Universidad Autónoma de Chiriquí Facultad de Ciencias Naturales y Exactas Escuela de Química
Curso de Bioquímica II (QM 382-L)
Electroforesis del ADN en geles de agarosa Estudiantes: Bejerano Daniel
4-777-1401
Castro Lidia P.
4-759-375
Sobenis Eira M.
4-758-271
Profesora: Albertina Montenegro
II Semestre 2012
Fecha de entrega: 12/11/2012
Electroforesis del ADN en geles de agarosa
I- Objetivos
Efectuar el proceso de electroforesis a partir del ADN extraído de tejido animal y vegetal Realizar el proceso de electroforesis con geles de agarosa II- Introducción
La electroforesis en gel es un método que se emplea para separar macromoléculas función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas.
en
El término electroforesis describe la migración de las partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico. «Electro» se refiere a la electricidad y «foresis», del griego phoros, significa «trasladar». Así pues, la electroforesis en gel es una técnica consistente en aplicar corriente eléctrica a las moléculas para que atraviesen una placa de gel. La fuerza motriz de la electroforesis es la tensión eléctrica aplicada a los electrodos en ambos extremos del gel. Las propiedades de una molécula determinan la velocidad con que un campo eléctrico puede desplazarla a través de un medio gelatinoso. Muchas macromoléculas biológicas importantes (por ejemplo, los aminoácidos, los péptidos, las proteínas, los nucleótidos y los ácidos nucleicos) poseen grupos ionizables y, a un pH determinado, existen en solución como especies cargadas eléctricamente, sean cationes (+) o aniones (-). Según la naturaleza de la carga neta, las partículas cargadas migrarán hacia el cátodo o hacia el ánodo. Así, por ejemplo, cuando se aplica un campo eléctrico a un gel con pH neutro, los grupos fosfato del ADN cargados negativamente lo harán migrar hacia el ánodo (Westermeier, 1997). La electroforesis en gel de agarosa es un método normalizado que se utiliza para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. Se trata de una técnica sencilla y rápida que permite diferenciar fragmentos de ADN que no pueden separarse adecuadamente con otros procedimientos. Por otra parte, el ADN puede localizarse en el gel tiñendo con una
concentración baja de bromuro de etidio, que es un agente intercalante fluorescente que se utiliza como colorante. En las siguientes secciones se presentan los principios físicos, los componente (matriz de gel, tampón, tampón de carga y marcador) y los procedimientos para preparar la electroforesis en gel de agarosa (Sambrook et al., 1989). La separación de las macromoléculas depende de dos variables: carga y masa. Cuando una muestra biológica, como por ejemplo el ADN, se mezcla en una solución tampón y se aplica a un gel, esas dos variables actúan conjuntamente. La fuerza de fricción del material de gel actúa como «tamiz molecular», separando las moléculas en función de su tamaño. Durante la electroforesis, las macromoléculas son empujadas a través de los poros, dependiendo su tasa de migración por el campo eléctrico de los siguientes factores: •
Fuerza del campo
•
Tamaño y forma de las moléculas
•
Hidrofobicidad relativa de las muestras
•
Fuerza iónica y temperatura del tampón en que se desplazan las moléculas.
La movilidad electroforética del ADN se ve afectada por la composición y la fuerza iónica del tampón de electroforesis. En ausencia de iones, la conductancia eléctrica es mínima y el ADN migra lentamente o ni siquiera se desplaza. En un tampón de elevada fuerza iónica la conductancia eléctrica es muy elevada y se genera una importante cantidad de calor. En el peor de los casos, el gel se funde y el ADN se desnaturaliza. Se dispone de varios tipos de tampones para la electroforesis de ADN nativo bicatenario. Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE), tris-borato (TBE) o trisfosfato (TPE) a una concentración de aproximadamente 50 mM (pH 7,5
–
7,8). Los tampones de electroforesis
suelen prepararse en forma de soluciones concentradas y se conservan a temperatura ambiente. El TBE se utilizaba inicialmente a una concentración de trabajo de 1x en el caso de la electroforesis en gel de agarosa.
III -Materiales y reactivos
Figura
Capacidad y Cantidad
Instrumento Cámara de electroforesis horizontal
1
-Fuente de poder
1
Peines para las bandejas
2
Pipetas
2-20uL y de 20-200uL
2 de 50 y 100 mL Vaso químico
IV- Reactivos
Bromuro de Etidio Propiedades físicas y químicas
Estado sólido apariencia color rojo violáceo Es una agente intercalante usado como marcador de ácidos nucleicos Para proceso de electroforesis en gel de agarosa Riesgo Es una sustancia mutágena carcinógena potente y moderadamente tóxica y teratógena
Agua destilada
Se le han eliminado impurezas e iones mediante destilación , carece de muchos iones que producen la conductividad ( cloruros , calcio, magnesio y fluoruros
Agarosa Grado molecular
La agarosa produce geles firmes , incluso cuando la concentración es baja temperatura de gelatinización 34-37 ° C Las agarosas son polisacáridos , polímeros lineales de hexosas , de gran poder gelificante obtenidos del agar agar –
Se utiliza para la separación de grandes fragmentos de ADN , tiene intervalos de fusión gelificación estándar
TBE 10X Se utiliza para la poliacrilamida y electroforesis en gel de agar. Esye producto ha sido optimizado para su uso en aplicaciones de ADN. Forma líquida transparente , líquido e incoloro Composición ( Tris borato , Acido bórico y EDTA –
V- Procedimiento: Preparación de la solución de agarosa
Se Preparó la bandeja sellando los bordes por presión o con cinta adhesiva (esto depende del modelo de cámara utilizado) y póngale los peines. 2. Se Pesó 2,5 gr. de agarosa. 3. Se Colocó la agarosa dentro de un envase de vidrio que contenía 250 mL de buffer TBE 0,5X y se colocó en el baño de María hasta su completa disolución. 1.
4. Cuando la solución de agarosa haya alcanzado una temperatura soportable por la mano, se agregó 2,5 ul de bromuro de etidio* (Solución madre 10 mg. mL-1) 5. Se Mezcló bien, agitando el recipiente en forma circular, evitando que se formen burbujas en la solución. 6. Se colocó la solución en la bandeja de corrida vertiendo la solución lentamente por uno de los extremos de la bandeja y retire las burbujas que queden sobre el área de corrida de las muestras con una punta limpia. 7. Se Dejó polimerizar la agarosa 8. Para la corrida, se llenó el tanque de la cámara de electroforesis con buffer TBE 0,5X hasta cubrir el gel. 9. Se conectó los electrodos de la cámara a la fuente de poder, gradúe el voltaje deseado y se corrieron las muestras.
VI- Resultados.
Electroforesis de ADN en Geles de Agarosa Imagen 1.
Descripción
Gel de agarosa al 1 % preparada.
2.
Introducción y corrida de las muestras de ADN animal y vegetal.
3.
Final de Corrida de las Muestras (ADN).
4.
Muestra de ADN vista desde un espectrómetro UV-visible
VII- Discusión:
En esta experiencia de laboratorio en el cual realizamos la separación de moléculas en base a su tamaño, carga y forma por medio de electroforesis en gel de agarosa, de tal forma que las moléculas que tenían una carga negativa migraron hacia el polo positivo; mientras que las moléculas cargadas positivamente migraron hacia el polo negativo. En la electroforesis de ADN fue necesaria la utilización de un colorante que simularon fragmentos de ADN haciendo más vistoso el gel, todos los colorantes poseen carga negativa y la electroforesis es capaz de separar las mezclas de colorantes según su carga. Como el ADN posee una carga negativa a pH neutro éste migrará a través del gel hacia el electrodo positivo durante la electroforesis. Los geles de agarosa permiten una electroforesis rápida, pero con una resolución limitada por cuanto las bandas que se forman en los geles tienen tendencia a ser difusas y a esparcirse. Ello obedece al tamaño de los poros y no puede controlarse La movilidad electroforética del ADN se ve afectada por la composición y la fuerza iónica del tampón de electroforesis. En ausencia de iones, la conductancia eléctrica es mínima y el ADN migra lentamente o ni siquiera se desplaza. En un tampón de elevada fuerza iónica la conductancia eléctrica es muy elevada y se genera una importante cantidad de calor. En el peor de los casos, el gel se funde y el ADN se desnaturaliza. Para determinar la pureza de las muestras obtenidas mediante la extracción de ADN de tejido animal y de tejido vegetal en experiencias anteriores, se veía la nitidez de las bandas
obtenidas, la degradación del material genético o los posibles barridos que se pudieran generar durante electroforesis. La determinación de la calidad del ADN extraído se suele hacer con base en el grado de degradación, ya que un ADN de alto peso molecular aparece como una banda definida en la parte superior del gel a poca distancia de los pozos, mientras que el material parcialmente degradado forma un barrido de fragmentos pequeños a lo largo del pozo (Valadez y Kahl; 2000). De acuerdo con esta información y al analizar los resultados de los geles de agarosa obtenidos como observamos en el cuadro de resultados en la figura 4 que las bandas con un ADN de mejor calidad son las que se presentan en la mayor parte de los posos que pertenecen al ADN de tejido tanto animal como vegetal extraído en el laboratorio. En las muestras en las cuales se logró extraer ADN, las bandas obtenidas prácticamente no presentan barridos, factor que indica que casi no hay presente mucha contaminación. En la imagen o figura 4 se observa que las bandas de las muestras 2, 3, 4 y 6 están más enmarcadas y más cerca a los pocillos; la velocidad de migración fue cero, por lo que no hubo ningún desplazamiento/recorrido en el gel de agarosa; teóricamente es gracias a que el ADN está intacto y por ende con un alto peso molecular lo que imposibilita su recorrido, (además la intensidad de la fuerza de rozamiento que se opone a la migración más que las características del medio también tiene que ver y depende del tamaño de la partícula) y por lo tanto que están en su estado nativo sin degradación alguna. En cambio las bandas de las muestras 1 que fue una muestra proporcionada en el laboratorio por el profesor la cual no fue ADN extraído por nosotros posee una distancia mayor de migración y también se observa en la muestra 5 que si fue ADN extraído por nosotros, ello evidencia que están en estado de degradación; ahora bien por la coloración intensa que presentan estas bandas indicaría que presentan contaminación posiblemente con RNA y proteínas (debido a la mala purificación sometida). La técnica de electroforesis de DNA en gel de agarosa es muy práctica y sencilla, nos provee de una gran certeza para el análisis de bandas visibles a luz UV, y nos proporciona una herramienta para darnos cuenta de la calidad de ADN que pudimos extraer tanto de tejido vegetal así como de tejido animal, la cual nos muestra que fue de muy buena calidad ya que en la mayoría de las muestras no se presentaros degradaciones lo que indicó la pureza de las muestra de ADN extraídos en experiencias anteriores.
VIII- Conclusiones: Existen algunos tipos de electroforesis en gel de agarosa pero la electroforesis
horizontal es el más utilizado para separar moléculas de ADN en agarosa. Otros tipos como la electroforesis vertical se utilizan para separar proteínas y utiliza geles de poliacrilamida. El tampón sirve como conductor de la electricidad y controla el pH, lo cual es
importante para la estabilidad de las moléculas biológicas. Las muestras evidenciaron sus grados de pureza y estados de conservación (nativo o
degradado), la mayoría estaban en su estado nativo, lo que indica una buena calidad de ADN extraído.
Independientemente de la excelencia de la muestra y el contenido como tal del ADN, para lograr una electroforesis exitosa, es necesario elegir un buen gel (que suele ser una red molecular de cierto polímero orgánico con una consistencia gelatinosa), el cual permitirá lograr una separación eficiente de las moléculas, con su principio que es aumentar altamente la fricción que dan las macromoléculas y reducir al mínimo la difusión.
IX- Bibliografía: Mathews, C; Van Holde, K. 1998. Bioquímica. 2 ed. McGraw-Hill Interamericana.
Madrid, España. 1283 pp. Valadez, E; Kahl, G. 2000. Huellas de ADN en genomas de plantas: teoría y
protocolos de laboratorio. Mundi-Presnsa Mexico, S.A de C.V. Mexico, D.F. 147 pp. Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989). «Gel electroforesis of DNA» en:
Molecular Cloning: a Laboratory Manual . New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, capítulo 6. Westermeier, R. (1997). Electroforesis in Practice: a Guide to Methods and
Applications of DNA and Protein Separation, VCH, Weinheim
