Informe Final de Bioprocesos c 3 Final

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Facultad de Ingeniería E . A . P I n g e n i e r í a A g r o i n d u s tr tr i a l

INDICE I.

............................................ ............................................. ............................................ ............................................. .......................4 RESULMEN .....................

II.

............................................ ............................................. ............................................. ..................................... ...............5 INTRODUCCION ......................

III.

........................................... ............................................. ............................................ ............................................. .......................7 OBJETIVOS: ....................

1. GENER GENERAL: AL:.................... ........................................... ............................................. ............................................ ............................................. .............................. .......7 2. ESPEC ESPECÍFICOS ÍFICOS:: ...................... ............................................. ............................................. ............................................ ............................................. .......................7 IV.

.......................................... ............................................. ............................................ .......................... .... 8 MATERIALES Y METODOS ...................

3.1 MATERIALES INSTRUMENTOS Y REACTIVOS ........ ................ ................ ................ ................. ................. ................ .............. ...... 8 3.2 METOD METODOLOGI OLOGIA A EXPERIMENTA EXPERIMENTALL ..................................................... ............................................................................ ......................... 10 3.2.1 DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO: ........ ................ ................ ................ ................ ................. ................. ................ ........ 10 A. Formu Formula la estima estimada da del m.o.:.... m.o.:.......................... ............................................ ............................................. ................................ ......... 10 B. Requerimientos nutricionales: ............................................................................ 10 C. Condi Condicion ciones es de culti cultivo: vo: ..................... ........................................... ............................................ ........................................... .....................10 D. REFERENCIAS DE COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE MANTENCIÓN, ACTIVACIÓN Y CULTIVO PARA Ralstonia eutropha NRRL B-1469 B-14690: 0: ..................... ............................................ ............................ ..... 11 E. COMPSICION DE LOS MEDIOS A UTILIZAR EN ESTA PRÁCTICA: ......... ................. ................ ............ .... 12 3.2.2 PREPARACION DE MEDIOS MEDIOS Y PROGRAMA DE MUESTREO: MUESTREO: ........ ................ ................. .............. ..... 13 A. PREPARACION DEL Medio solido de mantención PGY-Agar PGY -Agar (50 ml) ........ ................. .............. ..... 13

2

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Facultad de Ingeniería E . A . P I n g e n i e r í a A g r o i n d u s tr tr i a l 4.6 Preparación Del Medio De Fermentación para la Cinética. ........ ................ ................ ................ .............. ...... 26 4.7

Determinación De La Cinética Cinética De Crecimiento De La Biomasa Biomasa ........ ................. ................. ................ ........ 27

4.8 Obtención de la curva de Calibrado de Biomasa ....... ................ ................. ................ ................ ................. .............. ..... 30 VI.

RESULTADOS RESUL TADOS Y DISCU DISCUSION SION.................... .......................................... ............................................ ........................................... .....................32

VIII.

REFERENCIAS REFERE NCIAS BILIOG BILIOGRAFICA RAFICASS .................... .......................................... ............................................. ....................................... ................53

IX.

ANEXOSS ..................... ANEXO ............................................ .............................................. ............................................. ............................................. ......................... 55

3

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Facultad de Ingeniería E . A . P I n g e n i e r í a A g r o i n d u s tr i a l

I.

RESULMEN En el presente trabajo aborda todo lo referente al desarrollo del inóculo y cultivo celular por lote de la cepa Ralstonia eutropha NRRL B-14690, desarrollado por alumnos del curso de Bioprocesos realizado en este referido laboratorio. Este trabajo se inicio realizando su manipulación desde su estado en forma de cepa refrigerada (inactivada). Para la cual se procedió a preparar sus medios de mantención, activación y fermentación; además de seguir

una serie de

procedimientos secuenciales tales como inoculación en agar (30 ml), el cual tuvo todos los nutrientes que esta cepa requiere para su óptimo desarrollo, dándoles así todas las facilidades para que pueda crecer. Luego de un evidente crecimiento de la cepa en el medio, la totalidad de éste fue diluido dentro de otro medio al que se denomina medio de fermentación (120 ml) por sus limitaciones en cuanto a nutrientes, ya que este contiene solo los componentes necesarios para que el microorganismo pueda subsistir tales como fuente de carbono que en nuestro caso fue glucosa.

4


II.

INTRODUCCION El objetivo general en la práctica fue diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en matraces, empleando una cepa de Ralstonia eutropha NRRL B-14690, evaluándose el efecto de la razón Co/No en la cinética

de crecimiento microbiano. En la actualidad muchos de los alimentos son obtenidos gracias al manejo y conocimiento del crecimiento de microorganismos. Resulta entonces importante el conocimiento de las condiciones en que estos microorganismos puedan optimizar sus productos. Para ello la preparación de medios de cultivo para estos microorganismos es un buen punto de partida para conocer sobre su comportamiento así como también el seguimiento de la cinética que nos proporcionara

datos mucho más prácticos y exactos sobre la velocidad y

características del crecimiento del microorganismo tratado.

La bacteria Ralstonia eutropha NRRL B-14690 es la más utilizada en la producción de poli-β-hidroxibutirato (PHB) por su capacidad de acumular

5

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Facultad de Ingeniería E . A . P I n g e n i e r í a A g r o i n d u s tr i a l Concentración de biomasa permanece constante presentándose acumulación de polímero. Es así que para esta práctica tratamiento

hemos centrado nuestra atención

en el

de este microorganismo ( Ralstonia eutropha NRRL B-14690).

Iniciando desde su resiembra partiendo desde su estado en cepa, para luego sembrarlo en un medio apropiado procurando su rápida activación, para que luego de un determinado tiempo podamos sembrar la bacteria pero en un medio mínimo; es decir con los mínimos requerimientos; en el cual es más factible determinar la cinética de crecimiento. La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza química que desempeñan un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y además suministrar energía para la síntesis de metabolitos y para

6


III.

OBJETIVOS:

1. GENERAL: “Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en matraces,

empleando una cepa de Ralstonia eutropha NRRL B-14690, evaluándose el efecto de la razón Co/No en la cinética de crecimiento microbiano”. 7

2. ESPECÍFICOS: 

Diseñar y preparar los medios de cultivo para Ralstonia eutropha NRRL B14690.



Activación celular y desarrollo del inoculo.



Determinar la cinética de consumo de la fuente de carbono.



Determinar el  y los rendimientos de nutriente limitante en células y




IV.

MATERIALES Y METODOS

3.1 MATERIALES INSTRUMENTOS Y REACTIVOS Material Biológico: Ralstonia eutropha NRRL B-14690 Medios de Cultivos: 

Extracto de Levadura



Peptona de caseína



Agar



Glucosa



Solución de Sales

8


Instrumentos: 

Balanza analítica



Espectrofotómetro



Autoclave



Centrifuga



Agitador Orbital(Shaker)



Peachimetro



Estufa Eléctrica ( Incubadora)



Estufa Eléctrica ( Horno de esterilización)



Campana de Desecación.



Asa bacteriológica.



Mechero bunsen.



Tubos de ensayo con tapa para medio de cultivo.



Mechero.

9


3.2 METODOLOGIA EXPERIMENTAL 3.2.1 DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO: A la hora de diseñar un medio de cultivo no sólo hay que tener en cuenta los nutrientes sino también las condiciones físicas que permitan el crecimiento de los microorganismos. La cantidad y naturaleza de los nutrientes en un medio de cultivo viene determinada por el rendimiento de un producto en especial además de los requerimientos nutricionales del microorganismo.

Para la formulación del diseño de cultivo se tiene en cuenta los siguientes requerimientos nutricionales para el cultivo Ralstonia eutropha NRRL B14690. A. Formula estimada del m.o.:

...  = . −

10

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Facultad de Ingeniería E . A . P I n g e n i e r í a A g r o i n d u s tr i a l D. REFERENCIAS DE COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE MANTENCIÓN, ACTIVACIÓN Y CULTIVO PARA Ralstonia eutropha NRRL B-14690:

MEDIO

SOLIDO DE MANTENCION (PGY-Agar)

ACTIVACION

NUTRIENTE Extracto de levadura Peptona de caseína

CONCENTRACION (g/L)

KHPO

3.5 7.0 1.0 20 1.4

Ajustar pH: 7.0 Extracto de levadura Peptona de caseína

1.0 1.0 1.0 1.4

Agar Glucosa

KHPO Glucosa

Ajustar pH: 7.0 T=28°C ; N=200rpm

11


E. COMPSICION DE LOS MEDIOS A UTILIZAR EN ESTA PRÁCTICA: - TABLA N°01: Medio solido de mantención PGY-Agar para 50 ml

MEDIO


K HPO

  SOLIDO DE MANTENCION Agar Glucosa (PGY-Agar)

CONCENTRACION (g/L)

PESO (g)

3.5 7.0 1.0 20 1.4

0.175 0.35 0.05 1.00 0.07

Ajustar pH: 7.0 -

TABLA N°02: Medio Liquido de Activación para 20 ml MEDIO


KHPO ACTIVACION

Glucosa

CONCENTRACION (g/L)

PESO (g)

1.0 1.0 1.0 1.4

0.02 0.02 0.02 0.028

12


-

**Los cálculos de estas concentraciones y pesos se detallan en ANEXO 1 y 2 Tabla N°04: Composición de la solución de sales 100 veces concentrado, utilizadas en los medios de cultivo en g/l Nutriente

Concentración (g/l)

CaCl2.2H2O

2

ZnSO4.7H2O

0.1

CuSO4.5H2O

0.01

CoCl2.6H2O

0.2

MnCl2.6H2O

0.005

13

Fuente: Wang y Yu, (2001)

3.2.2 PREPARACION DE MEDIOS Y PROGRAMA DE MUESTREO: La precisión y concentración durante la preparación de los medios son factores determinantes de los resultados a obtener en nuestra experiencia. En cada medición es importante ser exacto para evitar desvíos en los resultados.

A. PREPARACION DEL Medio solido de mantención PGY-Agar (50 ml)

PESAR

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Facultad de Ingeniería E . A . P I n g e n i e r í a A g r o i n d u s tr i a l B. SIEMBRA EN MEDIO DE MANTENCION: - Materiales y equipos a utilizar:

-



Aza bacteriológica



Tubo de ensayo con medio sólido donde se encuentra el M.O.



Mechero Bunsen, trípode y rejilla.

Procedimiento: -

Esterilizar los materiales y equipos a utilizar.

-

Colocar la aza bacteriológica en el mechero hasta que se torne roja, luego enfriar.

-

Flamear la boca del tubo de ensayo con el agar preparado previamente y con el aza extraer la cepa.

-

Sembrar en la superficie realizando la mayor cantidad de estrías en la superficie.

-

Tapar el tubo de ensayo y repetir en mismo procedimiento con los demás tubos.

-

Incubar a 28°C por 24 – 48 horas.

14


ESTERIZAR (por separado) ENFRIAR CALENTAR Tubo 01-Tubo 02

AÑADIR AGITAR

<121°C por 15 minutos>

AJUSTAR pH

ESTERILIZAR

<121°C por 15 minutos >

ENFRIAR

RESERVAR

15

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Facultad de Ingeniería E . A . P I n g e n i e r í a A g r o i n d u s tr i a l -

Llevamos al shaker a 28°C y 200rpm por 24 horas.

-

Notaremos el desarrollo y crecimiento en biomasa por la turbidez del medio.

E. PREPARACIÓN DEL MEDIO DE FERMENTACIÓN, según la TABLA 03 para el cultivo de Ralstonia eutropha NRRL B-14690

PESAR

 hasta 100ml - (NH ) SO enrasada   hasta 10ml - K  HPO enrasada   hasta 10ml - MgSO . 7H O enrasada   hasta 10ml - FeSO .7H O enrasada   hasta 10ml

-Glucosa enrasada

DISOLVER

ESTERILIZAR (por separado)

CALENTAR

16

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Facultad de Ingeniería E . A . P I n g e n i e r í a A g r o i n d u s tr i a l F. PREPARACION DE LA SOLUCION DE SALES: según tabla N°04

PESAR 5 ml Agua destilada

DILUIR

Agua destilada

ENRASAR

17

AGITAR

ESTERILIZAR

< por 15 minutos>

G. FERMENTACION DEL LA CEPA: Materiales y equipos 

Matraz de 1 L conteniendo el medio de fermentación



pH-metro



Gasa y algodón



Tubos de ensayo


3. 2.3 MONTAJE DEL EQUIPO EXPERIMENTAL, CULTIVO DEL M.O, ETC. A. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES: MÉTODO DEL DNS (ÁCIDO DINITROSALICÍLICO) La preparación del reactivo DNS se requiere de lo siguiente: 

10 g/l de ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS)



200 ml/l de NaOH 2N



300 g/l de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado

Para la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en aproximadamente 500 ó 600 ml de agua, paralelamente se disuelve el ácido DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1 litro y se agita hasta la completa disolución de todos los componentes, para posteriormente aforar hasta un litro. Se precisa realizar los siguientes pasos para el análisis de la muestra:

1.- Se añade un volumen del reactivo DNS a un volumen de muestra a analizar. 2.- Se mantiene la mezcla en un baño de agua a ebullición durante 5 minutos para luego dejar enfriar.

18

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Facultad de Ingeniería E . A . P I n g e n i e r í a A g r o i n d u s tr i a l B. DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LA BIOMASA Materiales y equipos 

Matraz de 1 L conteniendo el medio de fermentación



Espectrofotómetro



pHmetro



Gasa y algodón



Centrifuga



Tubos de ensayo



Capachos de papel aluminio

19

Procedimiento: Al inicio y cada hora por 10 horas se realizara lo siguiente EXTRAER

˂ 5ml del medio de cultivo ˃

SEPARAR

˂ 3ml para el tubo de espectrofotómetro y el

MEDIR

˂ Absorbancia a 640nm y pH ˃

resto se le agregó al tubo de centrifugado. ˃

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Facultad de Ingeniería E . A . P I n g e n i e r í a A g r o i n d u s tr i a l C. Determinación de la concentración celular por D.O Materiales y equipos: 

Espectrofotómetro.



Centrífuga.



Estufa.

Reactivos: 

Muestra del medio.



Agua destilada.

Procedimiento:

20

El método se basa en el aumento de la turbidez del medio, al incrementarse la concentración de microorganismos, esto puede ser detectado fácilmente por espectrofotometría a 640nm. Para esta determinación es necesario que previamente se elabore una curva de calibrado, para lo cual las concentraciones de microorganismos en el medio son determinadas por peso seco de acuerdo al

siguiente procedimiento:

TOMAR MUESTRA

CENTRIFUGAR

˂ Volumen 5 ml˃

˂ 5000 rpm ; Tiempo: 20 ´ ˃


V.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1 Preparación Del Medio De Mantención

Primero pesamos los componentes de la tabla N° 1, luego lo diluimos con agua y lo llevamos

a

ebullición

por

1

min

aproximadamente. Finalmente la solución se coloco en dos tubos de ensayos y posteriormente se llevo a esterilizar por 15 min. Luego se dejo reposar en forma inclinada para posteriormente sembrar.

21


4.3 Determinación de La Curva de Calibrado de de DNS HIDRÓLISIS ACIDA DE LA MUESTRA Se tuvo una solución estándar de fructosa 5g/l, de la cual se prepararon7 tubos de ensayo a diferentes concentraciones, indicados en la siguiente tabla:

N° TUBOS 1 2 3 4 5 6 7

ml. Solución Estándar

ml. Agua destilada

Concentración g/l

0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.050 0.00

0 0.100 0.200 0.300 0.400 0.450 0.500

1 0.8 0.6 0.4 0.2 0.1 0

A los 7 tubos que contenían diferentes concentraciones de

22


Se adición 500 µl de DNS a cada tubo

y

luego

se

llevaron

a

ebullición por 5, luego se llevó a agua con hielo por 3 minutos.

23


4.4 Preparación Del Medio De Activación para la cinetica.

24

Se pesó todos los componentes descritos en la tabla N°02 en la balanza analítica para un medio de activación de 20 ml. Previo a esto se elaboró un tapón hecho de gaza y algodón, para colocarlo en el matraz para evitar la contaminación del medio.


25 Luego se llevaron a esterilizar los 2 tubos y el matraz en la olla a presión, se cubrió los tapones con papel aluminio, se controló 15 minutos a partir de la primera burbuja.


4.6 Preparación Del Medio De Fermentación para la Cinética.

26

De acuerdo con la tabla N° 03, se pesó las cantidades requeridas en la balanza analítica, sobre capachos de papel aluminio.


27

Se esterilizó las diluciones en la olla a presión por 15min. (A partir de la primera burbuja). Terminada la esterilización, se dejó enfriar para luego observar la cinética de crecimiento y luego se agrego el medio de activación y finalmente se llevo a pH 7 y se dejo por 10 horas en el Shaker.

4.7

Determinación De La Cinética De Crecimiento De La Biomasa


Con una pipeta limpia y estéril se procedió a sacar 5 ml del medio de activación. Los 4 ml de muestra se agregaron en una celda del espectrofotómetro, y se realizó la lectura a 640 nm. se colocó el matraz en el Shaker, para las próximas lecturas.

28

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Facultad de Ingeniería E . A . P I n g e n i e r í a A g r o i n d u s tr i a l LUEGO DE REALIZAR LAS EVALUACIONES DE CRECIMIENTO SE REALIZA LOS SIGUIENTES PASOS:

Una vez realizada la lectura en el espectrofotómetro, la muestra de la celda se colocó en un tubo de ensayo, y este se centrifugó por 15 minutos 29

y este se centrifugó por 15 minutos

Terminado la centrifugación, se retiró el tubo de ensayo, y se colocó el sobrenadante en un vial, el


4.8 Obtención de la curva de Calibrado de Biomasa Tabla 1: Diluciones De Muestra

N°

Diluciones

ml de

ml de H2O

Muestra

destilada

1

1:1

5 ml

0ml

2

1:2

2.5 ml

2.5 ml

3

1:3

1.67 ml

3.33 ml

4

1:4

1.25 ml

3.75 ml

5

1:5

1 ml

4 ml

30

El matraz previamente preparado el cual

contenía

fermentación,

el

medio

de

luego empezamos a

realizar las diluciones de la tabla 1.


31

Luego se centrifugó los tubos por 15 minutos, seguido se eliminó el sobrenadante y se quedó con el pellet (sólido); luego se lavó (dos veces) con 5ml de agua destilada aprox. (por posibles sales que quedan), luego se colocó el pellets al capacho, que previamente habían sido rotulados y colocados en la estufa, para que despegue presurizar con agua destilada. Se colocó los capachos con pellets en la estufa, por 24 horas a 80 °C.


VI.

RESULTADOS Y DISCUSION

 = .  /

CINETICA DE CRECIMIENTO: 

GRUPO B1: 2.5 (g glucosa/ g sulfato de amonio) 0.18 0.175 A I C N A B R O S B A

0.17

32

0.165 0.16 0.155 0.15 0.145 0

2

4

6

TIEMPO

GRUPO B2: 1.579 (g glucosa/ g sulfato de amonio)

8

10


GRUPO B3: 1.25 (g glucosa/ g sulfato de amonio) 0.172 0.17 0.168 A I 0.166 C N0.164 A B0.162 R O 0.16 S B0.158 A 0.156 0.154 0.152

33

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Tiempo

Guiándonos de las absorbancias obtenidas en estas tres experiencias se mantuvo la concentración de Carbono constante y aumento la concentración de Nitrógeno en el medio. Podemos observar en las dos primeras graficas un crecimiento inicial, seguido de una fase estacionaria corta y posteriormente una fase de declive o muerte. Sin embargo, en la tercera donde la concentración de nitrógeno es mayor (2.4 g/L) la fase estacionaria es más

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Facultad de Ingeniería E . A . P I n g e n i e r í a A g r o i n d u s tr i a l 2012 realizaron un estudio de los requerimiento nutricionales mínimos para Ralstonia eutropha ATCC 17699, en el determinaron que la relación

Carbono/Nitrógeno para no limitar el crecimiento celular era de 6,91gC/gN. Al emplear Glucosa como fuente de carbono y Sulfato de Amonio como fuente de nitrógeno la relación C/N determinada fue 3,4562 g glucosa/g sulfato de amonio. Por tanto, si la relación Glucosa/Sulfato de amonio que no limita el crecimiento celular es 3.4562, para una concentración de 3g/L de glucosa, la concentración de sulfato de amonio inicial debería ser 0.87 g/L. Tanto en B1, B3 y B3, se utilizaron concentraciones mayores de Sulfato de amonio (1.2; 1.9 y 2.4 g/L respectivamente) por lo que no hubo limitación de crecimiento por parte del N.

 = . /

CINETICA DE CRECIMIENTO: 

Grupo C1= 5.625 (g C/ g N) 0.18 0.16 0.14 a i 0.12 c n 0.1 a b s 0.08 o b 0.06

34


Grupo C3= 7.5 (g C/ g N) 0.3 0.25 A I 0.2 C N A B0.15 R S O B 0.1 A

35

0.05 0 0

2

4

6

8

10

12

TIEMPO

Las tres graficas tienen comportamientos diferentes:

-

Para 5.625 (g C/ g N): se observa un crecimiento notable a las 4 horas que cae en la siguiente toma de muestra. Para 6.25 (g C/ g N): no existen fases definidas, pues la absorbancia sube y baja en cada hora.


mediante análisis de diseño DCA determino que no existía una diferencia significativa entre las fermentaciones a diferentes concentraciones de glucosa. Las investigaciones afirman que es el nitrógeno el limitante del crecimiento de la R. Eutropha ya que una limitación de este unido a un exceso de fuente de carbono hace que el microorganismo empiece la síntesis de PHA (Gonzales et al ., 2013). Basados en estos estudios, nuestras curvas de cinética de crecimiento debieron ser optimas en C2 y C3 debido a que sus relaciones de C/N era de 6.25 y 7.5 contaban con el sustrato suficiente para el crecimiento de biomasa. Sin embargo en nuestra experiencia no hubo crecimiento en ambos casos, por lo que se deduce hubo problemas en la medida de los demás nutrientes.

CINETICA DE CRECIMIENTO: Concentración De Solución Salina Debido a los resultados obtenidos en los experimentos anteriores, se decidió variar la concentración de sales en las siguientes cinéticas de crecimiento.

36


Grupo D2: Sin solucion de sales 0.35 0.3 0.25

A I C N 0.2 A B O R0.15 S B A

37

0.1

0.05 0 0

2

4

6

8

10

12

Tiempo

Comparando ambos gráficos es evidente la diferencia en la cinética de crecimiento de ambas. La primera grafica conserva la misma concentración de sales utilizada por los grupos anteriores (10 mL/L), y


micronutrientes pueden ser añadidos por medio de soluciones salinas.( Ramírez et al., 2004) El efecto en el que la concentración salina provoca cambios en un cultivo bacteriano depende del balance osmótico requerido para tal cultivo. Algunas bacterias requieren un nivel increíblemente alto de sal para comenzar con el cultivo, mientras que otras bacterias mueren inmediatamente en niveles altos de sal (Ramírez et al., 2004; González et al., 2013; Repaske, 1981).

Halófilo es el adjetivo que se aplica a los organismos que viven en medios con presencia de gran cantidad de sales (Quillaguamán, et al., 2006). Ello es posible gracias a diversas adaptaciones fisiológicas que les permiten retener agua (Pohlmann, et al ., 2006). Uno de los mecanismos que han desarrollado es albergar en el interior de sus estructuras concentraciones de un soluto compatible a las sales (ácido polihidroxibutírico o PHB) mayores que en el exterior. Así el agua penetra por ósmosis (Jacquel et al., 2008). R. eutropha es conocida por producir y secuestrar plásticos de tipo Polihidroxialcanoato (PHA) cuando crece expuesta a un exceso de azúcares como sustrato (Shilpi, K. et al ., 2005; Kim, et al., 2005; Barbosa, et

38


CINETICA DE CRECIMIENTO: con Solución de sales a 1.5 mL/L 0.6

0.5

39

0.4

S B 0.3 A

0.2

0.1

0 -0.5

0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

Tiempo (h)

5.5

6.5

7.5

8.5

9.5

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Facultad de Ingeniería E.A.P Ingeniería Agroindustrial

DETERMINACION DE LA CONCENTRACION (x) EN (g/L): Reemplazando los valores de absorbancia en la ecuación: y = 0.4734 x + 0.0081 (Obtenido de la curva propia) N° 1 2 3 4 5 6 7 8

Hora 09:21 a.m. 10:51 a.m. 12:20 p.m. 01:20 p.m. 02:20 p.m. 03:50 p.m. 05:20 p.m. 06:50 p.m.

0 1.3 2.3 1 1 1.3 1.3 1.3

T(H)

ABS 640

X (g/L)

0 1.5 3 4 5 6.5 8 9.5

0.035 0.066 0.119 0.215 0.363 0.543 0.553 0.530

0.0568 0.1223 0.2343 0.4371 0.7497 1.1299 1.1510 1.1025

40 Se trabajó con los datos de la cinética de crecimiento de-Ralstonia eutropha NRRL B-14690 obtenidos por el grupo

B, ya que estos son los datos más cercanos posibles a la realidad y que siguen la cinética de crecimiento esperada.

Curva de Crecimiento Microbiano 1.4000 1.2000 1.0000 ) L / 0.8000 g ( x 0.6000

0.4000 0.2000 0.0000 0

1

2

3

4

5

Tiempo

6

7

8

9

10


FASES DURANTE LA ETAPA DE CRECIMIENTO

FASE DE LATENCIA

FASE EXPONENCIAL

0.5000

1.2000

0.4000

1.0000 0.8000

) 0.3000 L / g ( x 0.2000

) L ( g 0.6000 ( x

0.4000

0.1000

0.2000

0.0000

0.0000 0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0

1

2

Tiempo

3

4

5

6

7

Tiempo

FASE MUERTE

FASE ESTACIONARIA 1.3000

1.3000

) L / g ( x

41

y = 0.2611x - 0.5697 R² = 0.9955

1.2000

) L / g ( x

1.1000

1.2000

1.1000

1.0000

1.0000 6.3

6.8

7.3

Tiempo

7.8

8.3

7.8

8.3

8.8

Tiempo

9.3

9.8

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANT A Facultad de Ingeniería E.A.P Ingeniería Agroindustrial

Para poder analizar en el comportamiento de la Ralstonia eutropha NRRL B-14690 teniendo como sustrato a la glucosa, tenemos primero que linealizar los datos de la fase exponencial; así tenemos:

T(H) 3 4 5 6.5

ABS 640

X (g/L)

Ln (X/Xo)

0.119

0.2343

1.4165

0.215

0.4371

2.0401

0.363

0.7497

2.5797

0.543

1.1299

2.9900

LINEALIDAD 3.5000 3.0000 2.5000 ) o 2.0000 x / x / N1.5000 L

1.0000

y = 0.4481 x + 0.1841 R² = 0.9627

42


DETERMINACIÓN DEL LA VELOCIDAD MÁXIMA DE CRECIMIENTO EXPONENCIAL (µ MAX) Para determinar el µ

max, luego

de linealizar la curva de la fase exponencial se procedió a

trabajar con la ecuación que obtuvimos, y la relacionamos con la ecuación de Monod. ln

X X 0



 max .t

y = 0.4481x + 0.1841

La ecuación lineal es:

Reemplazando las variables según las gráficas:

  = 0.4481  + 0.1841 

Entonces:

 = .  − Determinación del tiempo de fermentación: ln

X 

X 0

 max .t

43


DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES:

=..

La fórmula usada fue:

Donde y =Absorbancia a 540 nm

con

R2=0.998

y x = Concentración glucosa (g/l)

44 Tiempo

Tubo

F.D.

Abs. (540 nm)

Glucosa (g/L)

0 1.5 3 4 5.5 7 8 9

1

1:6

0.825

0.5199

2

1:6

0.922

0.5795

3

1:6

0.921

0.5789

4

1:5

1.030

0.6460

5

1:5

1.013

0.6355

6

1:1

1.633

1.0173

7

1:1

1.518

0.9464

8

1:1

1.594

0.9932

Glucosa (g/L) x F.D. 3.1189 3.4772 3.4735 3.2302 3.1778 1.633 1.518 1.594

CONSUMO DE LA FUENTE DE CARBONO 4 ) 3 L / g ( a 2 s o c u l G1

0 0

1

2

3

4

5

Tiempo (Horas)

6

7

8

9

10

La mayoría de estos trabajos de investigación utilizan cepas mutantes de R. eutropha capaces de crecer sobre glucosa. Sin embargo, la cepa nativa crece en fructosa, por lo cual es necesario establecer las condiciones para la acumulación del polímero. Para la producción del polímero por R. eutropha, la estrategia de fermentación más empleada es el cultivo por lote alimentado en el cual las células crecen hasta una determinada concentración sin limitación de nutrientes, luego un nutriente esencial es limitado para permitir la síntesis de PHAs. Durante esta etapa, la concentración de biomasa permanece constante presentándose acumulación de polímero (Lee, 1996a; Madison y Huisman, 1999).


PRODUCCIÓN DE BIOMASA Y CONSUMO DE LA GLUCOSA: BIOMASA

SUSTRATO

1.8

4

1.6

3.5

1.4

3

1.2 ) L / g (

2.5

1

2

X 0.8

1.5

0.6

1

0.4

0.5

0.2 0

0

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Tiempo (hr)

En la presente grafica se puede observar la relación que existes entre el crecimiento microbiano y el consumo de sustrato podemos observar que el microorganismo cuando consume más rápido el sustrato ahí se da el crecimiento exponencial.

El crecimiento exponencial depende parcialmente de la concentración inicial del sustrato limitante (Khanna. S, 2006; Ching-Yee y Kumar, 2007), esto implica que el cultivo pasa de un estado en el cual crece con exceso de sustrato a otro de carencia de sustrato.

45

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANT A Facultad de Ingeniería E.A.P Ingeniería Agroindustrial Calculo de Rendimiento celular: Con referencia a los datos de consumo de sustrato y crecimiento microbiano: Y X / S

X 



S 0

X 0



S

N°

T(H)

X (g/L)

Glucosa (g/L)

1 2 3 4 5 6 7 8

0 1.5 3 4 5 6.5 8 9.5

0.0568 0.1223 0.2343 0.4371 0.7497 1.1299 1.1510 1.1025

3.1189 3.4772 3.4735 3.2302 3.1778 1.633 1.518 1.594

/ = 1.10250.0568 3.11891.594 / = .   /  Cálculo de la Productividad Celular:

46


DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES: GRUPO C1

=..

La fórmula usada fue:

Donde y =Absorbancia a 540 nm

tiempo(h)

con

R2=0.998

y x = Concentración glucosa (g/l)

Tubo

F.D.

Abs. Inicial (540 nm)

Glucosa (g/L)L)

Glucosa (g/L)

0 1.5

1

1:10

1.429

0.8679

2

1:10

1.442

0.8759

8.67935 8.75939

1.5 1

3

1:10

1.448

0.8796

4

1:10

1.420

0.8624

8.79633 8.62394

1

5

1:10

1.424

0.8649

8.64857

1 2

6

1:10

1.443

0.8766

7

1:10

1.435

0.8716

8.76555 8.71629

2.25

8

1:10

1.414

0.8587

8.58700

1.5

9

1:10

1.421

0.8630

8.63009

Consumo del Sustrato

47


LA DETERMINACION DE BIOMASA Usando la fórmula

48

y= 0.4734x+0.0081 CINETICA DE C


BIOMASA 0.6 0.5 0.4

) L ( g 0.3 ( X

0.2

49

0.1 0 0

2

4

6

8

10

12

Tiempo

PRODUCCION DE BIOMASA Y CONSUMO DE SUSTRATO (C1) 0.6

8.85000

0.5

8.80000

0.4

8.75000

) L ( g 0.3

8.70000

14

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANT A Facultad de Ingeniería E.A.P Ingeniería Agroindustrial DETERMINACIÓN DEL LA VELOCIDAD MÁXIMA DE CRECIMIENTO EXPONENCIAL (µ MAX)

N°

Tiempo

ABSORBANCIA

X (g/L)

LN(X/Xo)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

00:00

0.204

0.414

0

01:30

0.194

0.393

-0.05239543

01:30

0.163

0.327

-0.23482458

01:00 01:00

0.174 0.184

0.350 0.372

-0.16621913 -0.10768867

01:00

0.167

0.336

-0.20932925

01:00

0.244

0.498

0.18580366

01:00 01:00

0.142 0.212

0.283 0.431

-0.38051107 0.04002535

01:00

0.112

0.219

-0.63417543

PRODUCCIÓN DE BIOMASA Y CONSUMO DE LA GLUCOSA: 10.0000

1.8 1.6

9.5000 1.4 ) l /

9.0000

1.2

50

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANT A Facultad de Ingeniería E.A.P Ingeniería Agroindustrial Calculo de Rendimiento celular: Con referencia a los datos de consumo de sustrato y crecimiento microbiano: Y X / S

X 



S 0

X 0



S

N°

T(H)

X (g/L)

Glucosa (g/L)

1 2 3 4 5 6 7 8

0 1.5 3 4 5 6.5 8 9.5

0.10127 0.19097 0.34433 0.62211 1.05035 1.57118 1.60012 1.53356

8.8101

/ = 1.533560.10127 8.81018.7177

/ = .   /  Cálculo de la Productividad Celular:

8.8901 8.9270 8.7546 8.7793 8.8963 8.8470 8.7177

51


VII.

CONCLUSION 

El diseño de la experiencia de cultivo celular por lotes en matraces, empleando una cepa de Ralstonia eutropha NRRL B-14690 se realizo para determinar los parámetros de la cinetica de fermentación.

52 

En la grafica de producción de biomasa y consumo de sustrato se puede observar la relación que existes entre el crecimiento microbiano y el consumo de sustrato podemos observar que el microorganismo cuando consume más rápido el sustrato ahí se da el crecimiento exponencial.



Se diseño con las tablas en paginas anterior los medios de cultivo de para el respectiva fermentación.



El PH al inicio fue 7.03 y al final fue de 6.9.


VIII. -

REFERENCIAS BILIOGRAFICAS Cramm, R. (2009). Genomic View of Energy Metabolism in Ralstonia eutropha H16. J Mol Microbiol Biotechnol 16 (1 –2): pp. 38 –52.

-

Pohlmann, A., Fricke, W., Reinecke, F., Kusian, B., Liesegang, H., Cramm, R., Eitinger, T., Ewering, C., Potter, M., Schwartz, E., Strittmatter, A., Vob, I., Gottschalk, G., Steinbuchel, A., Friedrich, B. and Bowien, B. (2006). Genome sequence of the bioplastic-producing Knallgas bacterium Ralstonia eutropha H16. Nature Biotechnology 24 (10): pp. 1257 –1262

-

Repaske, R. (1981).

Nutritional Requirements for Hydrogenomonas

eutropha. J Bacteriol. 83 (2): pp. 418 –422

-

Shilpi Khanna , Ashok K. Srivastava. (2005). Statistical media optimization studies for growth and PHB production by Ralstonia eutropha. Process Biochemistry 40: 2173 - 2182

-

Becerra Jiménez Monica. (2013). Producción De Un Polímero Tipo Polihidroxialcanoato (Pha) Empleando Residuos De La Producción De

53

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Jacquel, N.; et al. (2008). «Isolation and purification of bacterial poly(3hydroxyalkanoates)». Biochem. Eng. J. 39 (1): pp. 15 –27.

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Mariana Cardona Betancur; Lina María Agudelo Escobar MsC. (2012). Producción de bioplásticos a partir de bacterias empleando sustratos no convencionales. Universidad de Antioquia. Grupo de Biotransformación Escuela de Microbiología

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-

S.O. Kulkarnia, P. Kanekara, S. Nilegaonkara, S. Sarnaika, J.P. Jogb. (2010). Production and characterization of a biodegradable poly (hydroxybutyrateco-hydroxyvalerate)

(PHB-co-PHV)

copolymer

by

moderately

54


IX. ANEXOS DISEÑO DE MEDIO DE FERMENTACION 1. CALCULO DE LA MASA DE GLUCOSA Y SULFATO DE AMONIO A UTILIZAR: Condiciones o exigencias:

 (g/L)  (g/L)

6.0

Volumen del medio

55

0.8 200 ml

Datos: ELEMENTO

Carbono Nitrógeno

Peso atómico (g) 12.011 14.007

NUTRIENTE

Glucosa

(NH)SO

Peso molecular (g/mol) 180.06 132.075

% EN NUTRIENTE 40.02 21.21

Entonces: para 200 ml de medio para la fermentación se necesitaran

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANT A Facultad de Ingeniería E.A.P Ingeniería Agroindustrial 2. CALCULOS DEL DISEÑO DEL MEDIO DE FERMENTACION: OTRAS FUENTES NO LIMITANTES Datos: Elemento C N H S O P Mg Fe K

Nutriente

Peso atómico g

.  . 

12.011 14.007 1.008 32.065 15.999 30.974 24.305 55.845 39.098

Peso molecular g 246.471 136.084 278.011

56

Entonces: para 120ml de medio ELEMENTO

NUTRIENTE

Mg

MgSO. 7H KHPO KHPO

K P

% en Células

% en Nutriente

Y x/s (g/g)

So (g/L)

So (g)

0.5

9.8612

19.7224

0.1141

0.02282

4.5

28.7307

6.3846

0.3524

0.07048*

3.0

22.7609

7.5870

0.2966

0.05932*

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANT A Facultad de Ingeniería E.A.P Ingeniería Agroindustrial CURVA DE CALIBRACION DNS (FRUCTUOSA): N°

Vol. Sol. Std. (ml)

Vol. Agua (ml)

FRUCTOSA (1g/l)

ABS 540 nm

1 2 3 4 5 6 7

0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,050 0,000

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,450 0,500

1 0.8 0.6 0.4 0.2 0.1 0

1.538 1.258 0.891 0.602 0.268 0.166 0

Curva de Calibrado DNS 1.8 1.6 1.4 1.2

) m n ( 1 A I C N 0.8

y = 1.551x - 0.0121 R² = 0.9984

57


N° 1 2 3 4 5 6 7

Vol. Sol. Std. (ml)

Vol. Agua (ml)

0,500

0,000

1

1.588

0,400 0,300

0,100 0,200

0.8 0.6

1.306 0.972

0,200

0,300

0.4

0.602

0,100

0,400

0.2

0.297

0,050

0,450

0.1

0.135

0,000

0,500

0

0

GLUCOSA ABSORBANCIA

Curva de calibrado de DNS 1.8 1.6 1.4 1.2 A I C 1 N A B 0.8 R O S 0.6 B A

y = 1.6242 x - 0.0193 R² = 0.9988

58


CURVA DE CALIBRACION DE BIOMASA: 

GRUPO A: A-1: Para la dilución 1:1 se realizó 3 repeticiones, obteniéndose: NUMERO DE CAPACHO

ABSORBANCIA

PESO INICIAL(g)

PESO FINAL(g)

PESO SECO(g)

CONCENTRACION (g/L)

A1-1

0.039

0.1914

0.1957

0.0043

1.075

A1-2

0.041

0.1517

0.1572

0.0055

1.375

A1-3

0.04

0.1689

0.1744

0.0055

1.375

ABS PROMEDO

0.04

0.0051

1.275

Datos obtenidos por regla de tres:

IDEAL NUMERO DE CAPACHO PROMEDIO A1-4 A1-5 A1-6 A1-7 BLANCO

ABSORBANCIA

PESO INICIAL(g)

PESO FINAL (g)

PESO SECO (g)

CONCENTRACION (g/L)

0.04

1.275

0.028 0.022 0.018 0.012 0

0.8925 0.70125 0.57375 0.3825 0


(IDEAL) 0.045 0.04 m n 0.035 0 4 0.03 6 A 0.025 A I 0.02 C N A 0.015 B R 0.01 O S 0.005 B A 0 -0.005 0

y = 0.0314 x - 1E-17 R² = 1

0.2

0.4

60

0.6

0.8

1

1.2

1.4

CONCENTRACION (g/L)

Datos obtenidos de la experiencia en laboratorio:

REAL NUMERO DE CAPACHO PROMEDIO A1-4 A1-5 A1-6 A1-7 BLANCO

DILUCION

DILUCION

ABSORBANCIA

1 - 1. 1 - 2. 1 - 3. 1 - 4. 1 - 5.

4 inoculo+ 0 agua 2.5 inoculo+2.5 agua 2 inoculo+4 agua 1 inoculo+3 agua 1 inoculo + 4 agua

0.04 0.028 0.022 0.018 0.012 0

PESO INICIAL(g) 0.1568 0.1842 0.2156 0.1667

PESO FINAL (g) 0.1626 0.1904 0.2188 0.1705

PESO SECO (g) 0.0051 0.0058 0.0062 0.0032 0.0038

CONCENTRACION (g/L)

1.275 1.16 1.033333333 0.8 0.76 0


REAL 0.045

61

0.04 0.035

y = 0.028x - 0.0034 R² = 0.8717

0.03 A 0.025 I C N A 0.02 B R O 0.015 S B A 0.01

0.005 0 -0.005 0 -0.01

0.2

0.4

0.6

0.8

CONCENTRACION (g/L)

1

1.2

1.4

Informe Final de Bioprocesos c 3 Final

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