Universidad Autónoma de Chiriquí Facultad de Ciencias Naturales y Exactas Escuela de Química
Curso de Bioquímica II (QM 382-L)
Aislamiento de ARN
Estudiantes: Bejerano Daniel 4-777-1401 Castro Lidia P.
4-759-375
Sobenis Eira M. 4-758-271
Profesora: Albertina Montenegro
II Semestre 2012
Fecha de entrega: 15/10/2012
Aislamiento del ARN en la levadura
I-
Objetivos:
1- Aislar muestras de ARN provenientes de la levadura. 2- Determinar el mecanismo de extracción del ARN.
II-
Introducción:
Los ácidos nucleícos codifican la información referentes la estructura y a la función de la célula. Las células tienen la capacidad de hacer copias exactas de su ADN y de pasar esta información a las células de la hija. El ADN también sirve como plantilla para la síntesis del ARN, o transcripción. Los diversos tipos de ARN se conocen como ARN ribosomal (ARNr), ARN de la transferencia ARN t), y ARN del mensajero (ARNm). El ARNm se procesa y se traduce a las proteínas. (El ARNm y el tARN) son componentes necesarios para la traducción de la proteína. La manipulación y secuenciación de los ácidos nucleícos son a menudo un acercamiento más fácil para estudiar la función de la proteína y estructura que aislando y caracterizando las proteínas. (Roca, P 2004) Aislamiento de Ácidos Nucleicos
Tres tipos importantes de técnicas, o combinaciones de ellas, se emplean en el aislamiento de ácidos nucleicos: solubilidad diferenciada, métodos de la absorción, o centrifugación del gradiente de densidad. La opción del método dependerá del tipo de ADN que sea aislado y del uso. Una meta importante del aislamiento del ácido nucleicos es la remoción de proteínas. La separación de ácidos nucleicos de las proteínas es logrado fácilmente debido a sus diversas características químicas. En particular, las estructuras de fosfato altamente cargadas hacen que los ácidos nucleicos algo hidrofílicos con respecto a las proteínas que son más hidrofóbicas. La separación de los diversos tipos de ácidos nucleicos puede ser más problemática en aquellos que tienen químicas similares. Por otra parte, aunque, esta
química similar da lugar a algunos procedimientos básicos que sean comunes a muchos protocolos del aislamiento del ácido nucleicos. (Aguilera, A 1996) La mayoría de los protocolos de aislamiento del ácido nucleico implican un paso de la lisis de la célula, tratamientos enzimáticos, solubilidad diferenciada (eg., extracción o absorción del fenol a una ayuda sólida), y precipitación. La mayoría de los protocolos del aislamiento del ARN también implican extracciones del fenol y son similares a los aislamientos del ADN. Sin embargo, hay algunas diferencias y consideraciones especiales. Las precauciones contra actividad del ARN se deben ser tomadas. El ARNes una enzima extremadamente estable y activa. Los guantes deben ser usados siempre y el quipo estéril debe ser utilizado siempre que sea posible evitar la introducción el ARN es exógeno a la muestra. La cristalería necesita tratado con el DEPCagua y esterilizado para hacer inactivo cualquier ARNse. Los buffer se deben preparar del DEPC-agua o de los inhibidores del ARN incluidos. (Bernadette F. – 2005)
III-
Materiales y Reactivos: Instrumento
Cantidad
Capacidad
Goteros
2
-
Probetas
2
100 mL
Centrifugadora
1
-
Varilla de vidrio
2
-
Vasos Químicos
4
100, 250 mL.
Filtro de papel
2
-
Tubos de centrifugar
3
-
Reactivos:
Solución de fenol al 90 % Propiedades físicas: Estado de agregación: Sólido Apariencia: Blanco-incoloro Densidad 1.070 kg/m3; 1.07 g/cm3 Masa molar: 94.11 g/mol Punto de fusión: 40,5 °C (314 K)
Punto de ebullición: 181,7 °C (455 K)
Riesgos para la salud: Es un veneno protoplasmático general y es corrosivo por contacto con cualquier tejido. Principalmente ingresa al organismo por la piel o por ingestión, la absorción por la piel es rápida. En forma líquida o en polvo es extremadamente corrosivo, el contacto con los ojos puede causar grandes daños, incluso llegar a la ceguera y la ingestión de 1g puede ser fatal.
Acetato de potasio Propiedades físicas: Apariencia: polvo cristalino Densidad: 1570 kg/m3; 1,57 g/cm3 Masa molar: 98.15 g/mol Propiedades químicas: Acidez 9.7 (0.1 M solution) pKa Solubilidad en agua, Solubilidad en metanol, etanol
Riesgo Inhalación: irritación suave en las vías respiratorias. Ingestión: grandes dosificaciones puede producir disturbios gastrointestinales. Contacto con la piel: Irritación y enrojecimiento. Contacto visual: enrojecimiento e irritación.
Alcohol etílico C2H6O Apariencia: Líquido incoloro volátil de olor característico y agradable. Punto de Ebullición (ºC): 78 - 79 Punto de Fusión (ºC): -114 Presión de Vapor (mm Hg): 44.0 / 20°C Solubilidad: Soluble en agua, alcohol metílico, éter, cloroformo, acetona y benceno.
Riesgos para la salud Inhalación: Altas concentraciones del vapor pueden causar somnolencia, tos, irritación. Ingestión: Sensación de quemadura. Actúa al principio como estimulante seguido de depresión, dolor de cabeza, visión borrosa, somnolencia e inconsciencia. Piel: Resequedad. Contacto con los ojos: Irritación, enrojecimiento, dolor, sensación de quemadura.
Éter etílico Estado de agregación: Líquido Apariencia: Incoloro 3 Densidad; 0.7134 g/cm Solubilidad: 6.9 g/100 ml H2O (20 °C) Punto de fusión: −116,3 °C (156,85 K) Punto de ebullición: 34,6 °C (307,75 K) Viscosidad: 0,224 cP a 25 °C (298 K) Momento dipolar: 1,15 D
Riesgo para la salud Inhalación: causa náuseas, vómito, dolor de cabeza y perdida de la conciencia , irritación del tracto respiratorio Contacto con los ojos: Irritación levemente
Contacto con la piel: Produce resequedad y dermatitis Ingestión: produce síntomas narcóticos
Levadura Propiedades Físico-QuímicasTOXICOLOGÍA: Nada Estado físico : granulado friable Peligro de explosión : ninguno
IV-
Procedimiento
1-
Se disolvió 30 g de levadura seca en 150
de agua Y se colocó la solución en
un baño a 37 ° C.
2-
Luego se adicionó 150
de fenol y se agitó durante 30 minutos a temperatura
ambiente.
3- Luego se colocó la solución en un baño de hielo y se procedió a centrifugar por 5 minutos, para romper la emulsión.
4- Se procedió a decantar la capa superior acuosa y se colocó a enfriar en un baño de hielo durante 5 minutos, donde esto ayuda a separar la proteína desnaturalizada.
5-
Se adicionó 12
de acetato de potasio frío al sobrenadante acuoso este permite
eliminar el ARN que haya quedado adherido en la fase acuosa.
6- Luego se adicionó dos volúmenes de etanol, para precipitar el ARN, se colocó nuevamente en un baño de hielo durante 1 hora.
7- Se colocó la muestra recoger el precipitado.
en la centrifugadora durante 5 minutos y se procedió a
8-
Luego de la recolección del precipitado de ARN, se adicionó 10 agua (3-1), luego de etanol y finalmente con 10
V-
de etanol -
de éter, se dejó secar al aire.
Resultados:
Tabla.1.Extracción de ARN de Levadura.
Imagen
Descripción Precipitación del ARN después de la adición de los dos volúmenes de Etanol y tras enfriamiento por 1hora.
Centrifugacióna 3000 rpm por 5 min para recoger el precipitado (ARN).
Lavado del ARN con una mezcla de etanolagua (3:1), luego con etanol. La muestra se guardó para su debida caracterización.
VI-
Discusión:
El ARN es un ácido nucleico formado por una cadena de ribonucleótidos. Está presente tanto en las células procariotas como en las eucariotas y es la molécula que dirige las etapas intermedias de la síntesis proteica; el ADN no puede actuar solo, y se vale del ARN para transferir esta información vital durante la síntesis de proteínas (producción de las proteínas que necesita la célula para sus actividades y su desarrollo). Varios tipos de ARN regulan la expresión génica, mientras que otros tienen actividad catalítica. El ARN es, pues, mucho más versátil que el ADN y se distribuye en toda la célula, mayormenteen citoplasma en forma soluble o formando parte de los ribosomas (C.K. Mathews). La levadura es un hongo microscópico unicelular y diminuto que existe alrededor nuestro, en la tierra, en las plantas e incluso en el aire. Es importante por su capacidad para producir la fermentación de hidratos de carbono, generando distintas sustancias. Existen diferentes tipos de levadura, pero la mayoría de las levaduras que se cultivan pertenecen al género Saccharomyces. Su ARN se puede obtener extrayendo un homogenizado de células con disolvente orgánico como el fenol, cloroformo o ambos. En esta experiencia de laboratorio utilizamos como disolvente orgánico el fenol, elcual en soluciones concentradasproduce el rompimiento de los enlaces de hidrogeno de las macromoléculas, causando desnaturalización de las proteínas.Esta suspensión turbia con fenol se centrifugódurante cinco minutos para romper la emulsión y se presentaron dos fases: la fase inferior de fenol que contenía ADN y la fase superior acuosa contenía glúcidos y el ARN, esta fase se enfrió por cinco minutos para evitar la ruptura de las ribonucleoproteinas. La proteína desnaturalizada se halla presente en ambas fases y pudo removerse por centrifugación. Luego de la centrifugación se utilizó el sobrenadante al cual se le agregó el acetato de potasio que permite eliminar el ARN que haya quedado en la fase acuosay el doble del volumen de etanol para que el mismo precipitara.La fase líquida se centrifuga para obtener un precipitado que contenía el ARN que era lo que más nos interesaba, este precipitado se lavó con una mezcla de etanol/agua 3:1 para extraer completamente ARN.
El producto obtenido no contiene ADN pero generalmente está contaminado con polisacárido que se puede tratar con amilasa para mejorar la purificación. Para evidenciar la presencia de ácidos nucleicos en extractos celulares vegetales se requiere células en cantidad suficiente y en medio libre de interferencias que puedan causar lisis celular o hidrólisis de los ácidos nucleicos por nucleasas. Una completa extracción de ácidos nucleicos es fundamental para la determinación indirecta.
VII-
Conclusión:
El ARN de la levadura se obtiene extrayendo un homogenizado de células con disolvente orgánico como el fenolque tiene la función de romper los enlaces de hidrogeno de la macromolécula presente en la levadura.
El acetato de potasio sirvió para eliminar el ARN que se encontraba presente en la fase acuosa y el etanol paraprecipitar el ARN presente en la mezcla..
La centrifugación fue utilizada para separar el ARN de la proteína desnaturalizada y glúcidos presentes en la solución.
Debemos saber que la mayoría del ARN en una muestra, se encuentra en el citoplasma como ARN soluble y ARN ribosomal, pero aproximadamente el 10% se encuentra en el núcleo y otro tanto se halla en las mitocondrias.
VIII- Bibliografía:
Bioquímica 3ª Edición. (2002) C.K. Mathews, K.E. van Holde, K.G. Ahern. Pearson Educación S.A.
Pilar Roca, et al Bioquímica Técnicas y métodos España 2004, editorial Helice, pág 294.
R. L. P. Adams et al Bioquímica de los ácidos nucleicos de Davidson – Editorial Reverté, España 1980 Página 51.
Benjamin Lewin, et al Genes, Editorial Reverté, España 1996 pág. 627.
