Unamba
RESUMEN “UNIVERSIDAD Fecha del boletín
En el presente informe se estudio el aislamiento de levadura procedente de la superficie de una manzana adquirida adquirida en el mercado mercado de abastos abastos de la ciudad, se utilizo: utilizo: agua agua peptona para la revivificación de la cepa, el agar Sabouraud para el el cultiv cultivo de la levadura, levadura, a una temperatura temperatura de 25ºC .
NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC” CARRERA PROFESIO SI ONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL BIOTECNOLOGIA AGROINDUSTRIALLABORATORIO
Los resultados obtenidos nos dieron un crecimiento de 76 UFC a los 5 días del inoculo en la primera dilución (10-1), 20 UFC a los 5 días en la segunda segunda dilución dilución (10-2), 6 UFC a los 5 días en en la tercera tercera dilución dilución (10-3), todos presentaron el color característico de blanco lechoso, forma forma circular, circular, superficie superficie ovalada. ovalada.
•
•
ALUMNO: Christian Andrew Aguilar M.
ABANCAYAPURIMAC
INTRODUCCION Levadura es el nombre genérico dado a un grupo de hongos Ascomicetes pertenecientes al orden Endomicetales. Las levaduras son microhongos que se encuentran generalmente en forma de células únicas y que se reproducen mediante gemación. Las levaduras fueron en un principio aisladas y utilizadas en el ámbito comercial en el año 1970 y muchas de las cepas de las levaduras de este tiempo se encuentran en uso en la actualidad. La levadura bayanus del Instituto Enológico del Champagne Champagne (Instit (Institut ut Oenologique Oenologique de ChampagChampagne) ha constituido uno de los pilares principales de la industria durante décadas. El aislamiento y reproducción de la levadura constituye un proceso largo y de gran trabajo. Primero se identifican las cepas aisladas por lo general en los viñedos, frutas y luego se anali-
DOCENTE: Bio. Yanett Campos Ya
zan las características de fermentación. fermentación. Se piensa que luego de haber buscado durante treinta años entre los viñedos y frutas, ya se ha encontrado la levadura ideal. En la actualidad, la tecnología se centra en comprender y manipular lo que ya se ha establecido. establecido.
OBJ ET ETIIVO Estudiar la la técnica de asilamiento asilamiento de levaduras levaduras de la superficie superficie de una manzana
Contenido: Resumen, introducción, objetivo
1
MarcoTeórico
2
MaterialesyProce yProcedimiento
4
Resultados
5
Discusiones, Discusiones, Conclusiones, yBibliografía
6
Página 2
AISLAMIENTO AISLAM IENTO DE LEVAD LEVADURAS URAS
MARCO TEORICO LEVADURAS
pesan unos 200 g. El examen al microscopio ordinario revela que cada célula está rodeada por una pared y que en el interior de la misma se pueden distinguir pocas estructuras, salvo una o más vacuolas. Para observar el núcleo y varios otros orgánulos se necesita recurrir a preparaciones teñidas, o a la microscopía de contraste de fases. La superficie de las levaduras se puede estudiar mediante microscopía microscopía electrónica de barrido y las estructuras internas mediante microscopía electrónica de transmisión, sobre preparaciones fracturadas por congelación, frescas, no fijadas. En la siguiente figura se muestra un diagrama de la sección sección de una levadura. levadura. Una información más detallada de las partes de la célula exige la identificación bioquímica de sus componentes. La pared ce-
Las levaduras son organismos pertenecientes al reino de los hongos: Como tales, son organismos heterotróficos por el hecho de que solo pueden alimentarse de materia ya preformada (como nosotros los mamíferos), al contrario que las plantas, que son organismos autotróficos y que al estar dotadas de clorofila pueden utilizar la energía del sol jun juntamente con el el air aire e y el ag agua pa para obtener todos los nutrientes. Las levaduras están distribuidas en casi todos los hábitats naturales. Son comunes en las hojas de las plantas y en las flores, también se encuentran en la superficie de la piel y en el tracto intestinal de los animales de sangre caliente donde pueden vivir en simbiosis o como parásitos. También se encuentran en los suelos y en el agua salada donde contribuyen a la descomposición de plantas y algas. Las levaduras se multiplican asexualmente como células individualizadas que se dividen por gemación o por división directa (fisión), hay especies que pueden crecer como filamentos formando el micelio típico de los hongos. En su apartado de reproducción sexual las levaduras producen unas estructuras llamadas ascas, que contienen hasta 8 esporas. Estas asco esporas pueden fusionarse entre sí y originar un nuevo individuo que podrá multiplicarse a través de una división vegetativa. Pero los más conocido y comercialmente significativo de las levaduras son las especies y cepas relacionadas de Saccharomyces cerevisiae. Este organismo ha sido largamente utilizado para Diagrama de una electronografía de la fermentar azúcares del arroz, del trigo, de la sección transversal de una célula en recebada y del maíz para la producción de poso de levadura de panaderos bebidas alcohólicas y en la industria de pa(Saccharomyces cerevisiae). ER, retículo nificación para expandir o aumentar la maendoplásmico; M, mitocondrias; N, núsa. Saccharomyces cerevisiae es comúncleo; Nm, membrana nuclear; Nn, nucléomente usada como levadura en el pan y palo; Pi, invaginación; Pl, plasmalerna; V, ra algunos tipos de fermentación. Extractos vacuola; Vp, granulo de polimetafosiato; de levadura se administran a menudo como W, pared celular; Ws, cicatriz de gemasuplemento vitamínico ya que están constición; L granulo lipídico tuidas en un 50% por proteínas y son fuente importante de vitaminas B, niacina, y ácido lular representa el 30 % del peso seco total fólico. y tiene un grosor de 100-200 nm. Está ESTRUCTURA ESTRUCTURADE LA LA CÉLULA CÉLULA DE LEVA LEVADURA: constituida por aproximadamente un 40 % Una célula de una levadura típica tiene, de (3 glucanos, otro 40 % de a mananos, 8 cuando se halla plenamente desarrollada, % de proteína, 7 % de lípidos, 3 % de susentre 8 y 14 nm de diámetro y una masa de tancias inorgánicas y 2 % de hexosamina y materia seca de 40 pg. Por tanto 10 12 célu- quitina. El glucano está unido a la proteína las desecadas pesan unos 40 g. En vivo, y representa el componente estructural prensadas, ese mismo número de células más abundante; se halla fundamentalmen-
Página 3
AISLAMIENTO DE LEVADURAS
te en la cara interna de la pared. El tamaño se encuentra también ligado a la proteína, a veces a través de hexosamina, y tiende a localizarse en la cara externa de la pared. La superficie de la célula se encuentra cargada, debido a la presencia de grupos carbóxilo y fosfato que, al pH de la cerveza, la confieren una fuerte carga neta negativa. También se encuentran grupos amino, pero sólo le confieren regiones locales de carga positiva. Las paredes celulares se pueden disolver mediante el uso de una preparación enzimática mixta, procedente de un actinomiceto denominado Arthrobader luteus, o de la glándula digestiva de un caracol comestible, Helix pomada. Generalmente, se requiere un agente reductor, como el mercaptoetanol. Si se mantienen en un estabilizador osmótico, como una disolución acuosa de manitol al 20 %, las células de levadura permanecen intactas, pero esféricas, al haber perdido su pared; se les denomina esferoblastos y, si las condiciones culturales son las adecuadas, resintetizan sus paredes. Algunas técnicas de manipulación genética explotan estos hechos. CULTIVO:
Las características macro y micromorfológicas son importantes para la identificación y si la formación de las ascosporas no puede ser observada en Malta-Glucosa a 25-30ºC, se inocula elmedio Acetato . Las cepas productoras de ácido desarrollan en Malta-Acético y las levaduras xerófilas crecen sobre Malta-Sal -Glucosa o Malta-50%Glucosa. Con estos datos y el resultado de la incubación a 37° C, se puede acceder a la identificación de las 14 especies más comunes de levaduras observadas en el 42,3% de los alimentos. Se utiliza también el medio Sabouraud par el crecimiento de levaduras. AMBIENTE:
La vasta mayoría de las levaduras son mesófilas, con una temperatura máxima de crecimiento entre 24 y 48ºC. Solo unas pocas (2%) son psicrófilas con una temperatura máxima de crecimiento por debajo de 24ºC, pero mayor es el número de las levaduras que tienen la temperatura óptima de crecimiento por debajo de 20ºC. No hay levaduras que puedan crecer a 50ºC y solamente unas pocas pueden desarrollar cerca de 0ºC, entre las que se encuentran Ya Yarrow rowia lip lipolytica ica, Debaryomyces hansenii y Pichia membranae-
faciens. Por otra parte, Kluyveromyces marxianus crece a 48ºC, mientras que otras de los molinos azucareros son capaces de proliferar por sobre los 40ºC, entre ellas Pichia polymorpha, Geotrichum capitatum, Saccharomyces cerevisiae y especies de Candida y Debaryomyces. En general, la presencia de etanol o bicarbonato aumenta la temperatura mínima de crecimiento (Déak & Beuchat 1996). La mayoría de las levaduras que causan deterioro de alimentos crece a una actividad de agua mínima de 0,90-0,95. En general las levaduras levaduras toleran toleran mejor mejor altas altas concentracioconcentraciones de azúcar que de sal. Entre las que prefieren substratos salados se hallan Geotrichum terrestre, Stephanoascus ciferrii, D. hansenii y Lipomyces kononekoae. Por otra parte Zygosaccharomyces mellis tolera mejor la glucosa que la sacarosa (Déak & Beuchat 1996). CARACTERÍSTICAS CTERÍSTICASDE LOSCULTIV CULTIVOS:
Crecimiento en forma de velo en la superficie de los medios líquidos indica que se trata de una levadura oxidativa o formadora de velo. ♦La producción de un pigmento carotenoide confirma que la levadura que ha crecido pertenece al genero Rhodoturola. ♦El aspecto de crecimiento de los microorganismos tiene importancia cuando estos producen un moteado pigmentado en la superficie de los alimentos ♦La mayoría de las colonias jóvenes de levaduras son húmedas y algo mucosas, aunque es posible que tengan aspecto harinoso. ♦Algunas colonias tienen un color crema o rosado. ♦Las levaduras son oxidativas, fermentativas o bien su actividad metabólica es a la vez de ambos tipos. ♦En la superficie de un liquido, las levaduras oxidativas pueden ser en forma de película, de velo, o espuma y por ello se denominan levadura formadoras de películas. ♦El aspecto de crecimiento de los microorganismos tiene importancia cuando estos producen un moteado pigmentado en la superficie de los alimentos ♦Las levaduras fermentativas suelen crecer en toda la masa del liquido y producen dióxido de carbono. ♦
Página 4
AISLAMIENTO DE LEVADURAS
MATERIALES Beaker de 200 ml.
♦
Agar Agar sabouraud.
Agua peptona.
♦
Matraz.
♦
♦
Placas petri.
♦
Pipeta.
♦
Tu Tubos de ensay sayo.
Manzana.
♦
♦
PROCEDIMIENTO Introducir, la manzana en el medio de agua peptona par revivificar a la levadura y agitar por alrededor de 30 minutos, el medio debe tapar completamente a la manzana.
Si hay bacterias, se aplica Rouling (bactericida)
Libre de bacterias
Medio agua peptona libre de bacterias y carga de levaduras.
1 gota 1 gota
1 gota
10-1
10-2
10-3
Cada tubo de ensayo contiene 15ml de agar sabouraud a una temperatura de 45ºC
Incubación a 25ºC promedio.
Página 5
AISLAMIENTO DE LEVADURAS
RESULTADOS En la siguiente tabla se muestran el crecimiento de la lev l evadura adura según según los días.
Día cero
Día 1
Día 2
Día 3
No hay crecimiento
No hay presen- La presencia de No se analizo cia de colonias, colonias es muy t=38ºC, presen- poca. cia de agua.
Día 4
Día 5
No se analizo
Existe Existe presencia de colonia y es posible realizar el conteo
Los siguientes siguientes gráficos gráficos nos muestr muestran an el crecimiento crecimiento al día 5 (lunes (lunes 09/ 09/ 05/ 08)
UFC UF C
Dilución 10-1
10
UFC UF C
10
Dilución 10-2
UFC
Dilución 10-3
U F C
En el siguiente cuadro cuadro se muestra la descripción cualitativ cualitativa de las colonias
10
−1
= 19 ∗ 4
−1
= 76
−2
10
−3
= 20
= 6
Página 6
AISLAMIENTO DE LEVADURAS
COLOR
Blanco lechoso
FORMA
Regular
TA TAMAÑ MAÑO
1.8-2.00mm
BORDE
Circular
SUPERFICIE
Lisa
CONSISTENCIA
Semidura
ESTRUCTURA INT INTERNA ERNA
Amorfa
OPACIDAD
Opaco
ELEVACIÓN
Convexa
DISCUSIONES SOBRE EL EL CRECIMINETO CRECIMINETO:
Déak & Beuchat 1996, menciona que la vasta mayoría de las levaduras son mesófilas, con una temperatura máxima de crecimiento entre 24 y 48ºC, pero que responden mejor a temperaturas menores a 30ºC, el día 1 se tuvo una temperatura de 38ºC lo cual no dejo crecer a las levaduras normalmente, ya de ahí par el día 5 se dejo la placa al medio ambiente y se tuvo el crecimiento adecuado.
concuerdan concuerdan con la teoría. SOBRE SU HABITAT:
Fernández Vila 2005, menciona que las levaduras son comunes en las hojas de las plantas, en los frutos y en las flores, también se encuentran en la superficie de la piel y en el tracto intestinal de los animales de sangre caliente donde pueden vivir en simbiosis o como parásitos. También se encuentran en los suelos y en el agua salada donde contribuyen a la SOBRE EL COLOR: descomposición de plantas y algas, para el asilaMontes Díaz 2003, menciona al respecto: que la mayo- miento se utilizo manzana, lo cual nos indica por teóría de las colonias jóvenes de levaduras son húmedas y rica que existe crecimiento de levaduras tal como se algo mucosas, aunque es posible que tengan aspecto dio en la práctica. harinoso. Algunas colonias tienen un color crema o rosado, las colonias aisladas presentaron un color blanco lechoso, lo cual nos muestra que resultados obtenidos
CONCLUSIONES ♦
♦
El crecimiento de levaduras se da dentro de una temperatura de 24 a 48ºC, pero para mejores resultados se debe cultivar a temperaturas menores de 30ºC. El color característico de las levaduras es de color
♦
blanco lechoso. El habitad natural de las levaduras son la superficies de las frutas, hojas, también se encuentran en el suelo y agua salada.
BIBLIOGRAFIA ♦ ♦ ♦
Déak Déak T, Beuchat LR. 19 1996. 96. Handbook Handbook of Food Spoil Spoilag age e Yeasts. CRC Press, Boca Ratón, Florida. Fernández Vila ila Juan J uan Antonio Antonio . 2005. 2005. Las Levaduras. Levaduras. http:// http:/ / www.cuinant.com/ .cuinant.com/ Montes Díaz Elizabeth. 2003. Método de cuenta total de Mohos y Levaduras. Revista Microbiología Industrial, Bogota-Colombia.
