.F. CUSI!UAMAN PUMA So"#a Es$ean%a Es$ean %a Q.F. LIZ ARRAGA CONC!A Vic&oia Vic&oia 'olan(a 'olan(a QCO. LIZARRAGA
CUSCO) *++,
INDICE
I.
CROMATOGRAFÍA CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO INTERCA MBIO IÓNICO
II.
CROMATOGRAFÍA CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA DE GELES DE FILTRACION FILTRACION
IV. IV.
CROM CROMA ATOG OGRA RAFÍ FÍA A LIQ LIQUI UIDA DA DE ALT ALTA PER PERFO FORM RMAN ANCI CIA A
V.
CROMATOGRAFÍA DE GASES
VI. VI.
CROMA ROMAT TOGRAF GRAFÍA ÍA EN CAP CAPA FINA INA
VII. VII.
CROM CROMA ATOG OGRA RAFÍ FÍA A DE ADSO ADSORC RCIÓ IÓN N
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INDICE
I.
CROMATOGRAFÍA CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO INTERCA MBIO IÓNICO
II.
CROMATOGRAFÍA CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA DE GELES DE FILTRACION FILTRACION
IV. IV.
CROM CROMA ATOG OGRA RAFÍ FÍA A LIQ LIQUI UIDA DA DE ALT ALTA PER PERFO FORM RMAN ANCI CIA A
V.
CROMATOGRAFÍA DE GASES
VI. VI.
CROMA ROMAT TOGRAF GRAFÍA ÍA EN CAP CAPA FINA INA
VII. VII.
CROM CROMA ATOG OGRA RAFÍ FÍA A DE ADSO ADSORC RCIÓ IÓN N
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CROMATOGRAFIA
La cromatogr cromatografía afía es una una técnica técnica que permite permite separar separar,, aislar e identif identificar icar los componentes de una mezcla de compuestos químicos. La muestra es dist distri ribu buid ida a entr entre e dos dos fase fasess inmi inmisc scib ible less (sól (sólid ida, a, líqu líquid ida a o gas) gas),, una una estacionaria y otra móvil, que se mueven una con respecto de la otra mant manten enie iend ndo o un cont contac acto to ínti íntimo mo,, de tal tal form forma a que que cada cada uno uno de los los comp compon onen ente tess de la mezc mezcla la es sele select ctiv ivam amen ente te rete reteni nido do por por la fase fase estacionaria. Los componentes de la mezcla a separar invierten un tiempo diferente en recorrer cada una de las fases, con lo que se produce la separación. Si un componente est la mayor parte del tiempo en la fase móvil el producto se mueve rpidamente, mientras que si se encuentra la mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda retenido y su salida es muc!o ms lenta. La separ separac ación ión se lleva lleva a efect efecto o en una colum columna na tubula tubularr rellena rellena de de un sóli sólido do poro poroso so fina finame ment nte e divi dividi dido do,, el cual cual pued puede e actu actuar ar como como fase fase estacionar estacionaria ia propiamente propiamente dic!a dic!a como soporte soporte de una fase estacionar estacionaria ia líquida. "ambién "ambién se puede efectuar utilizando como fases estacionaria papel de filtro o un sólido finamente dividido colocado en forma de capa fina sobre una placa de vidrio. #stos tres tipos de cromatografía se basan en los mismos mismos princi principio pioss fundam fundament entale ales, s, y se conoc conocen en respec respectiv tivame amente nte como como cromatografía en columna, en papel y de capa fina. La crom cromat atog ogra rafí fía a es un proc proces eso o de sepa separa raci ción ón muy muy com$ com$n n en ingeniería química y bioquímica. #s un procedimiento altamente selectivo, capaz de distinguir y separar componentes con características físicas y químicas muy similares. #sta técnica se considera importante tanto a nivel de producción como de anlisis. #l método de selección incluye los pasos necesarios para la obtención, preparación y posible fraccionamiento de la muestra, la aplicación de la técn técnic ica a anal analít ític ica a adec adecua uada da y el trat tratam amie ient nto o de los los dato datoss obte obteni nido dos. s. Las técnic técnicas as analí analític ticas as ms emplea empleadas das en la actua actualid lidad ad pueden pueden englo englobar barse se en dos grande grandess grupos grupos%% técnic técnicas as de separa separació ción n y técnic técnicas as espectroscópicas. Las técnicas espectroscópicas proporcionan, para cada compue compuesto sto analiz analizado ado,, una inform informaci ación ón comple comple&a, &a, relaci relaciona onada da con con sus caract caracterí erísti sticas cas estruc estructur turale aless especí específic ficas, as, por por otro otro lado lado las técnic técnicas as de separación se utilizan para resolver los componentes de una mezcla y la se'a se'all obte obteni nida da pued puede e util utiliz izar arse se con con fine finess anal analít ític icos os cuan cuantitita tatitivo voss o cualitativos. ctualmente las separaciones separaciones analíticas analíticas se realizan fundamentalmente fundamentalmente por por cromatografía y electroforesis. La cromat cromatograf ografía ía no no solo solo permit permite e la separació separación n de los componen componentes tes de una una mezcla mezcla,, sino sino tambié también n su identi identific ficaci ación ón y cuanti cuantific ficaci ación. ón. Se puede pueden n separar moléculas en función de sus cargas, tama'os y masas moleculares. "ambién a través de la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redo, etc. #l anli nlisi siss cuali ualita tati tivvo est est basad sado en la med medida ida de par parme metr tros os cromatogrficos (tiempos y vol$menes de retención) mientras que el anlisis cuan cuantitita tatitivo vo est est basa basado do en la medi medida da de altu altura rass o rea reass de pico picoss cromatogrficos que se relacionan con la concentración.
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Los métodos métodos cromatogrficos se pueden pueden clasificar clasificar seg$n seg$n la forma en que la fase móvil y la fase estacionaria se pongan en contacto. sí en la cromatografía de columna, un tubo estrec!o contiene la fase estacionaria a trav través és de la cua cual se !ace ace pasar sar la fase fase móvil óvil por pres presió ión n. #n la cromatografía en plano, la fase estacionaria se fi&a sobre una placa plana o a los intersticios de un papel* en este caso la fase móvil se desplaza a través de la fase estacionaria por capilaridad o por gravedad. Las Las tres tres clas clases es de crom cromat atog ogra rafí fía a desd desde e un ngu ngulo lo ms ms gene genera rall son son cromatografía de líquidos, cromatografía de gases y cromatografía de fluidos supercríticos. +omo su nombre lo indica, la fase móvil en las tres técnicas son líquido, gas y fluido supercrítico respectivamente. #n la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fi&a. Solo la cromatografía de líquidos es la que puede llevarse acabo en columna o sobre superficies planas, por otra parte tanto la de gas gas como omo la de flui fluid dos super upercr crít ític ico os est estn n res restrin tringi gida dass a los los procedimientos en columna de tal manera que las paredes de la columna contienen la fase móvil. La técnica ms usada es la cromatografía líquida de alta resolución(-L+), por por su sensib sensibilid ilidad, ad, fcil fcil adapta adaptació ción n a las determ determina inacio ciones nes cuant cuantita itativ tivas as eactas, su idoneidad para la separación de especies no voltiles y su aplicación a sustancias de primordial interés en la industria, como son los aminocid aminocidos, os, proteínas, proteínas, cidos cidos nucleicos nucleicos,, !idrocarbu !idrocarburos, ros, carbo!idr carbo!idratos, atos, entre otros.
Tipos de co!"#o$"%&"
FIG. 1 - Métodos cromatográficos. CGS: cromatografía gas-sólido; CGL: cromatografía gas-líquido; CLS: cromatografía líquido-sólido; CLL: cromatografía líquido-líquido; CF!: cromatografía d" fas" químicam"#t" u#ida; CII: cromatografía d" i#t"rcam$io ió#ico; CCF: cromatografía d" ca%a fi#a; C&: cromatografía d" %a%"l; C': cromatografía d" "(clusió#; C&G: cromatografía d" %"rm"ació# "# g"l; CFG: cromatografía d" filtració# "# g"l.
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CROMATOGRAFIA EN COLUMNA La cromatografía es una técnica que se emplea en el fraccionamiento de proteínas. +onsiste en la aplicación de una muestra comple&a de proteínas a una columna de cristal en la que se !a situado una matriz sólida porosa que est inmersa en el solvente. continuación se bombea una gran cantidad de solvente a través de la columna. Las diferentes proteínas se van retrasando de manera distinta seg$n sus interacciones con la matriz, por lo que pueden ser recogidas separadas a medida que son eluidas por el fondo de la columna. Seg$n la matriz escogida, las proteínas se pueden separar de acuerdo a su carga, su !idrofobicidad, su tama'o o su capacidad de unirse a grupos químicos particulares. La pureza de las fracciones obtenidas se suele comprobar mediante la electroforesis en geles de poliacrilamida. #n toda cromatografía !ablaremos de los siguientes términos%
M"#i' de (" co()!". Sustancia que est empapada de solvente y que se empaqueta en la columna. "ambién se denomina el lec!o de la columna. Lo*$i#)d de (" co()!*". Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna. #s importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad.
Vo()!e* de (" co()!*". olumen total de gel que se empaqueta en una columna cromatogrfica.
Vo()!e* !)e#o de (" co()!*". +antidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se !a reemplazado completamente. +oincide con el volumen de solvente que sale de la columna desde que se aplica la muestra !asta que empieza a salir la primera proteína. #n general, y dependiendo del tipo de cromatografía puede ser de / a varias veces el volumen de la columna.
+R)* T,o)$,# 0. #s, en columnas de intercambio iónico o de afinidad, el volumen de solvente ms proteínas que atraviesa la columna sin quedar retenido en ella. +orrespondería en el caso de la cromatografía de afinidad al volumen de solvente que contiene las proteínas no afines al ligando.
Tipos de co!"#o$"%&" e* co()!*" #l principio de separación de la cromatografía es la aplicación de un criterio de separación a las proteínas que se desplazan a lo largo de una matriz sólida porosa. #ste criterio de separación se basa en alguna propiedad que es diferentes entre las proteínas que se quieren separar % peso molecular, carga eléctrica, afinidad de una de ellas por alguna otra, etc... #n función de cual sea el criterio de separación que se aplique diferenciamos tres tipos de cromatografía en columna % 5
A. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO La cromatografía de intercambio iónico se realiza sobre matrices que tienen una carga neta, positiva en el esquema. La carga de la matriz de la columna así como la carga de las proteínas m depender del p del solvente y de su fuerza iónica (proporcional a la concentración de iones). #n unas condiciones determinadas sern retenidas en la columna las proteínas que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel (las proteínas cargadas negativamente sern retenidas por una matriz cargada positivamente), siendo eluidas las restantes. -ara eluir las proteínas retenidas se puede variar la carga iónica del solvente o su p de forma que se alcance el punto isoeléctrico de la proteína de interés o el de la matriz, neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las proteínas en la columna.
B. CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL La cromatografía de filtración en gel se realiza empleando unas matrices formadas por unas esferas porosas. #l volumen de los poros es muy elevado y su dimetro est determinado. +uando penetran en el lec!o de la columna dos proteínas de tama'os tales que una penetra en los poros de las bolas de gel y la otra no, la primera se reparte entre el espacio entre las bolas y el interior de los poros, reduciéndose la concentración en la fase libre entre las bolas. La segunda proteína, por tama'o, sólo puede encontrarse entre las bolas. #l flu&o de solvente es ms elevado entre las bolas que en el interior de los poros de éstas, por lo que el efecto neto es el de acelerar el desplazamiento de las proteínas de mayor peso molecular respecto al de las de menor peso molecular. #n esta cromatografía se eluyen primero las proteínas mayores, y en segundo lugar las menores, y tiene una gran influencia en el resultado la longitud de la columna y el volumen de la misma. +olumnas largas aseguran separaciones de mayor calidad. #mpleando patrones de proteínas de peso molecular conocido se emplea para determinar el peso molecular de proteínas de tama'o desconocido
C. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD - DE INMUNOAFINIDAD #n la cromatografía de afinidad las bolas de gel que conforman el lec!o de la columna presentan unido en su superficie un ligando, una molécula ante la que tiene afinidad una o ms de las proteínas presentes en la mezcla a separar. l atravesar la columna el ligando secuestra sobre la superficie de las bolas de gel la proteína afín, y de&a pasar el resto. La elución de la proteína afín se puede conseguir modificando las propiedades de carga del ligando (variando el p !asta alcanzar su punto isoléctrico, variando la fuerza iónica del solvente, etc...) con lo que se reduce la intensidad de la interacción !asta anularla. La naturaleza del ligando es muy variada, puede ser un receptor (proteína) unido a las bolas, que seleccionar su1s ligando1s de una mezcla comple&a, o el antígeno empleado en una inmunización el que recubre las bolas y que retendr del suero del animal aquellos anticuerpos que lo reconocen (anticuerpos
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purificados por afinidad), o en el caso concreto de la i*!)*o"%i*id"d el ligando que recubre las bolas son anticuerpos que retienen en la columna a aquellas proteínas que contienen los epítopos que reconocen. #n ocasiones la cromatografía de afinidad se realiza incubando el gel recubierto con el ligando directamente con la solución que contiene las proteínas a purificar. -osteriormente se empaqueta la columna y se procede a la elución, primero de las proteínas no unidas (0 )* #,o)$,# 0) y posteriormente de las retenidas (e()ido espec&%ico).
I. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO INTERCAMBIADORES DE IONES La cromatografía de intercambio iónico es el tipo de cromatografía ms empleado en anlisis inorgnico. #l intercambio iónico es el proceso reversible de intercambio de iones entre una solución y un sólido insoluble en contacto con ella. #ste cuerpo sólido, llamado intercambiador iónico, tiene que poseer ciertas características. #n primer lugar, debe ser un compuesto iónico. #n segundo lugar, debe poseer una estructura molecular suficientemente porosa o abierta para permitir que los iones entren o salgan de ella por difusión. #isten intercambiadores iónicos inorgnicos y orgnicos, naturales y sintéti cos. Los ms empleados son polímeros orgnicos llamados 2resinas de intercambio iónico3. Las resinas mas comunes son de poliestireno reticulado y poseen una estructura molecular /. Se fabrican a partir de mezclas de los dos monómeros líquidos estireno (+ 45+ 6 +7) y divinilbenceno ( 7+ 6 + 8 +49 8 + 6 +9) en una proporción que suele ser de alrededor de /7%/ pero que puede variar seg$n las necesidades de la síntesis, agregando una peque'a cantidad de un catalizador de tipo radical libre, como el peróido de benzoílo, y vertiendo inmediatamente la mezcla líquida, con fuerte agitación, en agua que contiene una peque'a cantidad de un agente tensoactivo. La agitación se contin$a, manteniendo las sustancias reaccionantes líquidas suspendidas en el agua en forma de peque'as gotas, que pueden ser mayores o menores seg$n la velocidad de agitación. #n un breve tiempo, las gotículas se convierten en perlas esféricas sólidas, al reaccionar entre sí las moléculas de estireno y divinilbenceno polimerizndose formando cadenas muy largas y retículos. continuación, se introducen los grupos iónicos (grupos de cido sulfónico, mediante un tratamiento químico adecuado, tal como por reacción con cido sulf$rico fumante. +,7
+,
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S:; ,
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En la Fig. . Estructura química de una resina eje intercambio canónico de poliestireno sulfonado.
=inalmente, la resina obtenida se lava y se clasifica seg$n los tama'os de las partículas. Las resinas intercambiadoras de iones poseen algunas características que deberían ser bien comprendidas por el químico que vaya a usarlas, especialmente para elegir la resina apropiada para una aplicación dada. #n primer lugar, el tipo de polímero, o 2esqueleto3 estructural. #n el e&emplo descrito antes, éste es el copolímero estireno8divinilbenceno, pero eisten algunos otros tipos, como los polímeros de cido acrílico o incluso productos naturales, como la celulosa. #n segundo lugar, los grupos funcionales o grupos iónicos fi&os. #n el mismo e&emplo citado, estos son los iones sulfonato, pero pueden ser también iones carboilato o iones positivos, como los de amonio cuaternario. sí, pues, los iones fi&os en la estructura pueden poseer carga negativa o carga positiva. Si estn cargados negativamente retienen iones positivos o cationes de peque'o volumen* si lo estn positivamente, retienen iones negativos o aniones peque'os. Son estos iones peque'os o contra8iones, los que son intercambiados. >n intercambiador cuyos iones fi&os sean negativos, es un intercambiador de cationes* si los iones fi&os son los positivos, es un íntercambiador de aniones. #ntre los intercambiadores de cationes se distinguen los que son fuertemente cidos y los débilmente cidos, seg$n la naturaleza de los grupos funcionales y el grado de disociación de éstos. nlogamente, eisten intercambiadores amónicos que son fuertemente bsicos y otros que son bases débiles. #l grado de reticulación mide la compacidad del retículo del polímero. +uanto mayor es la reticulación de una resina, tanto mayor es su densidad y el n$mero de iones que contiene por centímetro c$bico. ?o obstante, un elevado grado de reticulación !ace ms difícil la difusión de los iones, especialmente la de los de mayor tama'o, a través de la estructura. Las resinas comerciales ms corrientes, del tipo del poliestireno, poseen una reticulación del @ por ciento, cifra que significa que la mezcla estireno8divinilbenceno a partir de la cual son preparados contiene un @A de divinilbenceno. =inalmente, otro parmetro importante es el tama'o de las partículas. Bebe elegirse el tama'o adecuado de partícula en el momento de adquirir la resina. #sta est constituida por esférulas, llamadas perlas, que son etraordinariamen8 te duras y difíciles de moler, y no se debería adquirir en el comercio un tama'o de perla grande esperando obtener después tama'os menores por molturación. Los tama'os de las partículas se suelen epresar en función de la escala patrón de tamices norteamericana, dando el n$mero de orificios por pulgada, o tama'o de malla. Las resinas empleadas en la purificación industrial de aguas tienen que permitir flu&os rpidos de líquido, por lo cual son de un tama'o de malla grande* generalmente de 7C a ;C mallas. Las usadas en el anlisis cromatogrficos ms riguroso son resinas de partículas muc!o ms finas, generalmente de 7CC a 9CC mallas. Las características desfavorables de las resinas de partículas de peque'o tama'o provienen de su gran resistencia al flu&o. Si se emplean resinas de tanta finura de grano como la indicada, son precisos sistemas de alta presión para mover las soluciones, pues ba&o la acción eclusiva de la gravedad no fluyen a velocidad satisfactoria.
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#n el momento de tener que adquirir resinas para el traba&o de laboratorio resulta $til conocer algunos de los nombres comerciales que figuran en los catlogos. Se encuentran frecuentemente los nombres siguientes% BoDe85C o BoDe85C E. #s una resina intercambiadora de cationes, acida fuerte, de composición basada en poliestireno reticulado que contiene grupos sulfónico. Se encuentra en el comercio en 2forma !idrógeno3, la cual contiene iones !idrógeno como cationes sustituibles o contra8iones y en 2forma sódica3, con iones sodio como cationes sustituibles. BoDe8/ y BoDe87. #stas dos resinas son intercambiadoras de aniones, de carcter bsico fuerte, con el esqueleto estructural de poliestireno y los grupos funcionales 8+ 7?(+;);< y F+7?(+;)7+79: < respectivamente. La forma !idróido de la BoDe87 es una base algo ms débil que la de BoDe8/. #stas resinas se encuentran en el comercio en la forma cloruro, la cual contiene iones cloruro como anión sustituible. La forma !idróido es algo inestable y se descompone con el tiempo. BoDe 8G. #s una resina 2quelatante3 con esqueleto de poliestireno y el grupo funciona 8 C/0N1C/0COO/203 el mismo grupo presente en el reactivo EDTA. Se utiliza para concentrar vestigios de iones metlicos a partir de vol$menes grandes de solución. mberlita GH+85C. #s una resina intercambiadora de cationes acida débil cuya unidad estructural es 8+(+ ;)(+::) 8 +78. Se encuentra en el comercio en forma !idrógeno y también en forma sódica. La reticulación y el tama'o de malla de las resinas viene indicado generalmente en su propia denominación, tal como sigue% BoDe85C E 8 97CC89CC mallas, significando el símbolo 9 que en la preparación de dic!a resma se utilizó un 9 por ciento de divinilbenceno.
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EQUILIBRIO - SELECTIVIDAD +omo ya se indicó en la definición del término, el intercambio iónico es reversible. >n proceso típico de intercambio iónico es el de la sustitución de algunos de los iones sodio contenidos en un intercambiador cargado en su forma sódica, por iones potasio presentes en una solución eterior
Si se agita una cierta cantidad del intercambiador (en forma sódica) con una solución de cloruro de potasio, se alcanza un equilibrio de distribución, con una fracción de los iones sodio y una de los iones potasio en la resina y otra fracción
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de ambos en la solución. La distribución obedece la ley de acción de masas y viene descrita por una constante de equilibrio. I%
-ara la resina BoDe85C @. el valor de I es próimo a 7. Los iones potasio son retenidos ms fuertemente que los iones sodio. Se dice que la 2selectividad3 de la resina para los iones potasio es mayor que para los iones sodio. lgunas cifras típicas relativas a la selectividad de varias resinas de intercam8 bio iónico se !allan recogidas en la "abla. Los valores numéricos reales dependen de las características de cada resina, pero, en general, la selectividad para el intercambio de cationes aumenta en el orden% Li (mínima)8?a8J8Hb8+s, para los metales alcalinos y Kg (mínima)8+a8Sr8a8Ha, para los alcalinotérreos. Los iones de los metales pesados, como +u y -b, son retenidos ms fuertemente que Kg y +a. -ara el intercambio de aniones, el orden de los iones !aluro es% = (mínima)8+l8r8G. "L Selectividad del intercambio iónico% valores de I
(a)
+ationes univalentes +ationes divalentes niones univa8 (relativo a Li) (relativo a +a) lentes (relativo a +l) /.; Kg C,4/ = C,C@ +i /,CC r ?a 7.C 7.N ;./ +a /,CC ;,5 G /;,5 ?C; ;,C J ;,7 @,5 Sr 0 /.75 +/C9 7;,C : C.5 Hb /7,5 a 7,7 +s On C,P g +d C,@ "M -b /,N +u C,P5 ?i C,P5 (a) #stas cifras corresponden a resinas a base de poliestireno, con grupos sulfónico los intercambiadores de cationes, y con grupos de amonio cuaternario los de aniones* el grado de reticulación es del @A. Bebe !acerse notar que el valor numérico eacto varía de una partida de resina a otra. l epresar los resultados del intercambio entre iones de diferente carga, como, por e&emplo, la sustitución de +a 7< por 7 ?a < , !ay que ir con cuidado con las unidades, pues, en estos casos, el valor numérico de la constante de equilibrio depende de las unidades en que se epresen las concentraciones. ay que observar, adems, la influencia importantísima de la concentración% cuanto mayor es la concentración total tanto ms se desplaza el equilibrio en el sentido de poner en solución el ion de carga mayor* recíprocamente, cuanto8ms diluida es la solución tanto mayor es la fracción del ion de carga mayor que queda
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retenido en la resina. #llo es consecuencia de la ley de acción de masas, seg$n la cual la constante de equilibrio viene dada por%
I6
Hes7C" Hes?a
7
?a +a
< 7
7<
#ste efecto se aprovec!a, por e&emplo, en el tratamiento de aguas, para eliminar la dureza de las mismas. #l !ec!o de que las resmas de intercambio muestren una mayor apetencia para una clase de iones que para otras, es lo que !ace posible la cromatografía de intercambio iónico. +omo se ver ms adelante, el intercambio iónico se utiliza en con&unción con la formación de comple&os para obtener una selectividad adicional.
COLUMNAS DE INTERCAMBIO IÓNICO Los intercambiadores de iones, se utilizan casi siempre en columna. La técnica en columna permite que la sustitución de una clase de Gon por otra llegue a ser completa, aun a pesar de que la reacción sea reversible. dems, se puede conseguir fcilmente sustituir un ión por otro incluso en el caso de que ello vaya contra el orden de selectividad. sí, pasando una solución de cloruro de sodio por una columna rellena de una resina en forma potsica, es posible obtener a la0 salida de la columna, por lo menos durante un cierto tiempo, una solución de cloruro de potasio puro. La solución que pasa por la columna cloruro de sodio en este e&emplo se va encontrando de un modo continuo con resina fresca no reaccionada, en este caso resina cargada de iones potasio y el eceso de este reactivo va desplazando el equilibrio de un modo continuo. La técnica de traba&o en columna constituye un medio muy bueno para conseguir que una reacción reversible llegue a ser completa y es posible conseguirlo en cualquiera de ambos sentidos. Qracias a ello, las columnas de intercambio iónico se pueden usar repetida8 mente muc!as veces. +uando se agotan, esto es, cuando los iones que deberían quedar retenidos en la resina ya no lo son y empiezan a salir de la columna, ésta se 2regenera3 simplemente !aciendo pasar por ella una solución de los iones que contenía inicialmente. >na vez terminado el eperimento, no se desec!a la resina, sino que se pasa por ella una solución de cido clor!ídrico para eliminar de la misma el calcio y otros cationes metlicos* luego se lava con agua. +on ello, la resina queda 2regenerada3 y lista para ser utilizada nuevamente. #l titulo de este capítulo es el de 2+romatografía de intercambio iónico3, pero con muc!a frecuencia las columnas intercambiadoras se utilizan también para realizar separaciones o sustituciones químicas que no consisten propiamente en un proceso cromatogrfico (esto es. en un proceso de migración diferencial). Son e&emplos de aplicaciones no cromatogrficas los siguientes% la separación de trazas, la separación de iones interferentes y la determinación del contenido 12
salino total de las soluciones. Los tres primeros eperimentos de este capítulo son e&emplos de estos tres tipos de aplicaciones. #n algunas eperimentos constituye un e&emplo de concentración de un constituyente traza. Se !ace pasar una solución que contiene una peque'ísima concentración de iones cobre por una columna de una resina íntercambiadora de cationes, la cual fi&a los iones cobre, eliminndolos de la solución. -osteriormente, se recupera el cobre de la columna pasando un volumen relativamente peque'o de cido clor!ídrico diluido. +on ello, todo el cobre que estaba contenido inicialmente en un gran volumen de solución queda al final en un peque'o volumen de una solución relativamente concentrada, en la cual se puede determinar volumétricamente. l concentrar trazas por intercambio iónico no se debe olvidar nunca que este es un proceso competitivo. Los oíros iones presentes pueden competir en la ocupación de los grupos activos de la resina con los iones traza que se desea fi&ar. sí mediante el procedimiento del #perimento no sería posible retener las trazas de cobre contenidas en el agua del mar% la elevada concentración de iones sodio presentes impediría la absorción del cobre. -ara ello necesitaríamos una resina que tuviera una selectividad para los iones cobre ecepcionalmente elevada, como la resina quelatante descrita en la sección /.
ELIMINACIÓN DE IONES INTERFERENTES Sucede a menudo que un ión interfiere en la determinación analítica de otro. -or e&emplo, los iones fosfato interfieren en la valoración de los iones calcio o magnesio con #B" y los iones calcio interfieren en la determinación acidimétrica de los iones fosfato. Los iones calcio y fosfato, no obstante, poseen carga de signo contrario, y resulta fcil separarlos por intercambio iónico. Si una solución que contiene simultneamente iones calcio y fosfato, acidificada débilmente para evitar su precipitación, se pasa por una columna de una resina intercambiadora de cationes, en su forma acida, los iones calcio son retenidos por la resina, mientras que los iones fosfato pasan con la solución. La resina no 2separa3 calcio y fosfato en el sentido de ale&arlos físicamente uno de otro% la atracción electrosttica entre iones de carga de distinto signo es demasiado intensa para que ello sea posible. Lo que !ace la resina es producir asociaciones iónicas diferentes de la inicial. sí. en este caso, partimos de fosfato de calcio 0y terminamos con cido fosfórico y cloruro de calcio (si se emplea cido clor!ídrico para liberar los iones calcio retenidos en la resina). Se utiliza un método anlogo para la puesta en solución de algunas sales escasamente solubles, por e&emplo, el sulfato de calcio. #l mineral yeso (principalmente +aSC9.77C) se puede disolver colocando en un vaso la muestra pulverizada y agitndola con un eceso de una suspensión acuosa de una resina de intercambio catiónico en forma !idrógeno* luego, filtrando la suspensión por una columna corta que contenga una cantidad adicional de la misma resina. La solución final obtenida contiene todo el sulfato de la muestra original y est eenta de iones calcio y otros iones metlicos. #l sulfato se puede determinar a!ora por valoración con perclorato de bario en isopropanol al 5C por ciento, a p 7,5. empleando como indicador la sal disódica del acido 78 !idroi8;.48disulfo8l8naftilazobenceno8arsónico. de nombre trivial torina.
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DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN IÓNICA TOTAL La solución se pasa por una columna de un intercambiador de cationes, acido fuerte, en su forma !idrógeno, el cual convierte todas las sales en sus correspondientes cidos, que se valoran a continuación con una base patrón. #ste método sirve para determinar la concentración de los aniones de los cidos fuertes, no la de los débiles, como el cido carbónico.
SEPARACIÓN DE METALES POR INTERCAMBIO AMÓNICO DE SUS CLOROCOMPLE4OS #ste es verdaderamente un e&emplo de cromatografía de intercambio iónico. -arece paradó&ico que el modo ms efectivo de separar algunos metales, que consideramos normalmente como formadores de cationes, sea precisamente por medio de una resina intercambiadora de aniones. La causa reside en que muc!os iones metlicos, aunque no los alcalinos ni los alcalinotérreos, se combinan con los iones cloruro formando comple&os cargados negativamente. #stos cloro8comple&os difieren grandemente entre si con respecto a su estabilidad, así como con respecto a la fuerza con que quedan retenidos en una resina intercambiadora de aniones. Se puede tomar el caso del cobalto como buen e&emplo, ya que sus iones son coloreados y el color de las soluciones permite apreciar visualmente los desplazamientos del equilibrio. #n una solución diluida de una sal de cobaltoRGG) en agua, la principal especie iónica es el catión !idratado, +o( 7C)47 <, que es de color rosado. Si se agrega cido clor!ídrico concentrado a esta solución rosa, el color cambia, pasando por varios tonos de p$rpura y azul. +uando el cido clor!ídrico es 9 molar, la solución es de un color azul violceo% a la concentración 4 molar el color es azul puro. #ste cambio de color corresponde al desplazamiento del equilibrio% +o(:, 7) 4
7<
<
+"G:? H:SB:
9+l
8
+o+l 9
7
<
4, 7:
?G:? O>L
Los aniones son absorbidos por las resinas de intercambio aniónico, los cationes no lo son. Si adicionramos gradualmente cido clor!ídrico a un recipiente que contuviera una solución diluida de cloruro de cobalto y algunas esférulas de una resina de intercambio aniónico, veríamos cómo el cobalto se incorporora a la resina y la ti'e de azul cuando la concentración de cido clor!ídrico llega a ser mayor de 9 molar. La razón de distribución, B, que epresa la tendencia del cobalto a penetrar en la resina, aumenta rpidamente con la concentración del cido clor!ídrico a partir de un valor próimo a ; molar y alcanza un mimo cerca de N molar. umenta, lógicamente, al crecer la proporción de cobalto presente en la forma +o+l 978. -or encima de N molar, el valor de B disminuye algo porque el comple&o est ya completamente estabilizado y los iones cloruro adicionales compiten con los iones +o+l 97 8 para ocupar los puntos activos de la resina. #sta tendencia est indicada en la =ig., en la que se representan los valores del logaritmo de B en función de la concentración molar del cido clor!ídrico, en los casos del zinc, del cobalto(GG) y del !ierro(GGG). +ada elemento tiene su propia curva característica. partir del conocimiento de estas curvas resulta posible 14
idear métodos para la separación cromatogrfica de la mitad de los elementos de la "abla -eriódica, empleando como fase estacionaria una resina intercambiadora de aniones, bsica fuerte, y como fases móviles, sucesivas soluciones de cido clor!ídrico de diferentes concentraciones.
Fig. . Absorción de metales a partir de soluciones en ácido clorhídrico. D es la razón de distribución en mililitros por gramo.
ntes de discutir este eperimento, es conveniente indicar los metales cuyos iones no son absorbidos a partir de sus soluciones en cido clor!ídrico, cualquiera que sea la concentración de éste. #stos metales son% los alcalinos, los alcalinotérreos ecepto el berilio, el aluminio, el itrio, el lantano y los elementos de las tierras raras, el torio y el níquel. #cepto en el caso del níquel, todos los iones de la lista precedente poseen la configuración electrónica de 2gas inerte3 y se coordinan sólo débilmente o no se coordinan, con los iones cloruro. -resentan una débil tendencia a formar enlaces covalentes.
SEPARACIÓN DE COMPUESTOS ORG5NICOS POR INTERCAMBIO IÓNICO Las aplicaciones del intercambio iónico no se !allan limitadas a la química inorgnica. Los compuestos orgnicos que forman iones, sean positivos o negativos, se pueden separar por cromatografía de intercambio iónico* las impurezas iónicas se pueden separar de los compuestos no iónicos, y viceversa* y en ciertas circunstancias, las resinas de intercambio iónico pueden actuar como absorbentes sólidos o como disolventes de productos no iónicos. >n e&emplo de una separación sencilla que se puede conseguir por intercambio iónico es la de un conocido producto farmacéutico en tabletas contra el dolor de cabeza, el cual contiene cafeína, aspirina y fenacetina. La cafeína es una base débil que en soluciones acidas forma un catión* la aspirina o cido acetilsalicílico es un cido débil, que en solución bsica forma un anión% finalmente, la fenacetina es una sustancia neutra que no da lugar a aniones ni a cationes, aunque es absorbida por la acción 2disolvente3 de la resina. Las fórmulas son%
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>n esquema para su separación por intercambio iónico puede ser el siguiente% +afeína, aspirina, fenacetina +ada uno de estos compuestos se puede determinar por medición de su absorción en la región ultravioleta del espectro -odría conseguirse una separación anloga por etracción con disolventes. Gndudablemente, la aplicación ms importante del intercambio iónico al anlisis de compuestos orgnicos reside en el anlisis de mezclas de aminocidos. #stos constituyen los sillares de las proteínas y son liberados de las mismas por !idrólisis acida, calentndolas ba&o presión con cido clor!ídrico diluido. Las proteínas contienen cidos diferentes combinados en diferentes proporciones. "odos estos cidos contienen el grupo%
#n soluciones acidas este grupo se convierte en un catión por protonación del ?7% en soluciones bsicas forma un anión por pérdida de un protón del F +::. #n soluciones acidas, por lo tanto, los aminocidos se pueden fi&ar en resmas de intercambio catiónico. ?o obstante, son retenidos por fuerzas de diferente magnitud, pues unos lo son fuertemente y otros lo son débilmente, lo cual permite conseguir su separación por cromatografía. Se toma una columna larga rellena de una resina de intercambio catiónico en forma !idrógeno o en forma amónica y se introduce en su parte superior una peque'a cantidad de la mezcla de aminocidos. continuación se podría proceder a la separación de los cidos pasando cido clor!ídrico diluido o una solución de cloruro de amonio% los aminocidos absorbidos ms débilmente se desplazarían ms rpidamente, los absorbidos ms fuertemente lo !arían con ms lentitud. #n la prctica, no obstante, se utilizan soluciones reguladoras de cido cítrico con citrato de sodio o citrato de amonio, y se emplea la técnica llamada de 2elución con gradiente3. Se empieza con una solución tampón de p ba&o, por e&emplo ;,C o menor. este p casi todos los aminocidos forman cationes y son absorbidos fuerte8 mente. Sólo aquellos cidos absorbidos ms débilmente avanzan a una velocidad apreciable* éstos son los aminocidos en los que el carcter cido supera al carcter bsico, por e&emplo, el cido asprtico ::+ +,8 +?78+:: y el cido glutmíco ::+8+7 8+78+?78+::, que
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poseen dos grupos +:: y sólo uno ? 7. Bespués de que estos !an sido eluidos de la columna, se aumenta el p de la fase móvil adicionando cuidadosamente !idróido de sodio o citrato de sodio (siendo esto $ltimo lo recomendable). #n la técnica de 2elución con gradiente3, el citrato de sodio es adicionado de modo continuo al recipiente que contiene el eluyente de modo que el p de la solución crece uniformemente a medida que va pasando líquido. Be esta forma, se puede regular el avance de los diversos aminocidos a lo largo de la columna para que emer&an uno tras otro a intervalos ms o menos regulares. #n los estadios intermedios de la elución salen los aminocidos 2neutros3 que contienen un +:: y un ? 7 tales como la glicina + 7?78 +::, la alanina, + ;+?78+::0 y la tirosina :8+498+7 +?7 8+::. Los $ltimos en emerger son los cidos que poseen dos grupos bsicos y sólo un grupo cido, por e&emplo, la usina 7?8+7+7+7+?78+:T y la arginina ? 6 +(?7)?+78+7+7+?8+::. Los aminocidos se detectan de modo continuo y automtico a medida que salen de la columna. >na forma corriente de llevar a cabo esta detección consiste en mezclar la solución saliente con el reactivo nin!idrina y medir absorciométricamente los productos ro&os que se forman. >n problema bastante parecido al del anlisis de los aminocidos y que posee una importancia similar, es el del anlisis de los productos de !idrólisis de los cidos nucleicos, en particular del cido desoirribonucleico, o B?. #stos productos son de una gran variedad y su comple&idad abarca desde la de las cuatro bases, adenina, guanina, timina y citocina, a la de los nucleósidos (combinaciones base8az$car) y Uos nucleótidos (combinaciones base8az$car8 fosfato). "ambién para analizar estas mezclas se !a utilizado la cromatografía de intercambio iónico, tanto el catiónico como el aniónico. #l anlisis de las mezclas de cidos carboílicos tiene una cierta importancia en bioquímica vegetal y en el eamen de los zumos de fruta. #n las frutas se encuentran cidos tales como olico, lctico, tartrico, mlico. cítrico, malóni8 co y muc!os ms. -ueden separarse cromatogrficamente en columnas de resinas de intercambio aniónico, empleando una solución de nitrato de sodio como fase móvil.
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II. CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL La cromatografía de filtración en gel es una técnica que permite separar moléculas en función de su tama'o molecular. La capacidad separadora reside fundamentalmente en el gel cuya matriz consta de un gran n$mero de esferas porosas microscópicas. +ada gel se caracteriza por un rango de fraccionamiento que depende del tama'o de sus poros. #l ob&etivo de esta prctica es separar una mezcla de sustancias de distinto peso molecular por medio de una cromatografía en una columna de Sep!acryl S87CC H y determinar los correspondientes parmetros que caracterizan el comportamiento cromatogrfico de cada sustancia. / La purificación de una sustancia de interés se !ace siguiendo los criterios de separación basados en alguna propiedad física o química que diferencia al compuesto en cuestión de otros que en principio estarían ligados a él. #ntre los diversos criterios de separación cabe citar%
quellos que fraccionan las moléculas basndose en sus tama'os, como la cromatografía de filtración en gel y la ultracentrifugación. Los que separan las moléculas atendiendo a las diferencias en la carga eléctrica neta del compuesto, como la cromatografía de intercambio iónico y la electroforesis. Los que se basan en la retención específica de sólo uno o varios ti pos de moléculas, entre los que cabe destacar la cromatografía de afinidad. -rocedimientos de separación basados en diferencias de solubilidad. Kétodos basados en la adsorción diferencial a determinadas matrices.
La cromatografía de filtración en gel, ms corrientemente llamada de eclusión molecular, es una técnica de purificación muy etendida y apreciada debido a su sencillez y eficacia en la resolución de mezclas comple&as de macromoléculas. #sta técnica puede utilizarse con buenos resultados con fines analíticos (por e&emplo, para la determinación de pesos moleculares).
PROPIEDAD: "ama'o (y forma) Hesina de micropartículas esféricas formadas por polímeros SOPORTE !idrofílicos (detrano, agarosa, poliacrilamida o mezcla de ellos). "ama'os de poro à intervalo o rango de fraccionamiento. -.e.
Sep!ade Q75% Sep!ade Q7CC%
/CCC F 5CCC Ba 5CCC F 75CCCC Ba
(LMI>GB) solvente acuoso (el mismo que el de la F. ESTACIONARIA fase móvil) que se encuentra dentro de micropartículas.
F. MÓVIL (LMI>GB) solvente acuoso que atraviesa la columna por los espacios intersticiales (entre las micropartículas).
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PRINCIPIO DE LA CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL +on la cromatografía de filtración en gel se separan moléculas en virtud de sus diferencias de tama'o. La capacidad separadora reside en el gel cuya matriz consta de un gran n$mero de esferas porosas microscópicas. #stas esferas estn constituidas por largas cadenas de polímeros unidas entre si por enlaces químicos para formar una red tridimensional. #l gel, una vez !idratado, se deposita adecuadamente en una columna !ueca de vidrio quedando listo para su uso. Gnmediatamente se de&a en contacto con la muestra líquida que ba'a la superficie del gel depositado a manera de un filtro poroso que retiene un espacio muerto ocupado por relleno inerte , esto permite la salida de la muestra fraccionada. #n el interior de una columna de cromatografía pueden distinguirse varios vol$menes% #l volumen total (t), que es el volumen que ocupa el cilindro de gel !idratado.
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#l volumen de vacío (o), o el volumen eistente entre las esferas del gel. #l volumen ocupado por las esferas del gel, que se epresa como la diferencia entre los dos vol$menes anteriores% t8o.
+uando una mezcla de moléculas de diferentes tama'os se !ace pasar a través de la columna de gel, se produce la separación en virtud del siguiente principio% Las moléculas de muy peque'o tama'o penetran en el interior de las esferas que componen el gel y, por consiguiente, no son etraídas de la columna !asta que no !a pasado a través de ella un volumen de líquido igual a su volumen total (t). Sin embargo, aquellas moléculas cuyo tama'o es mayor que el de los poros de las esferas del gel, no pueden penetrar en su interior y atraviesan la columna recorriendo $nicamente el volumen vacío (o), siendo las primeras en salir de la columna. #l resto de las moléculas, de tama'o intermedio, presentan una mayor o menor facilidad para difundir al interior de las esferas en función de su tama'o, siendo etraídas fraccionadamente con vol$menes que estn comprendidos entre el t y el o. +uanto mayor es una molécula, menos capacidad tiene para acceder al interior de las esferas del gel y, por tanto, menor es el volumen de líquido que se requiere para etraerla de la columna. "eniendo en cuenta que para las proteínas globulares el tama'o est, en general, relacionado con el peso molecular, este tipo de cromatografía separa las sustancias en función de dic!os pesos moleculares, obteniéndose primero las ms pesadas.
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GRADOS DE LOS GELES +ada gel se caracteriza por un rango de fraccionamiento que depende del tama'o de sus poros. Vste viene epresado por dos n$meros que representan pesos moleculares, correspondiendo el menor de ellos al peso molecular mimo de una sustancia que difunda perfectamente a través de todos los poros del gel, y el mayor, al peso molecular mínimo que !a de tener una sustancia para que pueda ser ecluida de las esferas del gel. Las sustancias de peso molecular fuera de dic!o rango no son fraccionadas sino que se etraen con&untamente con el volumen vacío (o), las de peso molecular mayor que el rango, o con el volumen total (t), las ms peque'as que dic!o rango. #n el mercado se encuentran geles con rangos de fraccionamiento muy diversos (desde /.CCC85.CCC, !asta /C.CCC89.CCC.CCC), lo que posibilita la separación a diferentes escalas de pesos moleculares.
FACTORES QUE INFLU-EN EN LA SEPARACIÓN dems de la diferencia intrínseca de tama'o eistente entre las moléculas que van a ser cromatografiadas, !ay diferentes factores que influyen en una correcta separación de las mismas%
Longitud de la columna. La capacidad de separación de sustancias de diferente tama'o aumenta con la longitud de la columna. =lu&o. La resolución de la separación disminuye al aumentar el flu&o del líquido con que son arrastradas las moléculas a lo largo de la columna. ?ormalmente el flu&o oscila entre 7 y /C cm ! 8/. #l volumen de la muestra a cromatografiar. Bebe ser peque'o comparado con el volumen total de la columna. Las me&ores separaciones se obtienen aplicando vol$menes de muestra iguales o menores al 5A del volumen total. #mpaquetado del gel en la columna. Las propiedades separadoras del gel se alteran profundamente, e incluso desaparecen, cuando un gel no est empaquetado !omogéneamente en la columna o se encuentra ecesivamente comprimido.
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CARACTERI6ACIÓN DEL COMPORTAMIENTO CROMATOGR5FICO DE UN SOLUTO Los resultados de la cromatografía de filtración en gel se epresan !abitualmente en forma de grficas (cromatogramas) donde se representa la cantidad de solutos en función del volumen de líquido etraído de la columna (=ig. ;)
Se pueden utilizar varios parmetros para caracterizar el comportamiento cromatogrfico de una sustancia% olumen de elución (e). Se define como el volumen de líquido necesario para etraer una determinada sustancia. -resenta el inconveniente de depender fuertemente del volumen total de la columna. #l volumen de elución (e) de una sustancia varía entre t y o. +oeficiente de distribución (Jav). #s el parmetro ms correcto y también el ms ampliamente utilizado. #l Jav de una sustancia se define como% Jav 6 e8o1t8o #l valor de Jav oscila entre C (cuando e6o) y / (cuando e6t), y representa la fracción de volumen del interior de las esferas a la que accede cada sustancia en virtud de su tama'o. dems, el coeficiente de distribución est relacionado con el logaritmo del peso molecular de un soluto, a partir de su Jav, cromatografiando por filtración varios patrones de peso molecular conocido.
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III. CROMATOGRAFÍA DE GASES. La cromatografía de de gases es una técnica cromatografía en la que se muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatografía. La elución se produce por el flu&o de una fase móvil de gas inerte. diferencia de los otros tipos de cromatografía, la fase móvil no interacciona con las moléculas de del analito* su $nica función es la de transportar el analito a través de la columna. #isten dos tipos de +romatografía de Qases (Q+)% . +romatografía gas8sólido (QS+) . +romatografía Qas Líquido (QL+) Siendo ésta $ltima la que se utiliza ms ampliamente y que se pude llamar simplemente cromatografía de gases (Q+). #n la QS+, La fase estacionaria es sólida y la retención de los analitos en ella se produce mediante el proceso de absorción. -recisamente este proceso de absorción, que no es lineal, es el que !a provocado que este tipo de cromatografía tenga aplicación limitada, ya que la retención de analito sobre la superficie es semipermanente y so obtiene picos en elución con colas. Su $nica aplicación es la separación de especies gaseosas de ba&o peso molecular.
CROMATOGRAFIA DE GAS LIQUIDA 1GLC 7 GC.2 La QL+, utiliza como fase estacionaria moléculas de líquido inmovilizadas sobre la superficie de un sólido inerte. La Q+ se lleva acabo en un cromatógrafo de gases. #ste consta de diversos componentes como el gas portador, el sistema d inyección de muestra, la columna (generalmente dentro de un !orno) y el detector.
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TABLA DE CONTENIDOS Qas portador
Sistema de inyección de la muestra
+olumna y sistemas de control de temperatura
Betectores
+olumnas y tipos de fases estacionarias
plicaciones
Heferencias.
GAS PORTADOR #l gas portador debe ser un inerte, para prevenir una reacción con el analito o la columna. Qeneralmente se emplean como !elio, argón, nitrógeno, !idrógeno, dióido de carbono y la elección de este gas en ocasiones depende del tipo de detector empleado. #l almacena&e del gas puede ser en balas normales o empleando un generador, especialmente en el caso del nitrógeno y del !idrógeno. Luego tenemos un sistema de manómetros y regladores de flu&o para garantizar un flu&o estable y un sistema de des !idrogenación del gas, como puede ser un tamiz molecular.
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Qeneralmente la regulación de la presión se !ace a dos niveles% >n primer manómetro se sit$a a la salida de la bala o generador del gas y el otro a la entrada del cromatógrafo, donde se regula el flu&o. Las presiones de entrada entre /C y 75 psi, lo que da lugar a caudales de 75 a /5C mL1min en columnas de relleno y de / a 75 mL1min en columnas capilares. -ara comprobar el caudal se puede utilizar un rotmetro o un simple medidor de pompas de &abón, el cual da una mediada muy eacta al caudal volumétrico que entra a la columna.
SISTEMA DE IN-ECCION DE MUESTRA La inyección de muestra es un aparato crítico, ya que se debe inyectar una cantidad adecuada y debe introducirse de tal forma (tapón de vapor) que sea rpida para evitar el ensanc!amiento de la bandas de salida* este efecto se !a dado con cantidades elevadas de analito. #l método ms utilizado emplea una micro &eringa (de capacidades de varios micro litros) para introducir el analito en una cmara de vaporización instantnea. #sta cmara est 5C o+ por encima del punto de ebullición del componente menos voltil y est sellada por una &unta de goma de silicona septo o septum.
Si es necesario una reproductividad del tama'o de muestra inyectado se puede usar una vlvula de inyección, donde la cantidad a inyectar es constante y determinada por el tama'o del bucle de dic!a vlvula. Si la columna empleada en ordinaria, el volumen a inyectar ser de unos 7C L y el caso de las columnas capilares de dic!a cantidad es menor de /C 8; L. -ara obtener estas cantidades, se utiliza un divisor de flu&o a la entrada de la columna que desec!a parte del analito introducido.
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#n caso de muestras sólidas, simplemente se introducen en forma de disolución, ya que en la cmara de vaporización instantnea el disolvente se pierde en la corriente de purga y no interfiere en la elución. Seg$n las curvas de an Bemter (#-" vs. elocidad lineal), el me&or gas a usar en la columna cromatogrfica como portador de los analitos es el !idrógeno, sin embargo, dada su peligrosidad, es ms usando como gas de encendido en el detector =GB, &unto con el aire.
COLUMNAS - SITEMAS DE CONTROL DE TEMPERATURA #n Q+ se emplea dos tipos de columnas% L"s empaquetaduras o de relleno y las tubulares abierta o capilares. #stas $ltimas son ms comunes en la actualidad debido a su mayor rapidez y eficiencia. La longitud de onda de estas columnas es variable, de 7 a 5C metros, y estn construidas en acero inoidable, vidrio, sílice fundida o teflón. Bebido a su longitud ya la necesidad de ser introducidas en un !orno, las columnas suelen enrollarse en una forma !elicoidal con dimetros de / a ;C cm, dependiendo del tama'o del !orno. La temperatura s una variable muy importante, ya que de ella a depender el grado de separación de los diferentes analitos. -ara ello, debe a&ustarse con una precisión de décimas de grado. Bic!a temperatura depende del punto de ebullición del analito o analitos y por lo general se a&ustan a un valor igual o ligeramente superior a él. -ara estos valores, el tiempo de elución va a oscilar entre 7 y ;C89C minutos. Si tenemos varios componentes con diferentes puntos de elución, se a&usta la llamada Hampa de temperatura, con lo cual ésta va aumentando ya sea en forma continua los etapas. #n muc!as ocasiones, el a&ustar correctamente la rampa pude significar separar bien o no los diferentes analitos. #s recomendable utilizar temperaturas ba&as para la elución ya que aunque a mayor temperatura la elución es ms rpida, se corre el riesgo de descomponer el analito.
DETECTORES #l detector es la parte del cromatógrafo que se encarga de determinar cundo !a sido salido el analito por el final de la columna. Las características de un detector ideal son% Se*si8i(id"d% #s necesario que pueda determinar con precisión cuando sale el analito y cundo sale sólo el gas portador. "ienen sensibilidades entre /C8@ y /C8/5 g1s de analito
Resp)es#" (i*e"( "( "*"(i#o% +on rango de varios órdenes de magnitud
Tie!po de esp)es#" co#o% Gndependiente del caudal de salida.
I*#e9"(o de #e!pe"#)" de #"8"o "!p(io% -or e&m desde temperatura de ambiente !asta ;5C89CC o+, temperaturas típicas traba&o.
No de8e des#)i (" !)es#"
Es#"8i(id"d ; epod)ci8i(id"d% #s decir, a cantidades iguales de analito debe dar salida de se'al igual.
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A(#" %i"8i(id"d ; de !"*eo se*ci((o% prueba de operadores inepertos
Resp)es#" se!e"*#e p"" #odos (os "*"(i#os
Resp)es#" se(ec#i9" ; "(#"!e*#e pedeci8(e% -ara un reducido n$mero de analitos.
A($)*os Tipos de De#ec#oes: Betector de ionización de llama (=GB, =lame Gonization Betector).
Betector de conductividad térmica ("+B, termical +onductivity Betector)
Betector "ermoiónico ("GB, "!ermonic Betector)
Betector de +aptura de #lectrones #+B, #lectrón8+apture Betector).
Betector de emisión atómica (#B. tomic #misión Betector).
:tros detectores minoritarios son el Betector de =otómetro de llama (-=B),, empleado en computo como pesticidas e !idrocarburos que contengan fósforo o azufre. #n este detector se !ace pasar el gas eluído por una llama !idrógeno1oígeno donde parte del fósforo se convierte en una especie -:, la cual a 5/C y 574 nm, y simultneamente el azufre se convierte en S 7 , con emisión a ;N9 nm. Bic!a radiación emitida se detecta con un fotómetro adecuado. Se !an podido detectar otros elementos, como algunos !alógenos* nitrógeno etra'o* germanio y otros. #n el detector de fotoionización (-GB), el gas eluido al final de la columna se somete a una radiación ultravioleta con energías entre @.; y //,P e, correspondiente a una a una /C48/9N nm. Kediante la aplicación de un potencial a la celda de ionización se genera una corriente de de iones, la cual es amplificada y registrada.
COLUMNAS - TIPOS DE FASES ESTACINARIAS Co()!*"s de e((e*o Las columna de relleno o empacadas consisten en unos tubos de vidrio, metal (inerte a ser posible como el acero inoidable, ?íquel, cobre o aluminio) o teflón, de longitud de 7 a ; metros y un dimetro interno e unos pocos milímetros, típicamente de 7 a 9. #l interior se rellena con un material sólido, dividido para tener una mima superficie de interacción y recubierto con una capa e espesores entre 5C nm y / m. -ara que puedan introducirse en el !orno, se enrollan convenientemente. #l material de relleno ideal consiste en peque'as partículas, esféricas y uniformes, con una buena resistencia mecnica, para tener una mima superficie donde interaccionara la se estacionaria y el analito. La superficie especifica mínima !a de ser de / m 71seg. +omo todos los componentes de la columna para Q+, debe ser inerte a las altas temperaturas (89CC o+ y !umectantes uniformemente con la fase líquida estacionaria durante el proceso de fabricación. #l material referido actualmente (7CC5) es la tierra de diatomeas natural, debido a su tama'o de 27
poro natural. #stas especies, ya etinguidas utilizaban un sistema de difusión molecular para tomar nutrientes del medio y epresar sus residuos. -or tanto, debido a que el sistema de adsorción superficial del analito y la fase estacionaria es parecido, son materiales especialmente $tiles. #l tama'o es crítico a la !ora de darse el proceso de interacción el analito y a menores tama'os la eficacia de la columna es me&or. -ero eiste el problema de la presión necesaria para !acer circular un caudal estable de gas portador por la columna, ya que dic!a presión es inversamente proporcional al cuadrado del dimetro de dic!as partículas. sí el tama'o mínimo ara usar presiones mimas de 5C psi es de 75C a/9N m.
COLUMNAS CAPILARES Las columnas capilares son de dos tipos bsicos% Las de pared recubierta (E+:") y las de soporte recubierto (S+:"). Las E+:" son simplemente los tubos capilares donde la pared interna se !a recubierto con una finísima capa de fase estacionaria. Las columnas S+:" tienen en su parte interna una fina capa de material absorbente como el empleado en las columnas de relleno (tierra de diatomeas) donde se !a ad!erido la fase estacionaria. Las venta&as de las S+:" frete a las E+:" es la mayor capacidad de caga de ésta $ltima, ya que en su fabricación se emplean mayores cantidades de fase estacionaria, al ser la superficie de intercambio mayor. -o orden de eficacia, en primer lugar estn las E+:", luego las S+:" y por $ltimo las columnas de relleno. Las columnas E+:" se fabrican a partir de sílice fundido, conocidas como% Columnas tubulares abiertas de sílice fundido o =S:". #stas columnas fabrican a partir de sílice especialmente pura, sin apenas contenido de óidos metlicos. Bebido a la fragilidad in!erente a este material, en el mismo proceso de obtención del tubo se recubre con una capa de poliamida, de esta forma la columna pude enrollarse con un dimetro de unos pocos cm. #stas columnas, con propiedades con ba&a reactividad, resistencia física y fleibilidad, !an sustituido a las E+:" clsicas. Las columnas =:S" tienen dimetros internos variables, entre 75C y ;7Cm (para columnas normales) t de /5C87CC m para columnas de alta resolución. #stas $ltimas requieren menor cantidad de analito y un detector ms sensible, al eluír menor cantidad de gas. #isten así mismo columnas macro capilares con dimetros de !asta 5;C m, que admiten cantidades de analito comparables a las de relleno pero con me&ores prestaciones. #n estas columnas eisten un problema debido a la adsorción del analito sobre la superficie de la sílice fundida, adsorción debida a la presencia de grupos silanol 1Si8:), los cuales interacciona frecuentemente con moléculas polares orgnicas. #ste inconveniente se suelo solventar inactivando la superficie por sililación con dimetilclorosilano (B+S). La adsorción debida a los óidos metlicos se v paliada en gran pate por la elevada pureza de a sílice empleada.
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FASE ESTACIONARIA
Las propiedades necesarias para una fase estacionaria líquida inmovilizada son%
+aracterísticas de reparto (factor de capacidad W0 y factor de selectividad ) adecuado al analito.
a&a volatilidad, el punto de ebullición de la fase estacionaria debe ser al menos /CCo+ mayor que la mima temperatura alcanzada en el !orno.
a&a reactividad
#stabilidad térmica, ara evitar su descomposición durante la elución.
#isten como muc!o una docena de disolvente con estas características. -ara elegir uno, debe tenerse en cuenta la propiedad del analito, ya que a mayor polaridad del analito, mayor polaridad deber tener la fase estacionaria. lgunas fases estacionarias utilizadas actualmente son% -olidimetilsiloano, fase no polar de uso general para !idrocarburos aromticos, polinucleares, drogas, esteroides y -+s.
-oli (fenilmetildifenil) siloano (/CA fenilo), para esteres metílicos de cidos grasos, alcaloides, drogas y compuestos !alogenados.
-oli (fenilmetil)siloano (5CAfenido), para drogas, esteroides, pesticidas y glicoles.
-oli(trifluoropropildimetil) siloano, para aromticos clorados, nitro aromticos, bencenos alquilsustituidos.
-oli etilenglicol, sirve para compuestos polares, también para compuestos como glicoles, alco!oles, éteres, aceites esenciales.
-oli (dicianoalildimetil) siloano, para cidos grasos poli insaturados, cidos libres y alco!oles.
Qeneralmente, en columnas comerciales, la fase estacionaria se presenta enlazada y entrecruzada para impedir su pérdida durante las operaciones de elución o lavado .Be esta forma se obtiene una mono capa ad!erida químicamente a la superficie de la columna. La reacción implicada suele ser la adición de un peróido al líquida a fi&ar, inicindose una reacción por radicales libres que tiene como resultado la formación de un enlace carbono8carbono que adems incrementa su estabilidad térmica. :tra forma es la radiación con rayos gamma. :tro tipo de fase estacionaria son los quirales, lo cual permite resolver mezclas enantioméricas. #ste tipo de fase suelen ser aminocidos quirales o alg$n derivado adaptado al traba&o en columna. #l grosor de la película varia entre C,/y 5 m* el grosor depende de la volatilidad del analito. simismo muy voltil requerir una capa gruesa para
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aumentar el tiempo de interacción y separar efectivamente los diferentes componentes de la mezcla. -ara columnas típicas (dimetros internos de C.75 o C.;7 mm) se emplean grosores de C.75 m, y en las columnas macro capilares el grosor sube !asta / m. el grosor mimo suele ser de @ m.
APLICACIONES La Q+ tiene dos importantes campos de aplicación. -or una parte su capacidad para% Separar mezclar orgnicas comple&as
+ompuestos organometlicos
y sistemas bioquímicos.
Su otra aplicación es como método para determinar cuantitativa y cualitativamente los componentes de la muestra. -ara el anlisis cualitativo se suele emplear el tiempo de retención* que es $nico para cada compuesto dada unas determinadas condiciones (mismo gas portador, rampa de temperatura y flu&o), o el volumen de retención. #n aplicaciones cuantitativas* integrando las reas de cada compuesto o midiendo su altura* con los calibrados adecuados* se obtiene la concentración o cantidad presente de cada analito.
ESPECTROMETRIA DE MASAS DE ME6CLAS La técnica combinada de cromatografía de gases y espectrometría de masas permite realizar anlisis rutinarios de mezcla de compuestos como las mezclas que se obtienen en la reacciones o Las muestras que se recogen en el medio ambiente la figura /78/P muestra un diagrama simplificado de +Q8#K. #l cromatografía de gases utiliza una columna capilar incluida en un !orno termostatizado. #sta columna est revestida en su interior con gel de sílice 1u otra fase estacionaria), cuya diferente interacción con la sustancia de las mezclas permiten separar los componentes de la misma. Se inyecta una peque'a cantidad de muestra (/C84 gr. suele ser suficiente) en un inyector calentado que permite la volatilización de la muestra. Los componentes voltiles son empu&ados, entonces, a lo largo de la columna capilar por una corriente de !elio. medida que la muestra pasa a través de la columna, los componentes ms voltiles(o bien que interaccionan menos con la fase estacionaria) se mueven ms rpidamente a través de la columna que los componentes menos voltiles. Los componentes, separados, abandonan la columna a tiempos diferentes, pasando mediante un conducto de transferencia a la fuente de iones del espectrómetro de masas, donde las moléculas se ionizan y se fragmentan. La mayoría de los sistemas acoplados, cromatógrafo de gases8 espectrometría de masas, utilizan un cudruplo como sistema de Xfiltrado o discriminación de masas, para separar los iones. alto vacío, los iones pasan por el espacio entre cuatro barras, las cuales estn sometidas a volta&es variables (en la fig. /78/P estn representado dos de los cuatro rodillos). Los campos eléctricos variables !acen que los iones sigan órbitas comple&as y 30
que, en cada instante sólo fragmentos como una masa concretas lleguen al detector variando o !aciendo un barrido de volta&e, se pueden medir un amplio intervalo de masas en menos de / seg. Be esta forma e pueden realizar muc!os espectros de masas, que se almacena en el computador a medida que los componentes de la muestra pasan desde la columna del cromatógafo al espectrómetro de masas. #sta poderosa combinación +Q.#K permite que el coromatógrafo de gases separe los componentes de la mezcla y que posteriormente sean identificados por su espectro de masas.
IV. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA I*#od)cci7* La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la etensión, otro para aplicar la capa de adsorbente, y una cmara en la que se desarrollen las placas cubiertas. #s preciso también poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas. La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionaria ser un componente polar y el eluyente ser por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos polares. -olaridad de los compuestos orgnicos en orden creciente% !idrocarburos Y olefinas Y fluor Y cloro Y nitro Y alde!ído alde!ído Y ester Y alco!ol Y cetonas Y aminas Y cidos Y amidas
Ve*#""s de (" co!"#o$"%&" e* c"p" %i*" La cromatografía en capa fina presenta una serie de venta&as frente a otros métodos cromatogrficos (en columna, en papel, en fase gaseosa, ...) ya que el utilla&e que precisa es ms simple. #l tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es muc!o menor y la separación es generalmente me&or. -ueden usarse reveladores corrosivos, que sobre papel destruirían el cromatograma. #l método es simple y los resultados son fcilmente reproducibles, lo que !ace que sea un método adecuado para fines analíticos.
Adso8e*#es l realizar la elección del adsorbente se debe tener en cuenta el tama'o de las partículas del adsorbente, cuanto ms finamente dividido esté mayor ser su ad!esión al soporte, aunque también se le puede a'adir un ad!erente (yeso,...). lgunos de los adsorventes ms utilizados son% 31
+elulosa lmidón zucares Qel de sílice (silicagel) Tido de aluminio (al$mina) +arbón activo (carbón en polvo) Jieselgu!r
Los tres primeros se utilizan para etraer componentes polifuncionales de plantas y animales.
Si(ic"$e( #l gel de sílice o cido silícico es uno de los ms utilizados, es débilmente cido, su p oscila entre 985. +on lo cual no se deber utilizar con sustancias que se corrompan con los cidos. Los geles de sílice normales suelen contener impurezas de !ierro y1o aluminio, este factor también se debe tener en cuentas respecto al uso de componentes. #l tama'o del grano suele ser de /C a 9C micras () y el tama'o de poro varía de 7C a /5CZ. Qeneralmente lleva incorporado un agente aglomerante, yeso (sulfato de clcico semi!idratado), para proporcionar firmeza al adsorbente. "ambién !an sido incorporados dos indicadores del ultravioleta, &untos o por separados (amarillo y1o verde), en diversos tipos de gel de sílice. Se trata de un adsorbente polar, pero puede ser tratado con !idrocarburos para neutralizar los grupos 8:, de forma que se !aga apto para separar componentes lipófilos (esteroides, cidos grasos, ceras, vitaminas liposolubles, etc). este proceso se le denomina cromatografía de fase reversa (silanizado).
A(
Pep""ci7* de p("c"s. #l adsorvente se deslíe en agua destilada. -ara mezclar la papilla !omogéneamente es preferible agitar de modo mecnico. La proporción de adsorbente y agua depende del tipo de adsorbente. Bos parte de agua y una de adsorbente pueden tomarse como norma general, no obstante, !abrn de consultarse la instrucciones del fabricante. 32
:riginariamente se utilizaban, como soporte del adsorbente, lminas de vidrio, pero en la actualidad también se utilizan lminas de otros compuestos orgnicos ms fleibles. Bependiendo del tipo de separación que se desee (cualitativa o preparativa) se utilizar un tama'o de placa u otro. #n general para realizar una separación preparativa de un gramo de muestra es necesario una placa de vidrio de 7C7C cm., ;5 gramos de adsorbente y @C ml. de agua destilada. Las propiedades de la fase estacionaria pueden alterarse mediante la adición de compuestos tales como disoluciones tamponadoras para mantener el p deseado. #n la preparación de las placas también se pueden adicionar indicadores fluorescentes o aglomerantes. +abe destacar la adición de nitrato de plata (g?:;), a este proceso se le denomina argentación, y se utiliza para separar componentes insaturados. #l espesor de la placa es otro factor a tener en cuenta al preparar la placa, en general suele ser de% C./8C.7 mm. para separaciones analíticas. C.58 7 mm. para separaciones preparativas. La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades, que afectarían al desarrollo del proceso cromatogrfico. -ara ello eisten en el mercado e!tensores que se utilizan para crear de forma mecnica placas !omogéneas del espesor deseado. Si no se disponer de etensor, el proceso a seguir es el siguiente% /. 7. ;. 9. 5.
Kezclar en un #rlenmeyer el agua y el adsorbente. gitar enérgicamente. #tender la papilla sobre el soporte de vidrio. acer oscilar la papilla de un lado a otro. Qolpear con el dedo la parte inferior del soporte.
Las placas, normalmente, se de&an reposar un corto espacio de tiempo después de cubrirlas* luego se colocan en bande&as metlicas. #n este momento puede activarse el agente adsorbente, bien de&ando las placas reposar toda la noc!e a temperatura ambiente, bien calentndolas durante ;C84C minutos a /C58//C [+ (las placas de celulosa no deben calentarse ms de /C minutos a /C5 [+) para epulsar así el aire. #s conveniente de&ar secar las placas inicialmente al aire, para evitar los agrietamientos que se producirían por efecto del cambio de temperatura.
Ap(ic"ci7* de ("s !)es#"s Los productos a eaminar se disolvern, cuando sea posible, en un disolvente orgnico no polar que tenga un punto de ebullición lo suficientemente ba&o para que se evapore después de la aplicación.. Sin embargo a menudo se necesitan disolventes polares* la mezcla cloroformo%metanol (/%/) es efectiva. 33
=recuentemente se emplean disoluciones al /A, de manera que al aplicar 7 l resulta en la carga 7C g de producto sólido. Kuc!os reactivos de revelado llegan a detectar C./ g de material* por esto con esta carga puede llegarse a observar un 5A de impurezas. #isten una gran variedad de micropipetas y micro&eringuillas para realizar el proceso de siembra de la muestra a analizar. "ambién pueden usarse tubos capilares. #l proceso de siembra se realiza tocando con la punta del capilar (micropipeta, &eringuilla, etc) sobre la placa preparada. Be&ando una distancia al borde inferior de un centímetro aproimadamente. #l punto de aplicación de la muestra se denomina toque. >na vez colocado el toque se de&a secar para evaporar el disolvente, de forma que en la placa solo quedar la muestra a analizar.
E(ecci7* de( e();e*#e La elección del eluyente depender lógicamente del componente que se va a separar y del material en que la separación se lleva a cabo. -rincipales eluyentes en orden creciente de polaridad% #ter de petróleo. #ter dietílico. +iclo!eano. cetato de etilo. "etracloruro de carbono.\ -iridina. enceno.\ #tanol. +loroformo.\ Ketanol. Biclorometano. gua. ]cido acético. \compuestos cancerígenos. #n la elección del eluyente influyen varios factores%
-recio. -ureza. ?o utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad). ?o utilizar compuestos muy voltiles. #vitar que contengan trazas de metales (catalizadores).
La elección del eluyente se realiza de forma empírica. ay que estudiar la polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.
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a) "oque de la muestra sin aplicar ning$n eluyente. b) plicando un eluyente poco polar. c) plicando un eluyente ms polar. l aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir utilizando la misma placa para aplicar otros eluyentes ms polares, !asta dar con el ms apropiado. :tra técnica para realizar la elección del eluyente consiste en sembrar varias muestras distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo capilar distintos eluyentes sobre el centro de cada muestra. #sto permite desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de forma que se aprecie el eluyente con el cual la separación se realiza de una manera ms eficaz.
Des"o((o de (" co!"#o$"%&" #l desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el método ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi en vertical, por la acción de la capilaridad. La cromatografía se realiza en una cubeta. -ara conseguir la mima saturación posible de la atmósfera de la cmara, las paredes se tapizan con papel impregnado del eluyente. veces pueden obtenerse separaciones me&ores sin poner papeles en las paredes, cosa que no debe olvidarse. Qeneralmente el eluyente se introduce en la cmara una !ora antes del desarrollo, para permitir la saturación de la atmósfera. #l tiempo de desarrollo, por lo general, no llega a los ;C minutos. #l tiempo de una cromatografía cualitativa suele ser de un par de minutos, mientras que el tiempo de una cromatografía preparativa puede llegar a un par de !oras. Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefi&ado, o !asta que se alcance una línea dibu&ada a una distancia fi&a desde el origen. #sto se !ace para estandarizar los valores de "F . =recuentemente esta distancia es de /C cm.* parece ser la ms conveniente para medir valores de "F . Bespués del desarrollo, las placas pueden secarse rpidamente con una corriente de aire caliente.
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La me&or posición de desarrollo para un componente es el punto medio entre el origen y el frente del eluyente, ya que permite separar las impurezas que se desplazan con mayor y menor velocidad. #l frente del eluyente nunca debe llegar a tocar el borde de la placa. Si la placa se estropea por acción del aire o de la luz, se secar en una cmara que contenga un gas inerte o aislada de la luz.
Loc"(i'"ci7* de s)s#"*ci"s Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posición de dic!os compuestos, para ello eisten dos tipos de métodos%
Kétodos químicos. Kétodos físicos.
M=#odos >)&!icos +onsisten en realizar una reacción química entre un reactivo revelador y los componentes separados, para ello se pulveriza la placa con los reactivos reveladores con la ayuda de un pulverizador de vidrio y una pera de goma, o mediante un dispositivo que proporcione aire comprimido. #s preferible pulverizar con las placas en posición !orizontal. Si el reactivo revelador es peligroso o muy corrosivo, la pulverización deber realizarse en una vitrina de gases bien ventilada. La pulverización se realizar poco a poco. #n cromatografía en capa fina no puede realizarse el ba'ado del cromatograma (en cromatografía en papel sí). Qeneralmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma comple&os coloreados con los componentes orgnicos (con tonos amarillo8marrón), pero las manc!as desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente se'alar las manc!as aparecidas. :tro reactivo revelador bastante utilizado es el cido sulf$rico, que reacciona con los componentes orgnicos produciendo manc!as negras. #l tama'o de las manc!as no est relacionado con la cantidad de componente separado. dems de estos reveladores generales, eisten otros específicos%
7,9 8 dinitrofenil!idracina (para alde!idos y cetonas). erde de bromocresol (para cidos carboílicos). -aradimetil aminobenzalde!ido (para aminas). 36
?in!idrina (para aminocidos).
M=#odos %&sicos. #l ms com$n consiste en a'adir al adsorbente un indicador fluorescente. Be tal forma que al colocar la placa ba&o una lmpara ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la longitud de onda, aparecen manc!as fluorescentes en las zonas en las que !ay componentes, o en otros casos aparece toda la placa fluorescente ecepto donde !ay componentes. lgunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo que pueden ser detectados directamente en una lmpara de ultravioleta.
Co*s#"*#es R% - R? La constante "F (Hatio of =ront) es simplemente una manera de epresar la posición de un compuesto sobre una placa como una fracción decimal, mide la retención de un componente. Se define como%
La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la manc!a, los clculos se simplifican si el denominador es /C. -ara que los "F sean reproducibles deben ser fi&adas una serie de condiciones (#spesor de la placa, fase móvil, fase estacionaria, cantidad de muestra). #l mimo valor de "F que se puede alcanzar es de /, lo ideal es un "F entre C.45 y C.P. -ara averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma placa y se desarrolla con varios eluyentes. >na vez desarrollados se calculan los "F y si son distintos, puede deducirse con toda seguridad que no se trataba del mismo compuesto. -or el contrario si los "F son iguales los compuestos pueden ser iguales o no serlo. Si se sospec!a que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma placa con el mismo eluyente u otros de menor polaridad, !asta apreciar una separación mínima. #n este caso no se pueden usar reveladores químicos, ya que alterarían los compuestos, sino indGcador ultravioleta. "ambién se puede operar de la manera siguiente% Se selecciona un compuesto (^), que tenga una posición de desarrollo conveniente* todos los dems compuestos sobre la placa se relacionan con éste. Be esta manera se tiene el , "# , ya que%
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V. CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN Se realiza generalmente en columna (también es posible en capa fina), que se rellena de un adsorbente adecuado. #l sistema es ba'ado por un solvente que fluye a través de la columna para comprobar el funcionamiento de la misma. -or la parte superior se introduce la sustancia a separar disuelta adecuadamente. Se de&a fluir por la columna. ntes de que ésta quede totalmente seca se incorporan los disolventes de acuerdo con la solubilidad de las sustancias, sufriendo durante su arrastre interacciones de polaridad con el sólido adsorbente. Los eluatos son recogidos para su determinación posterior, normalmente por un método espectroscópico (espectrofotometría, espectrofluorimetría). Las separaciones se basan en las diferencias de distribución de los solutos entre el adsorbente (fase estacionaria) y el disolvente (fase móvil) de acuerdo con sus respectivas isotermas de adsorción. Los adsorbentes ms utilizados, ordenados de mayor a menor actividad son% / _ l$mina 7 _ Sílice ; _ +arbonato clcico #ste tipo de cromatografía se utiliza en el laboratorio clínico para la separación de /P8cetoteroides, /P8!idroicorticoides, catecolaminas y otras sustancias urinarias.
Bentro de esta técnica pueden diferenciarse dos tipos de cromatografías de adsorción denominadas cromatografía cromatografía de columna y de capa fina (abreviada "L+, del inglés "!in Layer +!romatograp!y). -ara la técnica de cromatografía de adsorción en columna se emplean columnas verticales de vidrio cerrada en su parte inferior con una llave que permita la regulación del flu&o de la fase móvil. Las columnas se rellenan con un adsorbente, como al$mina o gel de sílice (fase estacionaria), mo&ado con el disolvente que se vaya a emplear en 38
el proceso cromatogrfico. #n la parte superior de la columna se pone la disolución de la mezcla a separar y a continuación un depósito que contenga el eluyente (fase móvil) que se va a utilizar en la separación. Se abre la llave inferior de manera que el eluyente comience a ba&ar por la columna. #n este proceso, los componentes de la mezcla son adsorbidos por la fase estacionaria con diferente intensidad, de manera que el proceso de adsorción8desorción !ace que unos componentes avancen ms rpidamente que otros. #l líquido que sale por la parte inferior de la columna se recoge de manera fraccionada. Si los componentes de la mezcla avanzan a muy diferente velocidad se podrn obtener fracciones cromatogrficas constituidas por un solo componente.
SOLVENTES PARA LA CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
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