Informe Lab 1 Microbiologia

Universidad de Santiago de Chile Facultad Tecnológica Dpto. de Ciencia y Tecnología de los Alimentos Ingeniería de Alimentos

Informe Nº1 Laboratorio de Microbiología Microbiología de los alimentos I Profesores: Dra. Denisse Denisse Bravo R. - Dr. José M Pérez D

Procedimientos Básicos en Microbiología: Siembra y Morfología Bacteriana Francisca Anríquez A.

Víctor Escobar L

Santiago 15/12/2011

Resumen: Los microorganismos y en particular las bacterias, tiene una rol fundamental en la industria alimentaria pues se han utilizado desde la antigüedad en la elaboración de diversos productos como pan, lácteos,, vinagre. Sin embargo existen bacterias bacterias que son perjudiciales perjudiciales para la salud. Es por por esto que se han han desarrollados diversas diversas técnicas de cultivos, para poder poder aislar colonias puras puras y estudiarlas macro y microscópicamente. Y así prevenir o potenciar su desarrollo.

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Introducción:

APD (Agar Papa Dextrosa) desarrollo de hongos y mientras que el medio LB crecimiento de diversas (Tortora, 2007)

Los microorganismos y en particular las bacterias, tiene una rol fundamental en la industria alimentaria pues se han utilizado desde la antigüedad en la elaboración de pan y productos lácteos (bacterias del ácido láctico), vinagre (bacteria del ácido acético) y en la elaboración de cervezas y vinos (levaduras). (Schlegel, 1997). Sin embargo existen bacterias que son perjudiciales para la salud, como la responsable del cólera (Vibrio cholerae ), neumonía (Streptococcus pneumoniae ), entre otras. (Tortora, 2007).

permite el levaduras, permite el bacterias.

Debido al tamaño de las bacterias (110 µm), deben ser estudiadas bajo el microscopio, Si se utiliza uno óptico, las bacterias previamente se tiñen de acuerdo al parámetro a estudiar. (Tortora, 2007) Tinción simple: se utiliza safranina o azul de metileno para observar la morfología de la bacteria. Tinción diferencial: se utiliza para clasificar las bacterias, por ejemplo la tinción de Gram, separa las bacterias en dos grupos, de acuerdo a características de la membrana.

Por esto se han desarrollado diversas técnicas para cultivar bacterias, las que posteriormente serán utilizadas en diversos procesos. O bien para aislarlas, clasificarlas y estudiar su morfología, determinando protocolos para controlar y/o evitar su presencia en alimentos, en el caso de bacterias patógenas.

Tinción estructural: es utilizada para estudiar la presencia de estructuras específicas, por ejemplo para visualizar la cápsula, se utiliza tinta china en un método de tinción negativa. Para visualizar las esporas se utiliza una técnica con verde de malaquita.

Mediante técnicas de cultivos, como en medios de cultivos sólidos (agar), se han podido aislar colonias de bacterias puras, las que están formadas a partir de una bacteria, la que mediante fisión celular se replicó exponencialmente dando origen a una población clonal. Por esto es muy importante trabajar con técnicas estériles, para obtener efectivamente cultivos puros.

El presente trabajo tuvo como objetivos, manipular y observar cultivos bacterianos, sembrar bacterias en diferentes medios de cultivos, permitiendo el desarrollo de colonias aisladas y observar macro y microscópicamente diversos microorganismos.

Debido a que cada bacteria forma colonias características, en cuanto a color, forma, tamaño, etc. Es posible realizar un estudio macroscópico, comparando el cultivo obtenido con los descritos en literatura. Es importante seleccionar el medio de cultivo adecuado, de acuerdo al tipo de microorganismo a estudiar. El medio

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Materiales y Métodos:

II Contaminación ambiental

Materiales:

-Obtener una muestra de la superficie del mesón y sembrar en la mitad de una placa con LB Agar. Después de esto, se limpia la superficie con alcohol y se vuelve a extraer una muestra del mesón y se siembra en la otra mitad de la placa. Luego se repiten los pasos anteriores, pero en vez de una placa con LB Agar se usa una con ADP.

Placas petri con APD y con LB Agar , un tubo con LB Agar y uno con caldo LB, 2 asas (una con loop y la otra sin loop), una micropipeta, rastrillo de vidrio, placa con muestra de Staphylococcus aureus (medio solido) , tubo con muestra de Escherichia coli (medio liquido), incubadora, microscopio, safranina, azul de bromotimol.

-Dejar una placa con LB Agar y otra con APD abierta expuesta al ambiente por más de 15 min.

Composición LB Agar: Extracto de Levadura, Triptona y NaCl.

Precauciones: Llevar todas las muestras a la incubadora y dejar ahí por más de 24 hrs. Realizar siempre los procedimientos de siembra cerca de un mechero encendido. Esterilizar siempre el asa con la llama de un mechero.

Composición APD: papa, Sacarosa, Sulfato de Amonio y Cloranfenicol.

Procedimientos: I Siembra y aislamiento

III Tinciones

-Con un asa con loop se extrae una colonia de S. aureus y se siembra en una placa con LB Agar (técnica solido a solido).

-Para la tinción de Gram, sobre la muestra fijada en el porta objetos se agrega cristal violeta, luego se agrega yodo como fijador, posteriormente se decolora con alcohol y finalmente se le agrega safranina como contraste. Lo tenido morado corresponde a Gram+ y lo de color rosado a Gram-

-Con una micropipeta se extrae 1 ml de la solución con E. coli y se coloca en el centro de una placa con LB Agar, posteriormente se esparce con el rastrillo de vidrio por toda la placa (técnica de liquido a solido por extensión).

-Tomar una muestra de Escherichia coli colocar en un portaobjetos, secar en un mechero y teñir con safranina. Dejar que se tiña por más de 5 min.

- Se sumerge un asa sin loop en la solución de E. coli y luego se lleva al tubo con LB Agar y se entierra (técnica liquido a solido por profundidad).

-Tomar una muestra de Staphylococcus aureus y colocar en un portaobjetos, secar en un mechero y teñir con azul de bromotimol. Dejar que se tiña por más de 5 min.

-Con un asa con loop se extrae una colonia de S. aureus y se sumerge en el tubo con caldo LB (técnica solido a liquido).

-Finalmente limpiar las muestras del portaobjetos con alcohol y observar en el microscopio con una ampliación de 10x , 40x y 100x.

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Resultados: I Siembra y aislamiento

Figura Nº3: Cultivo de E. coli mediante el método de siembra de medio liquido a solido por extensión

Se aprecia un crecimiento homogéneo de colonias de E. coli por toda la placa Figura Nº1: Cultivo de S. Aureus por método de siembra de medio solido a solido.

Al lado izquierdo de la imagen se aprecia un crecimiento más homogéneo de colonias de aproximadamente 1 mm de diámetro. Por otra parte al lado de derecho se observa un crecimiento de colonias muchos más agrupadas.

Figura Nº4: Cultivo de E. coli mediante el método de siembra de medio liquido a solido por profundidad

Se aprecia un crecimiento de E. coli en la superficie de LB Agar, pero no se aprecia el surgimiento de colonias ya que estas se encuentran muy agrupadas en el medio de cultivo Figura Nº2: Implementación errónea del método de siembra de medio solido a solido

Se sembró de forma incorrecta la muestra de S. aureus en el LB Agar. En comparación con la Figura Nº1, en esta placa se logra apreciar el crecimiento de un microorganismo mas amarillo al lado izquierdo de la imagen y otro de color mas blanco al lado derecho de la imagen. Por otra parte, tampoco se logra apreciar el surgimiento de colonias claramente diferenciadas.

Figura Nº5: Cultivo de S. aureus mediante el método de siembra de medio solido a líquido.

En el caldo LB no se aprecia el surgimiento de colonias, sino más bien un cambio en la turbidez del liquido

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II Contaminación ambiental

varias colonias juntas. Y finalmente se tiene un MO de color café oscuro en el centro, aclarándose hacia los bordes, filamentoso y de gran tamaño.

Figura N°6: cultivo en medio APD de microorganismos presentes en la superficie del mesón

Se observa en el crecimiento de un hongo de gran tamaño de color blanco elevación redonda, y pequeñas colonias muy similares que difieren en el color, pues la del lado derecho de la imagen posee un color amarillo, mientras que las del lado superior son de una color blanco. En la zona limpia del mesón no se desarrollaron crecimientos de colonias. La línea fue mal trazada originalmente, por eso se aprecian dos linas de separación.

Figura N°8: cultivo en medio APD de microorganismos presentes en el ambiente

Se observan dos tipos de colonias, ambas de similar tamaño y forma (pequeñas y circulares), sin embargo una es de color blanco y la otra anaranjada.

Figura N°9: cultivo en medio LB Agar de microorganismos presentes en el ambiente

Se desarrollaron tres tipos de colonias, todas circulares de bordes definidos, de colores blanco, anaranjado y amarillo, sobre esta última se observa que su crecimiento se vio afectado por otra colonia, lo que la deformó. En las colonias anaranjadas se observan diferencias de tamaño.

Figura N°7: cultivo en medio LB Agar de microorganismos presentes en la superficie del mesón

En el lado derecho de la imagen (superficie sucia), se observa el crecimiento de tres microorganismos (MO) diferentes. Una colonia es de color rosado, forma circular, elevación en el centro, y borde entero. La otra es de color blanco opaco, de borde lobulados, parece el desarrollo de

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Discusión:

III Tinciones

Respecto a los métodos de siembra y aislamientos, se tiene que el método de liquido a solido por extensión es donde se obtuvo mayor numero de colonias. En comparación con el método de solido a solido la diferencia la hizo el instrumento de siembra, ya que para el método de extensión se uso un rastrillo de vidrio y en el de solido a solido se uso un asa con loop (el rastrillo permite distribuir más fácilmente y sin causar daños en el medio de cultivo). Por otra parte, si se compara los métodos de medio liquido a solido, se tiene que el de extensión supera ampliamente al de profundidad en cuanto a la formación de colonias, ya que en el método por profundidad no se logran apreciar colonias, esto se debe principalmente a que cuando se sembraron las bacterias estas solo fueron enterradas en el medio y no distribuidas por la superficie. Finalmente al observar los resultados del método de solido a liquido, no se logra apreciar ninguna colonia, más bien solo ocurre un aumento en la turbidez del medio, ya que al colocar la bacteria en el medio liquido esta se distribuye por todo el medio y al reproducirse también sigue distribuyéndose (este último método es más bien implementado en la medición de crecimiento bacteriano por turbidimetria). La Figura Nº2 representa un caso especial en donde de mala implementación del método de siembra de medio solido a solido, ya que no se realizo el procedimiento cerca de un mechero encendido, se daño el medio del cultivo y se expuso la placa a otro tipo de microorganismos. Producto de lo anterior es que en la figura Nº2 se aprecien dos tipos de microorganismos y no se aprecien colonias bien distribuidas.

Figura N°10: Tinción Gram positiva en S. aureus Fuente: Trinidad Sabalete ©

En la tinción de Gram se observó cocos en disposición de racimos de un color morado. Mediante la tinción de E. coli con safranina, se observó su forma de bacillo y se logró ver una bacteria en su fase terminal de separación. No se obtuvo una imagen clara en el microscopio de la muestra de E. coli teñida con azul de bromotimol.

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Del análisis de contaminación ambiental se observa que las bacterias son muy específicas en cuanto al medio donde se pueden desarrollar, pues en el medio LB Agar y en APD, se desarrollaron diferentes microorganismos. Esto debido a que el medio APD es selectivo para hongos y levaduras, mientras que el LB Agar es un medio rico para bacterias (Tortora, 2007)

violeta en su capa de peptidoglicán, lo que se observa en el color morado. Esta tinción a diferencia de las tinciones simples, permite diferenciar a las bacterias, debido a que reacciona de modo diferente de acuerdo a las características de la membrana. (Tortora, 2007).

Conclusiones: Mediante el cultivo de bacterias en los distintos medios descritos, se logro aislar colonias y observarlas a nivel macroscópico, con lo cual se realizó una descripción general de su forma, tamaño, color, etc., lo que permite iniciar una eventual identificación al compararlas con colonias conocidas.

Respecto de la contaminación del ambiente tanto en el análisis del aire como de las superficies se desarrollaron más bacterias que hongos y levaduras. De acuerdo a de la Rosa y colaboradores en el aire es frecuente encontrar y aislar bacterias esporuladas de los géneros Bacillus y Clostridium. También bacilos pleomórficos Gram positivos (Corynebacterium ) y los cocos Gram positivos (Micrococcus y Staphylococcus ). Añade también que los bacilos Gram negativos (Flavobacterium, Alcali- genes ) se encuentran en menor proporción y disminuyen con la altura A demás indica que Cladosporium es el hongo que predomina en el aire, tanto sobre la tierra como sobre el mar, aunque también es frecuente encontrar otros mohos, como Aspergillus , Penicillium , Alternaria y Mucor y la levadura Rhodotorula (de la Rosa et al, 2002).

Se logró aislar diferentes microorganismos del ambiente (aire y superficie del mesón de trabajo), con lo cual se visualiza la importancia de trabajar en condiciones de esterilidad, como por ejemplo, trabajar cerca del mechero, no hablar mientras se realizan los cultivos y limpiar el mesón y las manos con etanol 70% En el análisis microscópico, se observó la diferencia en cuanto al tipo de tinción realizada, pues con la tinción simple, solo fue posible observar la forma de la bacteria, mientras que de la tinción diferencial se obtuvo información del tipo de membrana de la bacteria analizada. Estos métodos, son de gran utilidad para identificar de un modo más exacto a los microorganismos, pues el estudio macroscópico entrega una visión general.

Mediante la tinción simple con safranina se observó la estructura de la bacteria, forma de bacilo, Sin embargo debido a un exceso de calor en el proceso de fijación de la muestra, se destruyeron muchas E. coli por lo que se observaron bacterias deformes. La tinción de Gram para S. aureus entrega un resultado positivo, es decir la bacteria retiene el colorante cristal

Finalmente, los autores destacan que al momento de manipular y observar cultivos bacterianos, se deben cuidar las medidas de higiene y esterilidad, para no dañar los cultivos, ni la salud personal.

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Bibliografía: De la Rosa M, Mosso M & Ullán C . (2002): El aire: hábitat y medio de transmisión de microorganismos . Observatorio Medioambiental Vol. 5 Págs. 375-402 “

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Sabalete T . Imagen de S. aureus en tinción Gram. Bajo licencia de Creative Commons Attribution 3.0 Unported License Schlegel H, (1997): Microbiología General . Ed Omega, Nueva Edición. “

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Tortora G, Funke B, Case C. (2007): Introducción a la Microbiología . Ed. Panamericana. 9ª Edición. “

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Informe Lab 1 Microbiologia

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